ШТАММ ДРОЖЖЕЙ HANSENULLA CALIFORNICA, РАЗЛАГАЮЩИЙ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫЕ БИФЕНИЛЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/16 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/16 C12R1/78 

Изобретение относится к биотехнологии, экологии, охране окружающей среды, касается биологической очистки объектов окружающей среды от полихлорированных бифенилов (ПХБ) и представляет собой новый штамм дрожжей, способный разлагать ПХБ в аэробных условиях in situ в объектах окружающей среды.

Внедрение достижений химии в промышленность и быт человека связано со многими опасностями непосредственного и отдаленного эффекта химического воздействия. В настоящее время вопрос о борьбе с загрязнением окружающей среды приобрел особую остроту.

ПХБ производят с 30-х годов и они нашли свое применение в основном в электротехнической промышленности. К концу 60-х годов в окружающей среде оказалось от 300 до 500 тыс. т ПХБ [1]. В среднем годовой выброс ПХБ составляет 2000 т. Попадание ПХБ в окружающую среду связано с авариями оборудования и систем, содержащих их, а также при сжигании отходов. В почву ПХБ попадают при авариях оборудования или при сбросе неочищенных производственных стоков с предприятий, использующих его в производственном цикле, а также при использовании иловых отложений с полей орошения. Обладая высокой способностью к абсорбции и малой способностью к разложению, полихлорированные бифенилы накапливаются в почве в поверхностном слое на глубине 2-10 см и в донных осадках. ПХБ обнаружены практически во всей живой природе. ПХБ - политропный яд, поражающий практически все органы и системы организма. Данные, опубликованные ВОЗ, свидетельствуют, что наиболее чувствительным к ПХБ является человек. ПХБ относится к веществам 1-й группы опасности.

Для очистки объектов окружающей среды от ПХБ в мировой практике используются в основном различные физико-химические методы.

Для санирования почв, загрязненных ПХБ, в Германии используется способ, разработанный "National Research Council" (Канада). Согласно этому способу в старые отвалы вводят специальные дисперсионные смеси натрий-масло, которые способствуют выделению хлора из ПХБ с образованием поваренной соли [2]. Группа фирм Gebruder Kemmer/Jng Buro Harbauer (ФРГ) разработала метод очистки почв, загрязненных ПХБ, основанный на выемке грунта. Почву измельчают и просеивают, фракции раздельно очищают водой с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ). Промывочная жидкость подается на установку очистки сточных вод [3].

В ФРГ фирма "Kloeckner Oecotec GmbH" разработала метод очистки почвы, загрязненной ПХБ, основанный на промывании почвы под высоким давлением на пилотной установке. Почва с диаметром кусков до 10 мм размельчается в конической струе воды. Высокое давление (250 бар) в кольцевом трубопроводе и высокая скорость (200-250 м/с) способствуют полной гомогенизации и отделению мельчайших компонентов и вредных веществ. Разделение суспензии после обработки почвы водой осуществляется одним из следующих методов: осаждением, циклонным сепарированием, центрифугированием, фильтрацией и т.д. В России разработан метод очистки почвы от ПХБ с помощью ракетного двигателя, плазмотронов [4].

Все эти методы обладают рядом существенных недостатков: они трудоемки, требуют больших экономических затрат и нарушают экологический баланс почвы. С конца 70-х годов все больший интерес проявляется к биологическим способам очистки. Известно, что различные бактериальные штаммы и грибы способны разлагать ПХБ. К ним относятся микроорганизмы рода Pseudomonas (Pseudomonas putida, способные деградировать полихлорированные бифенилы. Патент США МПК С 12 N 1/12, N 4843009, заявка N 866501, подана 23.05.86) и грибы Whit Rod Fungus Phanerochaete chrysosporium (Degradation of 4, 4'- Dichlorobiphinyl, 3, У, 4, 4'- Tetrachlorobiphinyl, and 2, 2', 4, 4', 5, 5'- Hexachlorobiphenyl by the White Rot Fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiologi. , 1995, vol. 61, N 11, p. 3904-3909), но бактерии рода Pseudomonas требовательны к питательным средам и условиям хранения. Грибы являются менее технологичными в производстве, но кроме всего прочего они приводят к сдвигу экологического равновесия при их применении в объектах внешней среды.

