ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка испрашивает приоритет патентной заявки США No. 61/242,741, поданной 15 сентября 2009 г. в соответствии с 35 U.S.C. 119(e) Свода законов США, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая область
Данное описание относится к фармацевтическим составам, содержащим искусственные ретиноиды, в частности к стабильным составам и лекарственным дозированным составам, пригодным для хромофор-заместительной терапии зрения.
Предпосылки изобретения
Зрительное восприятие является результатом биологического преобразования световой энергии в передачу электрических сигналов при помощи фоторецепторов сетчатки глаза, этот процесс называется фотопреобразованием. Процесс фотопреобразования инициируется зрительными пигментами, включающими хромофорный 11-цис-ретиналь, связанный с рецепторными опсинами, соединенными с апопротеиновыми G-белками, для образования родопсина (Palczewski K. G protein-coupled receptor rhodopsin. Annual review of biochemistry 2006; 75:743-767). Хромофор поглощает фотоны, которые переводят фотоизомеризацию хромофора в его транс-форму и вызывают каскады преобразования сигналов (Palczewski K. выше; Ridge KD et al. Visual rhodopsin sees the light: structure and mechanism of G protein signaling. J Biol Chem 2007; 282:9297-9301). Изомеризованный хромофор полностью транс-ретиналь затем редуцируется в полностью транс-ретинол, транспортируется к ретинальному пигментному эпителию (RPE) и преобразуется в полностью транс-ретиниловые эфиры жирных кислот при помощи лецитин:ретинолацилтрансферазы (LRAT). И, наконец, восстановление 11-цис-ретиналя из полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот завершает этот ретиноидный цикл (цикл превращений родопсина) (см., например, опубликованные заявки США Nos. 2004/0242704, 2006/028182, 2006/0221208).
Регенерация 11-цис-ретиналя имеет важнейшее значение для поддержания зрения (Travis GH, et al. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47:469-512). Дефекты образования 11-цис-ретиналя связаны с целым рядом наследственных дегенеративных ретинопатий (Gu SM, et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature genetics 1997; 17:194-197). Два примера представляют собой врожденную слепоту Лебера (LCA), начинающееся в детстве ретинальное заболевание, вызывающее тяжелое нарушение зрения; и пигментный ретинит (RP), другая ретинопатия, наступающая в более позднем, переходном возрасте.
LCA представляет собой наследственную, тяжелую и в настоящее время неизлечимую ретинальную дегенерацию, которая является основной причиной слепоты в детстве. При рождении или вскоре после рождения у LCA-пациентов характерным образом проявляется серьезное нарушение зрения, о чем свидетельствуют странствующий нистагм, амавротические зрачки, пигментная ретинопатия с потерей колбочковой и палочковой чувствительности, отсутствие или сильное ослабление ответов на электроретинограмме (ЭРГ) и примерно 100-кратное снижение амплитуды колбочкового мерцания (Perrault I, et al. Leber congenital amaurosis. Mol Genet Metab 1999; 68:200-208; Fazzi E, et al. Leber's congenital amaurosis: an update. Eur J Paediatr Neurol 2003; 7:13-22; Fazzi E, et al. Response to pain in a group of healthy term newborns: behavioral and physiological aspects. Functional neurology 1996; 11:35-43).
RPE65, белок массой 65кДа, специфический для и имеющийся в изобилии при RPE, который катализирует изомеризацию полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот в 11-цис-ретинол, обычно рассматривается в качестве ретиноидной изомеразы, принимающей участие в регенерации 11-цис-ретиналя (Hamel CP, et al. Molecular cloning and expression of RPE65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post- transcriptionally regulated in vitro. J Biol Chem 1993; 268:15751 -15757; Jin M, et al. Rpe65 is the retinoid isomerase in bovine retinal pigment epithelium. Cell 2005; 122:449-459; Moiseyev G, et al. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005; 102:12413-12418; Redmond TM, et al. Mutation of key residues of RPE65 abolishes its enzymatic role as isomerohydrolase in the visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005; 102:13658-13663)). Мутации в гене RPE65 являются причиной до 16% случаев LCA и 2% случаев аутосомно-рецессивной RP (Gu SM, выше; Marlhens F, et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature genetics 1997;17:139-141 ; Morimura H, et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998; 95:3088-3093; Thompson DA, et al. Genetics and phenotypes of RPE65 mutations in inherited retinal degeneration. Investigative ophthalmology & visual science 2000; 41:4293-4299; Lorenz B, et al. Early-onset severe rod-cone dystrophy in young children with RPE65 mutations. Investigative ophthalmology & visual science 2000; 41:2735-2742). Спонтанное или направленное делетирование Rpe65 у мышей и собак приводит к 11-цис-ретинальной недостаточности, начинающейся в раннем возрасте и медленно прогрессирующей ретинальной дегенерации с резким уменьшением ответов на электроретинограмме (ЭРГ) и типичной LCA-патологией, сопровождающейся накоплением полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот в RPE (Redmond TM, et al. Rpe65 is necessary for production of 11-цис-vitamin A in the retinal visual cycle. Nature genetics 1998; 20:344-351; Pang JJ, et al. Retinal degeneration 12 (rd12): a new, spontaneously arising mouse model for human Leber congenital amaurosis (LCA). Molecular vision 2005; 11:152-162; Wrigstad A, et al. Ultrastructural changes of the retina and the retinal pigment epithelium in Briard dogs with hereditary congenital night blindness and partial day blindness. Experimental eye research 1992; 55:805-818; Acland GM, et al. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nature genetics 2001; 28:92-95; Imanishi Y, et al. Noninvasive two-photon imaging reveals retinyl ester storage structures in the eye. The Journal of cell biology 2004; 164:373-383).
Для лечения LCA исследуется несколько возможных терапий. Терапия, основанная на функциональном дополнении гена RPE65, и ретинальное протезирование продемонстрировали предварительные обнадеживающие признаки сохранения зрения на ранней стадии клинического определения (Bainbridge JW, et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. The New England journal of medicine 2008; 358:2231-2239; Maguire AM, et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. The New England journal of medicine 2008;358:2240-2248; Yanai D, et al. Visual performance using a retinal prosthesis in three subjects with retinitis pigmentosa. American journal of ophthalmology 2007; 143:820-827).
Недавно, хромофор-заместительная терапия зрения 9-цис-ретиналем была предложена в качестве нового фармакологического способа обхода нарушенного ретиноидного цикла (Van Hooser JP, et al. Rapid restoration of visual pigment and function with oral retinoid in a mouse model of childhood blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2000;97:8623-8628; Van Hooser JP, et al. Recovery of visual functions in a mouse model of Leber congenital amaurosis. J Biol Chem 2002; 277:19173-19182; Aleman TS, et al. Impairment of the transient pupillary light reflex in Rpe65(-/-) mice and humans with leber congenital amaurosis. Investigative ophthalmology & visual science 2004; 45:1259-1271; Batten ML, et al. Pharmacological and rAAV Gene Therapy Rescue of Visual Functions in a Blind Mouse Model of Leber Congenital Amaurosis. PLoS Med 2005; 2:e333). 9-цис-ретиналь связывается с опсином, чтобы образовать пигмент палочковидной зрительной клетки, изо-родопсина, который инициирует фотопреобразование аналогично родопсину. Было показано, что пероральный прием 9-цис-ретиналя или его предшественников восстанавливал в глазах опсин в качестве изо-родопсина, улучшал функцию сетчатки, оцениваемую по ЭРГ-ответам, и улучшал зрачковый рефлекс на свет у мышей с нокаутом генов Rpe65 и Lrat, которые являются двумя генетическими моделями LCA. Существует необходимость в дальнейшей разработке синтетических 9-цис-ретиноидов в составах для перорального, желудочного, местного (например, в стекловидное тело) или внутривенного введения для лечения различных форм наследственной ретинальной дегенерации, вызванной нарушениями в ретиноидном цикле.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Описаны фармацевтические составы, содержащие искусственные ретиноиды в липидном наполнителе. Искусственные ретиноиды можно использовать для обхода критических блокад в ретиноидном цикле, таких как недостаток RPE65 или мутация, создавая посредством этого искусственный цис-ретиноидный хромофор, который может функционально объединяться с опсином. Также описанными являются и лекарственные формы фармацевтических составов, в том числе для однократного, прерывистого и ежедневного режимов дозирования.
