СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ IL-1БЕТА-ЗАВИСИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P3/00 A61P3/10 A61P5/50 

В соответствии со сводом законов США (35 U.S.С. § 119) данное изобретение претендует на установление приоритета по предварительным заявкам США №60/871046, поданной 20 декабря 2006, №60/908389, поданной 27 марта 2007, и №60/911033, поданной 10 апреля 2007, во всей своей полноте включенным в данное изобретение в виде ссылок.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к способам лечения и/или профилактики диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Такие способы могут быть использованы для лечения млекопитающих, страдающих от диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, или для предотвращения их проявлений у субъектов, находящихся в группе риска.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение направлено на способы лечения и/или профилактики диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину у млекопитающих. Такие способы могут быть использованы для лечения млекопитающих (например, людей), страдающих от диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, или для предотвращения их проявлений у субъектов, находящихся в группе риска.

Сахарный диабет является метаболическим нарушением у людей, причем его распространенность среди всего населения составляет примерно 1 процент (Foster, D. W., Harrison's Principles of Internal Medicine, Chap.114, pp.661-678, 10th Ed., McGraw-Hill, New York). Заболевание проявляется в виде серий гормонально индуцированных метаболических аномалий, которые со временем приводят к серьезным, продолжительным и вызывающим слабость осложнениям, затрагивающим системы нескольких органов, включая глаза, почки, нервы и кровеносные сосуды. С точки зрения патологии заболевание характеризуется повреждениями (патологическими изменениями) базальных мембран, что доказано с помощью электронной микроскопии. Сахарный диабет можно разделить на два комплекса клинических симптомов: сахарный диабет 1 типа и сахарный диабет 2 типа. Тип 1 или инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), также называемый ювенильной (юношеской) формой заболевания, представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся экстенсивной потерей бета-клеток в островках Лангерганса поджелудочной железы, продуцирующих инсулин. По мере того, как эти клетки постепенно разрушаются, количество секретируемого инсулина падает, приводя, в конечном итоге, к гипергликемии (аномально высокому уровню глюкозы в крови), когда количество секретируемого инсулина падает ниже нормального уровня, необходимого для поддержания нормальных необходимых уровней глюкозы в крови. Несмотря на то что точный пусковой механизм такого иммунного ответа неизвестен, у пациентов с ИЗСД отмечаются высокие уровни антител к белкам, экспрессируемым в бета-клетках поджелудочной железы. Однако не у всех пациентов с высокими уровнями этих антител развивается ИЗСД.

Диабетики 1 типа, как правило, имеют очень низкий или не доступный измерению уровень инсулина в плазме крови при повышенном глюкагоне. Независимо от того, какова точная этиология, большинство пациентов, страдающих диабетом 1 типа, имеют циркулирующие антитела к собственным клеткам поджелудочной железы, включая антитела к инсулину, к цитоплазме клеток островков Лангерганса и к ферменту декарбоксилазе глутаминовой кислоты. Иммунный ответ, направленный конкретно против бета-клеток (клеток, продуцирующих инсулин), ведет к диабету 1 типа. Широко распространенное в настоящее время лечение пациентов, страдающих диабетом 1 типа, состоит в инъекции инсулина и может также включать изменения в рационе питания с целью минимизировать гипергликемию, являющуюся результатом недостатка естественного инсулина, что, в свою очередь, является результатом повреждения бета-клеток. Питание также меняют, учитывая введение инсулина, с тем, чтобы противодействовать гипогликемическим воздействиям гормона.

Диабет 2 типа (также называемый инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД), зрелой или взрослой формой (maturity onset form, adult onset form) развивается, когда клетки мышц, жировой ткани и печени неадекватно реагируют на инсулин. Этот неадекватный ответ (называемый резистентностью к инсулину) может быть следствием как пониженного количества рецепторов инсулина на этих клетках, так и дисфункции сигнальных путей внутри клеток, или обеими причинами. Бета-клетки первоначально компенсируют эту резистентность к инсулину за счет продуцирования большего количества инсулина. Со временем эти клетки теряют способность продуцировать количество инсулина, достаточное для поддержания нормальных уровней глюкозы, что указывает на движение к диабету 2 типа. Диабет 2 типа вызывает комбинация генетических факторов и факторов риска, включая рацион с высоким содержанием жира, недостаточную физическую нагрузку и возраст (старение). Более 90% диабетиков страдает от диабета 2 типа, и этот процент продолжает расти, становясь главной причиной смертности, заболеваемости и расходов на уход за больными во всем мире (Amos и др., Diabetic Med. 14:S1-85, 1997).

Диабет 2 типа является комплексным заболеванием, характеризующимся нарушением метаболизма глюкозы и липидов. Обычно имеются нарушения многих параметров метаболизма, включая повышения уровней глюкозы в плазме крови натощак, уровней свободных жирных кислот и уровней триглицеридов, а также снижение отношения липопротеинов высокой плотности к липопротеинам низкой плотности (HDL/LDL). Как уже было сказано выше, считается, что одной из принципиальных, основополагающих причин диабета является повышение резистентности к инсулину периферических тканей, главным образом тканей мышц и жировой ткани. Причины диабета 2 типа не до конца ясны. Считается, что и резистентность тканей-мишеней к действию инсулина, и пониженная секреция инсулина («несостоятельность β-клеток») имеют место. Главными инсулин-реактивными тканями, поддерживающими гомеостаз глюкозы, являются печень, в которой инсулин стимулирует синтез гликогена и ингибирует глюконеогенез; мышцы, в которых инсулин стимулирует усвоение глюкозы и гликоген стимулирует усвоение глюкозы и ингибирует липолиз. Таким образом, последствиями диабетического состояния являются повышенные уровни глюкозы в крови, которые могут вести к глюкозо-медиированной клеточной токсичности и последующему заболеванию (нефропатии, невропатии, ретинопатии и пр.). Резистентность к инсулину жестко коррелирует с развитием диабета 2 типа.

В настоящее время существуют различные фармакологические подходы к лечению диабета 2 типа (Scheen и др., Diabetes Care, 22(9):1568-1577, 1999). Они действуют различными способами: 1) сульфонилмочевины (например, глимепирид, глизентид, сульфонилмочевина, AY31637) в значительной степени стимулируют секрецию инсулина; 2) бигуаниды (например, метформин) действуют за счет стимуляции утилизации глюкозы, снижая продукцию глюкозы печенью и уменьшая интестинальный выход глюкозы; 3) ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, акарбоза, миглитол) замедляют расщепление углеводов и, следовательно, абсорбцию из кишечника и снижают послеобеденную гипергликемию; 4) тиазолидинедионы (например, троглитазон, пиоглитазон, розиглитазон, глипизид, балаглитазон, ривоглитазон, нетоглитазон, троглитазон, энглитазон, AD 5075, Т 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, сиглитазон, адаглитазон (adaglitazone), CLX 0921, дарглитазон, СР 92768, ВМ 152054) усиливают действие инсулина, стимулируя, таким образом, утилизацию глюкозы в периферических тканях; 5) глюкагон-аналогичные пептиды, включая ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP4) (например, ситаглиптин); и 6) инсулин стимулирует утилизацию глюкозы тканями и ингибирует продуцирование глюкозы печенью. Перечисленные выше фармакологические подходы могут быть использованы по отдельности или в комбинированной терапии. Однако каждый подход, имеет свои ограничения и обладает неблагоприятными побочными действиями. Со временем значительным процент пациентов, страдающих от диабета 2 типа, перестают реагировать на эти препараты. Инсулиновая терапия, как правило, назначаемая после диеты, физических упражнений и перорально вводимых лекарств, не справляется с задачей адекватного контроля уровня глюкозы в крови. Недостатками инсулиновой терапии являются необходимость инъекции лекарства, потенциальная возможность гипогликемии и увеличение веса.

IL-1β является провоспалительным цитокином, который секретируется рядом различных клеток, включая моноциты и макрофаги. При высвобождении, что является частью воспалительного процесса, IL-1β вызывает ряд биологических эффектов, в основном посредством индуцирования образования других медиаторов воспаления, таких как кортикотропин, тромбоцитарный фактор-4, простагландин Е2 (PGE2), IL-6 и IL-8. IL-1β индуцирует как местные, так и системные воспалительные эффекты за счет активации рецептора IL-1, обнаруженного в практически всех типах клеток. Семейство цитокинов интерлейкина-1 (IL-1) вовлечено в ряд болезненных состояний. Члены семейства IL-1 включают IL-1α, IL-1β и IL-1Ra. Несмотря на то что их объединяет способность связываться с рецепторами IL-1 (IL-1R1 и IL-1R2), все из этих цитокинов являются разными, экспрессируются разными генами и имеют различную первичную аминокислотную последовательность. Более того, физиологические действия этих цитокинов могут отличаться друг от друга. Эксперименты, указывающие на несомненное вовлечение IL-1β в диабет, были опубликованы.

Maedler и др., J Clin Invest (2002) 110:851-860 предположил, что при диабете 2 типа хроническая гипергликемия может оказывать пагубное влияние на β-клетки поджелудочной железы, вызывая ослабленную секрецию инсулина, и заметил, что IL-1β является провоспалительным цитокином, действующим в ходе аутоиммунного развития диабета 1 типа, и ингибирует функцию β-клеток. В частности, они проверили гипотезу, что IL-1β может медиировать опасные воздействия высоких уровней глюкозы. Лечение флоризином животных, страдающих диабетом, нормализовало уровень глюкозы в плазме и предотвратило экспрессию IL-1β β-клетками. Было сделано заключение, что это вовлекает воспалительный процесс в патогенез глюкотоксичности при диабете 2 типа. Они также идентифицировали IL-1β/NF-_KB путь в качестве цели для сохранения массы и функций β-клеток в этом состоянии.

Donath и др., J Mol med (2003) 81:455-470 заметили очевидную важность IL-1β для пути к апоптозу β-клеток в островках поджелудочной железы, ведущему к дефициту инсулина и диабету, и предложили подходы, основанные на противовоспалительной терапии, направленные на блокирование апоптоза β-клеток при диабете 1 и 2 типа.

WO 2004/002512 направлен на использование антагонистов рецептора IL-1 (IL-1Ra) и/или пирролидиндитиокарбамата (PDTC) для лечения или профилактики диабета 2 типа. Однако обычные дозы, предложенные для терапевтического использования полипептида IL-Ra при лечении диабета 2 типа (инъекции каждые 24 часа), могут привести к проблемам, связанным с согласием пациента, уменьшая, таким образом, эффективность этого способа лечения и/или ограничивая его желательность. Таким образом, необходимость в эффективных средствах для лечения диабета 2 типа осталась, особенно для тех, кто не хочет ежедневных инъекций.

Larsen и др., New England Journal of Medicine (2007) 356:1517-1526 описывает использование препарата анакинра, являющегося рекомбинантным антагонистом рецепторов IL-1 (IL-1Ra), для лечения сахарного диабета 2 типа. Однако введение 100 мг препарата анакинра один раз в день, ежедневно в течение 13 недель, может вызвать проблемы с согласием пациента, уменьшая, таким образом, эффективность этого способа лечения и/или ограничивая его желательность. Таким образом, необходимость в эффективных средствах для лечения диабета 2 типа осталась, особенно для тех, кто не хочет частых (например, ежедневных) инъекций.

US 2005/0256197 и US 2005/0152850 направлены на способ облегчения контроля метаболизма (например, глюкозы) у субъекта (например, у субъекта с диабетом), включающий понижение уровня IL-1β в жидкости десневой борозды (gingival crevicular fluid) у субъекта таким образом, чтобы уровень циркулирующего TNF понизился, в частности, за счет использования противовоспалительного агента, такого как полоскание рта противовоспалительным кеторолаком.

Ожирение является хроническим заболеванием, которое широко распространено и связано не только с социальным клеймом (стигмой), но также и с сокращением продолжительности жизни и многочисленными медицинскими проблемами, включая неблагоприятное психологическое развитие, дерматологические нарушения, такие как инфекции, варикозное расширение вен, непереносимость физических нагрузок, сахарный диабет, резистентность к инсулину, гипертензию, гиперхолестеринемию и ишемическую болезнь сердца (Rissanen и др., British Medical Journal, 301: 835-837, 1990). Ожирение четко коррелирует с резистентностью к инсулину и диабетом у экспериментальных животных и у людей. Действительно, ожирение и резистентность к инсулину, последнее из которых обычно сопровождается гиперинсулинемией или гипергликемией, или и тем и другим, являются признаками диабета 2 типа. Кроме того, диабет 2 типа связан с повышенным в два-четыре раза риском заболевания коронарной артерии. Несмотря на десятилетия исследований этих серьезных проблем здоровья, этиология ожирения и резистентности к инсулину остается неизвестной.

Резистентность к инсулину связана с рядом болезненных состояний и условий и имеется примерно у 30-40% индивидуумов, не страдающих диабетом. Эти болезненные состояния включают, но не ограничены только этими: предиабет и метаболический синдром (также называемый синдромом резистентности к инсулину). Предиабет является состоянием аномальной переносимости глюкозы, характеризующийся либо пониженной переносимостью глюкозы (IGT) либо пониженным уровнем глюкозы натощак (IFG). Пациенты с предиабетом являются инсулин-резистетными и находятся в группе повышенного риска дальнейшего прогрессирования и явного проявления диабета 2 типа. Метаболический синдром включает группу связанных между собой характерных особенностей, включая, но не ограничиваясь только этими: гиперинсулинемию, аномальную переносимость глюкозы, ожирение, перераспределение жира в брюшную область или верхний отдел тела, гипертензию, дисфибринолиз и дислипидемию, характеризующуюся высоким уровнем триглицеридов, низким уровнем холестерина высокой плотности и низкой плотностью частиц липопротеинов низкой плотности. Резистентность к инсулину связали с каждой из этих характерных особенностей, предполагая, что метаболический синдром и резистентность к инсулину тесно связаны между собой. Обнаружение (диагностирование) метаболического синдрома является сильным фактором риска дальнейшего развития диабета 2 типа, а также ускоренного развития атеросклероза, приводящего к сердечным приступам, ударам и заболеванию периферических сосудов. Было показано, что воспалительные цитокины, включая IL-1, медиируют воспаление внутри жировой ткани, что, похоже, вовлечено в резистентность адипоцитов к инсулину (Trayhurn и др., Br. J. Nutr. 92:347-355, 2004; Wisse, J. Am. Soc. Nephrol. 15:2792-2800, 2004; Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol. 115:911-919, 2005; Matsuzawa, FEBS Lett. 580:2917-2921, 2006; Greenberg и др., Eur J. Clin. Invest. 32 Suppl. 3:24-34, 2002; Jager и др., Endocrinology 148:241-251, 2007). Адипоциты являются клетками, запасающими жир и секретирующими адипокины (т.е. субпопуляцию цитокинов), и являются важнейшим компонентом жировой ткани. Макрофаги, являющиеся воспалительными клетками и основными продуцентами воспалительных цитокинов, IL-1, TNF-α и IL-6, также существуют внутри жировой ткани, особенно воспаленной жировой ткани, связанной с ожирением (Kern и др., Diabetes 52:1779-1785, 2003). Ранее было известно, что TNF-α и IL-6 уменьшают восприимчивость адипоцитов к инсулиновой стимуляции (т.е. резистентность к инсулину).

В связи с затруднениями современных способов лечения, диабета 2 типа и других симптомов, таких как перечисленные выше, необходимо заменить их новыми или дополнить доступными фармацевтическими подходами. Данное изобретение включает способ лечения диабета 2 типа. Кроме того, данное изобретение также включает способ лечения ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Раскрытые здесь способы включают, например, введение антитела к IL-1β или фрагмента антитела. Способы, в которых лиганд IL-1β связывают антителами, особенно антителами с высокой аффинностью, обладают преимуществами по сравнению с другими потенциальными способами лечения, такими как те, в которых используют антагонисты рецепторов IL-1β (например, IL-1Ra, Anakinra, Kineret®). Проблема терапевтических способов лечения, основанных на антагонистах рецепторов IL-1β, заключается в необходимости связать большое количество рецепторов, что является трудной задачей, т.к. такие рецепторы широко представлены во всех клетках за исключением эритроцитов (Dinarello, Curr. Opin. Pharmacol. 4:378-385, 2004). В большинстве иммуномедиированных заболеваний, таких как описанные в данном изобретении, количество цитокина IL-1β, измеряемого в жидкостях тела или связанного с активированными клетками, относительно мало. Поэтому способ лечения и/или профилактики, напрямую направленный на лиганд IL-1β, представляет собой превосходную стратегию, особенно при введении антител к IL-1β, обладающих высокой аффинностью.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на способы лечения и/или профилактики у млекопитающих диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, диабета 1 типа, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Такие способы могут быть использованы для лечения млекопитающих (например, людей), страдающих от или находящихся в группе риска развития диабета, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Способы также могут быть использованы для предотвращения проявления (развития) диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, у субъектов, находящихся в группе риска.

С одной стороны, данное изобретение представляет собой способ лечения у людей заболеваний или болезненных состояний, выбранных из группы, включающей: диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина, диабет 1 типа и резистентность к инсулину. Способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям. В предпочтительном варианте выполнения изобретения, заболевание или состояние выбрано из группы, включающей диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину. Предпочтительно, заболевание или состояние представляет собой диабет 2 типа, ожирение, пониженную секрецию инсулина или резистентность к инсулину. Более предпочтительно, заболевание или состояние представляет собой диабет 2 типа, ожирение или резистентность к инсулину. Наиболее предпочтительно, заболевание или состояние представляет собой диабет 2 типа. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения, способ не вызывает усиления (обострения) сердечно-сосудистого заболевания или состояния. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело или его фрагмент используют для лечения двух или более перечисленных выше заболеваний или состояний у одного пациента (например, человека).

Согласно другому аспекту изобретение предусматривает способ лечения или профилактики заболевания или состояния путем введения антитела к IL-1β или соответствующего фрагмента, причем заболевание или состояние представляет собой предиабет, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертензию, метаболический синдром или болезненное состояние. Согласно еще одному аспекту, способ снижает или предотвращает связанное с диабетом 2 типа осложнение или состояние, выбранное из группы, включающей ретинопатию, почечную недостаточность, заболевание сердечно-сосудистой системы и лечение ран у людей; способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело или фрагмент используют для лечения двух или более перечисленных выше заболеваний или состояний у одного пациента (например, человека). В другом варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент используют для лечения почечной недостаточности (например, заболевания почек), которая может быть следствием состояния, не являющегося диабетом 2 типа. Еще в одном варианте выполнения изобретения, антитело или фрагмент используют для снижения уровня C-реактивного белка (CRP) у субъекта с повышенными уровнями CRP.

Согласно другому аспекту изобретения заявляются антитела к IL-1β или фрагменты таких антител для использования в лечении или профилактике указанных заболеваний или состояний. Кроме того, в изобретении заявлены антитела к IL-1β или фрагменты таких антител для использования в лечении или профилактике заболевания или состояний, выбранных из группы, включающей диабет 2 типа, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину. Еще в одном аспекте изобретение включает антитела к IL-1β или фрагменты таких антител для использования в лечении или профилактике диабета 2 типа.

Согласно другому аспекту изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие антитела к IL-1β или фрагменты таких антител и, необязательно, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенные для использования в лечении или для профилактики указанных в изобретении заболевания или состояний. Кроме того, изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие антитела к IL-1β или фрагменты антител и, необязательно, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенные для использования в лечении или для профилактики заболевания или состояний, выбранных из группы, включающей диабет 2 типа, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину. Еще в одном аспекте изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие антитела к IL-1β или фрагменты таких антител и, необязательно, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенные для использования при лечении или для профилактики диабета 2 типа.

Антитела к IL-1β или фрагменты таких антител, используемые в способах согласно данному изобретению, обычно обладают высокой аффинностью связывания с IL-1β. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения константа диссоциации связывания антитела или фрагмента антитела с IL-1β составляет примерно 10 нМ или меньше, около 5 нМ или меньше, около 1 нМ или меньше, около 500 пМ или меньше, около 250 пМ или меньше, около 100 пМ или меньше, около 50 пМ или меньше или около 25 пМ или меньше. В особенно предпочтительных вариантах выполнения изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 100 пМ или меньше, примерно 50 пМ или меньше, примерно 10 пМ или меньше, примерно 5 пМ или меньше, примерно 3 пМ или меньше, примерно 1 пМ или меньше, примерно 0.75 пМ или меньше, примерно 0.5 пМ или меньше, примерно 0.3 пМ или меньше, примерно 0.2 пМ или меньше или примерно 0.1 пМ или меньше. В особенно предпочтительных вариантах выполнения изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 10 пМ или меньше.