В основу изобретения положена задача выделить новый штамм микроорганизма, в частности дрожжей, способный разлагать более высокие концентрации ПХБ в объектах окружающей среды in situ в аэробных условиях, являющийся высокотехнологичным в производстве и применении.

Поставленная задача достигается тем, что получен новый генетически устойчивый штамм дрожжей Hansenulla californica AT.

Штамм дрожжей Hansenulla californica AT выделен из почвы и селекционирован путем длительных пересевов отдельных колоний дрожжей на минимальной солевой среде (Практикум по микробиологии.- М.: МГУ, 1976), содержащей:
(NH₄)2HPO₄ - 1,5 г
KH₂PO₄ - 0,7 г
NaCl - 0.51 г
Mg₂SO₄ - 0,8 г
Вода дистилированная - До 1 л
pH - 7,2
в присутствии различных концентраций ПХБ - от 100 до 400 мг на 1 л 30 питательной среды.

Отбор штамма дрожжей осуществляли по уровню и скорости разложения ПХБ, а также по их генетической устойчивости к ПХБ. Генетическую устойчивость отбираемых штаммов достигали путем неоднократных пересевов на плотные питательные среды. Выросшие на них колонии затем пересевали на минимальную солевую среду вышеприведенного состава.

В результате получен новый генетически устойчивый штамм дрожжей Hansenulla californica AT.

Идентификацию микроорганизма проводили в соответствии с определителем Kreger-van Rij. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Y-2284. Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Штамм растет на среде, содержащей 5% мальт-экстракта. После 72 ч роста при 25^oC в мазке, окрашенном по Граму, присутствуют клетки слегка сферической формы с размерами 2.4-6.2 х 3.0-8.1 мкм. Колонии белого цвета, матовые, круглой формы. Дрожжи образуют аски зиготического происхождения на ацетатной среде. В жидкой питательной среде растет при температуре 29^oC в течениe 72 ч при скорости мешалки 200 об/мин.

Физиологические признаки. Штамм является аэробом, растет при температуре от 4^oC, не растет при температуре при 42^oC, температурный оптимум 20^oC, растет при pH 5,0-7,5, оптимум pH 6,8-7,0. Растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона (МПБ) и ферментативного гидролизата рыбной муки (ФГРМ).

Биохимические признаки. Штамм в средах Гисса, усваивает как единственный источник углерода сахарозу, мальтозу, целлобиозу, Д-ксилозу, Д-маннит, лимонную кислоту, молочную кислоту, альфа-метил д-гликозид. Сбраживает глюкозу на 3-5-e сутки. Использует азот органического и неорганического происхождения.

Среды для хранения: ФГРМ или МПА и минимально-солевые среды с ПХБ. Для получения биомассы дрожжей, используемой для разложения ПХБ, штамм можно выращивать на различных питательных средах, содержащих обычно используемые источники углерода, азота, минеральные соли. В качестве источника углерода используются ПХБ, глюкоза, сахароза, мальтоза. В качестве источника азота могут быть использованы как органические, так и неорганические вещества. Из органических источников азота могут быть использованы, такие как ФГРМ, пептон, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт и другие. Из неорганических - соли аммония.

В зависимости от используемого состава сред и условий культивирования получают КЖ с титром клеток от 5,0•10⁶ до 1,0•10⁷ кл/см³.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Получение биомассы штамма.

Штамм дрожжей Hansenulla californica AT выращивают аэробно на жидкой питательной среде на основе МПБ глубинным способом при температуре t = 29±2^oC и скорости мешалки 200 об/мин в течение 72 ч. Титр выросшей культуры составляет 1.0•10⁷ кл/см³.

Пример 2.

Очистка почвы в лабораторных условиях.

В образец почвы вносят различные концентрации ПХБ и почву тщательно перемешивают.