Итак, один вариант осуществления предоставляет фармацевтический состав, содержащий липидный наполнитель и один или более 9-цис-ретинильных эфиров Формулы (I):
где R представляет собой алкильную группу или алкенильную группу; и липидный наполнитель содержит более чем 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
В конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9-цис-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель содержит соевое масло.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет лекарственную форму, пригодную для ежедневного дозирования 9-цис-ретинильного эфира нуждающемуся в этом субъекту, включающую примерно 1,25-20 мг/мл 9-цис-ретинилацетата в соевом масле, где лекарственная форма обеспечивает на площади поверхности тела субъекта примерно 1,25-20 мг/м2 9-цис-ретинилацетата в течение 24-часового периода.
Другой вариант осуществления предоставляет лекарственную форму, пригодную для однократного дозирования путем введения в стекловидное тело субъекта 9-цис-ретинилацетата, включающую около 18-40% мг/мл 9-цис-ретинилацетата в соевом масле.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ лечения врожденной слепоты Лебера у человека, включающий: введение фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в липидном наполнителе, содержащем более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
В конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловый эфир формулы (I), используемый в способе, представляет собой 9-цис-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель, используемый в способе, содержит соевое масло.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ, включающий введение человеку, испытывающему недостаточность в 11-цис-ретинале, фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в липидном наполнителе, содержащем более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
В конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловый эфир с Формулой (I), используемый в способе, представляет собой 9-цис-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель, используемый в способе, содержит соевое масло.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 (A-D) демонстрирует относительные поглощения 9-цис-ретинилацетата в соевом масле и удержание в плазме его активных метаболитов, включая 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот и 9-цис-ретинол.
Фигура 2 (A-C) демонстрирует дозозависимое увеличение амплитуд как а-волны, так и b-волны у мышей, подвергшихся лечению однократной дозой 9-цис-ретинилацетата в соевом масле.
Фигура 3 демонстрирует режим дозирования в течение 14-дневного периода, при котором регистрировали ЭРГ от одной вспышки и определяли ретиноидные уровни в глазах.
Фигура 4 (A-D) демонстрирует ЭРГ при дозозависимом увеличении амплитуд как а-волны, так и b-волны при лечении, по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей Rpe65 -/-.
Фигура 5 демонстрирует режим дозирования и оценку ЭРГ и ретиноидные анализы после трех суточных доз 9-цис-ретинилацетата в соевом масле.
Фигура 6 (A-F) демонстрирует дозозависимые амплитуды a- и b-волн ЭРГ-ответов, регистрируемых до 9 дня после трех суточных доз 9-цис-ретинилацетата в соевом масле.
Фигура 7 демонстрирует прерывистый режим дозирования и ежедневный режим дозирования в течение 8-недельного периода.
Фигура 8 (A-D) демонстрирует дозозависимое увеличение амплитуды a- и b-волн в день 28 и день 56 при прерывистом режиме дозирования и ежедневном режиме дозирования.
Фигура 9 (A-I) демонстрирует последовавшее за долгосрочным введением 9-цис-ретинилацетата дозозависимое защитное действие на сетчатку, оцененное по длинам внешних сегментов фоторецепторов.
Фигура 10 демонстрирует уровни ретиноидов в плазме, как определено при помощи ВЭЖХ, после введения 9-цис-ретинилацетата.
Фигура 11(A-D) демонстрирует ретиноиды в глазах и печени после 14-дневного ежедневно лечения 9-цис-ретинилацетатом.
Фигура 12 демонстрирует кинетику исчезновения 9-цис-ретиналя из глаза после 3 суточных доз 9-цис-ретинилацетата.
Фигура 13 (A-B) демонстрирует содержание ретиноидов в глазах мышей Rpe65-/- после прерывистого и ежедневного лечения 9-цис-R-Ас в течение 8 недель.
Фигура 14 (A-C) демонстрирует анализ ретиноидов в печени мышей Rpe65-/- после 56-дневного прерывистого и ежедневного лечения 9-цис-ретинилацетатом.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описаны фармацевтические составы 9-цис-ретиниловых эфиров, пригодных для ретиноидной заместительной терапии. Конкретнее, фармацевтические составы содержат один или более 9-цис-ретиниловых эфиров и липидный наполнитель.
Как используется в настоящем документе, «ретиноиды» относятся к классу химических соединений, природных или искусственных, родственных витамину А. Структурно ретиноиды обладают общей структурой ядра, состоящей из циклической концевой группы, конъюгированной полиеновой боковой цепи и полярной концевой группы. Ретиноиды естественного происхождения включают, например, витамин A (11-транс-ретинол), 11-транс-ретиналь и 11-транс-ретиноевую кислоту. Искусственные и синтетические ретиноиды, пригодные для ретиноидной заместительной терапии, включают, например, 9-цис-ретиниловые эфиры, как определено в настоящем документе, 9-цис-ретиналь и 9-цис-ретинол.
Как отмечалось в настоящем документе, 9-цис-ретиниловые эфиры могут выступать в качестве предшественников пролекарственной формы или пролекарства 9-цис-ретиналя, который способен функционально объединяться с опсинами, таким образом, завершая ретиноидный цикл, несмотря, например, на недостаток RPE65 или мутацию.
Таким образом, один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, включающий: один или более 9-цис-ретиниловых эфиров и липидный наполнитель, один или более 9-цис- ретиниловых эфиров, суспендированных в липидном наполнителе.
9-цис-ретиниловые эфиры
9-цис-ретиниловые эфиры относятся к следующей характерной структуре Формулы (I):
где R представляет собой алкильную группу или алкенильную группу.
«Алкил» относится к радикалу с неразветвленной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, не содержащему ненасыщенных углеводородов, содержащему до двадцати двух атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от двенадцати до семнадцати атомов углерода (также именуется как «С12-17-алкил»). В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от двенадцати до пятнадцати атомов углерода (также именуется как «С12-15-алкил»). В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до восьми атомов углерода (также именуется как «С1-8-алкил»). В других вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до шести атомов углерода (также именуется как «С1-6-алкил»). В дополнительных вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до четырех атомов углерода (также именуется как «С1-4-алкил»). Алкил присоединяется к остальной части молекулы при помощи простой связи, например метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил (изо-пропил), н-бутил, н-пентил, 1,1-диметилэтил (трет-бутил), 3-метилгексил, 2-метилгексил и тому подобное. Если в описании специально не указано иное, алкильная группа может быть необязательно заменена одной или несколькими из следующих заместителей: гало (в том числе -F, -Br, -Cl и -I), циано (-CN), нитро (-NO2), оксо (=O) и гидроксилом (-OH).
«Алкенил» относится к радикалу с неразветвленной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, содержащему, по крайней мере, один ненасыщенный углеводород (т.е., C=C), имеющий от двух до двадцати атомов углерода. В различных вариантах осуществления, R представляет С12-17-алкенил, С1-8-алкенил, С1-6-алкенил или С1-4-алкенил. Если в описании специально не указано иное, алкильная группа может быть необязательно замещена одной или несколькими из следующих замещающих групп: гало (в том числе -F, -Br, -Cl и -I), циано (-CN), нитро (-NO2), оксо (=O) и гидроксилом (-OH).
В некоторых вариантах осуществления, 9-цис-ретиниловые эфиры представляют собой искусственные ретиноиды, которые выступают в качестве предшественников (т.е., пре-лекарств) пролекарственной формы 9-цис-ретиналя. Конкретнее, 9-цис-ретиниловые эфиры могут преобразовываться печенью в метаболическую пролекарственную форму, а именно в 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот, которые хранятся в печени в печеночных липидных каплях. 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот и ретинол мобилизуются из печени и вводятся в кровообращение, где они перемещаются до глаза и RPE. Там они преобразуются в 9-цис-ретиналь, который, в конечном счете, соединяется с опсинами фоторецепторов, чтобы образовать активные зрительные пигменты.
Предпочтительным 9-цис-ретиниловым эфиром является 9-цис-ретинилацетат (т.е., R представляет собой метил). Также упоминаемый как «9-цис-R-Ac», 9-цис-ретинилацетат является фармацевтическим пре-лекарством, которое метаболизируется в печени до 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот, таких как 9-цис-ретинилпальмитат. 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот и ретинол затем преобразуются в 9-цис-ретиналь в глазе и RPE, в качестве замены недостающих хромофоров, таких как 11-цис-ретиналь.
9-цис-R-Ас можно подготовить путем первоначального преобразования полностью транс-ретинилацетата (Sigma-Aldrich) в смесь 9-цис-ретинилацетата и полностью транс-ретинилацетата в присутствии палладиевого катализатора (например, солей палладия, оксидов палладия). Смесь 9-цис-ретинилацетата и полностью транс-ретинилацетата затем гидролизуют для образования смеси 9-цис-ретинола и полностью транс-ретинола. Чистый 9-цис-ретинол можно выделить посредством селективной перекристаллизации и последующей этерификации, чтобы очистить 9-цис-R-Ac. Подробное описание процессов для подготовки и очистки 9-цис-R-Ac можно найти, например, в патенте Великобритании GB No. 1452012.
