ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES LATUS, РАЗЛАГАЮЩИЙ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫЕ БИФЕНИЛЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/05 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм, способный разлагать полихлорированные бифенилы (ПХБ) в аэробных условиях in situ в объектах окружающей среды.

Внедрение достижений химии в промышленность и быт человека связано со многими опасностями непосредственного и отдаленного эффекта химического воздействия. В настоящее время вопрос о борьбе с загрязнением окружающей среды приобрел особую остроту.

ПХБ производят с 30-х годов и они нашли свое применение в основном в электротехнической промышленности. К концу 60-х годов в окружающей среде оказалось от 300 до 500 тыс. т ПХБ [1]. В среднем годовой выброс ПХБ составляет 2000 т. Попадание ПХБ в окружающую среду связано с авариями оборудования и систем, содержащих их, а также при сжигании отходов. В почву ПХБ попадают при авариях оборудования или при сбросе неочищенных производственных стоков с предприятий, использующих его в производственном цикле, а также при использовании иловых отложений с полей орошения. Обладая высокой способностью к абсорбции и малой способностью к разложению, полихлорированные бифенилы накапливаются в почве в поверхностном слое на глубине 2-10 см и в донных осадках. ПХБ обнаружены практически во всей живой природе. ПХБ-политропный яд поражает практически все органы и системы организма. Данные, опубликованные ВОЗ, свидетельствуют, что наиболее чувствительным к ПХБ является человек. ПХБ относится к веществам 1-й группы опасности.

Для очистки объектов окружающей среды от ПХБ в мировой практике используются в основном различные физико-химические методы. Для санирования почв, загрязненных ПХБ, в Германии используется способ, разработанный "National Research" (Канада). Согласно этому способу в старые отвалы вводят специальные дисперсионные смеси натрий-масло, которые способствуют выделению хлора из ПХБ с образованием поваренной соли [2].

Группа фирм Gebruder Kemmer/Jng Buro Habauer (ФРГ) разработала метод очистки почв, загрязненных ПХБ, основанный на выемке грунта. Почву измельчают и просеивают, фракции раздельно очищают водой с добавлением поверхностно-активных активных веществ (ПАВ). Промывочная жидкость подается на установку очистки сточных вод [3].

В ФРГ фирма "Kloeckner Oecotec GmbH" разработала метод очистки почвы, загрязненной ПХБ, основанный на промывании почвы под высоким давлением на пилотной установке. Почва с диаметром кусков до 10 мм размельчается в конической струе воды. Высокое давление (250 бар) в кольцевом трубопроводе и высокая скорость (200-250 м/с) способствуют полной гомогенизации и отделению мельчайших компонентов и вредных веществ. Разделение суспензии после обработки почвы водой осуществляется одним из следующих методов: осаждением, циклонным сепарированием, центрифугированием, фильтрацией и т.д.

В России разработан метод очистки почвы от ПХБ с помощью ракетного двигателя, плазмотронов [4].

Все эти методы обладают рядом существенных недостатков: они трудоемки, требуют больших экономических затрат и нарушают экологический баланс почвы.

С конца 70-х годов все больший интерес проявляется к биологическим способам очистки. Известно, что различные бактериальные штаммы и грибы способны разлагать ПХБ. К ним относятся микроорганизмы рода Pseuomonas [5] Pseudomonas putida, способные деградировать полихлорированные бифенилы, и грибы Whit Rot Fungus Phanerochaete Chlysosporium [6] , но бактерии рода Pseuomonas требовательны к питательным средам и условиям хранения. Грибы являются менее технологичными в производстве, но кроме всего прочего они приводят к сдвигу экологического равновесия при их применении в объектах внешней среды.

В основу изобретения поставлена задача выделить новый штамм микроорганизма, способный разлагать более высокие концентрации ПХБ в объектах окружающей среды in situ в аэробных условиях, являющийся высокотехнологичным в производстве и применении.