Согласно другому аспекту изобретения антитело к IL-1β или фрагмент антитела является нейтрализующим антителом. Согласно другому аспекту антитело к IL-1β или фрагмент антитела связывается с эпитопом IL-1β таким образом, что связанное антитело или фрагмент в значительной степени допускает связывание IL-1β с рецептором I IL-1 (IL-1RI). Согласно другому аспекту антитело к IL-1β или фрагмент антитела связывается с IL-1β, но при этом заметно не препятствует связыванию связанного IL-1β с рецептором I IL-1 (IL-1RI). Согласно другому аспекту антитело или фрагмент антитела не связывается с IL-1α, IL-1R или IL-1Ra в степени, доступной для обнаружения/детекции. Согласно еще одному аспекту данного изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом, содержащимся в последовательности ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO 1). Согласно еще одному аспекту данного изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом, содержащим Glu64 интерлейкина IL-1β. Согласно другому аспекту изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с аминокислотами 1-34 N-конца IL-1β. Предпочтительно, антитело или фрагмент антитела является разработанным для человека (human engineered), гуманизированным или человеческим.

Согласно другому аспекту, изобретение включает способ лечения проявляющихся у людей симптомов упомянутых выше заболеваний или состояний или симптомов риска развития таких заболеваний или состояний (например, диабета 1 типа, диабета 2 типа, гипергликемии, гиперинсулинемии, ожирения, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину). Способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям в одну или несколько доз.

Согласно другому аспекту данного изобретения заявляется способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей: диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину. Способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям, причем после введения начальной дозы антитела к IL-1β или фрагмента антитела вводят одну или более последующих доз. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела вводят две или более последующие дозы. Согласно другому варианту выполнения изобретения, после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела вводят одну или более последующих доз, причем эти одна или более последующие дозы по величине являются примерно такими же или меньше, чем начальная доза. В другом варианте выполнения изобретения после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела вводят одну или более последующих доз, причем, по крайней мере, одна из последующих доз по величине является больше, чем начальная доза.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения вводят две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, десять или более или одиннадцать или более последующих доз антитела. В другом варианте выполнения изобретения введение начальной дозы и каждой одной или более последующих доз отделены друг от друга периодом, по крайней мере, примерно две недели, по крайней мере, примерно три недели, по крайней мере, примерно один месяц, по крайней мере, примерно два месяца, по крайней мере, примерно три месяца, по крайней мере, примерно четыре месяца, по крайней мере, примерно пять месяцев, по крайней мере, примерно шесть месяцев, по крайней мере, примерно семь месяцев, по крайней мере, примерно восемь месяцев, по крайней мере, примерно девять месяцев, по крайней мере, примерно десять месяцев, по крайней мере, примерно одиннадцать месяцев, или, по крайней мере, примерно двенадцать месяцев.

В другом варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз по 5 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 3 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 2 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.75 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.5 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.3 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше или 0.03 мг антитела или фрагмента на кг или меньше. Предпочтительно, в каждом из перечисленных выше вариантов выполнения изобретения антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз, по крайней мере, 0.01 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.03 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.05 мг антитела или фрагмента на кг или, по крайней мере, 0.09 мг антитела или фрагмента на кг. Перечисленные выше дозировки приведены в мг (антитела или фрагмента) на кг (массы индивидуума, которого предполагается лечить).

В другом варианте выполнения изобретения начальная доза и одна или более последующих доз антитела или фрагмента составляют каждая от примерно 0.01 мг/кг до примерно 10 мг антитела на кг, от примерно 0.05 до примерно 5 мг антитела на кг, от примерно 0.05 мг/кг до примерно 3 мг антитела на кг, от примерно 0.1 мг антитела на кг до примерно 3 мг/кг, от примерно 0.1 мг/кг до примерно 1 мг антитела на кг, от примерно 0.1 мг/кг до примерно 0.5 мг антитела на кг, от примерно 0.3 мг/кг до примерно 5 мг антитела на кг, от примерно 0.3 мг/кг до примерно 3 мг антитела на кг, от примерно 0.3 мг/кг до примерно 1 мг антитела на кг, от примерно 0.5 мг/кг до примерно 5 мг антитела на кг, от примерно 0.5 мг/кг до примерно 3 мг антитела на кг, от примерно 0.5 мг/кг до примерно 1 мг антитела /кг, от примерно 1 мг/кг до примерно 5 мг антитела на кг или от примерно 1 мг/кг до примерно 3 мг антитела на кг. В определенных вариантах выполнения изобретения вводят две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, десять или более или одиннадцать или более последующих доз антитела. Перечисленные выше дозировки приведены в мг (антитела или фрагмента) на кг (массы индивидуума, которого предполагается лечить). Это относится ко всем приведенным далее дозировкам.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 5 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 3 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 0.5 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 0.3 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента в виде начальной дозы, составляющей примерно 0.1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, и множества последующих доз антитела или фрагмента в количестве примерно таком же или меньше, чем начальная доза, при этом последующие дозы разделены временным интервалом, по крайней мере, 2 недели.

Предпочтительно, в перечисленных выше вариантах выполнения изобретения, согласно которым антитело или фрагмент вводят в виде начальной дозы и множества последующих доз, доза антитела или фрагмента составляет, по крайней мере, 0.01 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.03 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.05 мг антитела или фрагмента на кг или, по крайней мере, 0.09 мг антитела или фрагмента на кг.

Согласно еще одному аспекту данного изобретения, антитело или фрагмент вводят в виде фиксированной дозы, независящей от соотношения дозы и массы субъекта. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело или фрагмент вводят в виде одной или более фиксированных доз, составляющих 1000 мг или меньше антитела или фрагмента, 750 мг или меньше антитела или фрагмента, 500 мг или меньше антитела или фрагмента, 250 мг или меньше антитела или фрагмента, 100 мг или меньше антитела или фрагмента или примерно 25 мг или меньше антитела или фрагмента. В другом варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент вводят в виде одной или более фиксированных доз, составляющих, по крайней мере, примерно 1 мг антитела или фрагмента, по крайней мере, около 5 мг антитела или фрагмента или, по крайней мере, около 10 мг антитела или фрагмента.

В определенных вариантах выполнения изобретения фиксированная доза составляет от примерно 1 мг до примерно 10 мг, от примерно 1 мг до примерно 25 мг, от примерно 10 мг до примерно 25 мг, от примерно 10 мг до примерно 50 мг, от примерно 10 мг до примерно 100 мг, от примерно 25 мг до примерно 50 мг, от примерно 25 мг до примерно 100 мг, от примерно 50 мг до примерно 100 мг, от примерно 50 мг до примерно 150 мг, от примерно 100 мг до примерно 150 мг, от примерно 100 мг до примерно 200 мг, от примерно 150 мг до примерно 200 мг, от примерно 150 мг до примерно 250 мг, от примерно 200 мг до примерно 250 мг, от примерно 200 мг до примерно 300 мг, от примерно 250 мг до примерно 300 мг, от примерно 250 мг до примерно 500 мг, от примерно 300 мг до примерно 400 мг, от примерно 400 мг до примерно 500 мг, от примерно 400 мг до примерно 600 мг, от примерно 500 мг до примерно 750 мг, от примерно 600 мг до примерно 750 мг, от примерно 700 мг до примерно 800 мг, от примерно 750 мг до примерно 1000 мг. В предпочтительном варианте выполнения изобретения, фиксированная доза выбрана из группы, включающей от примерно 1 мг до примерно 10 мг, от примерно 1 мг до примерно 25 мг, от примерно 10 мг до примерно 25 мг, от примерно 10 мг до примерно 100 мг, от примерно 25 мг до примерно 50 мг, от примерно 50 мг до примерно 100 мг, от примерно 100 мг до примерно 150 мг, от примерно 150 мг до примерно 200 мг, от примерно 200 мг до примерно 250 мг.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение людям терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента, причем после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела вводят одну или несколько последующих доз, отличающийся тем, что допустимо снижение концентрации указанного антитела или фрагмента антитела в плазме людей ниже уровня примерно 0.1 мкг/мл в течение периода времени, большего примерно 1 недели и меньшего примерно 6 месяцев между введениями во время курса лечения указанных начальной дозы и одной или более последующих доз. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения допустимо снижение концентрации указанного антитела или фрагмента антитела в плазме людей ниже уровня примерно 0.07 мкг/мл, примерно до 0.05 мкг/мл, примерно до 0.03 мкг/мл или примерно до 0.01 мкг/мл в течение периода времени, большего примерно 1 недели и меньшего примерно 5 месяцев, примерно 4 месяцев, примерно 3 месяцев, примерно 2 месяцев, примерно 1 месяца, примерно 3 недель или примерно 2 недель между введениями. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения эти уровни в плазме относятся к уровням, измеренным для индивидуума, которого лечат антителом или фрагментом антитела в соответствии с изобретением. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения таким индивидуумом может быть пациент, страдающий от упомянутых ранее заболеваний, таких как диабет 2 типа.

Изобретение предусматривает, что антитело к IL-1β или его фрагмент, используемый в соответствии с описываемыми методами, может быть введено в любых (из перечисленных здесь) дозировках, при любом количестве (из перечисленных) последующих доз и при любых (из перечисленных) интервалах между введениями, причем любые из перечисленных дозировок, числа последующих доз и интервалов между введениями можно комбинировать друг с другом в альтернативных режимах для корректировки терапевтической пользы. В определенных вариантах выполнения изобретения одна или более последующих доз являются практически такими же по размеру или меньше, чем первая введенная доза. В другом варианте выполнения изобретения одна или более последующих доз являются по размеру практически такими же или больше, чем начальная доза. Предпочтительно, антитело к IL-1β или фрагмент вводят с помощью подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции. Изобретение предусматривает, что каждая доза антитела или фрагмента может быть введена в одно или в несколько мест.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения или профилактики заболевания или состояния у людей, используя антитело к IL-1β или фрагмент антитела, причем заболевание или состояние является диабетом 2 типа, и доза антитела или фрагмента является достаточной, чтобы достичь, по крайней мере, 0.5, по крайней мере, 1.0, по крайней мере, 1.5, по крайней мере, 2.0, по крайней мере, 2.5, или, по крайней мере, 3.0 процентного улучшения уровня гемоглобина A1c. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения эти значения параметра относятся к значениям, определенным для индивидуума, которого лечат антителом или фрагментом антитела в соответствии с изобретением. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения таким индивидуумом может быть пациент, страдающий от упомянутых заболеваний, таких как диабет 2 типа.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения улучшение уровня гемоглобина A1c является достаточным, чтобы удовлетворить регулятивные принципы для принятия (одобрения) терапевтических средств при лечении диабета 2 типа. Способы исследования для определения гемоглобина A1c хорошо известны из уровня техники. Изобретение предусматривает, что доза антитела или фрагмента, достаточная для достижения улучшения гемоглобина A1c, может включать любую из описанных ранее дозировок, любое (из описанных ранее) количество последующих доз и любые (из описанных ранее) интервалы между введениями доз, а также любую комбинацию дозировок, количества последующих доз и интервалов между введениями описанных антитела или его фрагмента. Кроме того, улучшение гемоглобина A1c может наступить в момент времени, по крайней мере, через примерно 1 месяц, через примерно 2 месяца, через примерно 3 месяца, через примерно 4 месяца или через примерно 5 месяцев и предпочтительно через примерно 6 месяцев или более, через примерно 7 месяцев или более, через примерно 8 месяцев или более, через примерно 9 месяцев или более, через примерно 10 месяцев или более, через примерно 11 месяцев или более или через примерно 12 месяцев или более после первоначального введения одной или более доз антитела или фрагмента.

Согласно другому аспекту упомянутых выше способов лечения или предотвращения диабета 2 типа, способ позволяет достичь, по крайней мере, одного из следующих изменений: снижения уровня сахара в крови натощак, уменьшения резистентности к инсулину, ослабления гиперинсулинемии, улучшения переносимости глюкозы, снижения C-реактивного пептида (CRP), повышения секреции инсулина и уменьшения гипергликемии, уменьшения необходимости медикаментозного лечения диабета, снижения индекса массы тела (BMI), изменения AUC глюкоза / С-пептид инсулина, снижения уровня глюкозы в моче, уменьшения острофазовых реактантов, снижения уровня липидов в сыворотке при улучшении липидного профиля в свете риска сердечно-сосудистых нарушений. Способы определения любого указанного изменения хорошо известны из уровня техники. Кроме того, изобретение предусматривает, что достижение одного из упомянутых изменений может наступить в момент времени, по крайней мере через примерно 1 месяц, примерно 2 месяца, примерно 3 месяца, примерно 4 месяца или примерно 5 месяцев и предпочтительно через примерно 6 месяцев или более, примерно 7 месяцев или более, примерно 8 месяцев или более, примерно 9 месяцев или более, примерно 10 месяцев или более, примерно 11 месяцев или более или через примерно 12 месяцев или более после первоначального введения одной или более доз антитела или фрагмента.

Согласно другому аспекту изобретения заявляемый способ снижает или предотвращает связанное с диабетом 2 типа осложнение или состояние, выбранное из группы, включающей ретинопатию, почечную недостаточность, заболевание сердечно-сосудистой системы и заживление ран, причем способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения осложнение или состояние представляет собой заболевание сердечно-сосудистой системы, причем заболевание сердечно-сосудистой системы является атеросклерозом или заболеванием периферических сосудов. В другом варианте выполнения изобретения осложнение или состояние представляет собой заживление ран, причем указанное заживление ран является диабетической язвой. Согласно другому аспекту способ предотвращает или приостанавливает (откладывает) терминальную стадию почечной недостаточности или диабетическую невропатию. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело к IL-1β или фрагмент вводят в комбинации, по крайней мере, с одним другим общепринятым с медицинской точки зрения способом лечения заболевания, состояния или осложнения. В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере, один другой общепринятый с медицинской точки зрения способ лечения заболевания, состояния или осложнения сокращается или приостанавливается, причем лечение антителом к IL-1β или его фрагментом проводят в режиме постоянных дозировок. В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере, один другой общепринятый с медицинской точки зрения способ лечения заболевания, состояния или осложнения сокращают или приостанавливают, причем лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращают. В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере, один другой общепринятый с медицинской точки зрения способ лечения заболевания, состояния или осложнения сокращают или приостанавливают, а лечение антителом к IL-1β или его фрагментом усиливают (увеличивают). Еще в одном варианте выполнения изобретения, по крайней мере один другой общепринятый с медицинской точки зрения способ лечения заболевания, состояния или осложнения сохраняют на прежнем уровне, а лечение антителом к IL-1β или его фрагментом сокращают или приостанавливают. Еще в одном варианте выполнения изобретения, по крайней мере, один другой общепринятый с медицинской точки зрения способ лечения заболевания, состояния или осложнения и лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращаются или приостанавливают.

Согласно другому аспекту изобретения заявляется способ уменьшения количества C-реактивного белка у субъекта, включающий введение антитела к IL-1β или его фрагмента субъекту. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз, составляющих 1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.75 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.5 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.3 мг антитела или фрагмента на кг или меньше, 0.1 мг антитела или фрагмента на кг или меньше или 0.03 мг антитела или фрагмента на кг или меньше. Предпочтительно, антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз, составляющих, по крайней мере, 0.01 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.03 мг антитела или фрагмента на кг, по крайней мере, 0.05 мг антитела или фрагмента на кг, или, по крайней мере, 0.09 мг антитела или фрагмента на кг. В другом варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент вводят независимо от соотношения размера дозы и массы субъекта, в виде одной или более фиксированных доз, составляющих 500 мг или меньше антитела или фрагмента, 250 мг или меньше антитела или фрагмента, 100 мг или меньше антитела или фрагмента или примерно 25 мг или меньше антитела или фрагмента. Предпочтительно, антитело или фрагмент вводят в виде одной или более фиксированных доз, составляющих, по крайней мере, примерно 1 мг антитела или фрагмента, по крайней мере, примерно 5 мг антитела или фрагмента или, по крайней мере, примерно 10 мг антитела или фрагмента. В другом варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент антитела связывается с IL-1β с константой диссоциации примерно 500 пМ или меньше, 250 пМ или меньше, примерно 100 пМ или меньше, примерно 50 пМ или меньше или примерно 25 пМ или меньше, примерно 10 пМ или меньше, примерно 5 пМ или меньше, примерно 3 пМ или меньше, примерно 1 пМ или меньше, примерно 0.75 пМ или меньше, примерно 0.5 пМ или меньше, примерно 0.3 пМ или меньше, примерно 0.2 пМ или меньше или примерно 0.1 пМ или меньше. В другом варианте выполнения изобретения после введения начальной дозы антитела вводят одну или более последующих доз, отделенных друг от друга периодом, по крайней мере, примерно две недели, по крайней мере, примерно три недели, по крайней мере, примерно один месяц, по крайней мере, примерно два месяца, по крайней мере, примерно три месяца, по крайней мере, примерно четыре месяца, по крайней мере, примерно пять месяцев, по крайней мере, примерно шесть месяцев, по крайней мере, примерно семь месяцев, по крайней мере, примерно восемь месяцев, по крайней мере, примерно девять месяцев, по крайней мере, примерно десять месяцев, по крайней мере, примерно одиннадцать месяцев или, по крайней мере, примерно двенадцать месяцев. В другом варианте выполнения изобретения заявляется указанный способ снижения количества C-реактивного белка у субъекта, отличающийся тем, что субъект страдает от заболевания почек (например, хронической болезни почек, почечной недостаточности). В другом варианте выполнения изобретения субъект страдает от диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. В другом варианте выполнения изобретения субъект страдает от заболевания или состояния предиабета, дислипидемии, гиперлипидемии, гипертензии, метаболического синдрома или болезненного состояния. Перечисленные выше дозировки приведены в мг (антитела или фрагмента) на кг (массы тела индивидуума, которого предполагается лечить). Введение антител или фрагментов, характеризующихся приведенными выше константами диссоциации, может быть осуществлено любыми перечисленными выше дозами и с любыми интервалами между введениями доз (при введении двух или более доз).