Полученную культуральную жидкость разводят водопроводной водой до титра 106-105-104 кл/см³. Суспензию клеток аэрозольно вносят на поверхность почвы, загрязненной ПХБ, из расчета 1 л/1 м². Почву выдерживают при комнатной температуре в течение 2 месяцев. Образцы почвы для анализа отбирают через 0,5, 1 и 2 месяца.

Концентрацию ПХБ в обработанной почве определяли с помощью газожидкостного хроматографа "Кристалл" (согласно методике "Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде". Т. 2.- М.: Агропромиздат, 1992.- C. 143-148). ПХБ из пробы почвы экстрагируют гексаном и вводят в газожидкостной хроматограф с детектором электронного захвата.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наиболее оптимальной концентрацией клеток в суспензии для внесения в почву является 105 кл/см³, концентрация 104 кл/см³ является неэффективной.

Концентрация 106 кл/см³ в суспензии для внесения в почву является экономически невыгодной.

Пример 3.

Очистка почвы в полевых условиях.

Суспензию клеток, полученную по примеру 1, вносят аэрозольно на поверхность почвы с помощью ранцевого распылителя из расчета 1 л/1 м². После внесения суспензии почву тщательно перекапывают и выдерживают при температуре окружающей среды в течение 2 месяцев. Образцы почвы для анализа отбирались через 1 и 2 месяца. Анализ проводили в соответствии с ранее приведенным примером.

Результаты исследований представлены в табл. 2.

Как видно из приведенных в тaбл. 2 данных, концентрация ПХБ в образцах почвы снижается на 45,3% в течение 2 месяцев.

Пример 4.

Очистка воды.

Суспензию клеток, полученную по примеру 1, вносят в 5 л сточной воды, содержащей ПХБ 25 мг/л. Суспензию вносят из расчета 104 кл/л. После внесения суспензии воду постоянно перемешивают со скоростью 10 об/мин в течение 14 суток при комнатной температуре. Образцы воды для анализа отбирались через 1 и 2 недели. Анализ проводили в соответствии с ранее приведенным примером.

Результаты исследований представлены в табл. 3.

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, концентрация ПХБ в сточных водах снижается на 49% в течение 2 недель.

Наиболее успешно предлагаемый штамм дрожжей позволяет снизить концентрацию ПХБ в объектах окружающей среды примерно на 50%. Может быть использован для детоксикации объектов окружающей среды, в частности почвы, воды, отходов электротехнической и химической промышленности, содержащих ПХБ. В перспективе может быть использован для получения различных органических соединений из ПХБ и отходов, содержащих ПХБ.

Источники информации
1. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/Основные достижения в науке. М., 1996, с. 24-41.

2. Deckwer W.-D. Weppen P. Обзор технологий по санации загрязненной почвы и заброшенных территорий, загрязненных вредными отходами. - Chemie-Ingenieur-Technik, 1987, vol. 59, # 6, p. 457-464.

3. Schondorf T., Munz К.Н. Удаление полихлорированных бифенилов из загрязненной почвы. - Chem. Rosch. (Schweiz.), 1988, v. 41, #45, s. 18.

4. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/Основные достижения в науке. М., 1996, c. 24-41.

5. Патент США N 4843009, С 12 N 1/12, опубл. 1986 г.

6. Degradation of 4, 4'- Dichlorobiphinyl, 3, У, 4, 4'- Tetrachlorobiphinyl, and 2, 2', 4, 4', 5, 5'- Hexachlorobiphenyl by the White Rot Fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiologi., 1995, vol. 61, N 11, p. 3904-3909.

Штамм дрожжей Hansenulla californica НТ ВКПМ Y-2284 предназначен для разложения полихлорированных бифенилов (ПХБ) и для детоксикации объектов окружающей среды. Штамм выращивают на средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли. Штамм культивируют глубинным способом до титра 5,0•106-1,0•107 кл/см³. Полученная биомасса используется для разложения ПХБ в концентрациях 106-105 кл/см³. Штамм обеспечивает снижение содержания ПХБ в почве и воде на 30-50%. 3 табл.

Штамм дрожжей Hansenulla californica ВКПМ Y-2284, разлагающий полихлорированные бифенилы.