В других вариантах осуществления, ретиниловые эфиры являются пролекарствами (а не предшественниками пролекарств) и могут быть непосредственно преобразованы в 9-цис-ретиналь в глазу и RPE. Пролекарственные формы 9-цис-ретиниловых эфиров являются, как правило, 9-цис-ретиниловыми эфирами жирных кислот, в которых R представляет собой С11-12-алкил. В настоящем документе, «жирная кислота» относится к карбоновой кислоте, имеющей длинную алифатическую цепь, которая может являться насыщенной (алкиловой) или ненасыщенной (алкениленовой). Как правило, алифатическая цепь содержит, по крайней мере, 11 углеродов и может достигать 21 углерода в длину. Типичные жирные кислоты включают, в качестве неограничивающих примеров, лауриновую кислоту, пальмитиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту.
Таким образом, в одном варианте осуществления, R представляет собой C15-алкил, и 9-цис-ретиниловый сложный эфир Формулы (I) представляет собой 9-цис-ретинилпальмитат.
В дополнительном варианте осуществления, R представляет собой C17-алкил, и 9-цис-ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9-цис-ретинилстеарат.
В другом варианте осуществления, R представляет собой C17-алкенил, и 9-цис-ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9-цис-ретинилолеат.
9-цис-ретиниловые эфиры, описанные в настоящем документе, могут быть получены из 9-цис-ретинола, используя соответствующие этерифицирующие агенты, способом, сходным со способом получения 9-цис-R-Ас, которые находятся в компетенции специалистов в данной области.
Как показано в настоящем документе, низкие дозы (1 и 4 мг/кг) типичного пре-лекарства, 9-цис-R-Ac, как было обнаружено, являются клинически безопасными и эффективными в поддержании зрительной функции у мышей Rpe65 -/-, оцененной по ЭРГ-регистрациям, уровням ретиноидов в глазах, гистологии сетчатки и зависимым от зрения поведенческим исследованиям. Это соединение используется для лечения, например, людей с ретинопатиями, связанными с недостаточным образованием ретиноидного хромофора.
Липидные наполнители
Как правило, 9-цис-ретиниловые эфиры представляют собой маслянистые вещества и являются липофильными. Таким образом, описанный фармацевтический состав может дополнительно включать липидный наполнитель.
Поскольку 9-цис-ретиниловые эфиры чувствительны к свету и кислороду, их стабильность имеет решающее значение для эффективности и срока годности состава. В связи с этим подходящий липидный наполнитель выбирают по его способности стабилизировать 9-цис-ретиниловые эфиры, суспендированные или солюбилизированные в нем.
Как используется в настоящем документе, «липид» или «липидный наполнитель» относится к одному из или смеси сложных эфиров жирных кислот. В различных вариантах осуществления, липидный наполнитель состоит из одного или более триглицеридов, которые образуются, когда глицерин этерифицируется тремя жирными кислотами. Триглицериды включают как растительные масла, так и животные жиры.
В контексте описания липидных наполнителей, триглицериды часто называют просто по их соответствующим жирным кислотам. Жирные кислоты триглицеридов могут быть насыщенными, мононенасыщенными и полиненасыщенными, в зависимости от числа углерод-углеродных двойных связей (C=C) в алифатических цепях. Насыщенная жирная кислота не содержит углерод-углеродных двойных связей в алифатических цепях. Примеры насыщенных жирных кислот включают, например, пальмитиновую и стеариновую кислоты. Мононенасыщенная жирная кислота содержит только одну углерод-углеродную двойную связь (C=C) в алифатической цепи. К примерам мононенасыщенных жирных кислот относятся, например, олеиновая и пальмитолеиновая кислоты. Полиненасыщенная жирная кислота содержит, по крайней мере, две углерод-углеродные двойные связи в алифатической цепи. Примеры полиненасыщенных жирных кислот включают, например, линолевую кислоту (два C=C) и линоленовую кислоту (три C=C). Далее, полиненасыщенные жирные кислоты включают жирные кислоты Омега-3 и жирные кислоты Омега-6, в зависимости от расположения конечной C=C-связи в алифатической цепи. Например, линолевая является жирной кислотой Омега-6, тогда как линоленовая является жирной кислотой Омега-3.
Как правило, липидный наполнитель представляет собой смесь жирных кислот, относительные содержания каждой из которых может влиять на общие характеристики липидного наполнителя, особенно на его способность препятствовать окислению и стабилизировать суспендируемый в нем 9-цис-ретиниловый эфир.
В некоторых вариантах осуществления, липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирные кислоты Омега-6 и жирные кислоты Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15. В конкретных вариантах осуществления, липидный наполнитель содержит триглицерид-линолеат и триглицерид-линоленат в соотношении (по массе) меньше чем 15, которые в совокупности составляют более чем 50% от общей массы липидного наполнителя.
В других вариантах осуществления, липидный наполнитель может представлять собой растительное масло или смесь масел, которая содержит более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирные кислоты Омега-6 и жирных кислоты Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
Таблица 1 показывает ряд растительных масел и их компонентов жирных кислот в массовых процентах (см., например, патентную публикацию США No. 2007071872).
Соевое масло является подходящим липидным наполнителем, поскольку оно содержит около 62% полиненасыщенной жирной кислоты (54% линолевой и 8% линоленовой), 25% мононенасыщенной жирной кислоты (олеиновой) и 16% насыщенной жирной кислоты (11% пальмитиновой кислоты и 5% стеариновая кислота).
Соевое масло является прозрачным маслом без запаха, которое смешивается с 9-цис-ретиниловыми эфирами, описанными в настоящем документе. По сравнению с жирными кислотами, содержащими меньшую концентрацию полиненасыщенных жирных кислот (например, рапсовое масло и оливковое масло, которые содержат примерно 30% и менее 20% полиненасыщенных жирных кислот, соответственно), соевое масло неожиданно демонстрирует улучшенный стабилизирующий эффект, о чем свидетельствует увеличенное содержание чистого 9-цис-ретинилацетата, сохранившегося в составах по прошествии двухнедельного периода.
Кроме того, при сравнении с жирными кислотами, которые имеют более высокое соотношение полиненасыщенных жирных кислот Омега-6 к Омега-3, соевое масло также демонстрирует превосходный стабилизирующий эффект. Например, подсолнечное масло, несмотря на общее количество полиненасыщенных жирных кислот (61%), сопоставимое с таковым для соевого масла, имеет гораздо более высокое соотношение полиненасыщенных жирных кислот Омега-6 к Омега-3 (более 600), чем соевое масло (около 7). Как показано в Таблице 2 (Пример 1), стабилизирующий эффект подсолнечного масла сопоставим с таковым для рапсового масла, для обоих намного ниже, чем для соевого масла (класса USP).
Существенно и то, что составы соевого масла являются наиболее стабильными по сравнению с составами других наполнителей при температурах, близких к физиологическим условиям (например, 40°C). Высоко рафинированное соевое масло, которое соответствует монограмме USP, является предпочтительным (например, как предусмотрено Ассортиментом химических веществ), поскольку отмечалось, что соевое масло класса USP обеспечивает более высокую стабилизацию, чем коммерческий сорт соевого масла (см. Пример 1).
Кроме того, наполнитель на основе соевого масла предоставляет самый высокий уровень в плазме метаболитов 9-цис-ретиниловых эфиров. Фигура 1 показывает относительное поглощение 9-цис-R-Ас и сохранение в плазме его активных метаболитов, 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот и 9-цис-ретинола.
Таким образом, показано, что соевое масло придает одновременно и стабильность 9-цис-ретиниловых эфиров, и высокое сохранение в плазме активных метаболитов этого, тем самым обеспечивая составам синергетические преимущества.
В дополнительном варианте осуществления, липидным наполнителем является масло грецкого ореха, которое содержит 72% полиненасыщенных жирных кислот (62% линолевой и 12% линоленовой).
И еще в одном варианте осуществления, липидным наполнителем является масло зародышей пшеницы, которое содержит 62% полиненасыщенных жирных кислот (55% линолевой и 7% линоленовой).
Составы:
В большинстве случаев, фармацевтические составы могут включать любой из 9-цис-ретиниловых сложных эфиров, описанных в настоящем документе, в сочетании с подходящим липидным наполнителем.