Согласно другому аспекту заявляемые способы осуществляются совместно, по крайней мере, с одним дополнительным способом лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или его фрагментом. Еще в одном аспекте заявляемые способы предотвращают или уменьшают необходимость использования, по крайней мере, одного дополнительного способа лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом. Согласно еще одному аспекту, заявляемые способы снижают количество, частоту или продолжительность, по крайней мере, одного дополнительного способа лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения, по крайней мере одна фармацевтическая композиция, содержащая активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом, выбрана из группы, включающей сульфонилмочевину, меглитинид, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, тиазолидинедион, пептид, аналогичный глюкагону, и инсулин. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой сульфонилмочевину. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой меглитинид. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой бигуанид. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой ингибитор альфа-глюкозидазы. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой тиазолидинедион. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой пептид, аналогичный глюкагону. В другом варианте выполнения изобретения активный агент представляет собой инсулин. В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере, одна фармацевтическая композиция, содержащая активный агент, включает два активных агента. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения два активных агента представляют собой сульфонилмочевину и бигуанид. В другом варианте выполнения изобретения два активных агента представляют собой тиазолидинедион и бигуанид. Еще в одном варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сохраняют на прежнем уровне. В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом снижают или приостанавливают, в то время как лечение с помощью антитела к IL-1β или его фрагмента сохраняют на прежнем уровне постоянного режима дозировок. В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом снижают или приостанавливают и лечение с помощью антитела к IL-1β или фрагмента сокращают. В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом снижают или приостанавливают, в то время как лечение с помощью антитела к IL-1β или фрагмента увеличивают. Еще в одном варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сохраняют на прежнем уровне, а лечение с помощью антитела к IL-1β или фрагмента сокращают или приостанавливают. Еще в одном варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом и лечение с помощью антитела к IL-1β или его фрагмента сокращают или приостанавливают.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента людям, при этом после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела вводят одну или более последующих доз, при этом концентрацию антитела или фрагмента антитела в плазме людей поддерживают на уровне, по крайней мере, около 0.03 мкг/мл, по крайней мере, около 0.05 мкг/мл, по крайней мере, около 0.08 мкг/мл, по крайней мере, около 0.1 мкг/мл, по крайней мере, около 0.15 мкг/мл, по крайней мере, около 0.2 мкг/мл, по крайней мере, около 0.25 мкг/мл, по крайней мере, около 0.3 мкг/мл, по крайней мере, около 0.4 мкг/мл, по крайней мере, около 0.5 мкг/мл, по крайней мере, около 0.6 мкг/мл, по крайней мере, около 0.8 мкг/мл, по крайней мере, около 1 мкг/мл, по крайней мере, около 1.5 мкг/мл, по крайней мере, около 2 мкг/мл, по крайней мере, около 3 мкг/мл, по крайней мере, около 4 мкг/мл или, по крайней мере, около 5 мкг/мл в течение курса лечения с помощью указанной начальной дозы и одной или более последующих доз. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения эти уровни в плазме относятся к уровням, определенным для индивидуума, проходящего лечение антителом или фрагментом в соответствии с изобретением. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения таким индивидуумом может быть пациент, страдающий от одного из перечисленных далее заболеваний, таких как диабет 2 типа.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента людям, при этом введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям приводит к уменьшению продукции одного или более генных продуктов, выбранных из группы, включающей лептин, резистин, висфатин, RANTES, IL-6, MCP-1, PAI-1, белок, стимулирующий ацилирование (ASP), SAA3, пентраксин-3, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF), IL-1RA, IL-12, IL-8 и TNF-α. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям приводит к уменьшению продукции одного или более генных продуктов, выбранных из группы, включающей лептин, резистин и висфатин. В другом варианте выполнения изобретения введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям приводит к уменьшению экспрессии одного или более генных продуктов, выбранных из группы, включающей MCP-1, RANTES, IL-6, TNF-α и пентраксин-3. Еще в одном варианте выполнения изобретения указанное уменьшение продукции одного или более генных продуктов происходит из жировой ткани. Еще в одном варианте выполнения изобретения указанное уменьшение фиксируется в крови людей.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента людям, при этом введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям приводит к увеличению секреции адипонектина. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения указанное увеличение секреции адипонектина происходит из жировой ткани. В другом варианте выполнения изобретения указанное увеличение детектируется в крови людей.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента людям, при этом согласно анализу ингибирования IL-1β в цельной крови людей, позволяющему определить индуцированную IL-1β продукцию IL-8, антитело к IL-1β или его фрагмент характеризуются меньшим значением IC₅₀, чем антагонист рецепторов IL-1β. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения по данным анализа ингибирования IL-1β в цельной крови людей, позволяющего определить индуцированную IL-1β продукцию IL-8, антитело или фрагмент характеризуются IC₅₀, величина которого составляет менее примерно 90%, 80%, 70%, 60%, 50% от значения IC₅₀ для антагониста рецепторов IL-1β. Согласно еще одному варианту выполнения изобретения антитело или фрагмент характеризуются IC₅₀, величина которого составляет менее примерно 40%, 30%, 20%, 10% от значения IC₅₀ для антагониста рецепторов IL-1β (по данным анализа ингибирования IL-1β в цельной крови людей, позволяющего определить индуцированную IL-1β продукцию IL-8). В предпочтительном варианте выполнения изобретения антитело или фрагмент характеризуются IC₅₀, величина которого составляет менее примерно 8%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% от значения IC₅₀ для антагониста рецепторов IL-1β (по данным анализа ингибирования IL-1β в цельной крови людей, позволяющего определить индуцированную IL-1β продукцию IL-8). Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антагонистом рецепторов IL-1β является анакинра (т.е. кинерет, Kineret®).

Согласно другому аспекту изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента людям, при этом согласно исследованиям, описанным Economides и др., Nature Med., 9:47-52 (2003), включенным в изобретение в виде ссылки, антитело или его фрагмент in vivo ингибируют стимулированное IL-1β высвобождение IL-6 у мышей по сравнению с контрольным антителом. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело или фрагмент in vivo ингибирует стимулированное IL-1β высвобождение IL-6 у мышей, по крайней мере, примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% по сравнению с контрольным антителом. Согласно еще одному варианту выполнения изобретения антитело или фрагмент in vivo ингибирует стимулированное IL-1β высвобождение IL-6 у мышей, по крайней мере, примерно на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% по сравнению с контрольным антителом. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения контрольное антитело представляет собой изотип антитела в качестве контроля.

Согласно другому аспекту, изобретение включает способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к IL-1R или его фрагмента людям, при этом, антитело или его фрагмент ингибирует индуцированную Staphylococcus epidermidis продукцию цитокина в цельной крови людей по сравнению с контролем, в котором антитело не использовали. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело или фрагмент оказывают более сильное ингибирующее действие на индуцированную Staphylococcus epidermidis продукцию цитокина в цельной крови людей, по крайней мере, примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% по сравнению с контролем. Согласно еще одному варианту выполнения изобретения антитело или фрагмент оказывает более сильное ингибирующее действие на индуцированную Staphylococcus epidermidis продукцию цитокина в цельной крови людей, по крайней мере, примерно на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% по сравнению с контролем. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения ингибируемыми цитокинами являются IL-1β, IL-1a, IL-6, IL-8, IL-1Ra, TNFα или IFNγ.

Согласно другому аспекту изобретение включает использование антитела к IL-1β или его фрагмента с меньшим значением IC₅₀, чем антагонист рецепторов IL-1β (по данным анализа ингибирования IL-1β в цельной крови людей, позволяющего определить индуцированную IL-1β продукцию IL-8) для производства композиции, предназначенной для использования в лечении диабета 1 типа, диабета 2 типа, гипергликемии, гиперинсулинемии, ожирения, пониженной секреции инсулина и резистентности к инсулину. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антагонистом рецепторов IL-1β является анакинра (т.е. кинерет, Kineret®).

Согласно другому аспекту изобретения предусматривается использование антитела к IL-1β или связывающих фрагментов для производства лекарства, предназначенного для лечения или профилактики заболевания или состояния, такого как описанные. При любых использованиях лекарственное средство может быть скоординировано с лечением, в котором используется второй активный агент. В другом варианте выполнения изобретения предусматривается использование синергической комбинации, включающей антитело по данному изобретению, для получения лекарства, предназначенного для лечения пациента, имеющего симптомы или находящегося в группе риска по развитию упоминаемых заболеваний или состояний, при этом использование лекарственного средства скоординировано с лечением, в котором используется второй активный агент. Еще в одном близком варианте выполнения изобретения заявляется композиция, в которой вторым активным агентом является другое антитело, фактор роста, цитокин или инсулин. Существуют варианты выполнения изобретения, предусматривающие любое использование из перечисленных выше, согласно которым антитело или фрагмент, связывающий IL-1β, содержится в лекарстве в таком количестве, чтобы эффективно снижать дозировку второго активного агента, требующегося для достижения терапевтического эффекта.

Согласно еще одному аспекту данного изобретения предусматривается изделие, включающее контейнер, композицию внутри контейнера, содержащую антитело к IL-1β или его фрагмент, и листовку-вкладыш в упаковке, содержащую инструкции по введению антитела или фрагмента людям, нуждающимся в лечении описанными выше способами по данному изобретению. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения контейнер дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В близком варианте выполнения изобретения композиция внутри контейнера дополнительно содержит второй активный агент. Еще в одном близком варианте выполнения изобретения заявляется композиция, в которой второй активный агент является другим антителом, фактором роста, цитокином или инсулином.

Киты (наборы) также предусматриваются данным изобретением. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения набор включает терапевтически или профилактически эффективное количество антитела к IL-1β или фрагмента, упакованного в контейнер, такой как пузырек или флакон, содержит также этикетку, прикрепленную к контейнеру или упакованную вместе с контейнером, причем на этикетке описано содержимое контейнера и имеются указания и/или инструкции относительно использования содержимого контейнера для лечения или предотвращения заболевания или состояния в соответствии с описанными ранее способами по данному изобретению. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения контейнер также содержит фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В близком варианте выполнения изобретения композиция внутри контейнера дополнительно содержит второй активный агент. Еще в одном близком варианте выполнения изобретения второй активный агент включает другое антитело, фактор роста, цитокин или инсулин.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения изделие, кит (набор) или лекарство предназначены для лечения или предотвращения заболевания или состояния у людей, причем заболевание или состояние выбрано из группы, включающей диабет 1 типа, диабет 2 типа, гипергликемию, гиперинсулинемию, ожирение, пониженную секрецию инсулина и резистентность к инсулину. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения заболевание или состояние выбрано из группы, включающей диабет 2 типа, ожирение и резистентность к инсулину. В другом варианте выполнения изобретения инструкции на листовке-вкладыше в упаковке изделия или этикетка на наборе содержат инструкции по введению антитела или фрагмента в соответствии с любыми описанными выше дозировками, количеством последующих доз и интервалами между введениями, а также любой комбинацией описанных дозировок, количества последующих доз и интервалов между введениями. Еще в одном варианте выполнения изобретения контейнер с набором или изделием представляет собой предварительно заполненный шприц.

Следует понимать, что поскольку данное описание включает способы лечения с использованием антител или их фрагментов, обладающих определенными свойствами (такими как значения Kd или IC₅₀), изобретение включает и использование таких антител или их фрагментов в производстве лекарств, предназначенных для использования согласно этим способам. Кроме того, изобретение также включает антитела или их фрагменты, обладающие описанными свойствами, а также фармацевтические композиции, включающие эти антитела или их фрагменты, для использования согласно описанным способам лечения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой графическое изображение результатов экспериментов по ингибированию IL-1β антителом, обозначенным АВ7, и Kineret®, включающими индуцированную IL-1 продукцию IL-8 in vitro.

Фиг.2 представляет собой графическое изображение результатов экспериментов по ингибированию IL-1β антителами, обозначенными АВ5 и АВ7, включающих индуцированное IL-1 высвобождение IL-6 in vivo.

Фиг.2B представляет собой графическое изображение результатов экспериментов по ингибированию IL-1β in vivo антителом, обозначенным АВ7, включающих индуцированное IL-1 высвобождение IL-6, и сравнительного ингибирования человеческого (вставка А) и мышиного (вставка В) IL-1β.

Фиг.3 представляет собой графическое изображение концентраций антитела в сыворотке крыс после введения 0.1, 1 или 10 мг/кг антитела к IL-1β.

Фиг.4 представляет собой графическое изображение концентраций антитела в сыворотке обезьян Cynomolgus после введения 0.3 или 3 мг/кг антитела к IL-1β.

Фиг.5 представляет собой графическое моделирование концентрационных профилей антитела к IL-1β в плазме обезьян Cynomolgus после пяти доз по 0.1, 0.3, 1 или 3 мг/кг, введенных ежемесячно.

Фиг.6 представляет собой таблицу, показывающую снижение индуцированной Staphyloccus epidermidis секреции цитокинов в цельной крови людей при лечении антителом к IL-1β.

Фиг.7 представляет собой графическое изображение фармакокинетики АВ7 у людей после введения антитела в количестве 0.01 мг/кг.

Фиг.8 представляет собой графическое изображение влияния введения АВ7 в количестве 0.01 мг/кг на снижение уровней CRP у людей.

Фиг.9 представляет собой графическое изображение влияния введения АВ7 в количестве 0.03 мг/кг на снижение уровней CRP у людей.

Фиг.10 представляет собой графическое изображение уровней CRP в контрольных экспериментах у групп людей, получавших плацебо в количестве 0.01 или 0.03 мг/кг.

Фиг.11 представляет собой графическое моделирование уровней CRP у людей после введения различных доз антитела, обладающего свойствами, сходными с АВ7, через 28-дневные интервалы.

Фиг.12 представляет собой графическое изображение влияния АВ7 на диабет 2 типа в мышиной модели ожирения, вызванного рационом питания.

ДЕТАЛЬНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IL-1β является провоспалительным цитокином, который секретируется рядом клеток различных типов, включая моноциты и макрофаги. Высвобождаясь как часть воспалительной реакции, IL-1β вызывает ряд биологических эффектов, в основном медиируемых посредством возбуждения других медиаторов воспаления, таких как кортикотропин, тромбоцитарный фактор-4, простагландин Е2 (PGE2), IL-6 и IL-8. IL-1β индуцирует как местные, так и системные воспалительные эффекты за счет активации рецептора IL-1, обнаруженного в практически всех типах клеток.

Семейство цитокинов интерлейкина-1 (IL-1) вовлечено в ряд болезненных состояний, таких как ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит (UC), септический шок, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), астма, гомологичное заболевание, вызванное реакцией «трансплантат против хозяина», атеросклероз, Т-клеточная лейкемия взрослых, множественная миелома, рассеянный склероз, удар и болезнь Альцгеймера. Члены семейства IL-1 включают IL-1α, IL-1β и IL-1Ra. Несмотря на то что их способность объединяет способность связываться с рецепторами IL-1 (IL-1R1 и IL-1R2), каждый из этих цитокинов экспрессируется особым геном и имеет особую первичную аминокислотную последовательность. Более того, физиологические действия этих цитокинов могут отличаться друг от друга.

Соединения, которые нарушают сигнализацию рецептора IL-1, были изучены в качестве терапевтических агентов для лечения IL-1-медиированных заболеваний, таких как, например, некоторые из перечисленных ранее. Эти соединения включают рекомбинантный IL-1Ra (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), пептид, связывающий IL-1 рецептор (IL-1 receptor "trap" peptide, Regeneron Inc., Tarrytown, NY), а также антитела к IL-1β животного происхождения и рекомбинантные антитела к IL-1β и их фрагменты.

Как уже говорилось выше, для использования при лечении диабета 2 типа был предложен полипептид антагонист рецептора IL-1 (IL-1Ra) (WO 2004/002512). Однако необходимость в эффективных средствах лечения диабета 2 типа сохраняется, особенно для пациентов, не желающих делать ежедневные, повторяющиеся инъекции. Дополнительная проблема терапевтических способов лечения, основанных на антагонистах рецепторов IL-1β, заключается в необходимости при такой терапии занять (связать) большое количество рецепторов, что является труднопреодолимой задачей, т.к. такие рецепторы широко представлены во всех клетках за исключением эритроцитов (Dinarello, Curr. Opin. Pharmacol. 4:378-385, 2004). В большинстве иммуномедиированных заболеваний, таких как описанные в данном изобретении, количество цитокина IL-1β, измеряемого в жидкостях тела или связанного с активированными клетками, относительно мало. Поэтому способ лечения и/или профилактики, напрямую направленный на лиганд IL-1β, представляет собой превосходную стратегию, особенно при введении антител к IL-1β, обладающих высокой аффинностью.

В данном изобретении заявлены способы и связанные с ними изделия (товары), предназначенные для лечения и/или профилактики у млекопитающих диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, с помощью специфичного к IL-1β антитела или его фрагмента.

Как показано далее в Примере 1, мы с удивлением обнаружили, что такое антитело (например, с высокой аффинностью) может быть значительно более эффективным ингибитором метаболического пути IL-1, чем IL-Ra (например, Kineret®), что, как показано далее в Примере 9, дает возможность достижения терапевтического эффекта при более низких дозах и/или при меньшей частоте введения, чем необходимо для других лекарственных препаратов, таких как рекомбинантный IL-1Ra.

Способы с использованием антитела к IL-1β или фрагмента, такие как описанные здесь, могут включать лечение субъекта, страдающего от диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, гипоинсулинемии, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Способы также могут включать предотвращение проявления диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной секреции инсулина, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, или предотвращать проявление описанных заболеваний у субъектов, находящихся в группе риска. Термин «гиперинсулинемия» относится к относительной гиперинсулинемии, являющейся результатом резистентности к инсулину.

Антитела, гуманизированные антитела и антитела, разработанные для людей (Human Engineered Antibodies)

IL-1-связывающие антитела (например, IL-1β) по данному изобретению могут быть получены в виде поликлональных антител, моноклональных антител (mAbs), рекомбинантных антител, химерных антител, CDR-привитых антител, полностью человеческих антител, одноцепочечных антител и/или биспецифических антител, а также фрагментов, включая варианты и производные, полученные известными способами, включая, но не ограничиваясь только этими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или способы рекомбинации.

Антитела обычно включают две тяжелые полипептидные цепи и две легкие полипептидные цепи, хотя антитела с одиночным доменом, имеющие одну тяжелую и одну легкую цепь, а также антитела с тяжелой цепью, лишенные легкой цепи, также предусматриваются. Существуют пять типов тяжелых цепей, называемые альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю на основании аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. Этим различным типам тяжелых цепей соответствуют пять классов антител, IgA (включая IgA₁ и IgA₂), IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄. Существуют также два типа легких цепей, называемые каппа (κ) или лямбда (λ) на основании аминокислотной последовательности константных доменов. Полноцепочечное антитело включает константный домен и вариабельный домен. В антигенсвязывающем фрагменте антитела присутствие константного домена не обязательно. Раскрытые в изобретении антигенсвязывающие фрагменты антитела могут включать Fab, Fab', F(ab')₂ и F(v) фрагменты антитела. Как более детально показано ниже, IL-1β-связывающие фрагменты включают фрагменты антител и антигенсвязывающие полипептиды, связывающиеся с IL-1β.

Каждая из последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный участок с тремя гипервариабельными участками (CDR), а также области каркаса (FR), не относящиеся к гипервариабельным участкам (CDR). В данном контексте термины «тяжелая цепь» и «легкая цепь» относятся к вариабельному участку тяжелой цепи и вариабельному участку легкой цепи соответственно, если не оговорено иначе. Гипервариабельные участки (CDRs) тяжелой цепи обозначены как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. Гипервариабельные участки (CDRs) легкой цепи обозначены как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Вариабельные и гипервариабельные участки последовательности антитела можно идентифицировать (i) с помощью обычных правил, известных из уровня техники, или (ii) выравниванием последовательностей с известными из базы данных вариабельными участками. Способы идентификации этих участков описаны в Antibody Engineering под ред. Kontermann и Dubel, Springer, New York, NY, 2001, и Dinarello и др., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Базы данных последовательностей антител описаны и доступны в базе данных «The Kabatman» на сайте www.bioinf.org.uk/abs (поддерживается А.С.Martin, Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England) и VBASE2 на сайте www.vbase2.org, как описано Retter и др., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005). Сайт базы данных «Kabatman» также включает общие правила работы по идентификации CDR. В данном контексте термин «CDR» понимается так, как он определен в Kabat и др., Sequences of Immunological Interest, 5^th ed., U.S. Department of Health and Human Services, 1991, если не оговорено специально.

Поликлональные антитела предпочтительно получают от животных путем многократных подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций подходящего антигена и адъюванта. Усиленный иммунный ответ (антителогенез) может быть получен путем конъюгации подходящего антигена с белком, являющимся иммуногенным для подвергаемых иммунизации видов, например гемоцианином моллюска фиссуреллии (keyhole limpet hemocyanin), сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или соевым ингибитором трипсина, используя бифункциональный или преобразующий агент, например, малеимидобензоильный эфир сукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (конъюгация через остатки лизина), глутаральдегид, янтарный ангидрид или другие агенты, известные из уровня техники.

Животных иммунизируют антигеном, иммуногенным конъюгатом или производными, смешивая, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для крыс или мышей соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и делая инъекции раствора интрадермально (внутрикожно) во множество мест. Через месяц животных повторно стимулируют с помощью 1/5-1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожных инъекций во множество мест. Через 7-14 дней после стимулирующей инъекции у животных берут кровь и определяют титр антитела в сыворотке. Животных стимулируют до тех пор, пока титр не выходит на плато. Предпочтительно, животных стимулируют конъюгатом того же антигена, но связанного с другим белком и/или с помощью другого сшивающего агента. Конъюгаты могут быть получены в виде фьюжн-белков рекомбинантной клеточной культуры. Для усиления иммунного ответа могут быть также использованы агрегирующие агенты, такие как квасцы.

Моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени гомогенных антител. Моноклональные антитела обычно являются высокоспецифичными и могут быть направлены на один единственный иммунодоминантный сайт в отличие от препаратов традиционных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов). Помимо специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что они синтезируются гомогенной культурой, не содержат примесей других иммуноглобулинов с другой специфичностью и характеристиками.

Моноклональные антитела, предназначенные для использования согласно данному изобретению, могут быть получены способом гибридом, впервые описанным Kohler и др. (Nature, 256:495-7, 1975), или могут быть получены способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). Моноклональные антитела можно выделить из фаговых библиотек антител, используя способы, описанные, например, в Clackson и др. (Nature 352:624-628, 1991) и Marks и др. (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991).

