ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый аэробный штамм бактерий, способный эффективно разлагать стойкие токсичные соединения - полихлорированные бифенилы (ПХБ), в том числе в условиях засоления.

Данные вещества включены в группу Стойких Органических Загрязнителей (СОЗ) [Стокгольмская конвенция, ФЗ-РФ №164 «О ратификации Стокгольмсокй конвенции…»] и подлежат полному уничтожению. Однако при реализации положений конвенции возникает проблема уничтожения соединений группы СОЗ, так как за длительный период производства и применения накоплены сотни тонн данных веществ, значительная часть которых попала в окружающую среду [Трегер Ю.А. Стойкие органические загрязнители. Проблемы и пути их решения // Вестник МИТХТ, 2011, т.6, №5].

Известен ряд способов термической и химической переработки ПХБ, однако эти способы являются высокозатратными и могут приводить к образованию более токсичных соединений - диоксинов [Полихлорбифенилы: Проблемы экологии, анализа и химической утилизации / отв. Ред. В.Н. Чарушин. - М.: КРАСАНД; Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 400 с.].

Наиболее экологически безопасным способом утилизации полихлорированных бифенилов (ПХБ) является их биологическая деструкция с использованием бактерий [Васильева Г.К., Стрижакова Е.П. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами // Микробиология. 2007. Т.76. №6. С.725-741. и Beyer A., Biziuk М. Environmental fate and global distribution of polychlorinated biphenyls // Rev. Environ. Contamin. Toxic. 2009. V.201. P.137-158]. Известно, что в промышленных масштабах выпускались коммерческие смеси ПХБ, содержащие от 20 до 60 конгенеров с разной степенью хлорирования. Поэтому наибольший интерес представляют штаммы, способные утилизировать коммерческие смеси ПХБ.

В патентной литературе имеются сведения о бактериальных штаммах родов Pseudomonas, Burkcholderia и Rhodococcus [Патент US №4999300 А, 12.03.91; Патент US №6537797 В1, 25.03.2003; Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005], осуществляющих полное разложение отдельных конгенеров моно- и дихлорированных бифенилов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому решению является «Штамм бактерий Rhodococcus ruber (ИЭГМ 896) - деструктор полихлорированных бифенилов» (Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005 г., МПК C12N 1/20; C02F 3/34).

Недостатками аналогов и прототипа является ограниченность эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.

Задачей создания изобретения является создание нового штамма - деструктора полихлорированных бифенилов, а также расширение арсенала средств для эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.

Поставленная задача решается с помощью Штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D - который является активным деструктором полихлорированных бифенилов.

Ниже приведен сопоставительный анализ эффективности предлагаемого Штамма по сравнению с прототипом.

Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описан рост на трех конгенерах ПХБ (ПХБ1, ПХБ3, ПХБ8), наиболее «легких» для бактериального разложения и не содержащих заместителей в метаположении. О полной утилизации данных ПХБ судится по косвенным признакам: рост бактериальной культуры, способность штамма расти на продуктах разложения данных ПХБ, а именно на хлорбензойных кислотах.

Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 разлагает более широкий спектр конгенеров ПХБ (26 конгенеров), в том числе содержащих более 2 заместителей в молекуле и/или заместителей в метаположении (табл.1, 2). Четко показано, что происходит убыль каждого конкретного конгенера ПХБ (количества указаны в соответствующей концентрации), установлены промежуточные соединения для 11 конгенеров, позволяющие утверждать, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов.

Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описана «острая» деструкция 7 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто- и/или параположении, и показаны 2 возможных промежуточных продукта. Нет сведений об изменении концентрации начальных конгенеров ПХБ, а также не указано, будут ли проявляться данные свойства штамма в отношении остальных конгенеров ПХБ (их всего 209, содержащих от 1 до 10 заместителей).

Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.

Ниже показана убыль 11 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто-, мета-, параположениях при деструкции каждого конгенера индивидуально, установлены основные промежуточные соединения, подтверждающие, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов. Кроме того, показана убыль 26 конгенеров ПХБ в составе коммерческой смеси «Совол», содержащих от 3 до 6 заместителей. Приведенные результаты демонстрируют более высокий деградативный потенциал штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.

В прототипе нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ, содержащие конгенеры с количеством заместителей больше трех. Способность разлагать отдельные (моно-три)-хлорированные бифенилы не позволяет предполагать, что штамм проявит деградативные свойства в отношении коммерческих смесей ПХБ.

Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.

Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». Деструкция составляет 93.8%.

По прототипу нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ в почве, а также при повышенном уровне засоления среды.

Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.

Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» в почве, а также при содержании хлорида натрия в концентрации 30 г/л. Данные свойства уникальны и ранее описаны не были.