Один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий один или более 9-цис-ретиниловых эфиров в липидном наполнителе, где липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9-цис-ретинилацетат в липидном наполнителе, где липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9-цис-ретинилацетат в липидном наполнителе, где липидный наполнитель содержит триглицерид-линолеат и триглицерид-линоленат в соотношении (по массе) меньше чем 15, что в совокупности составляет более чем 50% от общей массы липидного наполнителя.
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9-цис-ретинилацетат в соевом масле.
Еще один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9-цис-ретинилацетат в масле грецкого ореха.
Еще один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9-цис-ретинилацетат в масле зародышей пшеницы.
В различных вариантах осуществления, фармацевтический состав содержит до 40% (по массе) 9-цис-ретиниловых эфиров, до 30% (по массе) 9-цис-ретиниловых эфиров, до 25% (по массе) 9-цис-ретиниловых эфиров, до 10% (по массе) 9-цис-ретиниловых эфиров, до 5% (по массе) 9-цис-ретиниловых эфиров.
Необязательные компоненты:
Фармацевтические составы, описанные в настоящем документе, могут необязательно включать дополнительные компоненты, которые повышают стабильность и вкусовые качества. Например, для придания дополнительного стабилизирующего эффекта может быть включен один или несколько стабилизаторов (например, антиоксидантов). Далее, для улучшения вкуса в составы для перорального введения могут быть добавлены вкусовые добавки.
Антиоксидант, используемый в настоящем раскрытии, может представлять собой один или несколько из следующих: α-токоферола, бутилированного гидроксианизола (БГА), бутилированного гидрокситолуола (БГТ), аскорбилпальмитата и пропилгаллата, трет-бутилгидрохинона (TBHQ). Можно использовать комплексообразующие агенты, такие как динатрийэдетат и кальцийдинатрийэдетат.
Ароматизирующие вещества и интенсификаторы вкусоароматических свойств делают фармацевтические составы более приятными на вкус для пациента. К общеизвестным ароматизирующим веществам и интенсификаторам вкусоароматических свойств фармацевтической продукции, которые могут быть включены в композицию по настоящему изобретению, относятся мальтол, ванилин, этилванилин, ментол, лимонная кислота, фумаровая кислота, этилмальтол и винная кислота. Предпочтительны ароматизированные масла (например, лимонное масло), поскольку они смешиваемы с липидным наполнителем. Подслащивающие вещества, такие как сорбитол, сахарин, натрийсахарин, сахароза, аспартам, фруктоза, маннитол и инвертный сахар, можно добавлять для улучшения вкуса.
Воду, сурфактанты или эмульгаторы можно добавлять к составам на масляной основе для образования смеси, пригодной для перорального применения (например, в виде напитка) или внутривенной инъекции. Подходящие сурфактанты и эмульгаторы включают, например, соевый лецитин и дипальмитоилфосфатидилхолин. Напитки, такие как соевое молоко, также можно добавлять непосредственно к составам, описанным в настоящем документе.
Таким образом, один вариант осуществления предоставляет напиток, содержащий один или более 9-цис-ретиниловых эфиров и липидный наполнитель, где липидный наполнитель содержит более чем 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет рецепт напитка, эмульсию или напиток, содержащего 9-цис-ретинилацетат, соевое масло и питьевую жидкую среду. В определенных вариантах осуществления, питьевая жидкая среда бывает в виде эмульсии типа «масло в воде» (например, молоко или соевое молоко). Также могут использоваться дополнительные эмульгаторы, как, например, акация, трагакантовая камедь и метилцеллюлоза.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет состав для перорального применения в виде капсул, содержащих 9-цис-ретинилацетат, соевое масло. Могут быть включены дополнительные наполнители, такие как антиоксиданты, как определяется специалистом в рассматриваемой области.
Составы для введения и лекарственные формы
Фармацевтический состав, описанный в настоящем документе, можно вводить субъекту путем перорального, желудочного или местного введения, такого как инъекция в стекловидное тело и внутривенная инъекция.
Пероральное введение может осуществляться перорально при помощи зонда или с помощью питьевого состава или напитка, который включает один или более 9-цис-ретиниловых эфиров, липидного наполнителя и напитка, такого как соевое молоко.
Желудочное введение может осуществляться с помощью желудочного зонда (например, желудочной трубки).
Местное введение, такое как инъекция в стекловидное тело и внутривенная инъекция, осуществляют при помощи шприцев.
Как используется в настоящем документе, «субъект» относится к пациенту, который может относиться к любым видам млекопитающих, например приматов, в частности людей; грызунов, в том числе мышей, крыс и хомяков; кроликов; животных семейства лошадиных; крупного рогатого скота; собак; кошачьих и др. Животные модели, в частности генетически модифицированные животные, представляют интерес для экспериментальных исследований, предоставляя модели для лечения заболеваний человека, например LCA.
Как правило, все дозы 9-цис-R-Ac полностью смешиваются в липидных наполнителях, включая соевое масло, USP (Spectrum Chemicals). В различных вариантах осуществления описаны однократное, прерывистое и ежедневное введения. Далее, основываясь на уровнях фармакологически активных метаболитов 9-цис-ретиниловых эфиров в плазме после поглощения, дозировку и соответствующую эффективность 9-цис-ретиниловых эфиров можно оценить с помощью ЭРГ, остроты зрения, тестирование при стимулах полного возбуждения, анализа поля зрения, тестирования цветового зрения.
Как показано в Примерах, дозозависимое повышение как уровня, так и длительности ретинальной функции наблюдалось у мышей с нокаутом Rpe65 и Lrat, которые являются двумя генетическими моделями LCA. Важно, фармакологическая активность поддерживалась в течение достаточно длительного периода времени после дозирования, чтобы дать возможность составлять гибкую, прерывистую схему дозирования.
Конкретнее, однократные дозы 9-цис-R-Ac (6,25 -50 мг/кг) приводили к значительному дозозависимому улучшению ЭРГ-ответов. Суточные дозы (1, 4 и по 12,5 мг/кг) в течение двух недель хорошо переносились и индуцировали замечательное улучшение ретинальной функции. Значительные дозозависимые улучшения ЭРГ-ответов наблюдались 6 дней после введения 9-цис-R-Ac ежедневно в течение 3 дней по 1, 4 и по 12,5 мг/кг. Мыши, получавшие ежедневно или периодически лечение 9-цис-R-Ac с 1 и 4 мг/кг/день и оцененные через два месяца, демонстрировали дозозависимое улучшение ретинальной функции и морфологии 8 неделями позже, тогда как у сравниваемых 3-месячных контрольных животных ретинальная функция ухудшилась.
Таким образом, в одном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, представлена лекарственная форма, пригодная для 24 часового или ежедневного дозирования 9-цис-R-Ac нуждающемуся в этом субъекту, содержащая примерно 1,25-20 мг/мл 9-цис-R-Ac в соевом масле, где лекарственная форма обеспечивает примерно 1,25-40 мг/м2 9-цис-R-Ac на площади поверхности тела субъекта в течение 24-часового периода.
В другом варианте осуществления, лекарственная форма обеспечивает время до максимума или пика концентрации в плазме 9-цис-ретиниловых эфиров около 3-6 ч после перорального или желудочного введения лекарственного состава. Как используется в настоящем документе, «пиковая концентрация в плазме крови» является фармакокинетической мерой для оценки биодоступности лекарственного продукта. Плазменная концентрация лекарственного препарата увеличивается с ростом степени поглощения; пик достигается, когда скорость элиминации лекарственного препарата становится равной скорости поглощения. В дополнение к максимальной (пиковой) концентрации лекарственного препарата в плазме, параметрами фармакокинетики также являются соответствующее время пика (когда имеет место максимальная концентрация лекарственного препарата в плазме) и площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени.
В дополнительном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, представлен лекарственный состав, пригодный для однократного дозирования введением в стекловидное тело 9-цис-ретинилацетата субъекту, содержащий около 18-40% мг/мл 9-цис-ретинилацетата в соевом масле. Было установлено, что однократная дозировка введением в стекловидное тело глаза субъекта может продолжаться в течение нескольких дней, даже недель, возможно, при помощи способа замедленного высвобождения.
Применение 9-цис-ретиниловых эфиров в качестве ретиноидной заместительной терапии
Также описанными в настоящем документе являются способы применения 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в качестве ретиноидной заместительной терапии дегенерации сетчатки у людей.
Оценку эффективности и безопасности 9-цис-ретиниловых эфиров, в качестве ретиноидной заместительной терапии, проводили с использованием соответствующих животных моделей (см. Примеры). Используемые животные модели представляют собой мышей Rpe65 -/-, у которых отсутствует ретинальный пигментный эпителий-специфический белок массой 65 кДа (RPE65) и развивается ретинопатия и слепота, напоминающие LCA у людей.