Согласно способу гибридомы мышей или других подходящих животных-хозяев, таких как хомяки или макаки, иммунизируют, как описано в изобретении, для извлечения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, использованным для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем осуществить слияние лимфоцитов с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для получения клеток гибридомы (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслившихся родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы испытывают недостаток фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT среда), состав которой предотвращает рост HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительными являются клетки миеломы, которые эффективно гибридизуются (сливаются), поддерживают стабильно высокий уровень выработки антител выбранными клетками, продуцирующими антитела, и являются чувствительными к среде. Клеточные линии миеломы людей и гетеро-миеломы мышей и людей также описаны для получения человеческих моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). В качестве примера можно привести линии миеломы мышей, в частности, являющиеся производными МОР-21 и М.С.-11 рака мышей, которые доступны в Центре Распространения Клеток Института Солка, Сан Диего, Калифорния, США (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA), и SP-2 или X63-Ag8-653 клетки, доступные в Американской Коллекции Типовых Культур, Роквилл, Мэриленд, США (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA).

Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, проверяют на продуцирование моноклональных антител к антигену. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридными клетками, определяют с помощью иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА). Аффинность связывания моноклонального антитела можно определить, например, с помощью анализа Скэтчарда (Munson и др., Anal. Biochem, 107:220 (1980)).

После установления того, что клетки гибридомы продуцируют антитела нужной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы с помощью процедур ограниченного разбавления и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие для этих целей культуральные среды включают, например, DMEM или RPMI-1640 среды. Кроме того, клетки гибридомы можно вырастить in vivo в виде асцитных опухолей у животных. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки традиционными способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, белок А-сефарозный, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Также предусматривается, что антитело по данному изобретению может быть использовано в виде меньших антигенсвязывающих фрагментов антитела, хорошо известных из уровня техники и описанных в изобретении.

Данное изобретение включает антитела, связывающие IL-1 (например, IL-1β), которые содержат две полноцепочечные тяжелые цепи и две полноцепочечные легкие цепи. Альтернативно, антитела, связывающие IL-1β, могут представлять собой конструкты, такие как одноцепочечные антитела или «мини» антитела, сохраняющие способность связываться с IL-1β. Такие конструкты могут быть получены известными из уровня техники способами, такими как, например, клонирование с помощью полимеразной цепной реакции (PCR mediated cloning) и сборка одноцепочечных антител для экспрессии в Е.coli (как описано в Antibody Engineering, The practical approach series, J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, и D. J. Chiswell, eds., Oxford University Press, 1996). В конструктах этого типа вариабельные участки тяжелых и легких цепей молекулы антитела амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с участием кДНК. Полученные в результате ампликоны затем собирают вместе, например, на следующей стадии PCR, с помощью ДНК линкера, кодирующей гибкий белковый линкер, состоящий из аминокислот Gly и Ser. Этот линкер дает возможность вариабельным участкам тяжелых и легких цепей изгибаться таким образом, чтобы антигенсвязывающий карман восстанавливался и антиген связывался с аффинностью, часто сопоставимой с аффинностью родительской полноцепочечной димерной молекулы иммуноглобулина.

Антитела, связывающие IL-1 (например, IL-1β), и их фрагменты по данному изобретению включают варианты приведенных здесь в качестве примера антител, фрагментов и последовательностей. Варианты включают пептиды и полипептиды, содержащие одну или более аминокислотную замену, делецию и/или вставку, обладающие такими же или практически такими же аффинностью и специфичностью связывания эпитопа, как одно или более приведенных здесь в качестве примера антител, фрагментов и последовательностей. Таким образом, варианты включают пептиды и полипептиды, содержащие одну или более замену, делецию и/или вставку в аминокислотной последовательности по сравнению с приведенными в качестве примера антителами, фрагментами и последовательностями, причем такие замены, делеции и/или вставки не вызывают заметных изменений аффинности и специфичности связывания эпитопа. Например, вариант антитела или фрагмента может являться результатом одного или более изменений антитела или фрагмента, при этом измененное антитело или фрагмент обладает такими же или практически такими же аффинностью и специфичностью связывания эпитопа, как и исходная последовательность. Варианты могут быть природными, такими как аллельные варианты или варианты сплайсинга, или могут быть сконструированы искусственно. Варианты могут быть получены из молекул соответствующих нуклеиновых кислот, кодирующих указанные варианты. Варианты данных антител и IL-1β-связывающих фрагментов могут иметь изменения в аминокислотных последовательностях легких и/или тяжелых цепей, природные или введенные с помощью инженерии нативных последовательностей in vitro с использованием способов с участием рекомбинантных ДНК. Природные варианты включают «соматические» варианты ("somatic" variants), которые генерируются in vivo из соответствующих нуклеотидных последовательностей зародышевых линий клеток в процессе образования антител в ответ на чужеродный антиген.

Варианты антител и фрагментов, связывающих IL-1 (например, IL-1β), можно также получить с помощью мутагенеза. Например, изменения аминокислот могут быть введены случайным образом в область, кодирующую антитело, а полученные в результате варианты можно подвергнуть скринингу на аффинность их связывания с IL-1β или другое свойство. Альтернативно, аминокислотные замены могут быть введены в выбранные участки антитела к IL-1β, такие как гипервариабельные участки (CDR) легкой цепи и/или тяжелой цепи, и/или в области каркаса, а полученные в результате антитела можно подвергнуть скринингу на аффинность их связывания с IL-1β или другую активность. Аминокислотные замены включают замену одной или более аминокислот в гипервариабельном участке (CDR), начиная от различия в одной аминокислоте вплоть до введения множественных перестановок аминокислот внутри заданного CDR, такого как CDR3. Согласно другому способу можно определить вклад каждого остатка внутри CDR в связывание с IL-1β путем замены, по крайней мере, одного остатка внутри CDR аланином. Lewis и др. (1995), Mol. Immunol. 32: 1065-72. Остатки, не являющиеся оптимальными с точки зрения связывания с IL-1β, можно затем заменить для определения более оптимальной последовательности. В изобретение также включены варианты, полученные путем введения вставок (инсерций) аминокислот для увеличения размера CDR, такого как CDR3. Например, большинство последовательностей легких цепей CDR3 содержат девять аминокислот. Последовательности легких цепей антитела, включающие менее девяти остатков, можно оптимизировать с точки зрения связывания с IL-1β путем введения инсерций подходящих аминокислот для увеличения длины CDR.

Варианты могут быть получены также путем «перетасовки» легких или тяжелых цепей. Marks и др. (1992), Biotechnology 10: 779-83. Одну (единичную) легкую (или тяжелую) цепь можно комбинировать с библиотекой, имеющей репертуар тяжелых (или легких) цепей, а полученный в результате набор вариантов подвергнуть скринингу на нужную активность, такую как связывание с IL-1β. Это дает возможность проведения скрининга большего количества образцов различных тяжелых (или легких) цепей в комбинации с одной легкой (или тяжелой) цепью по сравнению с возможностями, которые дает использование библиотек, включающих наборы обеих (тяжелой и легкой) цепей.

Антитела и фрагменты по данному изобретению, связывающие IL-1 (например, IL-1β), включают производные приведенных здесь в качестве примера антител, фрагментов и последовательностей. Производные включают полипептиды или пептиды, или их варианты, фрагменты или производные, которые были химически модифицированы. Примеры включают ковалентно присоединенные через атом N один или более полимер, такой как водорастворимые полимеры, или присоединенные через О углеводы, сахары, фосфаты и/или другие подобные молекулы. Производные модифицированы таким способом, что они отличаются от природных или исходных пептидов или полипептидов либо по типу, либо по локализации присоединяемых молекул. Производные также включают делеции (удаление) одной или более химических групп, исходно (от природы) присутствующих в пептиде или полипептиде.

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению могут быть биспецифическими. Биспецифические антитела или фрагменты могут быть нескольких конфигураций. Например, биспецифические антитела могут иметь сходство с «одиночными» антителами (или фрагментами антител), но иметь два различных антигенсвязывающих участка (вариабельные области). Биспецифические антитела можно получить химическими способами (Kranz и др. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5807), способами «полидома» («polydoma techniques») (Патент США № 4474893) или способами рекомбинантных ДНК. Биспецифические антитела по данному изобретению могут обладать специфичностью связывания, по крайней мере, с двумя различными эпитопами, по крайней мере один из которых является эпитопом IL-1β. IL-1β-связывающие антитела и фрагменты могут также быть гетероантителами. Гетероантитела представляют собой соединенные вместе два или более антител или связывающих фрагментов антител (Fab), причем каждое антитело или фрагмент обладает различной специфичностью.

Технологии создания рекомбинантных ДНК, кодирующих антигенсвязывающие участки молекул антител, не включающие получение моноклональных антител, включены в число способов получения антител и фрагментов, связывающих IL-1 (например, IL-1β), по данному изобретению. ДНК клонируют в бактериальной системе экспрессии. Один из примеров такого способа, подходящего для целей данного изобретения, состоит в использовании в качестве векторной системы бактериофага лямбда с лидирующей последовательностью, вызывающей миграцию экспрессированного Fab-белка в периплазматическое пространство (между бактериальной клеточной мембраной и клеточной стенкой) или его секрецию. Можно быстро получить и подвергнуть скринингу большое количество функциональных Fab фрагментов, чтобы найти те, которые связывают IL-1β. Такие IL-1β-связывающие агенты (Fab фрагменты, обладающие специфичностью по отношению к полипептиду IL-1β) входят в число IL-1β-связывающих антител и фрагментов по данному изобретению.

Антитела и фрагменты, связывающие IL-1 (например, IL-1β), могут быть гуманизированными антителами или антителами, разработанными для людей (human engineered antibody). Темин гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой рекомбинантный полипептид, включающий часть антигенсвязывающего участка нечеловеческого антитела и часть каркаса и/или константных участков человеческого антитела. Термин «антитело, разработанное для людей», или фрагмент антитела, относится к нечеловеческому (например, мышиному), которое было модифицировано, например, за счет делеций, инсерций или замещений аминокислот в определенных положениях, таким образом, чтобы уменьшить или устранить любую детектируемую иммуногенность модифицированного антитела у людей.

Гуманизированные антитела включают химерные антитела и CDR-трансплантированные антитела. Химерные антитела представляют собой антитела, содержащие вариабельный фрагмент нечеловеческого антитела, соединенный с константным участком человеческого антитела. Таким образом, в химерных антителах вариабельный участок является в основном нечеловеческим, в то время как константный участок является человеческим. Химерные антитела и способы их получения описаны в Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6841-6855 (1984), Boulianne и др., Nature, 312: 643-646 (1984), и публикации заявки РСТ WO 86/01533. Несмотря на то что они могут быть менее иммуногенными, чем мышиное моноклональное антитело, введения химерных антител были связаны с ответами в виде человеческих антимышиных антител (НАМА) против нечеловеческой части антител. Химерные антитела можно также получить сплайсингом генов молекулы мышиного антитела, имеющего соответствующую специфичность связывания антигена, с генами молекулы человеческого антитела с подходящей биологической активностью, такой как способность активировать человеческий комплемент и медиировать опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (ADCC). Morrison и др. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851; Neuberger и др. (1984), Nature, 312: 604. Одним из примеров является замена Fc участка на другой, относящийся к иному изотипу.

Термин «CDR-трансплантированное антитело» означает антитело, в котором гипервариабельные участки (CDRs) нечеловеческого «донорного» антитела связаны с каркасным участком «акцепторного» антитела человеческого происхождения. Обычно CDR-трансплантированные антитела включают больше человеческих последовательностей, чем химерные антитела, т.к. они включают и последовательности константных участков, и последовательности вариабельных (каркасных) участков человеческих антител. Так, например, CDR-трансплантированное гуманизированное антитело по данному изобретению может включать тяжелую цепь, содержащую протяженную аминокислотную последовательность (например, примерно 5 или более, 10 или более, или даже 15 или более прилегающих аминокислотных остатков) из каркасного участка человеческого антитела (например, FR-1, FR-2 или FR-3 человеческого антитела) или, необязательно, большую часть или всю целиком каркасную область человеческого антитела. CDR-трансплантированные антитела и способы их получения описаны в работах Jones и др., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann и др., Nature, 332: 323-327 (1988) и Verhoeyen и др., Science, 239: 1534-1536 (1988)). Способы, которые можно использовать для получения гуманизированных антител, также описаны в патентах США 4816567, 5721367, 5837243 и 6180377. Считается, что CDR-трансплантированные антитела в меньшей степени индуцируют иммунный ответ против участков антитела нечеловеческого происхождения, чем химерные антитела. Однако было показано, что каркасные последовательности донорных антител необходимы для проявления аффинности связывания и/или специфичности донорного антитела, предположительно вследствие того, что эти каркасные последовательности влияют на сворачивание антигенсвязывающего участка донорного антитела. Поэтому, когда донорные нечеловеческие последовательности гипервариабельных участков трансплантируют в неизменные каркасные последовательности человеческого происхождения, полученное в результате CDR-трансплантированное антитело в некоторых случаях может утратить авидность связывания с антигеном по сравнению с исходным нечеловеческим донорным антителом. См., например, Riechmann и др., Nature, 332: 323-327 (1988) и Verhoeyen и др., Science, 239: 1534-1536 (1988).

Антитела, разработанные для людей, включают, например «облицованные» («veneered») антитела и антитела, полученные с использованием технологии human engineering™ (Патент США 5869619). Технология human engineering™ является коммерчески доступной и включает изменения нечеловеческого антитела или фрагмента антитела, такого как мышиный, или химерного антитела или фрагмента антитела, путем специфических изменений аминокислотной последовательности антитела для получения модифицированного антитела, обладающего пониженной иммуногенностью у людей и которое при этом сохраняет желательные характеристики связывания исходного нечеловеческого антитела. Обычно способ включает классификацию аминокислотных остатков нечеловеческого (например, мышиного) антитела на остатки с «низкой степенью риска», «умеренным риском» и «высокой степенью риска». Классификацию осуществляют с использованием расчета глобального риска/вознаграждения (global risk/reward calculation), позволяющего оценить предсказанные выгоды осуществления конкретной замены (например, относительно иммуногенности у людей) и риска, что замена повлияет на способность полученного в результате антитела сворачиваться и/или на его антигенсвязывающие свойства. Таким образом, положением с низкой степенью риска является такое положение, замена в котором по прогнозу является выгодной, т.к. прогнозируется, что она приведет к снижению иммуногенности, заметно не влияя на антигенсвязывающие свойства. Положением с умеренным риском является положение, замена в котором по прогнозу снизит иммуногенность, но при этом с большой вероятностью повлияет на способность белка сворачиваться и/или на связывание с антигеном. Представляется наиболее вероятным, что положения с высокой степенью риска содержат остатки, вовлеченные в правильное сворачивание или связывание с антигеном. Как правило, положения с низкой степенью риска в нечеловеческом антителе замещают остатками человеческого происхождения, в положения с высокой степенью риска замены вводят редко, иногда для гуманизации проводят замены в положения с умеренным риском, но не огульно. Положения, содержащие пролин в вариабельных участках нечеловеческих антител, обычно классифицируют как позиции, по крайней мере, с умеренным риском.

Конкретный человеческий аминокислотный остаток, который может быть использован для замещения в данном положении с низким или умеренным риском в последовательности нечеловеческого (например, мышиного) антитела, может быть выбран путем выравнивания аминокислотной последовательности из вариабельных фрагментов нечеловеческого антитела с соответствующим участком специфической или консенсусной последовательности человеческого антитела. Аминокислотные остатки в положениях с низкой или умеренной степенью риска могут быть замещены надлежащими остатками последовательности человеческого антитела в соответствии с выравниванием. Способы получения «белков для людей» очень подробно описаны в работе Studnicka и др., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), патентах США 5766886, 5770196, 5821123 и 5869619, и в публикации заявки РСТ WO 93/11794.

«Облицованные» (veneered) антитела представляют собой нечеловеческие или гуманизированные (например, химерные или CDR-трансплантированные антитела) антитела, сконструированные таким образом, чтобы заменить некоторые обращенные к растворителю (solvent-exposed) аминокислотные остатки для дальнейшего снижения их иммуногенности или усиления их функции. Полагают, что влияние остатков, расположенных на поверхности химерного антитела, на правильное сворачивание антитела маловероятно. Более вероятно, что такие остатки участвуют в иммунной реакции. Поэтому «облицовка» химерного антитела может включать, например, идентификацию расположенных на поверхности остатков нечеловеческого каркасного участка химерного антитела и замену, по крайней мере, одного из них соответствующими поверхностными остатками человеческого каркасного участка. Облицовку можно провести любым подходящим способом генной инженерии, включая использование описанной выше технологии human engineering™.

Согласно другому подходу восстановление авидности связывания может быть достигнуто за счет «дегуманизации» CDR-трансплантированного антитела. Дегуманизация может включать возвращение остатков из каркасных участков донорного антитела в CDR-трансплантированное антитело, восстанавливая, таким образом, правильное сворачивание. Аналогичная «дегуманизация» может быть достигнута путем (i) введения фрагментов «донорного» каркасного участка в «акцепторное» антитело или (ii) трансплантирования фрагментов каркасного участка «донорного» антитела в «акцепторное» антитело (наряду с трансплантированными донорными CDRs).

Подробно антитела, гуманизированные антитела, антитела, разработанные для людей, и способы их получения описаны в книге под редакцией Kontermann и Dubel, Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001.

Примеры гуманизированных антител или антител для людей включают IgG, IgM, IgE, IgA и IgD. Данные антитела могут принадлежать любому классу (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, и т.д.) или изотипу и могут включать каппа или лямбда легкую цепь. Например, человеческое антитело может включать тяжелую цепь IgG или определенный фрагмент, такой как, по крайней мере, один из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Такие антитела или фрагменты могут включать, например, тяжелую цепь IgG1 и легкую цепь IgG1.

Антитела и фрагменты могут быть человеческими антителами, такими как антитела, связывающие полипептиды IL-1β и кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, которые являются природными соматическими вариантами нуклеотидной последовательности иммуноглобулина человеческих зародышевых линий, а также их фрагменты, синтетические варианты, производные и фьюжн-производные. Такие антитела могут быть получены любым известным из уровня техники способом, таким как использование трансгенных млекопитающих (таких как трансгенные мыши), у которых нативный репертуар иммуноглобулинов замещен человеческими V-генами в хромосоме млекопитающего. Похоже, что такие млекопитающие при нормальном функционировании осуществляют VDJ-рекомбинацию и соматическую гипермутацию генов антител человеческих зародышевых линий, продуцируя, таким образом, высокоаффинные антитела с полностью человеческими последовательностями.

Человеческие антитела против белка-мишени можно также получить, используя трансгенных животных, у которых отсутствует эндогенная секреция иммуноглобулина, но, в результате использования генной инженерии, имеются локусы человеческих иммуноглобулинов. Например, WO 98/24893 раскрывает трансгенных животных, имеющих локус человеческого Ig, причем животные не продуцируют функциональные эндогенные иммуноглобулины вследствие инактивации локусов эндогенных тяжелых и легких цепей. В WO 91/00906 также раскрываются трансгенные млекопитающие-хозяева, не относящиеся к приматам, способные обеспечивать иммунный ответ на иммуноген, причем антитела имеют константные и/или вариабельные участки приматов, а локусы, кодирующие эндогенный иммуноглобулин, замещены или инактивированы. WO 96/30498 и Патент США №6091001 раскрывают использование Cre/Lox системы для модификации локуса иммуноглобулина у млекопитающих, такой как полная или частичная замена константного или вариабельного участка для получения молекулы модифицированного антитела. В WO 94/02602 описаны млекопитающие-хозяева, не являющиеся людьми, с инактивированными локусами эндогенного Ig и функционирующими локусами человеческого Ig. Патент США №5939598 раскрывает способы получения трансгенных мышей, у которых отсутствуют эндогенные тяжелые цепи и экспрессируется локус экзогенного иммуноглобулина, содержащего один или более ксеногенных константных участков. См. также патенты США №№6114598, 6657103 и 6833268.

При использовании описанных выше трансгенных животных можно получить иммунный ответ на выбранную молекулу антигена, а продуцирующие антитело клетки можно выделить из животного и использовать для получения гибридом, секретирующих человеческие моноклональные антитела. Протоколы иммунизации, адъюванты и пр. известны из уровня техники и используются при иммунизации, например, трансгенных мышей, как описано в WO 96/33735. В этой публикации раскрыты моноклональные антитела против множества антигенных молекул, включая IL-6, IL-8, TNFα, человеческий CD4, L селектин, gp39 и столбнячный токсин. Моноклональные антитела можно протестировать на способность ингибировать или нейтрализовать биологическую активность или физиологический эффект соответствующего белка. В публикации WO 96/33735 показано, что моноклональные антитела против IL-8, выделенные из иммуноцитов трансгенных мышей, иммунизированных IL-8, блокируют индуцированные IL-8 функции нейтрофилов. Человеческие моноклональные антитела, обладающие специфичностью по отношению к антигену, использованному для иммунизации трансгенных животных, также описаны в WO 96/34096 и заявке на патент США №20030194404; и заявке на патент США №20030031667.