Технический результат от предлагаемого решения - Штамм R. wratislaviensis КТ112-7 осуществляет разложение индивидуальных конгенеров ПХБ: монозамещенных на 96.7-96.9%, ди- и трихлорированных (заместители расположены в одном кольце молекулы в орто-, мета- или параположении) на 69.4-89.0%, дихлорированных с заместителями в каждом кольце в положениях орто- и/или пара- на 78.0-96.4%, трихлорированных (расположение заместителей два в одном кольце и один во втором кольце в орто- или параположении) на 67.0-88.9% за 24 часа и коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол» на 93.8% за 5 суток.

Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, обладающий способностью к деструкции широкого спектра токсичных веществ, выделен из отходов (техногенно-минеральных образований) производства калийно-магниевых солей ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) методом накопительного культивирования на среде Раймонда состава (г/л): NH₄NO₃ - 2.0, MgSO₄×7Н₂O - 0.2, К₂НРO₄ - 2.0, Na₂HPO₄ - 3.0, СаСl₂×6Н₂O - 0.01, Na₂CO₃ - 0.1, с добавлением ортофталевой кислоты - 1 г/л. Полученный штамм бактерий депонирован 07.05.2013 г. во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D.

Характеристика предлагаемого штамма.

Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Клетки грамположительные, неподвижные, не образуют спор, каталазоположительные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Штамм растет при температуре 10-45°C с оптимумом роста 28°C.

На богатой агаризованной среде Раймонда (состав среды см. выше), содержащей (г/л): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 10, агар - 1, образует непрозрачные округлые, матовые, светло-розовые колонии. Штамм способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от 0 до 10% в среде культивирования. При росте на минеральной среде Раймонда не нуждается в дополнительных факторах роста. Использует в качестве источника углерода нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол, opтoфталевую кислоту, бензойную кислоту.

По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082^T. На основании морфофизиологических и молекулярно-генетических признаков штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis. Методом ВОХ-ПЦР [Versalovic J., Schneider М., de Bruijn F.J., Lupski J.R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence based-polymerase chain reaction // Methods Cell. Mol. Biol. 1994. V.5. P.25-40] и последующей разгонки в агарозном геле получен набор фрагментов ДНК, характерный только для штамма R. wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ Ac-2623D). Изучение генома штамма показало наличие двух плазмид размером около 470 т.п.н. и 500 т.п.н. Штамм содержит гены «верхнего» пути разложения бифенила/ПХБ, а также гены, кодирующие ферменты деструкции бензойной и opтoфталевой кислот, а также хлоркатехола. Анализ показал, что штамм КТ112-7 по морфофизиологическим, биохимическим, генетическим характеристкам имеет существенные отличия от других представителей данного вида.

Преимуществом данного изобретения является способность штамма R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагать без накопления токсичных продуктов моно-, ди- и тризамещенные хлорбифенилы (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3, ПХБ8, ПХБ12, ПХБ15, ПХБ17, ПХБ28, ПХБ29, ПХБ30) и коммерческую смесь ПХБ торговой марки «Совол» как в качестве субстрата, так и в качестве загрязняющего вещества в почве. R. wratislaviensis КТ112-7 является галотолерантным штаммом, способным эффективно осуществлять разложение ПХБ (индивидуально и в составе коммерческой смеси) в условиях повышенной солености среды (30 г/л NaCl).

Данные свойства штамма описываются впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Ниже приведены примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Разложение конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7

Деструкцию ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками». Штамм выращивали в жидкой среде Раймонда состава (г/л): NH₄NO₃ - 2.0, MgSO4×7Н₂O - 0.2, К₂НРO₄ - 2,0, Na₂HPO₄ - 3.0, СаСl₂×6Н₂O - 0.01, Na₂CO₃ - 0.1, содержащей 30 г/л NaCl и бифенил (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии при 28°C до ОП₆₀₀=1.0. Отмытые дважды в среде Раймонда клетки (1 мл, ОП₆₀₀=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками.

В качестве субстрата вносили ацетоновый раствор хлорбифенилов до конечной концентрации: моноХБ - 94.25 мг/л, диХБ - 22.3 мг/л, триХБ - 12.5 мг/л (табл.1).

Для выделения хлорированных бифенилов культуральную жидкость экстрагировали смесью конц. Н₂SO₄ - 12.5%-ный додецил-сульфат-натрия (ДДС-Na)-гексан (1:10:25) в течение 60 мин при 30°C, скорость перемешивания 200 об/мин. Экстракты обезвоживали Na₂SO₄ и анализировали на газовом хроматографе GC6890N ("Agilent Technology", США) с масс-селективным детектором MSD5973N ("Agilent Technology", США).

Количественное содержание выделенных хлорбифенилов оценивали на основании сравнения величины полученных пиков и стандартных соединений.

Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом ВЭЖХ.