Фармакокинетические и фармакодинамические эффекты пре-лекарства показывают, что в модели на мышах Rpe65 -/- пре-лекарство в печени преобразуется в пролекарство, т.е., в основном, в 9-цис-ретинилпальмитат (см. Примеры). Далее, в модели на мышах Rpe65 -/- наблюдали, что 9-цис-ретиноиды доставлялись к сетчатке двумя путями, то есть, прежде всего, быстро из циркулирующей крови и, во-вторых, более медленно, из запасов 9-цис-ретиноидов в печени (см., например, 5).
С использованием нескольких различных режимов у мышей Rpe65 -/- для оценки эффективности действия препарата и безопасности, было показано, что 9-цис-ретиниловые эфиры можно применять в качестве синтетических ретиноидов для лечения LCA-пациентов человека. Наблюдалось как дозозависимое, так и зависящее от периода введения сохранение зрительной функции, даже при самых низких испытанных дозах 1 и 4 мг/кг (Фигура 2, 4, 6, 8). Существенно, дозозависимое продление эффективности наблюдалась для пре-лекарства 9-цис-R-Ac.
Таким образом, один вариант осуществления предоставляет способ лечения врожденной слепоты Лебера у субъекта-человека, включающий введение фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в соевом масле. В более конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловые эфиры с Формулой (I) представляют собой 9-цис-ретинилацетат.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ, включающий: введение субъекту-человеку с недостатком 11-цис-ретиналя фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в соевом масле. В более конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловые эфиры с Формулой (I) представляют собой 9-цис-ретинилацетат.
Различные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, дополнительно иллюстрируются следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Материалы, методология и анализ
Электроретинограмма (ЭРГ) - ЭРГ регистрировали для наркотизированных мышей, как описано, например, в Maeda A, et al. Role of photoreceptor- specific retinol dehydrogenase in the retinoid cycle in vivo. J Biol Chem 2005; 280:18822-18832; и Maeda T, et al. A Critical Role of CaBP4 in the Cone Synapse. Investigative ophthalmology & visual science 2005; 46:4320-4327.
Вкратце, мышей сначала адаптировали к темноте в течение ночи перед регистрацией. Затем при безопасном свете мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 20 мкг/г массы тела 6 мг/мл кетамина и 0,44 мг/мл ксилазина, разбавленного раствором 10 мМ фосфата натрия, рН 7,2, содержащего 100 мМ NaCl. Зрачки расширяли 1%-ным тропикамидом. Контактную линзу-электрод помещали на глаз и контрольный электрод и электрод заземления располагали соответственно на ухе и хвосте. ЭРГ регистрировали с использованием универсальной тестирующей и электрофизиологической системы (UTAS) E-3000 (LKC Technologies, Inc.).
Регистрация после однократной вспышки - Стимулирующие вспышки белого света применялись в диапазоне интенсивностей (от -3,7 до 2,8 log cd·s·m2), и длительность вспышек корректировали в соответствии с интенсивностью (от 20 мкс до 1 мс). Было сделано от двух до пяти регистраций с достаточными интервалами между стимулирующими вспышками (от 10 с до 10 мин), чтобы дать возможность мышам восстановиться. Как правило, для регистрации каждой точки было использовано от четырех до восьми животных. Односторонний тест ANOVA использовали для статистического анализа ответов.
Гистология и иммуногистохимия - Гистологические процедуры использовали для анализа глаз, как описано в Maeda A, et al. выше.
Анализ ретиноевой кислоты и неполярных ретиноидов - Все экспериментальные процедуры, связанные с экстракцией, получением ретиноидных производных и разделением ретиноидов, проводились под тусклым красным светом, обеспечиваемым светозащитным фильтром 1 от Kodak (коэффициент пропускания >560 нм). Экстракцию ретиноевой кислоты из печени проводили, как ранее описано, например, в Batten ML. et al. выше. Анализ полярных ретиноидов в плазме крови, глазе и печени проводили с использованием ВЭЖХ Agilent 1100 и двух тандемных колонок с нормальными фазами: Varian Microsorb Silica 3 мкм, 4,6×100 мм (Varian, Пало Альто, Калифорния) и колонки Ultrasphere-Si, 5 мкм, 4,6×250 мм (Aleman TS et al., выше). Изократическая система нормальной фазы гексан:2-пропанол:ледяная уксусная кислота (1000:4,3:0,675; об./об./об.) была использована для элюции при скорости потока 1 мл/мин при 20°C с детектированием при 355 нм. Калибровку проводили со стандартами полностью транс-ретиноевой кислоты и 9-цис-ретиноевой кислоты, приобретенными у Sigma-Aldrich. Анализ неполярных ретиноидов в плазме крови, глазу и печени проводили при помощи ВЭЖХ с нормальными фазами (Ultrasphere-Si, 5 мкм, 4,6×250 мм, Beckman, Фуллертон, Калифорния) с 10% этилацетата и 90% гексана при скорости потока 1,4 мл/мин, с детектированием при 325 нм путем ВЭЖХ HP1100 с диодно-матричным детектором и программным обеспечением HP Chemstation A.03.03.
ПРИМЕР 1
ТЕСТЫ НА СТАБИЛЬНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ СОСТАВОВ
Несколько различных составов на основе липидов 9-цис-R-Ac были подготовлены для проверки стабильности, предоставляемой различными липидными наполнителями. Поскольку 9-цис-R-Ac рассматривался как чувствительный к свету, флаконы янтарного стекла использовались всегда, когда это было возможно, и с соединением обращались при золотистом свете флуоресцентной лампы. 9-цис-R-Ac переместили из морозильника на -20°C и подогрели до комнатной температуре в течение 30 минут. Обращение с соединением выполняли в потоке газа аргона, поскольку соединение перемещали в предварительно взвешенный флакон янтарного стекла, и повторно взвешивали для расчета количества соединения, до того как флаконы заполнили аргоном и поместили на хранение при -20°C до использования.
Смеси 9-цис-R-Ас (от 1,4 до 8 мг/мл) в различных носителях/наполнителях были подготовлены с использованием флаконов янтарного стекла, содержащих точно взвешенное соединение. Флаконы с образцами заполняли аргоном и смешивали путем интенсивного встряхивания. Образцы касторового масла с полиоксилом 35 нагревали до 60°С. Каждый образец разделяли на две части и хранили при 4°С или 40°С. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на содержание 9-цис-ретинилацетата сразу после получения (день 0) и в моменты времени до 2 недель после получения.
Образцы для ВЭЖХ-анализа разводили приблизительно до 0,1 мг/мл в тетрагидрофуране. Пробы сразу же анализировали или хранили при -20°С или - 70°С до 1 недели перед анализом. Процент извлечения рассчитывали относительно концентрации в составе в день 0, определенной путем ВЭЖХ.
Неожиданно, соевое масло (USP), с присутствием и без присутствия БГЕ, обеспечивает наиболее стабильную суспензию для 9-цис-R-Ac, особенно при физиологической температуре (около 40°С), как показано процентным содержанием 9-цис-R-Ac в составе в день 7 и день 14 (Таблица 2).
ПРИМЕР 2
СОХРАНЕНИЕ В ПЛАЗМЕ МЕТАБОЛИТОВ 9-ЦИС-РЕТИНИЛАЦЕТАТА
Было подготовлено несколько различных препаратов на основе масла для определения уровней поглощения 9-цис-R-Ас в плазме. Конкретнее, однократную дозу 50 мг/кг 9-цис-ретинилацетата (50 мг/кг), суспендированную в 4 различных наполнительных маслах, вводили при помощи желудочного зонда 5-недельным мышам C57/BI6 и после этого определяли ретиноидный уровень в плазме (n=5 в каждой временной точки на группу).
Раствор 9-цис-R-Ac в соевом или подсолнечном масле, по сравнению с маслом канолы и рапсовым маслом, обеспечивал лучшее поглощение 9-цис-R-Ac, о чем свидетельствуют самые высокие уровни 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот и 9-цис-ретинола в плазме, обоих активных метаболитов 9-цис-R-Ас (Фигура 1A, C, 11). Наивысшие уровни в плазме этих 9-цис-ретиноидов были отмечены примерно в 3 ч. Плазменные уровни полностью транс-ретинола и полностью транс-ретиноловых эфиров жирных кислот существенно не отличаются, как среди тестируемых наполнителей, так и во время 23-часового периода тестирования, что позволяет предположить, что цис-ретиноиды не были преобразованы в полностью транс-ретиноиды (Фигура 1, B, D).