Трансгенные животные, полезные для получения моноклональных антител, включают также мышей Medarex HuMAb-MOUSE®, описанных в патенте США №5770429 и Fishwild и др. (Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996), имеющих генные последовательности нетрансформированных генов человеческих антител, кодирующих тяжелые и легкие цепи человеческих антител. Иммунизация мышей HuMAb-MOUSE® дает возможность продуцировать полностью человеческие моноклональные антитела к белку-мишени.

Ishida и др. (Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002) также описывают мышей TransChromo Mouse (TCMOUSE™), имеющих мегасегменты (megabase-sized segments) человеческой ДНК, включающие полный локус человеческого иммуноглобулина (hIg). Мыши TCMOUSE™ имеют совершенно иной репертуар hIgs, включая все подклассы иммуноглобулинов (IgG1-G4). Иммунизация мышей ТС MOUSE™ различными человеческими антигенами вызывает ответ в виде образования антител, включая человеческие антитела.

См. также Jakobovits и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits и др., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann и др., Year in Immunol., 7:33 (1993); и патент США №5591669, патент США No. 5589369, патент США No. 5545807; и публикацию заявки на патент США №20020199213. В публикации заявки на патент США №20030092125 описаны способы влияния на иммунный ответ животного на желаемый эпитоп. Человеческие антитела могут также генерироваться активированными in vitro В клетками (см. патенты США №5567610 и 5229275).

Человеческие антитела также могут быть получены с помощью скрининга in vitro библиотек, презентирующих антитела. См. Hoogenboom и др. (1991), J. Mol. Biol. 227: 381; и Marks и др. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581. Были описаны и можно легко подготовить различные фаговые библиотеки, презентирующие антитела. Библиотеки могут содержать разнообразные последовательности человеческих антител, таких как человеческие Fab, Fv и scFv фрагменты, которые можно подвергнуть скринингу относительно подходящей мишени. Фаг-презентирующие библиотеки могут содержать пептиды или белки, не являющиеся антителами, которые можно подвергнуть скринингу для идентификации агентов, селективно связывающих IL-1β.

Развитие способов получения репертуаров генов рекомбинантных человеческих антител и презентации кодируемых фрагментов антител на поверхности нитчатого фага обеспечило способы прямого получения человеческих антител. Антитела, полученные с помощью технологии фагового отображения, продуцируются бактериями в виде антигенсвязывающих фрагментов (обычно Fv или Fab фрагментов) и, таким образом, лишены эффекторных функций. Эффекторные функции можно привнести с помощью одного из двух стратегических подходов: методами генной инженерии фрагменты могут быть достроены либо до полного антитела для экспрессии в клетках млекопитающих, либо до биспецифических фрагментов антител со вторым участком связывания, способным запускать эффекторную функцию.

Изобретение предусматривает способ получения специфичного по отношению к мишени антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий стадии синтеза фаговой библиотеки человеческих антител, скрининга библиотеки белком-мишенью или его фрагментом, выделения фага, связывающегося с мишенью, и получения антитела из фага. Например, один способ получения библиотеки антител для использования согласно способу фагового отображения включает стадии иммунизации не являющегося человеком животного, имеющего локус человеческого иммуноглобулина, антигеном-мишенью или ее антигенным фрагментом для получения иммунного ответа, выделение из иммунизированного животного клеток, продуцирующих антитела; выделение РНК из выделенных клеток, обратную транскрипцию РНК для получения кДНК, амплификацию кДНК с использованием праймера и внедрение кДНК в вектор фагового отображения (phage display vector) таким образом, что антитела экспрессируются фагом. Рекомбинантные специфичные по отношению к мишени антитела по данному изобретению могут быть получены этим способом.

Процессы фагового отображения имитируют иммунную селекцию за счет презентации репертуара антител на поверхности нитевидного бактериофага с последующей селекцией фагов по их связыванию с выбранным антигеном. Один из таких способов описан в WO 99/10494, где раскрыто выделение высокоаффинных и функциональных агонистических антител к MPL и msk рецепторам с использованием такого подхода. Антитела по данному изобретению можно выделить скринингом рекомбинантных комбинаторных библиотек антител, предпочтительно фаговых библиотек, презентирующих scFv, полученных с использованием кДНК человеческих V_L и V_H, полученных из мРНК, выделенной из человеческих лимфоцитов. Методологические подходы для получения и скрининга таких библиотек известны из уровня техники. См., например, патент США №5969108. Существуют коммерчески доступные киты (наборы) для создания фаг-презентирующих библиотек (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, каталожный №27-9400-01; и Stratagene SurfZAP.TM. phage display kit, каталожный №240612). Существуют также другие способы и реагенты, которые могут быть использованы при получении и скрининге библиотек, презентирующих антитела (см., например, Ladner и др. патент США №5223409; Kang и др., публикация РСТ № WO 92/18619; Dower и др., публикация РСТ № WO 91/17271; Winter и др., публикация РСТ № WO 92/20791; Markland и др., публикация РСТ № WO 92/15679; Breitling и др., публикация РСТ № WO 93/01288; McCafferty и др., публикация РСТ № WO 92/01047; Garrard и др., публикация РСТ № WO 92/09690; Fuchs и др. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay и др. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse и др. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty и др., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths и др. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins и др. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson и др. (1991) Nature 352:624-628; Gram и др. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad и др. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom и др. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas и др. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения для выделения человеческих антител, специфичных по отношению к антигену-мишени и обладающих желаемыми характеристиками, библиотеку человеческих V_H и V_L скринировали для выбора фрагментов антител, обладающих нужной специфичностью. Библиотеками антител, использованными согласно этому способу, предпочтительно являются библиотеки scFv, подготовленные и подвергнутые скринингу, как описано в изобретении и известно из уровня техники (McCafferty и др., публикация РСТ № WO 92/01047, McCafferty и др., (Nature 348:552-554, 1990); и Griffiths и др. (EMBO J 12:725-734, 1993). Библиотеки scFv антител предпочтительно подвергают скринингу с использованием белка-мишени в качестве антигена.

Альтернативно, Fd фрагмент (V_H-C_H1) и легкую цепь (V_L-C_L) антител отдельно клонируют с помощью ПЦР и случайным образом рекомбинируют в комбинаторных фаг-презентирующих библиотеках, которые затем отбирают для связывания с конкретным антигеном. Fab фрагменты экспрессируются на поверхности фага, т.е. физически связаны с кодирующими их генами. Таким образом, селекция Fab по связыванию с антигеном сопровождается селекцией последовательностей, кодирующих Fab, которые впоследствии могут быть амплифицированы. Через несколько циклов связывания с антигеном и повторной амплификации осуществляют «пэннинг» (panning), Fab, специфические по отношению к антигену, обогащают и, наконец, выделяют.

В 1994 был описан подход к гуманизации антител, названный «селекцией под контролем» ("guided selection"). Селекция под контролем использует преимущества (силу) способа фагового отображения для гуманизации мышиного моноклонального антитела (см. Jespers, L. S., и др., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Для этого Fd фрагмент мышиного моноклонального антитела можно презентировать в комбинации с библиотекой человеческих легких цепей, а полученную библиотеку гибридных Fab подвергнуть селекции с использованием антигена. Таким образом, мышиный Fd фрагмент обеспечивает матрицу для проведения селекции. Впоследствии отобранные человеческие легкие цепи комбинируют с библиотекой человеческих Fd фрагментов. Селекция полученной библиотеки дает полностью человеческий Fab.

Было описано множество способов для получения человеческих антител из фаг-презентирующих библиотек (см., например, Hoogenboom и др., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks и др., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); патенты США №№5565332 и 5573905; Clackson, Т., и Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). В частности, мощным инструментом стала селекция in vitro и эволюция антител, полученных из фаг-презентирующих библиотек (см. Burton, D. R. и Barbas III, С.F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter, G. и др., Аnnu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); публикация заявки на патент США №20020004215 и WO 92/01047; публикация заявки на патент США №20030190317; и патенты США №№. 6054287 и 5877293.

В работе Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193 (2002), и в публикации заявки на патент США №20030044772, опубликованной 6 марта 2003 г., описаны способы скрининга фаговых библиотек, экспрессирующих антитела или другие связывающие молекулы, путем «захвата подъемом» (capture lift), способом, включающим иммобилизацию на твердую подложку молекул, являющихся кандидатами на связывание.

Fv фрагменты располагаются на поверхности фага за счет ассоциации одной цепи, экспрессированной фагом в виде фьюжн-белка (например, гена III фага М13), с комплементарной цепью, экспрессированной в виде растворимого фрагмента. Было предположено, что фаг может быть нитчатым (нитевидным) фагом, таким как один из фагов I класса: fd, М13, f1, If1, lke, ZJ/Z, Ff и одним из фагов II класса Xf, Pf1 и Pf3. Фаг может быть М13 или fd, или их производным.

Как только исходные человеческие V_L и V_H сегменты выбраны, проводят эксперименты «смешай и подбери пару» («mix and match»), в которых различные пары исходно отобранных V_L и V_H сегментов подвергают скринингу на связывание с мишенью, с целью отбора предпочтительных комбинаций V_L/V_H пар. Кроме того, для дальнейшего улучшения качества антитела, V_L и V_H сегменты предпочтительных V_L/V_H пар(ы) можно подвергнуть случайным мутациям, предпочтительно в пределах любого из CDR1, CDR2 или CDR3 участков V_H и/или V_L, способом, аналогичным процессу соматической мутации in vivo, ответственному за увеличение аффинности антител в ходе естественного иммунного ответа. Эта мутация, приводящая к изменению аффинности in vitro, может быть дополнена (доведена до совершенства) путем амплификации V_L и V_H участков, используя ПЦР праймеры, комплементарные CDR1, CDR2 и CDR3 V_H, или CDR1, CDR2 и CDR3 V_L, соответственно, причем в эти праймеры введена случайная смесь четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так чтобы полученные в результате продукты ПЦР кодировали V_L и V_H сегменты, в которых были осуществлены случайные мутации в CDR3 участках V_H и/или V_L. Эти случайным образом мутированные V_L и V_H сегменты можно подвергнуть повторному скринингу на связывание с антигеном-мишенью.

После скрининга и выделения антитела, специфичного относительно мишени, из рекомбинантной библиотеки, презентирующей иммуноглобулины, из набора отображения (display package) (например, из генома фага) можно выделить нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранное антитело, и субклонировать в другие векторы экспрессии стандартными способами с использованием рекомбинантной ДНК. При желании на нуклеиновую кислоту можно воздействовать дальше для создания других форм антитела согласно данному изобретению, как описано ниже. Для экспрессии рекомбинантных человеческих антител, выделенных скринингом комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный вектор экспрессии и вводят в клетку-хозяин млекопитающего, как описано в изобретении.

Полагают, что технология фагового отображения может быть осуществлена в мутаторном штамме бактерии или в клетке-хозяине. Мутаторный штамм представляет собой клетку-хозяин, имеющую генетический дефект, вызывающий мутацию репликацированной внутри нее ДНК по отношению к родительской ДНК. Примерами мутаторных штаммов являются NR9046mutD5 и NR9046 mut T1.

Полагают также, что технология фагового отображения может быть осуществлена с использованием фага-помощника, являющегося фагом, используемым для инфицирования клеток, содержащих геном дефектного фага, функция которого заключается в дополнении дефекта. Геном дефектного фага может быть фагмидой или фагом с удаленными последовательностями генов, кодирующих некоторые функции. Примеры фагов-помощников включают M13K07, M13K07 ген III №3; и фаг, отображающий или кодирующий связывающую молекулу, слитую с капсидным белком.

Антитела также получают способами скрининга фагового отображения с использованием иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в WO 92/01047, согласно которому индивидуальную колонию, содержащую клон либо тяжелой (Н), либо легкой (L) цепи, используют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующей другую цепь (L или Н), и полученный в результате двухцепочечный специфически связывающий элемент выбирают с помощью технологий фагового отображения, таких как описанные в изобретении. Этот способ описан также в Marks и др. (Bio/Technology, 10:779-783, 1992).

Способы отображения пептидов на поверхности дрожжевых и бактериальных клеток также были использованы для идентификации антигенспецифических антител. См., например, патент США №6699658. Библиотеки антител могут быть прикреплены к дрожжевым белкам, таким как агглютинин, эффективно имитируя презентирование антител клеточной поверхностью В-клеток иммунной системы.

Помимо технологий фагового отображения, антитела можно выделить с использованием способов отображения рибосомальной мРНК и способов отображения бактериальными клетками. Селекция полипептида с использованием рибосомального отображения описана в Hanes и др. (Proc. Natl Acad Sci USA, 94:4937-4942, 1997) и патентах США №№5643768 и 5658754, выданных Kawasaki. Рибосомальное отображение также полезно для быстрого крупномасштабного мутационного анализа антител. С помощью подхода селективного мутагенеза можно получать антитела с улучшенной активностью, которые могут быть отобраны с использованием технологий рибосомального отображения.

Антитела и фрагменты, связывающие IL-1 (например, IL-1β), могут включать один или более участков, которые не связывают IL-1β, но вместо этого отвечают за другие функции, такие как период полувыведения из циркуляции, прямой цитотоксический эффект, детектируемое мечение или активацию каскад эндогенного комплемента реципиента или эндогенной клеточной цитотоксичности. Антитела или фрагменты могут включать полный или часть константного участка и может принадлежать к любому изотипу, включая IgA (например, IgA1 или IgA2), IgD, IgE, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или IgM. В дополнение к этому или вместо этого, включая константный участок, антигенсвязывающие соединения по данному изобретению могут содержать эпитопную метку (epitope tag), эпитоп рецептора реутилизации (salvage receptor epitope), метку для диагностики или очистки, или цитотоксический фрагмент, такой как радионуклеид или токсин.

Константный участок (если есть) антител и фрагментов может быть γ1, γ2, γ3, γ4, µ, β2, δ или ε типа, предпочтительно γ типа, более предпочтительно γ типа, причем константный участок человеческой легкой цепи может быть κ или λ типа (включая λ₁, λ₂ и λ₃ подтипы), но предпочтительно относится к κ типу.

Варианты также включают антитела или фрагменты, включающие модифицированный Fc участок, причем модифицированный Fc участок включает, по крайней мере, одну аминокислотную модификацию, относящуюся к Fc участку немутантного типа. Вариант Fc участка может быть сконструирован (относительно сопоставимой молекулы, включающей Fc участок немутантного типа) таким образом, чтобы связывать Fc рецепторы с большей или меньшей аффинностью.

Например, IL-1β связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению могут включать модифицированный Fc участок. Fc участок относится к природным или синтетическим полипептидам, гомологичным C-концевому домену IgG, который продуцируется при расщеплении IgG папаином. IgG Fc имеет молекулярную массу примерно 50 кДа. В антителах и фрагментах по данному изобретению может быть использован полный Fc участок или только фрагмент, увеличивающий время полувыведения. Кроме того, приемлемы многие модификации аминокислотной последовательности, т.к. природная активность не во всех случаях является необходимой или желательной.

При желании Fc участок может быть подвергнут мутации для ингибирования его способности фиксировать комплемент и связывать рецептор Fc с высокой аффинностью. Для Fc мышиного IgG замена остатков Ala на Glu 318, Lys 320 и Lys 322 делает белок неспособным к прямой ADCC. Замена Glu на Leu 235 ингибирует способность белка связываться с рецептором Fc с высокой аффинностью. Известны также различные мутации человеческого IgG (см., например, Morrison и др., 1994, The Immunologist 2: 119 124 и Brekke и др., 1994, The Immunologist 2: 125).

В некоторых вариантах выполнения изобретения предусмотрены антитела или фрагменты с модифицированным Fc участком, в котором природный Fc участок модифицирован для увеличения времени полувыведения антитела или фрагмента в биологическом окружении, например, времени полувыведения из сыворотки или времени полувыведения, измеренного в исследованиях in vitro. Способы изменения исходной формы Fc участка IgG также описаны в патенте США №6998253.

В определенных вариантах выполнения изобретения может быть желательным модифицировать антитело или фрагмент для увеличения времени его полувыведения из сыворотки, например, добавление к фрагменту антитела молекулы, такой как PEG, или других водорастворимых полимеров, включая полисахаридные полимеры, для увеличения времени полувыведения. Этого можно также достичь, например, путем введения эпитопа связывания рецептора реутилизации во фрагмент антитела (например, путем мутации соответствующей области во фрагменте антитела или за счет инкорпорации эпитопа в пептидную метку, так чтобы затем слить ее с фрагментом антитела либо по концу, либо в середине, например, путем ДНК- или пептидного синтеза) (см. международную публикацию № WO96/32478). Эпитоп связывания рецептора реутилизации относится к эпитопу Fc участка молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), ответственному за увеличение in vivo времени полувыведения из сыворотки молекулы IgG.

Эпитоп связывания рецептора реутилизации может включать участок, в котором один или несколько аминокислотных остатков из одной или двух петель Fc домена перемещены в аналогичную позицию фрагмента антитела. Еще более предпочтительно, чтобы были перемещены три или более остатка из одной или двух петель Fc домена. Еще более предпочтительно, чтобы эпитоп был взят из СН2 домена Fc участка (например, IgG) и перемещен в СН1, СН3 или V_H область, или более чем в одну такую область антитела. Альтернативно, эпитоп взят из СН2 домена Fc участка и перемещен в C_L или V_L, или в обе области фрагмента антитела. См. также международные заявки WO 97/34631 и WO 96/32478, в которых описаны варианты Fc и их взаимодействие с рецептором реутилизации.

Мутации остатков внутри участков связывания с рецептором Fc может привести к изменению эффекторной функции, такой как измененная ADCC или CDC активность или измененное время полувыведения. Потенциальные мутации включают инсерции, делеции или замены одного или более остатков, включая замену на аланин, консервативную замену, неконсервативную замену, или замену на аминокислотный остаток IgG другого подкласса, находящийся в том же положении (например замена остатка IgG1 соответствующим остатком IgG2 в том же положении). Например, было показано, что мутации серина в 241 положении аминокислотной последовательности IgG4 на пролин (обнаруженный в этом положении в IgG1 и IgG2) ведет к выработке гомогенного антитела, а также увеличению времени полувыведения из сыворотки и улучшению распределения в тканях по сравнению с исходным химерным IgG4 (Angal и др., Mollmmunol. 30:105-8, 1993).

Фрагменты антитела представляют собой участки интактного полноцепочечного антитела, такие как антигенсвязывающий или вариабельный фрагменты интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); фрагменты мультиспецифических антител, таких как биспецифические, триспецифические и мультиспецифические антитела (например, диатела, триатела, тетратела; миниантитела; хелатирующие рекомбинантные антитела; тритела или битела; интратела; нанотела; маленькие модульные иммунофармацевтические агенты (SMIP), аднектины, фьюжн-белки на основе связывающего домена иммуноглобулинов; камелизованные (camelized) антитела; V_HH-содержащие антитела; и любые другие полипептиды, полученные из фрагментов антител.

Данное изобретение включает IL-1β-связывающие фрагменты антител, включающие любую из упомянутых выше последовательностей тяжелой или легкой цепи, связывающие IL-1β. Термин «фрагменты» в данном тексте относится к последовательности трех или более аминокислот (например, 4 или более, 5 или более, 6 или более, 8 или более, или даже 10 или более смежных аминокислот) антитела и включают Fab, Fab', F(ab')₂ и F(v) фрагменты, или индивидуальные вариабельные фрагменты легкой или тяжелой цепи или их участки. IL-1β-связывающие фрагменты включают, например. Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и scFv. Эти фрагменты не имеют Fc фрагмента интактного антитела, быстрее выводятся из кровообращения и могут иметь пониженное неспецифическое связывание с тканями, чем интактное антитело. См. Wahl и др. (1983), J. Nucl. Med., 24: 316-25. Эти фрагменты можно получить из интактных антител, используя хорошо известные способы, например протеолитическое расщепление ферментами, такими как папаин (для получения Fab фрагментом) или пепсин (для получения F(ab')₂ фрагментов).