Для выделения и идентификации продуктов биодеструкции хлорированных бифенилов культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток методом центрифугирования (9660 g в течение 3 мин на центрифуге miniSpin ("Eppendorf", Германия)). Для дальнейших анализов использовали надосадочную жидкость.

Образование продуктов метарасщепления ароматического кольца хлорбифенилов-2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновые кислоты (ГОФДК) определяли методом спектроскопии на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini ("Shimadzu", Япония) при λ_макс от 390 нм до 440 нм.

Наличие в надосадочной жидкости хлор- и гидрокси-бензойных кислот (ХБК, (ОН)БК), а также катехолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-20A ("Shimadzu", Япония) с колонкой Discovery С18 (150×4.6 мм) ("Supelco", "Sigma-Aldrich", США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил - 0.1%-ый Н₃РO₄ (70:30). Идентификацию проводили с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоты пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает конгенеры ПХБ, содержащие заместителей в одном из колец молекулы (табл.1). Уровень деструкции составил 69.0-96.9%. При этом эффективность разложения зависела не от положения заместителя (орто-, мета-, пара-), а от количества заместителей во втором кольце молекулы бифенила. Так, уровень деструкции монозамещенных ХБ (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3) составил 96.7-96.9%, а ди- и тризамещенных (ПХБ12, ПХБ29, ПХБ30) - 69.0-89.0%. Также показано, что образующиеся при этом хлорбензойные кислоты не являются конечным продуктом (табл.1), а разлагаются через стадию образования гидрокси-производных ((ОН)БК) до соединений основного обмена.

Анализ деградационной активности по отношению к дихлорированным бифенилам, содержащим по одному заместителю в каждом кольце в орто- и/или параположении (ПХБ4, ПХБ8, ПХБ15), а также по отношению к трихлорированным бифенилам, у которых в одном из колец также располагается один заместитель в орто- или параположении, показал, что штамм КТ112-7 предпочтительнее окисляет ортохлорированное кольцо молекулы ПХБ (табл.1). На эффективность деструкции, в случае если заместители располагаются в обоих кольцах молекулы, влияют оба фактора: и расположение заместителей, и их количество.

Таким образом, эффективность разложения ПХБ штаммом КТ112-7 изменяется в ряду не замещенное > ортозамещенное > паразамещенное кольцо и моноХБ > диХБ ≥ триХБ.

Таблица 1. Разложение отдельных конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7         Промежуточные продукты         ГОФДК     № ПХБ (по IUPAK) Положение заместителей в молекуле Время, ч ПХБ, мг/л Длина волнымакс,н.м. ОП, о.е. Хлорбензойные кислоты, мкг/л Гидрокси-бензойные кислоты, мкг/л 1 2 3 4 5 6 7 8 ПХБ1 2-(орто-) 0 94.25 - - - - 2 20.6 390 0.268 - - 24 3.0 390 0.247 - - ПХБ2 3-(мета-) 0 94.25 - - - - 2 26.2 392 0.401 - - 24 2.9 392 0.235 - - ПХБ3 4-(пара-) 0 94.25 - - - - 2 41.7 416 0.196 18.7 25.9 24 3.1 416 0.291 23.0 19.2 ПХБ12 3,4- 0 22.3 - - - - 2 7.68 390 0.372 5.51 0.48 24 5.57 390 0.235 0.53 0.19

Продолжение табл.1 1 2 3 4 5 6 7 8 ПХБ29 2,4,5- 0 12.5 - - - - 2 - 394 0.652 7.9 - 24 1.37 394 0.292 4.8 - ПХБ30 2,4,6- 0 12.5 -   - - 2 - 449 0.249 - - 24 3.87 449 0.297 - - ПХБ4 2,2′- 0 22.3 - - - - 2 1.42 394 0.962 86.8 - 24 0.81 394 0.761 12.3 - ПХБ8 2,4′- 0 22.3 - - - - 2 15.4 390 0.246 1.2 2.5 24 2.2 390 0.245 0.7 0.6 ПХБ15 4,4′- 0 22.3 - - - - 2 11.6 428 0.274 3.2 0.5 24 4.9 428 0.508 0.3 0.3 ПХБ17 2,4,2′- 0 12.5 - - - - 2 6.25 449 0.277 3.8 - 24 1.38 449 0.209 2.4 - ПХБ28 2,4,4′- 0 12.5 - - - - 2 - 392 0.067 0.2 4.7 24 4.12 392 0.271 0.1 2.7 «- » - вещества не определены

Пример 2. Разложение штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол»

Деструкцию смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками» по схеме, описанной в примере 1.

В эксперименте использовали коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» (ГСО №7821-2000), основной состав которой представлен тетра- (22%), пента- (53%) и гекса- (23%) замещенными конгенерами. «Совол» вносили в виде ацетонового раствора до конечной концентрации 0.8 г/л.