Фигура 10 показывает ретиноиды в плазме, как определено при помощи ВЭЖХ. Ретиниловые эфиры жирных кислот, детектированные ранее в фазе элюции (a, b, c), состояли из четырех пиков 9-цис- (a, c) и двух пиков полностью транс- (b) изомеров. Как 9-цис-ретинол (d), так и полностью транс-ретинол (e) элюировались позднее.
ПРИМЕР 3
ЭФФЕКТЫ ОДНОКРАТНЫХ ДОЗ 9-ЦИС-R-AC НА РЕТИНОВУЮ ФУНКЦИЮ МЫШЕЙ Rpe65 -/-
Однократные дозы (2-50 мг/кг) 9-цис-R-Ас в соевом масле вводили 5-недельным мышам Rpe65Rpe65 -/- для проверки того, было ли способно пре-пролекарство 9-цис-R-Ac доставлять искусственный хромофор к глазу.
Мыши не продемонстрировали никаких явных клинических побочных эффектов, даже после получения наивысшей дозы 50 мг/кг. После адаптации к темноте в течение 3 дней и зондового введения регистрировали скотопические ЭРГ от одиночных вспышек, и глаза собирали для оценки уровней 9-цис-ретиналя.
Скотопические ЭРГ подвергнутых лечению мышей показали дозозависимое увеличение амплитуд как а-, так и b-волн (Фигура 2А, Б); наименьшая испытанная доза, которая обеспечивала значительное улучшение после высокоинтенсивного стимулирования, составляла 6,25 мг/кг. Аналогичным образом, дозозависимое накопление 9-цис-ретиниля было обнаружено в глазах прошедших лечение мышей, что коррелировало с улучшением ретиновой функции (Фигура 2С). Ни в одном из исследованных глаз не было обнаружено никаких 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот, тогда как уровни полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот находились в диапазоне от примерно 1 до 1,6 нмоль/глаз и существенно не отличаются между четырьмя группами лечения. Кроме того, уровни полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот были сходны с 1,2 нмоль/глаз, сообщенным для не прошедших лечение 5-недельных мышей Rpe65 -/-.
9-цис-ретинол (43 пмоль/глаз) был обнаружен только в глазах мышей, дозированных с 50 мг/кг, в то время как уровни полностью транс-ретинола, варьирующие от 14 до 22 пмоль/глаз, существенно не отличались между четырьмя группами лечения. Ни в одном из глаз 11-цис-ретиноиды обнаружены не были.
Таким образом, полученные результаты указывают на то, что 9-цис-ретиналь рекомбинирует с опсином с образованием изо-родопсина. Главное, уменьшенные дозы 9-цис-R-Ac (2 и 4 мг/кг) вызывали положительные ЭРГ-эффекты, несмотря на то, что только следовые уровни 9-цис-ретиналя детектировались в глазу (Фигура 2).
ПРИМЕР 4
ЭФФЕКТЫ 9-цис-R-AC, ВВОДИМОГО ЕЖЕДНЕВНО В ТЕЧЕНИЕ 14 ДНЕЙ
Ретиновую функцию мышей Rpe65 -/- и C57BI/6 тестировали после неоднократного ежедневного дозирования 9-цис-R-Ac. Чтобы проверить это непосредственно, 5-недельным мышам Rpe65 -/- ежедневно через зонд вводили 9-цис-R-Ac в соевом масле в дозах 1, 4 или 12,5 мг/кг в течение 14 дней. Мыши подвергались воздействию внешних условий с переменой темноты и флуоресцентного света (диапазон яркости 500-1500 люксов) во время последних 11 дней лечения. Скотопические ЭРГ от однократных вспышек регистрировали и определяли ретиноидные уровни в глазах (Фигура 3).
ЭРГ показали дозозависимое увеличение амплитуд a- и b-волн у прошедших лечение мышей по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей Rpe65 -/- (Фигура 4A, B). Даже самая низкая ежедневная проверяемая доза 1 мг/кг вызывала значительные улучшения ретиновой функции по сравнению с контрольной группой.
9-цис-ретиналь легко детектировался в глазах животных с нокаутом генов, но ни 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот, ни 9-цис-ретинол не присутствовали (Фигура 11A-C). При этом 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот накапливались дозозависимым образом в печени как мышей C57BI/6, так и мышей Rpe65 -/- (Фигура 11D). Присутствие 9-цис-ретиналя в глазах этих мышей предполагает улучшение ретиновой функции, как наблюдалось в исследованиях с однократными дозами на мышах Rpe65 -/-. В глазах прошедших лечение мышей также было соответствующее дозозависимое накопление 9-цис-ретиналя (Фигура 4C). В глазах контрольной группы и группы, прошедшей лечение 1 мг/кг, 9-цис-ретиналь не был обнаружен, в то время как в группах с ежедневными дозами 4 и 12,5 мг/кг было определено соответственно 38±4 и 95±14 пмоль. Уровни 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот были низкими (1 пмоль/глаз) в группах с ежедневными 4 и 12,5 мг/кг и не обнаруживалось в глазах из других групп (Фигура 4D). Ни в какой группе не были обнаружены ни полностью транс-ретинол, ни 9-цис-ретинол. Уровни полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот (в основном, пальмитата, стеарата и олеата) в глаза мышей, подвергшихся воздействию 9-цис-R-Ac, находились в диапазоне от 1,2 до 1,4 нмоль/глаз и не значительно отличались от таковых в глазах контролей (1,2 нмоль/глаз в 5-недельном возрасте).
ЭРГ-ответы свидетельствуют об увеличении эффективности и улучшении кинетики 9-цис-R-Ас дозозависимым образом. Самая низкая доза (1 мг/кг) значительно улучшала ЭРГ-ответы по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей Rpe65 -/-, несмотря на то, что 9-цис-ретиналь и 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот не были обнаружены в глазе (Фигура 4). Это говорит о том, что 9-цис-ретиналь исчезает при выдержке на свету (8 ч света/16 ч темноты) и что 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот вместо этого используются для регенерации изо-родопсина. Действительно, накопление 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот обнаруживалось дозозависимым образом в образцах печени, что дает основание предполагать, что запас 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот в печени может служить в качестве источника для образования 9-цис-ретиналя и изо-родопсина в глазу.
В этом 14-суточном исследовании каждая из суточных дозировок 1, 4, 12,5-50 мг/кг хорошо переносилась как 5-недельными мышами C57BI/6, так и 5-недельными мышами Rpe65 -/-, что свидетельствует о безопасности 9-цис-R-Ac.
ПРИМЕР 5
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ УЛУЧШЕННОЙ РЕТИНОВОЙ ФУНКЦИИ ПОСЛЕ 3 СУТОЧНЫХ ДОЗ 9-цис-R-AC
9-цис-ретинол в виде 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот накапливался в печени мышей Rpe65 -/-, получавших повторные дозы 9-цис-R-Ас по крайней мере 12,5 мг/кг в течение 2 недель (см. Фигуру 11D, Пример 4).
Для оценки способности мышей сохранять 9-цис-ретиноиды и впоследствии использовать их в ретиноидном цикле, 9-цис-R-Ac в соевом масле вводили через зонд один раз в день в течение трех дней подряд в дозе 1, 4 или 12,5 мг/кг/день в 5-недельных мышей Rpe65 -/-, содержавшихся в темноте. Мышей затем подвергали воздействию циклов по 8 ч флуоресцентной лампы с яркостным диапазоном 500-1500 люкс, с последующими 16 ч в темноте.
ЭРГ и ретиноидный анализ проводились в конце первого (день 4), второго (день 5), четвертого (день 7) и шестого (день 9) дня выдержки на свету (Фигура 5). Амплитуды как a-, так и b-волн ЭРГ-ответов, зарегистрированных до дня 9 (Фигура 6A-F), были дозозависимыми в каждой временной точке и снижались с числом выдержек на свету. Самая высокая проверенная доза (12,5 мг/кг/день) существенно улучшала как a-, так и b-волну до дня 9 (Фигура 6A-B) при высокой интенсивности стимулов, в то время как дозы 4 мг/кг и 1 мг/кг показали увеличение амплитуд а-волны до дня 9 и дня 7 соответственно и амплитуд b-волны до дня 9 (Фигура 6C-F). Уровни 9-цис-ретиналя в глазу также являлись дозозависимыми и уменьшилась с течением времени (Фигура 12). Это соединение было обнаружено в сетчатке всех прошедших лечение мышей в день 4 (Фигура 12), но только в сетчатке мышей, подвергшихся действию 4 и 12,5 мг/кг, в день 5 и только в группе 12,5 мг/кг на 7 день. В день 9 в сетчатках прошедших лечение или контрольных мышей 9-цис-ретиналь не был обнаружен. Таким образом, не было необходимости в ежедневном введении 9-цис-R-Ac, чтобы доставлять 9-цис-R-Ac к глазу и поддерживать улучшение ретиновой функции у мышей Rpe65 -/-.