Исследования in vitro и исследования на клетках для определения связывания IL-1β с рецептором IL-1 I типа (IL-1R1), включая исследования, позволяющие определить присутствие молекул (таких как антитела, антагонисты или другие ингибиторы), которые связываются с IL-1β или IL-1R1, хорошо известны из уровня техники (см., например, Evans и др. (1995), J. Biol. Chem. 270:11477-11483; Vigers и др. (2000), J. Biol. Chem. 275:36927-36933; Yanofsky и др. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7381-7386; Fredericks и др. (2004), Protein Eng. Des. Sel. 17:95-106; Slack и др. (1993), J. Biol. Chem. 268:2513-2524; Smith и др. (2003), Immunity 18:87-96; Vigers и др. (1997), Nature 386:190-194; Ruggiero и др. (1997), J. Immunol. 158:3881-3887; Guo и др. (1995), J. Biol. Chem. 270:27562-27568; Svenson и др. (1995), Eur. J. Immunol. 25:2842-2850; Arend и др. (1994), J. Immunol. 153:4766-4774). Рекомбинантные рецепторы IL-1 I типа, включая человеческий рецептор IL-1 I типа, для таких исследований коммерчески доступны в различных источниках (см., например, R&D Systems, SIGMA). Рецептор IL-1 I типа может также экспрессироваться конструктом или вектором экспрессии, внедренным в соответствующую клетку-хозяин с использованием стандартных способов молекулярной биологии и трансфекции, известных из уровня техники. Экспрессированный рецептор IL-1 I типа затем можно выделить и очистить для использования в исследованиях по связыванию или, альтернативно, использовать напрямую в связанном с клетками виде.

Например, связывание IL-1β с рецептором IL-1 I типа можно определить путем иммобилизации IL-1β-связывающего антитела, взаимодействия (контакта) IL-1β с иммобилизованным антителом и определения, связался ли IL-1R с антителом, и взаимодействия растворимой формы IL-1RI со связанным комплексом IL-1β/антитело и определения, связался ли растворимый IL-1RI с комплексом. Протокол может также включать взаимодействие растворимого IL-1RI с иммобилизованным антителом до контакта с IL-1β, чтобы подтвердить, что растворимый IL-1RI не связался с иммобилизованным антителом. Этот протокол может быть осуществлен с использованием прибора Biacore® для анализа кинетики связывания. Такой протокол может быть также применен для выяснения, допускает или блокирует антитело или другая молекула связывание IL-1β с рецептором IL-1 I типа.

Для других исследований связывания IL-1β с IL-1RI можно определить возможность или блокирование связывания IL-1β с рецептором IL-1 I типа путем сравнения связывания IL-1β с IL-1RI в присутствии или в отсутствие антител к IL-1β или их IL-1β-связывающих фрагментов. Блокирование идентифицируют по заметному снижению связывания IL-1β с рецептором IL-1 I типа в присутствии антител к IL-1β или их IL-1β-связывающих фрагментов по сравнению с контрольным образцом, содержащим соответствующий буфер или разбавитель, но не содержащим антител к IL-1β их IL-1β-связывающих фрагментов. Результаты анализа можно оценить качественно как указание на присутствие или отсутствие блокирования или можно оценить количественно как процент или кратность ослабления связывания вследствие присутствия антитела или фрагмента.

Альтернативно или в дополнение, когда IL-1β-связывающее антитело или IL-1β-связывающий фрагмент существенно блокируют связывание IL-1β с IL-1RI, связывание IL-1β с IL-1RI уменьшается, по крайней мере, в 10 раз, альтернативно, по крайней мере, примерно в 20 раз, альтернативно, по крайней мере примерно в 50 раз, альтернативно, по крайней мере примерно в 100 раз, альтернативно, по крайней мере примерно в 1000 раз, альтернативно, по крайней мере примерно в 10000 раз или более по сравнению со связыванием IL-1β и IL-1RI при тех же концентрациях в отсутствие антитела или фрагмента. Другой пример: когда IL-1β-связывающее антитело или IL-1β-связывающий фрагмент в значительной степени допускает связывание IL-1β с IL-1RI, связывание IL-1β с IL-1RI составляет, по крайней мере, примерно 90%, альтернативно, по крайней мере, примерно 95%, альтернативно, по крайней мере, примерно 99%, альтернативно, по крайней мере, примерно 99.9%, альтернативно, по крайней мере, примерно 99.99%, альтернативно, по крайней мере, примерно 99.999%, альтернативно, по крайней мере, примерно 99.9999%, альтернативно, практически идентично связыванию IL-1β с IL-1RI при тех же концентрациях в отсутствие антитела или фрагмента.

Отдельные варианты выполнения данного изобретения могут подразумевать, что антитела, связывающие IL-1β, или фрагменты, связывающие IL-1β, связываются с тем же или практически тем же эпитопом, что и одно или больше антител, приведенных здесь в качестве примера. Альтернативно или в дополнение, IL-1β-связывающие антитела или IL-1β-связывающие фрагменты конкурируют с антителом, имеющим последовательность вариабельного участка АВ7, описанную в заявке США №11/472813 (последовательности приведены ниже) за связывание. Альтернативно или в дополнение, данное изобретение включает IL-1β-связывающие антитела и фрагменты, которые связываются с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO: 1), эпитопом, с которым связываются антитела, обозначенные АВ5 и АВ7 (заявка США №11/472813). Подразумевается, что с помощью нескольких известных из уровня техники способов можно легко определить, связывается ли IL-1β-связывающее антитело или фрагмент с тем же эпитопом или практически тем же эпитопом, что и одно или больше антител, приведенных здесь в качестве примера, таких как, например, антитело, обозначенное АВ7.

Например, ключевые аминокислотные остатки (эпитоп), связанные с IL-1β-связывающим антителом или фрагментом, можно определить, используя набор пептидов, такой как, например, пептидный набор PepSpot™ (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany), в котором скан двенадцати аминокислотных пептидов, перекрывающих полную аминокислотную последовательность IL-1β, причем каждый пептид перекрывает 11 аминокислот предыдущего пептида, синтезирован непосредственно на мембране. Мембрану, несущую пептиды, затем зондируют антителом, информацию об эпитопе которого хотят получить, например при концентрации 2 мкг/мл в течение 2 часов при комнатной температуре. Связывание антитела с пептидами, присоединенными к мембране, можно зарегистрировать, используя вторичное HRP-конъюгированное козье античеловеческое (или мышиное, если подходит) антитело, с последующей детекцией усиленной хемилюминесценции (ECL). Пептидное пятно(а), соответствующее конкретным аминокислотным остаткам или последовательностям зрелого белка IL-1β, являющееся положительным указанием на связывание с антителом, указывают на эпитоп, связанный с конкретным антителом.

Альтернативно или в дополнение можно провести эксперименты по конкуренции с антителом, и такие исследования хорошо известны из уровня техники. Например, чтобы определить, связывается ли антитело или фрагмент с эпитопом, содержащимся с пептидной последовательности, включающей аминокислоты ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO: 1), что соответствует остаткам 83-105 зрелого белка IL-1β, можно сравнить антитело, обладающее неизвестной специфичностью, с любым приведенным в качестве примера антителом (например, АВ7) по данному изобретению, про которое известно, что оно связывается с эпитопом, содержащимся в этой последовательности. Исследования конкуренции связывания можно провести, например, используя прибор Biacore® для проведения кинетических анализов связывания или ELISA. В таком исследовании антитело с неизвестной эпитопной специфичностью выявляют по его способности конкурировать с известным компараторным антителом (например, АВ7) за связывание. Конкуренция за связывания с конкретным эпитопом, определенная по снижению связывания с эпитопом IL-1β известного компараторного антитела (например, АВ7) на, по крайней мере, примерно 50%, или, по крайней мере, примерно 70%, или по крайней мере, примерно на 80%, или, по крайней мере, примерно на 90%, или, по крайней мере, примерно на 95%, или, по крайней мере, примерно на 99% или примерно на 100%, указывает на связывание в значительной степени с тем же эпитопом.

Принимая во внимание приведенную идентификацию IL-1β-связывающих участков приведенных в качестве примера антител и/или эпитопов, распознаваемых описанными антителами, подразумевается, что могут быть получены дополнительные антитела с аналогичными характеристиками связывания и терапевтической или диагностической выгодой, что соответствует варианту выполнения изобретения.

Антигенсвязывающие фрагменты антитела включают фрагменты, сохраняющие способность специфически связываться с антигеном, обычно за счет сохранения антигенсвязывающего фрагмента антитела. Общепризнано, что функция связывания антитела с антигеном может быть осуществлена фрагментами полноцепочечного антитела. Примеры антигенсвязывающих участков включают: (i) Fab фрагмент, являющийся моновалентным фрагментом, состоящим из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')² фрагмент, являющийся бивалентным фрагментом, состоящим из двух Fab фрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, представляющий собой VH и СН1 домены; (iv) Fv фрагмент, представляющий собой VL и VH домены одного плеча антитела, (v) dAb фрагмент (Ward и др. (1989) Nature 341:544-546), являющийся VH доменом; и (vi) изолированный гипервариабельный участок (CDR). Одноцепочечные антитела также предусматриваются термином антигенсвязывающий участок (фрагмент) антитела. IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают моновалентные или мультивалентные, или мономерные, или мультимерные (например, тетрамерные), связывающие домены на основе CDR с каркасом или без каркаса (scaffold) (например, с белковым или углеводным каркасом).

IL-1β-связывающие антитела или фрагменты по данному изобретению могут являться частью иммуноадгезивных молекул большего размера, образованных за счет ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или более другим белком или пептидом. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной scFv молекулы (Kipriyanov S. М. и др. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевого участка полигистидина для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov S. М. и др. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Антитела и фрагменты, включающие иммуноадгезивные молекулы, могут быть получены стандартными способами рекомбинантной ДНК, как описано в изобретении. Предпочтительные антигенсвязывающие участки являются полными доменами или парами полных доменов.

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают фрагменты доменов антитела (dAb) (Ward и др., Nature 341:544-546, 1989), включающие V_H домен. IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают диатела, являющиеся бивалентными антителами, в которых V_H и V_L домены экспрессированы в виде одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, слишком короткого для спаривания двух доменов одной цепи, что способствует спариванию комплементарных доменов, принадлежащих разным цепям, и созданию двух антигенсвязывающих участков (см., например, ЕР 404097; WO 93/11161; Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, и Poljak и др., Structure 2:1121-1123, 1994). Диатела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают одноцепочечные фрагменты антител (scFv), связывающиеся с IL-1β. scFv включает вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела (V_H), функционально связанный с вариабельным фрагментом легкой цепи антитела (V_L), причем вариабельный фрагмент тяжелой цепи и вариабельный фрагмент легкой цепи вместе или индивидуально формируют связывающий участок, который связывает IL-1β. scFv может включать V_H фрагмент на N-конце и V_L фрагмент на С-конце. Альтернативно, scFv может включать V_L фрагмент на N-конце и V_H фрагмент на С-конце. Более того, поскольку два домена Fv фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, их можно объединить, используя способы рекомбинации, с помощью синтетического линкера, что дает возможность получить их в виде одной белковой цепи, в которой V_L и V_H участки спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird и др. (1988) Science 242:423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883).

scFv может (не обязательно) дополнительно включать полипептидный линкер между вариабельным фрагментом тяжелой цепи и вариабельным фрагментом легкой цепи. Такие полипептидные линкеры обычно содержит от 1 до 50 аминокислот, альтернативно, от 3 до 12 аминокислот, альтернативно, 2 аминокислоты. Пример полипептидного линкера для связывания тяжелой и легкой цепей в scFv включает пятичленную аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2). Другие примеры включают одну или более тандемную дупликацию этой последовательности (например, полипептид, включающий от двух до четырех дупликаций Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2) для создания линкеров).

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают антитела, содержащие только тяжелые цепи (heavy chain antibody, HCAb). Исключениями из H₂L₂ структуры обычных антител являются некоторые изотипы иммуноглобулинов, найденных у верблюдовых (camelids) (верблюдов, одногорбых верблюдов и лам; Hamers-Casterman и др., 1993 Nature 363: 446; Nguyen и др., 1998 J. Mol. Biol. 275: 413), ковровых акул (Nuttall и др., Mol Immunol. 38:313-26, 2001), песчаных акул (Greenberg и др., Nature 374:168-73, 1995; Roux и др., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804) и у пятнистой химеры (spotted ratfish) (Nguyen, и др., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," 2002 Immunogenetics 54(1): 39-47). По всей видимости, эти антитела могут формировать антигенсвязывающие участки, используя только вариабельные фрагменты тяжелой цепи, так как эти функциональные антитела представляют собой димеры только тяжелых цепей (называемые антителами, содержащими только тяжелые цепи «heavy-chain antibodies» или «HCAb»). Соответственно, согласно некоторым вариантам выполнения изобретения IL-1β-связывающие антитела и фрагменты могут быть антителами, содержащими только тяжелые цепи, специфически связывающимися с IL-1β. Например, антитела, содержащие только тяжелые цепи, принадлежащие к классу IgG и не имеющие легких цепей, продуцируются животными семейства Camelidae, включая верблюдов, одногорбых верблюдов и лам (Hamers-Casterman и др., Nature 363:446-448 (1993)). HCAb имеют молекулярную массу порядка 95 кДа вместо молекулярной массы примерно 160 кДа обычных IgG антител. Их связывающие домены, состоящие только из вариабельных доменов тяжелых цепей, часто называют V_HH, чтобы отличить их от традиционных V_H (Muyldermans и др., J. Mol. Recognit. 12:131-140 (1999). Вариабельный домен антител, содержащих только тяжелые цепи, иногда называют нанотелом (nanobody) (Cortez-Retamozo и др., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Библиотека нанотел может быть получена от иммунизированных одногорбых верблюдов, как описано Conrath и др., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001) или используя способы рекомбинации.

В связи с тем, что первый константный домен (C_H1) отсутствует (удален в процессе сплайсинга в ходе процессинга мРНК вследствие утраты консенсусного сигнала сплайсинга), вариабельный домен (V_HH) следует непосредственно за шарнирной областью, C_H2 и C_H3 доменами (Nguyen и др., Mol. Immunol. 36:515-524 (1999); Woolven и др., Immunogenetics 50:98-101 (1999)). Полагают, что V_HH верблюдовых (Camelid) рекомбинирует с константными участками IgG2 и IgG3, включающими шарнирный участок, СН2 и СН3 домены и не имеющими СН1 домена (Hamers-Casterman и др., см. выше). Например, IgG1 лам является антителом обычного изотипа (H₂L₂), в котором V_H рекомбинирует с константным участком, содержащим шарнирную область, СН1, СН2 и СН3 домены, в то время как IgG2 и IgG3 ламы относятся к изотипам, содержащим только тяжелые цепи, не имеющим СН1 доменов и не содержащим легких цепей.

Несмотря на то что HCAb лишены легких цепей, у них есть антигенсвязывающий репертуар. Механизм генетического воспроизведения HCAb рассмотрен Nguyen и др., Adv. Immunol 79:261-296 (2001) и Nguyen и др., Immunogenetics 54:39-47 (2002). У акул, включая усатых (ковровых) акул (nurse shark), найдены похожие мономерные V-домены, содержащие рецептор антигена. Irving и др., J. Immunol. Methods 248:31-45 (2001); Roux и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11804 (1998).

V_HH включают небольшие интактные антигенсвязывающие фрагменты (например, фрагменты примерно 15 кДа, 118-136 остатков). Было установлено, что V_HH домены верблюдов связываются с антигеном с высокой аффинностью (Desmyter и др., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001), при этом аффинность V_HH обычно находится в наномолярном диапазоне и сопоставима с аффинностью Fab и scFv фрагментов. V_HH хорошо растворимы и более стабильны, чем соответствующие производные scFv и Fab фрагментов. До последнего времени было довольно сложно получить V_H фрагменты в растворимой форме, однако улучшение растворимости и специфического связывания может быть достигнуто, если каркасные остатки заменить на остатки, более похожие на V_HH (см., например, Reichman и др., J Immunol Methods 1999, 231:25-38.). V_HH содержат аминокислотные замены, которые делают их более гидрофильными и предотвращают пролонгированное взаимодействие с BiP (белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина), который обычно связывается с Н-цепью в эндоплазматической сети (ER) в процессе сворачивания и сборки до тех пор, пока его не замещает L-цепь. Вследствие повышенной гидрофильности V_HH секреция из ER улучшается.

Функциональные V_HH могут быть получены протеолитическим расщеплением HCAb иммунизированных верблюдовых, прямым клонированием генов V_HH из В-клеток иммунизированных верблюдовых, приводящим к получению рекомбинантных V_HH, или из наивных (naive) или синтетических библиотек. V_HH с нужной специфичностью по отношению к антигену можно также получить по технологии фагового отображения. Использование V_HH в фаговом отображении значительно проще и эффективнее, чем Fab или scFv фрагментов, т.к. в клонировании и экспрессии для получения функционального антигенсвязывающего фрагмента нуждается только один домен. Muyldermans, Biotechnol. 74:277-302 (2001); Ghahroudi и др., FEBS Lett. 414:521-526 (1997); и Van der Linden и др., J. Biotechnol. 80:261-270 (2000). Способы получения антител, содержащих тяжелые цепи верблюдовых, также описаны в патентных публикациях США №№20050136049 и 20050037421.

Технологии рибосомального отображения могут быть использованы для идентификации и выделения молекул scFv и/или V_HH, обладающих нужной активностью и аффинностью связывания. Irving и др., J. Immunol. Methods 248:31-45 (2001). Рибосомальное отображение и селекция обладают потенциальной возможностью получения и презентации (отображения) больших библиотек (10¹⁴).

Другой вариант выполнения изобретения позволяет получать похожие на V_HH молекулы с использованием способа «камелизации» («оверблюживания», camelisation) за счет модификации V_H неверблюжьего происхождения, таких как человеческие V_HH, для улучшения их растворимости и предотвращения неспецифического связывания. Это достигается заменой остатков V_H со стороны V_L остатками, аналогичными V_HH, имитируя, таким образом, более растворимые V_HH фрагменты. Ожидается, что камелизованные V_H фрагменты, особенно основанные на человеческом каркасе, будут обладать значительно сниженным иммунным ответом при введении пациенту in vivo и, соответственно, будут иметь значительные преимущества при терапевтическом использовании. Davies и др., FEBS Lett. 339:285-290 (1994); Davies и др., Protein Eng. 9:531-537 (1996); Tanha и др., J. Biol. Chem. 276:24774-24780 (2001); и Riechmann и др., Immunol. Methods 231:25-38 (1999).

Доступно огромное множество различных систем экспрессии для продуцирования IL-1β фрагментов, включая Fab фрагменты, scFv и V_HH. Например, системы экспрессии как прокариотического, так и эукариотического происхождения могут быть использованы для широкомасштабной выработки фрагментов антитела и фьюжн-белков антитела. Особенно полезными являются системы экспрессии, допускающие секрецию большого количества фрагментов антитела в культуральную среду.

Выработка биспецифического Fab-scFv («битела», bibody) и триспецифического Fab-(scFv)(2) («тритела», tribody) описана Schoonjans и др. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) и Willems и др. (J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Для получения бител или трител молекулу scFv сливают с одной или обеими цепями VL-CL (L) и VH-CH₁ (Fd), например, для получения тритела две scFv соединяют с С-концом Fab, в то время как при получении битела одну scFv соединяют с С-концом Fab. «Минитело», состоящее из scFv, слитого с СН3 с использованием пептидного линкера (бесшарнирного, hingeless) или через шарнирный участок IgG, описано Olafsen и др., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):315-23.

Интратела (intrabodies) представляют собой одноцепочечные антитела, экспрессирующиеся внутриклеточно, которые могут воздействовать на функцию внутриклеточных белков (Biocca, и др., ЕМВО J. 9:101-108, 1990; Colby и др., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004). Интратела, содержащие клеточные сигнальные последовательности, которые удерживают конструкт анатитела во внутриклеточной области, могут быть получены, как описано Mhashilkar и др. (ЕМВО J 14:1542-51, 1995) и Wheeler и др., (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Транстела (transbodies) представляют собой антитела, которые могут проникать в клетки и в которых домены белковой трансдукции (PTD) слиты с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) антител (Heng и др., Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают антитела, представляющие собой маленькие модульные иммунофармацевтические агенты (SMIP) или фьюжн-белки на основе связывающего домена иммуноглобулинов, специфичные по отношению к белку-мишени. Эти конструкты являются одноцепочечными полипептидами, содержащими антигенсвязывающие домены, слитые с доменами иммуноглобулина, необходимыми для осуществления эффекторных функций антитела. См., например, WO 03/041600, патентную публикацию США 20030133939 и патентную публикацию США 20030118592.