Технический результат, который может быть получен при использовании изобретения, - улучшение качества разложения полихлорированных бифенилов (ПХБ) в аэробных условиях in situ в объектах окружающей среды и снижение содержания ПХБ в почве и воде на 35-50%.

Штамм бактерии Alcaligenes latus ТХД-13 выделен из почвы и селекционирован путем длительных пересевов отдельных колоний бактерий на минимальной солевой среде (в соответствии с Практикумом по микробиологии.- М.: МГУ, 1976), содержащей:
(NH₄)₂HPO₄ - 1,5 г
KH₂PO₄ - 0,7 г
NaCl - 0,5 г
Mg₂SO₄ - 0,8 г
Вода дистиллированная - До 1 л
pH - 7,2
в присутствии различных концентраций ПХБ - от 100 до 400 мг на 1 л питательной среды.

Отбор штамма осуществляли по уровню и скорости разложения ПХБ, а также по их генетической устойчивости к ПХБ.

Генетическую устойчивость отбираемых штаммов достигали путем неоднократных пересевов на плотные питательные среды. Выросшие на них колонии затем снова пересевали на минимальную солевую среду вышеприведенного состава.

В результате получен новый генетически устойчивый штамм бактерий Alcaligenes latus ТХД-13. Идентификацию проводили в соответствии с определителем Bergey. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В 75-05.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

На глюкозопептонной среде с дрожжевым экстрактом микроорганизм образует прозрачные колонии: с возрастом поверхность становится не блестящей, а матовой. Цвет колонии - сероватый, становится желтоватым. Кoлонии при рассеве имеют величину диаметра 2-3 мм.

На среде Эндо Плоскирева культура растет в виде гладких, блестящих колоний. Культура грамотрицательна, в мазке присутствуют мелкие палочки и кокки. В жидкой питательной среде растет при температуре 29^oC в течение 72 ч при скорости мешалки 200 об/мин.

Физиологические признаки.

Культура аэроб, растет при температуре от 4^oC, не растет при температуре 37^oC, температурный оптимум 20^oC. Растет на средах при pH от 6,0 до 8,0, оптимум pH 6,8-7,5. Растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона (МПБ) и ферментативного гидролизата рыбной муки (ФГРМ).

Биохимические признаки.

Культура в среде Смита усваивает как единственный источник углерода глицерин, фруктозу, Д-глюкозу. Культура каталазоположительна, оксидазоположительна. Использует азот органического и неорганического происхождения.

Среды для хранения: ФГРМ или МПА и минимально солевые среды с ПХБ.

Для получения биомассы бактерий, используемой для разложения ПХБ, штамм можно выращивать на различных питательных средах, содержащих обычно используемые источники углерода, азота, минеральные соли.

В качестве источника углерода используются ПХБ, глюкоза, фруктоза, глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы как органические, так и неорганические вещества. Из органических источников азота могут быть использованы такие, как ФГРМ, пептон, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт и другие. Из неорганических - нитраты.

Изобретение поясняется следующим примерами.

Пример 1.

Получение биомассы штамма.

Штамм бактерии Alcaligenes latus ТХД-13 выращивают аэробно на жидкой питательной среде на основе МПБ глубинным способом при температуре t = 29 ± 2^oC и скорости мешалки 200 об/мин в течение 72 ч. Титр выросшей культуры составляет 2.0-10⁹ кл/см³.

Пример 2.

Очистка почвы в лабораторных условиях.

В образец почвы вносят различные концентрации ПХБ и почву тщательно перемешивают. Полученную культуральную жидкость разводят водопроводной водой до титра 10⁸-10⁷-10⁶ кл/см³. Суспензию клеток аэрозольно вносят на поверхность почвы, загрязненной ПХБ, из расчета 1 л/1 м². Почву выдерживают при комнатной температуре в течение 2 месяцев. Образцы почвы для анализа отбирают через 0,5, 1 и 2 месяца.