Таким образом, показано, что ЭРГ-амплитуды улучшались, в основном, дозозависимым образом, и этот положительный эффект сохранялся в течение 4-6 дней после лечения. Кроме того, аналогичная картина была отмечена для уровней 9-цис-ретиналя, обнаруженного в глазах этих животных. Главное, улучшение ЭРГ-ответов при дозовом уровне 4 мг/кг продолжалось в течение 4-6 дней после прекращения лечения, когда 9-цис-ретиналь больше нельзя было обнаружить в глазах. Эти результаты показывают, что положительные эффекты от 9-цис-R-Ac терапии сохраняются на следовых уровнях 9-цис-ретиналя в сетчатке, что стабилизирует ROS, тогда как ЭРГ-ответы в контрольных группах ухудшились. Кинетику ретиноидных уровней в глазах затем проверяли во время адаптации к темноте после выдержки на свету. Важно, что восстановление 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот и 9-цис-ретиналя в глазах происходило во время адаптации к темноте.
ПРИМЕР 6
РЕТИНОВАЯ ФУНКЦИЯ У МЫШЕЙ Rpe65 -/- ПОСЛЕ ПРЕРЫВИСТОГО И ЕЖЕДНЕВНОГО ВВЕДЕНИЯ 9-цис-R-Ас В ТЕЧЕНИЕ 8 НЕДЕЛЬ
Из-за того что 3 низкие суточные дозы 9-цис-R-Ac улучшали ЭРГ-ответы после 6 дней выдержки на свету (Фигура 6A-F), был проведен длительный 8-недельный прерывистый режим дозирования.
Мыши Rpe65 -/- были разделены на две группы (прерывистая группа и ежедневная группа), каждая из которых подвергалась лечению в общей сложности 8 недель с 1 или 4 мг/кг 9-цис-R-Ac. Прерывистую группу дозировали ежедневно в течение 3 дней, с последующим 4-дневным перерывом в приеме лекарственного препарата, в течение каждой недели 8-недельного режима. Ежедневную группу дозировали ежедневно в течение всего 8-недельного периода. Режимы дозирования проиллюстрированы на Фигуре 7. Мышей подвергали воздействию ежедневного цикла - 8 ч флуоресцентного света с диапазоном яркости 500-1500 люкс, с последующими 16 ч в темноте. ЭРГ регистрировали в день 28 и еще раз в день 56, после чего ткани собирали для ретиноидного анализа глаза и печени и гистологии глаза.
ЭРГ-ответы прошедших лечение мышей в прерывистой группе и ежедневной группы были значительно лучше, чем таковые контролей, как в день 28, так и в день 56, и умеренное снижение амплитуды между днем 28 и днем 56 отмечалось как у мышей, прошедших лечение 9-цис-R-Ac, так и у контрольных мышей. Как режим прерывистого дозирования, так и режим ежедневного дозирования вызывал дозозависимое увеличение амплитуды a- и b-волн в дни 28 и 56 (Фигура 8A-D). Ответы были более выраженными в группе ежедневного дозирования, чем в группе прерывистого дозирования. Пониженная доза (1 мг/кг) была достаточна, чтобы вызвать значительное улучшение ЭРГ-ответов в контрольной группе при высокой интенсивности стимулов, независимо от графика лечения. Кроме того, амплитуды a- и b-волн были сходными в день 28 и день 56, что дало основание предполагать, что может быть достигнуто равновесие между приемом и хранением 9-цис-ретинола, с одной стороны, и его мобилизацией в сетчатке для поддержания ретиноидного цикла, с другой. В согласии с этими результатами ЭРГ, 9-цис-ретиналь детектировался дозозависимым образом в глазах, где уровни были выше у мышей, дозированных ежедневно (Фигура 13А). 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот на низких изменчивых уровнях также были обнаружены в глазах обеих групп прошедших лечение животных (Фигура 13B). Дозозависимое небольшое увеличение полностью транс-ретиниловых эфиров жирных кислот также было отмечено в глазах прошедших лечение мышей, независимо от режима. В печени 9-цис-ретинол, по существу, сохранялся в виде 9-цис-ретиниловых эфиров жирных кислот дозозависимым и режим-зависимым образом (Фигура 14А, B). Уровни жирных кислот полностью транс-ретиниловых эфиров, по существу, не зависели от этих режимов, несмотря на то, что могли быть немного увеличенными у мышей, получавших 4 мг/кг 9-цис-R-Ac. Долговременное введение 9-цис-R-Ac обладало дозозависимым защитным действием на сетчатку, что оценивалось по длине внешних сегментов фоторецепторов (Фигура 9A, C) и числу ядер во внешнем ядерном слое (Фигура 9B, D). Эти эффекты были более выраженными во внешней, чем во внутренней области сетчатки. Изображения при более сильном увеличении поперечных срезов сетчатки показали улучшение морфологии палочкового наружного сегмента (ROS) и уменьшение структур, похожих на масляные капельки, в частях внешних и внутренних областей сетчаток мышей, прошедших лечение режимами либо 4 мг/кг ежедневно, либо 4 мг/кг прерывисто (Фигура 9E, F). При этом не наблюдалось существенного изменения в сетчатках мышей, получавших дозу 1 мг/кг 9-цис-R-Ac при помощи любой схемы (Фигура 9G, H), по сравнению с сетчатками контрольных мышей (Фигура 9).
Важно, что ЭРГ-ответы мышей, прошедших прерывистое лечение 9-цис-R-Ac, свидетельствовали об отсутствии существенных различий между группами доз 1 и 4 мг/кг в день 56, что позволяет предположить, что более низкая доза 1 мг/кг может обладать сходной эффективностью, если давать беспрерывно. Как показано на Фигуре 9, наблюдались морфологические улучшения ROS, такие что длины ROS были значительно больше у внешних областей сетчатки мышей, прошедших лечение 4 мг/кг, в то время как у животных, получавших дозу 1 мг/кг, существенных изменений не отмечалось. Эти наблюдения позволяют сделать обоснованное предположение, что режимы лечения с использованием как 1, так и 4 мг/кг поддерживали функцию сетчатки у мышей Rpe65 -/- без существенной клинической токсичности или ненормального ретиноидного накопления в глазах и печени.
Все вышеприведенные патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, иностранные патенты, иностранные патентные заявки и непатентные публикации, упомянутые в настоящей спецификации и/или перечисленные в инструкции по применению, включены в настоящем документе посредством ссылки в их полном объеме.
Из вышесказанного должно быть понятно, что, несмотря на то, что конкретные варианты осуществления изобретения были описаны в настоящем документе в иллюстративных целях, различные модификации могут быть сделаны без отступления от духа и границ изобретения. Соответственно, изобретение не ограничивается ничем, кроме как прилагаемыми пунктами формулы изобретения.
Изобретение относится к области фармацевтики, а именно представляет собой фармацевтические составы, содержащие 9-цис-ретиниловые сложные эфиры в липидном наполнителе. Фармацевтические составы, содержащие 9-цис-ретиниловые сложные эфиры описываются для применения в ретиноидной заместительной терапии для лечения дегенераций сетчатки у людей. 6 н. и 67 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 6 пр.
1. Жидкий пероральный фармацевтический состав для доставки ретиноида, посредством перорального введения в жидкой пероральной дозированной форме, в глаз человека в эффективном количестве для лечения ретинальной деградации глаза, включающий 9-цис-ретиниловый сложный эфир Формулы (I):
где R представляет собой алкильную группу; и липидный наполнитель, содержащий более чем 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирные кислоты Омега-6 и жирные кислоты Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
2. Фармацевтический состав по п.1, где R представляет собой С12-17-алкил, C1-8-алкил, C1-6-алкил или C1-4-алкил.
3. Фармацевтический состав по п.2, где R представляет собой C1-8-алкил.
4. Фармацевтический состав по п.3, где R представляет собой C1-6-алкил.
5. Фармацевтический состав по п.4, где R представляет собой C1-4-алкил.
6. Фармацевтический состав по п.5, где R представляет собой метил и 9-цис-ретиниловый сложный эфир Формулы (I) представляет собой 9-цис-ретинилацетат.