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают иммуноадгезины. Один или более CDR может быть внедрен в молекулу, либо ковалентно, либо нековалентно, для получения иммуноадгезина. Иммуноадгезин может включать CDR(ы) как часть большей полипептидной цепи, может ковалентно соединять CDR(ы) с другой полипептидной цепью или может включать CDR(ы) нековалентно. CDR-участки, описанные в изобретении, позволяют иммуноадгезинам специфически связываться с IL-1β.

IL-1β-связывающие антитела и фрагменты по данному изобретению также включают миметики антител, включающие один или несколько участков, связывающих IL-1β, построенных на органическом или молекулярном каркасе (scaffold) (таком, как белковый или углеводный каркас). Белки, имеющие относительно выраженные трехмерные структуры, обычно называемые белковыми каркасами (protein scaffolds), могут быть использованы в качестве реагентов для дизайна миметиков антител. Эти каркасы обычно содержат один или несколько участков, подлежащих определенному или случайному изменению последовательности, при этом рандомизацию последовательности часто осуществляют для получения библиотеки белков, из которой могут быть отобраны нужные продукты. Например, миметик антитела может содержать химерный полипептид, связывающий не-иммуноглобулины, имеющий домен, похожий на иммуноглобулин, содержащий каркас, имеющий две или несколько петель, экспонированных в раствор, содержащий иной CDR из родительского антитела, внедренный в каждую из петель, и обладающий селективной активностью связывания по отношению к лиганду, связанному с родительским антителом. Белковые не-иммуноглобулиновые каркасы были предложены для получения белков с новыми характеристиками (свойствами) связывания (Tramontane и др., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994; McConnell и Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Другие белки были протестированы в качестве каркасов и были использованы для презентации (отображения) рандомизированных остатков на альфа-спиральных поверхностях (Nord и др., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord и др., Protein Eng. 8:601, 1995), петлях между альфа-спиралями в альфа-спиральных тяжах (Ku и Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995), и петлях, создаваемых дисульфидными мостиками, такими как у маленьких ингибиторов протеаз (Markland и др., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland и др., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen и Collins, Gene 164:243, 1995; Wang и др., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995). Способы использования каркасов для получения миметиков антител описаны в патенте США 5770380 и патентных публикациях США 2004/0171116, 2004/0266993 и 2005/0038229.

Предпочтительные антитела к IL-1β или фрагменты таких антител для использования согласно изобретению обычно связывают человеческий IL-1β с высокой аффинностью (например, как определено с помощью BIACORE), такой как, например, с равновесной константой диссоциации (K_D) для IL-1β примерно 10 нМ или меньше, примерно 5 нМ или меньше, примерно 1 нМ или меньше, примерно 500 пМ или меньше, или более предпочтительно примерно 250 пМ или меньше, примерно 100 пМ или меньше, примерно 50 пМ или меньше, примерно 25 пМ или меньше, примерно 10 пМ или меньше, примерно 5 пМ или меньше, примерно 3 пМ или меньше, примерно 1 пМ или меньше, примерно 0.75 пМ или меньше, примерно 0.5 пМ или меньше или примерно 0.3 пМ или меньше.

Антитела или фрагменты по данному изобретению могут, например, связываться с IL-1β с IC₅₀ примерно 10 нМ или меньше, примерно 5 нМ или меньше, примерно 2 нМ или меньше, примерно 1 нМ или меньше, примерно 0.75 нМ или меньше, примерно 0.5 нМ или меньше, примерно 0.4 нМ или меньше, примерно 0.3 нМ или меньше, или даже примерно 0.2 нМ или меньше, как определено с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Предпочтительно, антитело или фрагмент антитела по данному изобретению не вступает в перекрестные реакции с мишенями, отличными от IL-1. Например, антитела и фрагменты по данному изобретению могут связываться с IL-1β, но не связываются с IL-1α в степени, доступной для обнаружения, или обладают, по крайней мере, примерно в 100 раз (например, по крайней мере примерно в 150 раз, по крайней мере примерно в 200 раз или даже, по крайней мере примерно в 250 раз) большей селективностью связывания IL-1β по сравнению со связыванием IL-1α. Антитела или фрагменты, используемые согласно изобретению, в отдельных вариантах выполнения изобретения ингибируют индуцированную IL-1β экспрессию сывороточного IL-6 у животных, по крайней мере, на 50% (например, по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, или даже, по крайней мере 80%) по сравнению с уровнем IL-6 в сыворотке животных, стимулированных IL-1β, которым не было введено антитело или фрагмент по данному изобретению. Антитела могут связывать IL-1β, но допускать или в значительной степени допускать связывание связанного лиганда IL-1β с рецептором IL-1 I типа (IL-1RI). В отличие от многих известных IL-1β-связывающих антител, блокирующих или в значительной степени препятствующих связыванию IL-1β с IL-1RI, антитела, обозначенные АВ5 и АВ7 (заявка США №11/472813), селективно связывают лиганд IL-1β, но оставляют возможность связывания связанного лиганда IL-1β с IL-1RI. Например, антитело, обозначенное АВ7, связывается с эпитопом IL-1β, но оставляет возможность связывания связанного IL-1β с IL-1RI. В отдельных вариантах выполнения изобретения антитело может снижать аффинность взаимодействия связанного IL-1β с IL-1RI. Соответственно, изобретение включает, в соответствующем аспекте, использование IL-1β-связывающего антитела или IL-1β-связывающего фрагмента антитела, обладающего, по крайней мере, одной из указанных выше характеристик. Любое из упомянутых выше антител, фрагментов антител или полипептидов по данному изобретению может быть гуманизированным или разработанным для людей, как описано в изобретении.

Множество антител к IL-1 (например, IL-1β) и фрагментов, известных из уровня техники, может быть использовано согласно заявляемым способам, включая, например, антитела, описанные или разработанные с использованием способов, раскрытых в следующих патентах и заявках на патент: патент США 4935343; патент США 2003/0026806; патент США 2003/0124617; WO 2006/081139; WO 03/034984; WO 95/01997; WO 02/16436; WO 03/010282; WO 03/073982. WO 2004/072116, WO 2004/067568, EP 0267611 B1, EP 0364778 В1, и заявка на патент США 11/472813. В качестве нелимитирующих примеров можно привести антитела АВ5 и АВ7 (заявка на патент США №11/472813, WO 2007/002261), которые могут быть использованы согласно изобретению. Последовательности вариабельных участков АВ5 и АВ7 приведены ниже:

АВ5

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLSWYQQKPDGTVKLLIYYTSKLHSGV

PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYFCLQGKMLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 3)

Подчеркнутые последовательности относятся (слева направо) к CDR1, 2 и 3.

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

OVTLKESGPGILKPSOTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDG

DESYNPSLKTQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTVDTATYFCARNRYDPPWFVDWGOGT

LVTVSS (SEQ ID NO: 4)

Подчеркнутые последовательности относятся (слева направо) к CDR1, 2 и 3.

АВ7

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

DIOMTOSTSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKAVKLLIYYTSKLHSGV

PSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCLQGKMLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 5)

Подчеркнутые последовательности относятся (слева направо) к CDR1, 2 и 3.

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

OVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDG

DESYNPSLKSRLTISKDTSKNQVSLKITSVTAADTAVYFCARNRYDPPWFVDWGOGT LVTVSS (SEQ ID NO: 6)

Подчеркнутые последовательности относятся (слева направо) к CDR1, 2 и 3.

Описанные в изобретении антитела и фрагменты антител могут быть получены любым подходящим способом. Подходящие способы получения таких антител и фрагментов антител известны из уровня техники. Другие способы получения таких антител и фрагментов антител описаны в изобретении в качестве составной части изобретения. Антитело, фрагмент антитела или полипептид по данному изобретению, как описано в изобретении, может быть выделен или очищен до любой степени. В данном контексте «выделенное соединение» относится к соединению, выделенному из его естественного (природного) окружения. Очищенное соединение представляет собой соединение, чистота которого повышена таким образом, что соединение существует в форме более чистой, чем оно существует (i) в его природном окружении или (ii) в условиях исходного синтезированного и/или амплификацированного в лабораторных условиях, причем «чистота» является относительным термином и не обязательно означает «абсолютную чистоту».

Фармацевтические композиции

Антитела и фрагменты антител, связывающие IL-1 (например, IL-1β) для использования согласно данному изобретению могут быть включены в состав композиций, особенно фармацевтических композиций, для использования согласно способам по данному изобретению. Такие композиции включают терапевтически или профилактически эффективное количество IL-1β-связывающего антитела или фрагмента антитела по данному изобретению в смеси с подходящим носителем, например, фармацевтически приемлемым агентом. Обычно, антитела и фрагменты антител, связывающие IL-1, по данному изобретению до составления фармацевтической композиции являются в значительной степени очищенными для введения животному.

Фармацевтически приемлемые агенты включают носители, наполнители, разбавители, антиоксиданты, консерванты, красители, ароматизирующие и разбавляющие агенты, эмульгаторы, суспендирующие средства, растворители, наполнители, буферы, носители для доставки, средства, влияющие на тоничность, сорастворители, смачивающие (увлажняющие) средства, комплексующие средства, буферные агенты, антимикробные средства и поверхностно-активные вещества.

Нейтральные буферные солевые растворы или солевой (физиологический) раствор, смешанный с альбумином, являются примерами подходящих носителей. Фармацевтические композиции могут включать антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы солей, такие как ионы натрия; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как твин, плюроники или полиэтиленгликоль (PEG, ПЭГ). Также в качестве примера подходящие средства для увеличения тоничности включают галогениды щелочных металлов (предпочтительно, хлорид натрия или калия), маннитол, сорбит и аналогичные. Подходящие консерванты включают бензалконий хлорид, тимерозал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту и аналогичные. В качестве консерванта также может быть использована перекись водорода. Подходящие сорастворители включают глицерин, пропиленгликоль и ПЭГ. Подходящие комплексующие агенты включают кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропилциклодекстрин. Подходящие поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты включают эфиры сорбита, полисорбаты, такие как полисорбат 80, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапол и аналогичные. В качестве буферов можно использовать обычные буферы, такие как ацетатный, боратный, цитратный, фосфатный, бикарбонатный или трис-HCl. Ацетатный буфер может иметь рН примерно 4-5.5, и трис-буфер может иметь рН примерно 7-8.5. Дополнительные фармацевтические агенты описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, под ред. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, 1990.

Композиция может быть в жидкой форме или высушенной сублимационной сушкой или лиофилизированной и может включать один или более лиопротектор, наполнитель, поверхностно-активное вещество, высокомолекулярную структурную добавку и/или наполнитель (см., например, патенты США 6685940, 6566329 и 6372716). Согласно одному из вариантов выполнения изобретения композиция включает лиопротектор, представляющий собой невосстанавливающий сахар, такой как сахароза, лактоза или трегалоза. Лиопротектор обычно включают в таком количестве, чтобы при реконструкции получившаяся в результате рецептура была изотонической, хотя и гипертонические или слабо гипотонические рецептуры также могут быть подходящими. Кроме того, количество лиопротектора должно быть достаточным, чтобы предотвратить недопустимую степень деградации и/или агрегации белка при лиофилизации. Например, концентрации лиопротектора для сахаров (например, сахарозы, лактозы, трехалозы) в препаратах перед лиофильной сушкой составляют от примерно 10 мМ до примерно 400 мМ. В другом варианте выполнения изобретения в композицию включено поверхностно-активное вещество, такое как, например, неионные поверхностно-активные вещества и ионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбат 20, полисорбат 80); полоксамеры (например, полоксамер 188); фениловые эфиры полиэтиленгликоля (например, тритон); додецилсульфат натрия (SDS); лаурелсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-сульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-саркозин; линолеил-, миристил- или цетил-бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристиламидопропил-, палмидопропил- или изостеарамидопропил-бетаин (например, лауроамидопропил); миристарнидопропил-, палмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; метилкокоил натрия, кокоил- или динатрийметилофеилтаурат; и серии MONAQUAT™. (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль и сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля (например, плюроник PF68 и др.). Количества поверхностно-активных веществ, которые могут содержаться в препаратах до лиофильной сушки, может составлять, например, примерно 0.001-0.5%. Высокомолекулярные структурные добавки (например, наполнители, связующие) могут включать, например, акацию, альбумин, альгиновую кислоту, фосфат кальция (двухосновный), целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, декстран, декстрин, декстраты, сахарозу, тилозу, прежелатинизированный крахмал, сульфат кальция, амилозу, глицин, бентонит, мальтозу, сорбит, этилцеллюлозу, кислый динатрий фосфат, динатрий фосфат, динатрий пиросульфит, поливиниловый спирт, желатин, глюкозу, гуаровую смолу, жидкую глюкозу, сжимаемый сахар, магний алюминий силикат, мальтодекстрин, полиэтиленоксид, полиметакрилаты, повидон, альгинат натрия, трагакант, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал и зеин. Примерные концентрации высокомолекулярных структурных добавок составляют от 0.1% до 10% по весу. В других вариантах выполнения изобретения в композицию может быть включен наполнитель (например, маннитол, глицин).

Композиции могут быть подходящими для парентерального введения. Приведенные в качестве примера композиции подходят для инъекций или инфузий (вливаний) животным любым доступным для квалифицированного работника способом, таким как внутрисуставное, подкожное, внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное, интрацеребральное (интрапаренхимное), интрацеребровентрикулярное, внутримышечное, внутриглазное, внутриартериальное, внутрь поражения (intralesional), внутриректальное, трансдермальное, пероральное введение и введение с помощью ингаляции. Рецептура для парентерального введения обычно представляет собой стерильный, апирогенный, изотонический водный раствор, необязательно содержащий фармацевтически приемлемые консерванты.

Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы с хлоридом натрия, раствор Рингера с лактозой или нелетучие масла. Носители для внутривенного введения включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители, такие как полученные на основе раствора Рингера с декстрозой и др. Могут присутствовать также консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и пр. См. в целом Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980, включенное в изобретение в виде ссылки.

Фармацевтические композиции, описанные в изобретении, могут быть составлены для контролируемой или продолжительной (непрерывной) доставки, обеспечивающей локальную концентрацию продукта (например, болюс, эффект замедленного всасывания), продолжительного (непрерывного) высвобождения и/или повышенной стабильности или времени полувыведения в конкретном локальном окружении. Изобретение предусматривает, что в определенных вариантах выполнения изобретения такие композиции могут включать существенно большее количество антитела или фрагмента в исходном препарате, в то время как эффективное количество антитела или фрагмента, действительно высвобожденного и доступного в любой момент времени, оказывается, в соответствии с изобретением, значительно меньше, чем в исходном препарате. Композиции могут включать сочетания (рецептуры) IL-1β-связывающих антител, фрагментов антител, нуклеиновых кислот или векторов по данному изобретению с корпускулярными препаратами полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и пр., а также средствами, такими как биодеградируемая матрица (матрикс), пригодными для инъекций микросферы, микрокапсульные частицы, микрокапсулы, биоразлагаемые гранулы, липосомы и имплантируемые устройства для доставки, обеспечивающие контролируемое или продолжительное высвобождение активного агента, который затем может быть доставлен в виде инъекции агента замедленного всасывания. Технологии приготовления таких средств для контролируемой или продолжительной доставки известны, причем было разработано и использовано множество полимеров для контролируемого высвобождения и доставки лекарственных средств. Такие полимеры обычно являются биодеградируемыми и биосовместимыми. Полимерные гидрогели, включая гели, образованные за счет комплексообразования энантиомерных полимеров или полипептидных сегментов, и температуро- или рН-чувствительные гидрогели могут быть желательными для обеспечения эффекта замедленного всасывания за счет мягких и водных условий инкапсулирования («ловушки», trapping) биологически активных белковых агентов (например, антител). См., например, описание контролируемого высвобождения полимерными микрочастицам и для доставки фармацевтических композиций в публикации заявки РСТ WO 93/15722.

Подходящие материалы для этой цели включают полилактиды (см., например, патент США 3773919), полимеры поли-α-гидроксикарбоновых кислот, таких как поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988 А), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman и др., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), поли-2-гидроксиэтил-метакрилат (Langer и др., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), и Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), этиленвинилацетат или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Другие биодеградируемые полимеры включают полилактоны, полиацетали, полиортоэфиры и полиортокарбонаты. Композиции для продолжительного высвобождения также могут включать липосомы, которые могут быть получены любым известным из уровня техники способом (см., например, Eppstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)). Сам носитель или продукты его деградации должен быть нетоксичным в ткани-мишени и не должен ухудшать состояние. Этого можно достичь рутинным скринингом на моделях целевого нарушения у животных или, если такие модели недоступны, на нормальных животных.

Микроинкапсулирование рекомбинантных белков для продолжительного высвобождения было успешно осуществлено с человеческим гормоном роста (human growth hormone, rhGH), интерфероном- (rhIFN--), интерлейкином-2 и MN rgp120. Johnson и др., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora и др., Bio/Technologv. 8:755-758 (1990); Cleland, «Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds (Plenum Press: New York, 1995), pp.439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; и патент США №5654010. Были разработаны рецептуры для продолжительного высвобождения этих белков с использованием сополимера молочной и гликолевой кислот (poly-lactic-coglycolic acid, PLGA) из-за его биосовместимости и широкого спектра биодеградируемых свойств. Продукты деградации PLGA, молочная и гликолевая кислоты, могут быть быстро выведены из человеческого тела. Более того, деградируемость этого полимера может зависеть от его молекулярной массы и состава. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp.1-41. Дополнительные примеры композиций для продолжительного высвобождения описаны, например, в ЕР 58481 А, патенте США №3887699, ЕР 158277 А, патенте Канады №1176565, U. Sidman и др., Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer и др., Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha и др., J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu и др., Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000] и Dai и др., Colloids Surf В Biointerfaces 41, 117 [2005].

Биоадгезивные полимеры также предусмотрены для использования в составе или вместе с композициями по данному изобретению. Биоадгезивы представляют собой синтетические и природные материалы, способные прилипать к биологическим субстратам на продолжительные временные интервалы. Например, карбопол и поликарбофил оба являются синтетическими сшитыми производными полиакриловой кислоты. Биоадгезивные системы доставки, основанные на природных материалах, включают, например, гиалуроновую кислоту, также известную как гиалуронан. Гиалуроновая кислота является природным мукополисахаридом, состоящим из D-глюкуроновых остатков и N-ацетил-D-глюкозоамина. Гиалуроновая кислота найдена во внеклеточном матриксе тканей позвоночных, включая соединительные ткани, а также в синовиальной жидкости и в стекловидном теле и внутриглазной жидкости. Эстерифицированные производные гиалуроновой кислоты были применены для получения микросфер для использования в доставке как биосовместимые и биодеградируемые (см., например, Cortivo и др., Biomaterials (1991) 12:727-730; ЕР 517565; международная публикация WO 96/29998; Illum и др., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141). Примеры композиций по данному изобретению, содержащих гиалуроновую кислоту, включают полимерный эфир гиалуроновой кислоты в количестве от примерно 0.1% до примерно 40% (по весу) IL-1β-связывающего антитела или фрагмента по отношению к полимеру на основе гиалуроновой кислоты.