Концентрацию ПХБ в обработанной почве замеряли с помощью газожидкостного хромотографа "Кристалл" согласно методике (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т. 2.- М.: Агропромиздат, 1992. - C. 143-148). ПХБ из пробы почвы экстрагируют гексаном и вводят в газожидкостной хромотограф с детектором электронного захвата.

Результаты исследования представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наиболее оптимальной концентрацией клеток в суспензии для внесения в почву, является 10⁷ кл/см³, концентрация 10⁶ кл/см³ является неэффективной.

Концентрация 10⁸ кл/см³ в суспензии для внесения в почву является экономически невыгодной.

Пример 3.

Очистка почвы в полевых условиях.

Суспензию клеток, полученную по примеру 1, вносят аэрозольно на поверхность почвы с помощью ранцевого распылителя из расчета 1 л/1 м². После внесения суспензии почву тщательно перекапывают и выдерживают при температуре окружающей среды в течение 2 месяцев. Анализ проводили в соответствии с ранее приведенным примером.

Образцы почвы для анализа выбирались в течение 1 и 2 месяца.

Результаты исследования представлены в табл. 2.

Как видно из приведенных в табл. 2 данных, концентрация ПХБ в образцах почвы снижается на 45,3% в течение 2 месяцев.

Пример 4.

Очистка воды.

Суспензию клеток, полученную по примеру 1, вносят в 5 л сточной воды, содержащей ПХБ 25 мг/л. Суспензию вносят из расчета 10⁷ кл/л. После внесения суспензии воду перемешивают со скоростью 10 об/мин в течение 14 суток при комнатной температуре.

Образцы воды для анализа отбирались через 1 и 2 недели. Анализ проводили в соответствии с ранее приведенным примером.

Результаты исследования представлены в табл. 3.

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, концентрация ПХБ в сточных водах снижается на 40% в течение 2 недель.

Предлагаемый штамм позволяет снизить концентрацию ПХБ в объектах окружающей среды примерно на 50%.

Наиболее успешно заявленный штамм бактерий Alcaligenes latus ВКПМ В 75-05 может быть использован для детоксикации объектов окружающей среды, в частности почвы, воды, отходов электротехнической и химической промышленности, содержащих ПХБ. В перспективе может быть также использован для получения различных органических соединений из ПХБ и отходов, содержащих ПХБ.

Источники информации
1. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/ Основные достижения в науке. М., 1996, с. 24-41.

2. Deckwer W.-D. Weppen P. Обзор технологий по санации загрязненной почвы и заброшенных территорий, загрязненных вредными отходами. - Chemie-Ingenieur-Technik, 1987, vol. 59, # 6, р. 457-464.

3. Schondorf T., Munz K.H. Удаление полихлорированных бифенилов из загрязненной почвы. - Chem. Rosch. (Schweiz.), 1988, v. 41, # 45, s. 18.

4. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/Основные достижения в науке. М., 1996, c. 24-41.

5. Патент США N 4843009, С 12 N 1/12, опубл. 1986 г.

6. Degradation of 4,4'-Dichlorobiphinyl, 3, У, 4, 4'- Tetrachlorobiphinyl, and 2, 2', 4, 4', 5, 5'- Hexachlorobiphenyl by the White Rot Fungus Phanerochaete chlysosporium. Applied and Environmental Microbiologi., 1995, vol. 61, N 11, p. 3904-3909.

Штамм бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 ВКПМ B 75-05 предназначен для разложения полихлорированных бифенилов (ПХБ) и для детоксикации объектов окружающей среды. Штамм выращивают на средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли. Штамм культивируют глубинным способом до титра 6,0•10⁸-2,0•10⁹ кл/см³. Полученная биомасса в концентрациях 10⁷-10⁸ кл/см³ используется для разложения ПХБ. Обеспечивает снижение содержания ПХБ в почве и воде на 35-50%. 3 табл.

Штамм бактерий Alcaligenes latus ВКПМ В 75-05, разлагающий полихлорированные бифенилы.