7. Фармацевтический состав по п.1, где липидный наполнитель содержит соевое масло, масло грецкого ореха или масло зародышей пшеницы.
8. Фармацевтический состав по п.7, где соевое масло является высоко очищенным соевым маслом.
9. Фармацевтический состав по п.7, где указанное соевое масло является соевым маслом сорта U.S.Р.
10. Фармацевтический состав по п.1, где указанный фармацевтический состав включает до 40 масс.% 9-цис-ретинилового сложного эфира.
11. Фармацевтический состав по п.1, где указанный фармацевтический состав включает до 30 масс.% 9-цис-ретинилового сложного эфира.
12. Фармацевтический состав по п.1, где указанный фармацевтический состав включает до 25 масс.% 9-цис-ретинилового сложного эфира.
13. Фармацевтический состав по п.1, где указанный фармацевтический состав включает до 10 масс.% 9-цис-ретинилового сложного эфира.
14. Фармацевтический состав по п.1, где указанный фармацевтический состав включает до 5 масс.% 9-цис-ретинилового сложного эфира.
15. Фармацевтический состав по п.1, содержащий 1,25-20 мг/мл 9-цис-ретинилового сложного эфира.
16. Фармацевтический состав по п.1, содержащий 20 мг/мл 9-цис-ретинилового сложного эфира.
17. Фармацевтический состав по п.1, дополнительно содержащий антиоксидант.
18. Фармацевтический состав по п.17, где антиоксидант представляет собой α-токоферол, бутилированный гидроксианизол (БГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), аскорбилпальмитат, пропилгаллат, трет-бутилгидрохинон (ТБГХ), или хелатирующий агент, или их сочетание.
19. Фармацевтический состав по п.17, включающий примерно 0,1 масс./об.% антиоксиданта.
20. Фармацевтический состав по п.17, где указанный антиоксидант представляет бутилированный гидроксианизол (БГА).
21. Фармацевтический состав по п.1, дополнительно включающий одно или более ароматизирующих веществ, усилителей вкуса, ароматизированных масел и подслащивающих средств.
22. Фармацевтический состав по п.1, дополнительно включающий среду, пригодную для питья.
23. Фармацевтический состав по п.22, где указанная пригодная для питья среда включает одно или более из воды, молока, соевого молока, сурфактантов и эмульгаторов.
24. Фармацевтический состав по п.23, где указанные сурфактанты и эмульгаторы выбраны из группы, состоящей из соевого лецитина, дипальмитоилфосфатидилхолина, акации, трагакантовой камеди и метилцеллюлозы.
25. Фармацевтический состав по п.1, где указанный пероральный состав не является капсульной формой.
26. Фармацевтический состав по п.1, где введение указанного состава обеспечивает 1,25-40 мг/м2 9-цис-ретинилового сложного эфира на площади поверхности тела субъекта.
27. Фармацевтический состав по п.1, где введение указанного состава обеспечивает 40 мг/м2 9-цис-ретинилового сложного эфира на площади поверхности тела субъекта.
28. Жидкий пероральный фармацевтический состав для доставки ретиноида посредством перорального введения в жидкой оральной дозированной форме, в глаз человека в эффективном количестве для лечения ретинальной деградации глаза, включающий 9-цис-ретиниловый сложный эфир и соевое масло.
29. Фармацевтический состав по п.28, дополнительно содержащий антиоксидант.
30. Фармацевтический состав по п.29, где антиоксидант представляет собой α-токоферол, бутилированный гидроксианизол (БГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), аскорбилпальмитат, пропилгаллат, трет-бутилгидрохинон (ТБГХ), или хелатирующий агент, или их сочетание.
31. Фармацевтический состав по п.29, включающий примерно 0,1 масс./об.% антиоксиданта.
32. Фармацевтический состав по п.30, где указанный антиоксидант представляет бутилированный гидроксианизол (БГА).
33. Фармацевтический состав по п.28, дополнительно включающий одно или более ароматизирующих веществ, усилителей вкуса, ароматизированных масел или подслащивающих средств.
34. Фармацевтический состав по п.28, дополнительно включающий среду, пригодную для питья.
35. Фармацевтический состав по п.34, где указанная пригодная для питья среда включает одно или более из воды, молока, соевого молока, сурфактантов и эмульгаторов.
36. Фармацевтический состав по п.35, где указанные сурфактанты и эмульгаторы выбраны из группы, состоящей из соевого лецитина, дипальмитоилфосфатидилхолина, акации, трагакантовой камеди и метилцеллюлозы.
37. Фармацевтический состав по п.28, где соевое масло является высокоочищенным соевым маслом.
38. Фармацевтический состав по п.28, где указанное соевое масло является соевым маслом сорта U.S.Р.
39. Фармацевтический состав по п.28, включающий до 5 масс.% 9-цис-ретинилацетата.
40. Фармацевтический состав по п.28, включающий 1,25-20 мг/мл 9-цис-ретинилацетата.
41. Фармацевтический состав по п.28, включающий 20 мг/мл 9-цис-ретинилацетата.
42. Фармацевтический состав по п.28, где указанный оральный состав не является капсульной формой.
43. Жидкий пероральный фармацевтический состав для доставки ретиноида посредством перорального введения в жидкой пероральной дозированной форме в глаз человека в эффективном количестве для лечения ретинальной деградации глаза, включающий до 10 масс.% 9-цис-ретинилацетата, соевое масло и 0,1 масс./об.% бутилированного гидроксианизола (БГА).
44. Способ применения жидкого орального состава по любому из пп.1-23, включающий введение пероральной дозировки фармацевтического состава, включающего эффективное количество 9-цис-ретинилового сложного эфира человеку с ретинальной деградацией.
45. Способ по п.44, где введение является ежедневным.
46. Способ по п.44, где введение является прерывистым.
47. Способ по п.44, где введение состава обеспечивает пиковую концентрацию в плазме активных метаболитов указанного 9-цис-ретинилового сложного эфира через 3-6 часов после введения.
48. Способ по п.44, пероральное введение состава представляет собой ретиноидную заместительную терапию или хромофор-заместительную терапию для лечения ретинальной деградации.
49. Способ по п.44, где ретинальная деградация является следствием 11-цис-ретинальной недостаточности.
50. Способ по п.49, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации RPE65.
51. Способ по п.49, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации LRAT.
52. Способ по п.44, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет врожденную слепоту Лебера (LCA).
53. Способ по п.44, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет пигментный ретинит (RP).
54. Способ применения жидкого орального состава по любому из пп.28-42, включающий введение пероральной дозировки фармацевтического состава, включающего эффективное количество 9-цис-ретинилового сложного эфира человеку с ретинальной деградацией.
55. Способ по п.54, где введение является ежедневным.
56. Способ по п.54, где введение является прерывистым.
57. Способ по п.54, где введение состава обеспечивает пиковую концентрацию в плазме активных метаболитов указанного 9-цис-ретинилового сложного эфира через 3-6 часов после введения.
58. Способ по п.54, где пероральное введение состава представляет собой ретиноидную заместительную терапию или хромофор-заместительную терапию для лечения ретинальной деградации.
59. Способ по п.54, где ретинальная деградация является следствием 11-цис-ретинальной недостаточности.
60. Способ по п.59, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации RPE65.
61. Способ по п.59, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации LRAT.
62. Способ по п.54, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет врожденную слепоту Лебера (LCA).
63. Способ по п.54, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет пигментный ретинит (RP).
64. Способ применения жидкого перорального состава по п.43, включающий введение пероральной дозировки фармацевтического состава, включающего эффективное количество 9-цис-ретинилацетата человеку с ретинальной деградацией.
65. Способ по п.64, где введение является ежедневным.
66. Способ по п.64, где введение является прерывистым.
67. Способ по п.64, где введение состава обеспечивает пиковую концентрацию в плазме активных метаболитов указанного 9-цис-ретинилового сложного эфира через 3-6 часов после введения.
68. Способ по п.64, пероральное введение состава представляет собой ретиноидную заместительную терапию или хромофор-заместительную терапию для лечения ретинальной деградации.
69. Способ по п.64, где ретинальная деградация является следствием 11-цис-ретинальной недостаточности.
70. Способ по п.69, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации RPE65.
71. Способ по п.69, где 11-цис-ретинальная недостаточность является следствием мутации LRAT.
72. Способ по п.64, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет врожденную слепоту Лебера (LCA).
73. Способ по п.64, где указанный человек с ретинальной деградацией имеет пигментный ретинит (RP).
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
| WO 2003045379 A1, 5.06.2003 | |||