Экстракцию и анализ ПХБ, анализ возможных метаболитов проводили как описано в примере 1.

В результате проведенных исследований установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ 112-7 эффективно разлагает коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». За 5 суток концентрация «Совола» снизилась на 93.8%, при этом отмечена деградационная активность ко всем представленным в смеси конгенерам (таблица 2).

Таблица 2. Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 № пика № ПХБ по классификации IUPAK Площадь пика % деструкции 1 сут. 3 сут. 5 сут. 1 28 23521 8740 3812 83,8 2 52 8142 2391 1019 87,5 3 49 2476 0 0 100,0 4 44 10954 3706 1553 85,8 5 41\64 6132 2205 865 85,9 6 74 7139 2902 1087 84,8 7 70 21149 8209 3371 84,1 8 66\95 34511 12668 5279 84,7 9 91 5986 2475 1019 83,0 10 60\56 8942 2980 1137 87,3 11 84\101 45555 15421 6321 86,1 12 99 29093 9531 3866 86,7 13 97 12424 4046 1681 86,5 14 87 12685 6934 2837 77,6 15 85 45049 4267 1729 96,2 16 110 6324 15500 6247 1,2 17 82 3152 2427 423 86,6 18 119 2229 0 0 100,0 19 118 33262 0 0 100,0 20 153 1904 1773 641 66,3 21 105 17875 5613 2205 87,7 22 138 25900 9267 3347 87,1 23 128 7725 0 0 100,0 24 156 2487 1060   100,0 25 180 29789 9700 3734 87,5 26 170 6472 2090 674 89,6 Общий % деструкции смеси «Совол» 51,3 84,2 93,8  

При этом, как и в случае разложения индивидуальных конгенеров, происходит снижение концентрации образовавшихся метаболитов (табл.3).

Таблица 3. Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при разных концентрациях хлорида натрия в среде NaCl, г/л Время деструкции, сут. Совол, г/л Промежуточные соединения ГОФДК, ОП452 ХБК, мг/л (ОН)БК, мг/л 0 0 0.8 - - - 1 0.39 0.145 25.1 46.2 3 0.13 0.100 21.8 35.4 5 0.05 0.091 20.4 31.9 30 0 0.8 - - - 1 0.41 0.288 31.5 45.4 3 0.12 0.259 28.4 25.4 5 0.03 0.180 12.5 11.1 «-» - вещества не определены

Динамика изменения концентрации метаболитов свидетельствует об их утилизации штаммом R. wratislaviensis КТ112-7. Разложение метаболитов происходит до соединений основного обмена клетки, при этом повышение осмолярности среды не оказывает негативного влияния на данный процесс.

Пример 3. Разложение ПХБ в почве штаммом R. wratislaviensis КТ112-7

Для разложения ПХБ, содержащихся в почве, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 вносили в почву, содержащую ПХБ (марка «Совол»), отобранную с промышленной площадки г. Чапаевск Самарской области из расчета 10⁶ и 10⁷ клеток на грамм. Бактерии выращивали на среде Раймонда состава (г/л): NH₄NO₃ - 2,0, MgSO₄×7Н₂O - 0,2, К₂НРO₄ - 2,0, Na₂HPO₄ - 3,0, СаСl₂×6Н₂O - 0,01, Na₂CO₃ - 0,1, бифенил - 1,0. Через 3 месяца оценивали содержание ПХБ в почве с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N (Agilent Technology, США).

Через 3 месяца обработка загрязненной почвы бактериями R. wratislaviensis КТ112-7 привела к значительной убыли ПХБ (табл.4). Снижение концентрации ПХБ в загрязненной почве с внесенными бактериями относительно почвы без обработки составило в варианте с внесением 10⁶ кл/г почвы в 4,2 раза, а в варианте с внесением 10⁷ кл/г почвы в 4,1 раза.

Таблица 4. Концентрация смеси ПХБ «Совол» в почве после ее обработки бактериальным штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 Соединение Количество бактерий штамма КТ112-7, внесенных в почву, количество кл/г почвы 0 10⁶ 10⁷ смесь ПХБ, мг/кг 0,997 0,235 0,241

Таким образом, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает моно-, ди- и трихлорированные конгенеры орто-, мета- и паразамещенных бифенилов, а также промышленную смесь ПХБ марки «Совол» как в виде единственного источника углерода, так и в виде загрязнителя в почве.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 обладает деструктивной активностью в отношении группы стойких токсичных хлорароматических соединений - полихлорированных бифенилов (ПХБ). Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ас-2623D и может быть использован для разложения моно-, ди- и трихлорированных конгенеров, орто-, мета- и паразамещенных бифенилов, а также промышленной смеси ПХБ. 4 табл., 3 пр.

Штамм Rhodococcus wratislaviensis, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Ac-2623D - активный деструктор полихлорированных бифенилов.