В составе композиций для доставки согласно данному изобретению могут быть использованы как биодеградируемые, так и не биодеградируемые полимерные матрицы. Такие полимерные матрицы могут включать природные или синтетические полимеры. Биодеградируемые матрицы являются предпочтительными. Период времени, в течение которого происходит высвобождение, зависит от выбора полимера. Обычно высвобождение в течение периода от нескольких часов до трех-двенадцати месяцев является наиболее желательным. Примеры синтетических полимеров, которые можно использовать для получения биодеградируемой системы доставки включают:

полимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиамиды, поликарбонаты, полиалкены, полиалкенгликоли, полиалкеноксиды, полиалкентерефталаты, поливиниловые спирты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинил галогениды, поливинилпирролидон, полигликолиды, полисилоксаны, полиангидриды, полиуретаны и их сополимеры, полимасляную кислоту, поливалериановую кислоту, алкилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозу, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, нитроцеллюлозы, полимеры на основе эфиров акриловой и метакриловой кислот, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксибутилметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетатбутират целлюлозы, ацетатфталат целлюлозы, карбоксилэтилцеллюлозу, триацетат целлюлозы, натриевую соль сульфата целлюлозы, полиметилметакрилат, полиэтилметакрилат, полибутилметакрилат, полиизобутилметакрилат, полигексилметакрилат, полиизодецилметакрилат, полилаурилметакрилат, полифенилметакрилат, полиметилакрилат, полиизопропилакрилат, полиизобутилакрилат, полиоктадецилакрилат, полиэтилен, полипропилен, полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиэтилентерефталат, поливиниловые спирты, поливинилацетат, поливинилхлорид, полистирол и поливинилпирролидон. Примеры природных полимеров включают альгинат и другие полисахариды, включая декстран и целлюлозу, коллаген, их химические производные (замещения, добавления химических групп, таких как, например, алкил, алкилен, гидроксилирование, окисление и другие модификации, повседневно осуществляемые специалистами), альбумин и другие гидрофильные белки, зеин и другие проламины и гидрофобные белки, сополимеры и их смеси. Вообще говоря, эти материалы расщепляются (деградируют) либо в процессе ферментативного гидролиза или при экспонировании в воду за счет поверхностной или объемной эрозии in vivo. Полимер (не обязательно) находится в форме гидрогеля (см., например, WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney, и др., Macromolecules, 1993, 26, 581-587), способного абсорбировать вплоть до примерно 90% его веса в воде и далее, не обязательно, является (поперечно) сшитым мультивалентными ионами или другими полимерами.

Системы доставки также включают неполимерные системы, являющиеся липидами, включая стеролы, такие как холестерин, эфиры холестерина и жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно- ди- и триглицериды; системы высвобождения на основе гидрогелей, силастиковые системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; таблетки, прессованные с использованием традиционных связующих и наполнителей, частично слитые импланты и пр. Характерные примеры включают, но не ограничены только этими: (а) эрозионные системы, в которых продукт содержится внутри матрицы, такие как описанные в патентах США №№4452775, 4675189 и 5736152, и (б) диффузионные системы, в которых продукт с контролируемой скоростью выходит из полимера, такие как описанные в патентах США №№3854480, 5133974 и 5407686. Липосомы, содержащие продукт, могут быть получены известными способами, такими как, например (DE 3218121; Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; заявка на патент Японии 83-118008; патенты США №№4485045 и 4544545; и EP 102324).

Фармацевтические композиции, содержащие антитело или фрагмент, связывающий IL-1β, могут быть составлены для ингаляций в форме, такой как, например, сухой порошок. Растворы для ингаляций также могут быть приготовлены в сжатой жидкости в аэрозольном баллончике для доставки с аэрозолем. Согласно еще одной рецептуре, растворы могут распыляться. Дополнительные фармацевтические композиции для введения в легкие включают описанные, например, в публикации заявки РСТ WO 94/20069, в которой описана доставка в легкие химически модифицированных белков. Для доставки в легкие размер частиц должен быть подходящим для доставки в периферические участки легких. Например, размер частиц может составлять от 1 мкм до 5 мкм; в то же время могут быть использованы и частицы большего размера, например, если частица является довольно пористой.

Некоторые рецептуры, содержащие IL-1β-связывающие антитела или фрагменты антител, можно вводить перорально. Рецептуры, вводимые таким образом, можно составить с или без носителей, обычно используемых при составлении твердых дозировочных форм, таких как таблетки или капсулы. Например, капсула может быть разработана таким образом, чтобы высвобождать активную часть рецептуры в том месте желудочно-кишечного тракта, где биодоступность достигает максимума, а досистемная деградация минимальна. Могут быть включены дополнительные средства для усиления абсорбции селективно связывающего агента. Разбавители, ароматизаторы, низкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие средства, агенты, способствующие расщеплению таблеток, и связующие также могут быть использованы.

Другая рецептура (препарат) может включать эффективное количество IL-1β-связывающего антитела или фрагмента в смеси с нетоксичными наполнителями, подходящими для производства таблеток. Растворы в форме стандартной дозы можно приготовить путем растворения таблеток в стерильной воде или другом подходящем носителе. Подходящие наполнители включают, но не ограничены только этими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия или бикарбонат, лактоза или фосфат кальция; или связующие, такие как крахмал, желатин или акация, или смазывающие средства, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Подходящие и/или предпочтительные фармацевтические рецептуры могут быть откорректированы, принимая во внимание данное изобретение и общие знания технологии составления лекарственных средств, в зависимости от предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозы. Невзирая на способ введения, эффективную дозу можно рассчитать в соответствии с массой тела пациента, площадью поверхности тела или размером органа. Дальнейшие уточнения расчетов для определения подходящей дозировки для лечения, включающего каждую из описанных здесь рецептур, известны из уровня техники и повседневно осуществляются специалистами. Подходящие дозировки могут быть установлены при использовании соответствующих данных дозировка - ответ.

Принимая во внимание данное изложение изобретения, дополнительные рецептуры являются очевидными, включая IL-1β-связывающие антитела и фрагменты в комбинации с одним или более другим терапевтическим средством. Например, в некоторых рецептурах IL-1β-связывающее антитело, фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту или вектор по данному изобретению комбинируют со вторым ингибитором сигнального пути IL-1. Представителями таких вторых ингибиторов являются (но не ограничиваясь только ими) антитела, фрагменты антител, пептиды, полипептиды, соответствующие смеси, нуклеиновые кислоты, векторы и фармацевтические композиции, такие как, например, описанные в документах US №№6899878, 2003022869, 20060094663, 20050186615, 20030166069, WO/04022718, WO/05084696, WO/05019259. Например, композиция может включать IL-1β-связывающее антитело, фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту или вектор по данному изобретению в комбинации с IL-1β-связывающим антителом, фрагментом, или нуклеиновой кислотой, или вектором, кодирующим такое антитело или фрагмент.

Фармацевтические композиции могут включать антитела или фрагменты, связывающие IL-1β, в комбинации с другими активными агентами. Такими комбинациями являются комбинации, эффективные для достижения поставленной цели. Комбинациями, составляющими часть изобретения, являются комбинации антител к IL-1β и фрагментов, таких как, например, описанные в изобретении, по крайней мере, с одним дополнительны агентом, выбранным из приведенного ниже списка. Перечисленные ниже активные агенты указаны исключительно для иллюстрации и не ограничивают список возможных. Комбинация может также включать более одного дополнительного агента, например, два или три дополнительных средства, если составленная таким образом композиция может выполнить предназначенную функцию.

Изобретение также подразумевает, что фармацевтические композиции, содержащие один или более активных агентов, могут вводиться отдельно от IL-1β-связывающих антител или фрагментов, и такие введения по отдельности могут быть осуществлены в тот же или в разные моменты времени, например, в тот же день или в разные дни. Введение других активных агентов может быть осуществлено стандартными способами врачебной практики, известными из уровня техники, или способ введения может быть модифицирован (например, большие интервалы, меньшие дозы, введение с запозданием) при использовании совместно с введением IL-1β-связывающих антител или фрагментов, таких как описаны в изобретении.

Активные агенты или комбинации с антителами или фрагментами по данному изобретению включают нестероидные противовоспалительные лекарства (NSAID), такие как аспирин, ибупрофен и другие производные пропионовой кислоты (алминопрофен, беноксапрофен, буклоксиновая кислота, карпрофен, фенбуфен, фенопрофен, флупрофен, флурбипрофен, индопрофен, кетопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пирпрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофеновую кислоту и тиоксапрофен, производные уксусной кислоты (индометацин, ацеметацин, алклофенак клиданак, диклофенак, фенклофенак, фенклозовая кислота, фентиазак, фуирофенак, ибуфенак, изоксепак, окспинак, сулиндак, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак), производные фенамовой кислоты (флуфенамовая кислота, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлуминовая кислота и толфенамовая кислота), производные бифенилкарбоновой кислоты (дифлунизал и флуфенизал), оксикамы (изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикан), салицилаты (ацетилсалициловая кислота, сульфасалазин) и пиразолоны (апазон, безпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон, фенилбутазон). Другие комбинации включают ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ-2). Другие активные средства для комбинаций включают стероиды, такие как преднизолон, преднизон, метилпреднизолон, бетаметазон, дексаметазон или гидрокортизон. Такая комбинация может быть особенно полезна, т.к. один или более из побочных эффектов стероида может быть уменьшен или даже устранен за счет постепенного уменьшения дозы стероида, необходимой для лечения пациентов в комбинации с заявляемыми антителами и фрагментами.

Альтернативно или в дополнение может быть использован терапевтический способ лечения, по крайней мере, с одним или более дополнительным активным агентом, действующим по иному механизму (иным способом): 1) сульфонилмочевины (например, хлорпропамид, толазамид, ацетогексамид, толбутамид, глибурид, глимепирид, глипизид) и/или меглитиниды (например, репаглинид, натеглинид), которые заметно стимулируют секрецию инсулина; 2) бигуаниды (например, метформин) способствуют утилизации глюкозы, снижая продукцию глюкозы печенью и уменьшая поступление глюкозы из кишечника; 3) ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, акарбоза, миглитол) замедляют расщепление углеводов и, в результате, абсорбцию из кишечного тракта и снижают послеобеденную гипергликемию; 4) тиазолидиндионы (например, троглитазон, пиоглитазон, розиглитазон, глипизид, балаглитазон, ривоглитазон, нетоглитазон, троглитазон, энглитазон, AD 5075, Т 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, сиглитазон, адаглитазон, CLX 0921, дарглитазон, СР 92768, ВМ 152054) усиливают действие инсулина, за счет чего способствуют утилизации глюкозы в периферических тканях; 5) пептиды, аналогичные глюкагону, включая ингибиторы DPP4 (например, ситаглиптин); и 6) инсулин, стимулирующий утилизацию глюкозы тканями и ингибирующий поступление глюкозы из кишечника. Глюкагон-аналогичный пептид-1 (GLP-1), DPP-IV-резистентные аналоги (миметики инкретина), ингибиторы DPP-IV, инсулин, аналоги инсулина, агонисты PPAR-гамма, агонисты PPAR двойного действия, агонисты или аналоги GLP-1, ингибиторы РТР1В, ингибиторы SGLT, средства, усиливающие секрецию инсулина, агонисты RXR, ингибиторы гликоген-синтазы-киназы-3, сенсибилизаторы инсулина, иммуномодуляторы, агонисты адренорецептора бета-3, агонисты Pan-PPAR, ингибиторы 11beta-HSD1, аналоги амилина, бигуаниды, ингибиторы альфа-глюкозидазы, меглитиниды, тиазолидиндионы, сульфонилмочевины и пр. также могут быть использованы в качестве другого активного агента(ов) (см., например, Nathan, 2006, N. Engl. J. Med. 355:2477-2480; Kahn и др., 2006, N. Engl. J. Med. 355:2427-2443). Еще в одном варианте выполнения изобретения активным агентом может быть ингибитор HMG Со-А редуктазы (например, статины).

Также предусматривается, что антитело к IL-1β или фрагмент, введенный субъекту в соответствии с изобретением, может быть введен в комбинации с лечением, по крайней мере, одним дополнительным активным агентом, таким как, например, любой из перечисленных ранее активных агентов. Согласно одному из вариантов выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом продолжают на прежнем уровне. В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сокращают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), в то время как лечение антителом к IL-1β или фрагментом продолжают при постоянном режиме дозирования. В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сокращают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), а лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения). В другом варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сокращают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), а лечение антителом к IL-1β или фрагментом усиливают (например, повышают дозировку, увеличивают частоту дозирования, увеличивают длительность лечения). Еще в одном варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом сохраняют на прежнем уровне, в то время как лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращают или приостанавливают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения). Еще в одном варианте выполнения изобретения лечение, по крайней мере, одним активным агентом и лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращают или приостанавливают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения).

Фармацевтические композиции, используемые согласно изобретению, могут включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество IL-1β-связывающих антител или фрагментов. Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при соблюдении дозировок и временных периодов, необходимых для достижения желаемого терапевтического эффекта. Терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела может меняться в зависимости от факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, а также способности антитела или его части вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективным также является количество, для которого любые токсические или вредные эффекты антитела или фрагмента антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами. Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при соблюдении дозировок и временных периодов, необходимых для достижения желаемого профилактического результата.

Терапевтически или профилактически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей IL-1β-связывающее.антитело или фрагмент, будет зависеть, например, от терапевтических задач, таких как показания (симптомы), для лечения которых используют композицию, от способа введения, состояния субъекта. Фармацевтические композиции вводят в терапевтически или профилактически эффективном количестве для лечения IL-1-зависимого состояния. Согласно данному изобретению «терапевтически или профилактически эффективное количество» IL-1β-связывающего антитела или фрагмента по данному изобретению это такое количество, которое может лечить или предотвращать один или более симптомов IL-1-зависимого заболевания у субъекта, как описано в изобретении.

Способы использования

Согласно данному изобретению антитела против IL-1β в эффективном количестве могут быть использованы для лечения и/или профилактики диабета 1 типа, диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Такие способы могут быть использованы для лечения млекопитающих (например, человека), страдающих от диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, резистентности к инсулину и болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, или для предотвращения таких состояний у субъектов, находящихся в группе риска.

Термины «предотвращение», «предотвращать», «предупреждение», «профилактика», «подавление», «подавлять», «ингибировать» и «ингибирование» относятся к способу действия (такому как введение соединения или фармацевтической композиции), начатому таким образом (например, до проявления клинических симптомов болезненного состояния), чтобы предотвратить, подавить и уменьшить, временно или надолго, появление (проявление) клинических признаков болезненного состояния. Такое предотвращение, подавление или уменьшение не обязательно должно быть абсолютным, чтобы быть полезным.

Термины «лечение» и «лечить» в данном контексте относятся к способу действия (такому как введение соединения или фармацевтической композиции), начатому после проявления клинического симптома болезненного состояния, для устранения, уменьшения, подавления или улучшения временно или надолго клинических проявлений или развития болезненного состояния. Такое лечение не обязательно должно быть абсолютным, чтобы быть полезным.

В данном контексте термин «нуждается в лечении» относится к суждению, высказанному человеком, ухаживающим за индивидуумом, о том, что пациент нуждается в лечении или получит пользу от лечения. Это суждение может быть основано на самых разных факторах, находящихся в области компетенции (опыта, знаний) ухаживающего человека, но включает знание о том, что человек болен или будет болен из-за состояния, которое можно лечить с использованием способа или вещества согласно данному изобретению.

В данном контексте термин «нуждается в профилактике» относится к суждению, высказанному человеком, ухаживающим за индивидуумом, о том, что пациент нуждается в профилактике или получит пользу от профилактики. Это суждение может быть основано на самых разных факторах, находящихся в области компетенции (опыта, знаний) ухаживающего человека, но включает знание о том, что человек будет болен или может стать больным из-за состояния, которое можно предотвратить при использовании способа или вещества согласно изобретению.

Термин «терапевтически эффективное количество» в данном контексте относится к количеству вещества (например, антитела), самого по себе или в составе фармацевтической композиции, которое способно вызвать любой детектируемый положительный эффект в отношении любого симптома, аспекта или признака болезненного состояния при введении пациенту (например, в виде одной или более доз). Такой эффект не обязательно должен быть абсолютным, чтобы быть полезным.

В данном контексте термин «резистентность к инсулину» относится к состоянию, когда нормальное количество инсулина не в состоянии вызвать нормальный физиологический или молекулярный ответ.В некоторых случаях повышенное по сравнению с физиологическим количество инсулина, либо секретированного эндогенно, либо введенного экзогенно, в состоянии преодолеть резистентность к инсулину полностью или частично и вызвать биологический ответ.

Антитела против IL-1β или фрагменты можно вводить людям в эффективном количестве для лечения и/или профилактики диабета 2 типа, диабета 1 типа, ожирения, гипергликемии, гиперинсулинемии, резистентности к инсулину и/или болезненных состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину. Другие заболевания или состояния, для которых возможно лечение с помощью антител к IL-1R или соответствующих фрагментов по данному изобретению, включают предиабет, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертензию, метаболический синдром и болезненное состояние. Изобретение также включает способы использования таких антител или фрагментов для уменьшения частоты или тяжести заболеваний, или стабилизации осложнений или состояний, связанных с диабетом 2 типа, таких как, например, ретинопатия, почечная недостаточность, заболевание сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероз, заболевание периферических сосудов), и заживление ран (например, диабетической язвы).

Изобретение также включает способы использования антител к IL-1β и фрагментов для снижения уровня C-реактивного белка (CRP) у субъекта как описано в изобретении. CRP является белком острой фазы, который продуцируется преимущественно гепатоцитами под влиянием цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и фактор некроза опухолей (TNF). По данным электронной версии 2007 г. руководства по лечению внутренних болезней UpToDate®, несмотря на недостаточную специфичность причин воспаления (например, инфекция, хроническое заболевание почек, аутовоспалительное заболевание, рак), данные более 30 эпидемиологических исследований показали существенную связь между повышенными концентрациями CRP в сыворотке или плазме и широким распространением лежащего в основе атеросклероза, риском возвратных сердечно-сосудистых приступов среди пациентов с установленным заболеванием, а также с частотой сердечно-сосудистых приступов среди индивидуумов, находящихся в группе риска по атеросклерозу. Взаимодействие с основным заболеванием почек, приводящее в результате к почечной недостаточности с окислительным стрессом и пост-синтетической модификацией белков, диализ, связанными с ним загрязняющими веществами, и влияние диализной мембраны на белки сыворотки, и инфекции, связанные с повторным внедрением в место доступа, и последующие системные инфекции приводят этих пациентов к непомерному грузу стимулов воспаления. Так как уровни очищения сыворотки от креатинина падают по мере ослабления функции почек, существует пропорциональное увеличение медиаторов воспаления в сыворотке (например, цитокинов TNF, IL-6, IL-1), а также очевидные попытки тела бороться с этой ситуацией с помощью увеличения (но недостаточного) выработки противовоспалительных медиаторов IL-1 RA и IL-10. Это воспалительное состояние у пациентов с хронической почечной недостаточностью ведет к нестабильности атеросклеротических бляшек вследствие прямого запуска апоптоза клеток гладких мышц сосудов. Рост уровня цитокинов ведет в результате к одной из двух важнейших причин смертности у таких пациентов - поразительному увеличению смертей от сердечно-сосудистых заболеваний вследствие инфарктов миокарда и ударов. Прямая иллюстрация такого повышенного риска видна при выяснении уровней CRP у пациентов: при разделении пациентов на четыре группы в зависимости от уровня CRP, в группе с наивысшими уровнями CRP смертность составляет примерно 35% в течение 12 месяцев. Таким образом, данное изобретение раскрывает использование антител к IL-1β или фрагментов по изобретению для снижения уровней CRP у таких пациентов (например, у субъектов, страдающих от заболевания почек). Снижение уровней CRP у субъекта, как описано в изобретении, является подходящим способом для достижения соответствующего пропорционального снижения заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний.

Согласно одному из вариантов выполнения изобретения антитело к IL-1β или фрагмент вводят субъекту, страдающему от, по крайней мере, одного из перечисленных выше заболеваний, состояний или осложнений, причем субъект также получает, по крайней мере, одно иное, приемлемое с медицинской точки зрения, лечение заболевания, состояния или осложнения (например, медикаментозное лечение, лекарственный препарат, терапию, активный агент). В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере одно иное приемлемое с медицинской точки зрения лечение заболевания, состояния или осложнения уменьшают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), в то время как лечение антителом к IL-1β или фрагментом сохраняется при постоянном режиме дозирования. В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере одно иное приемлемое с медицинской точки зрения лечение заболевания, состояния или осложнения уменьшают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), и лечение антителом к IL-1β или фрагментом сокращают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения). В другом варианте выполнения изобретения, по крайней мере одно иное приемлемое с медицинской точки зрения лечение заболевания, состояния или осложнения уменьшают или приостанавливают (например, когда субъект стабилен), а лечение антителом к IL-1β или фрагментом усиливают (например, повышают дозировку, увеличивают частоту дозирования, увеличивают длительность лечения). Еще в одном варианте выполнения изобретения, по крайней мере одно иное приемлемое с медицинской точки зрения лечение заболевания, состояния или осложнения оставляют на прежнем уровне и лечение антителом к IL-1β или фрагментом уменьшают или приостанавливают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения). Еще в одном варианте выполнения изобретения, по крайней мере, одно иное приемлемое с медицинской точки зрения лечение заболевания, состояния или осложнения и лечение антителом к IL-1β или фрагментом уменьшают или приостанавливают (например, снижают дозировки, уменьшают частоту дозирования, укорачивают программу лечения).

В предпочтительных способах лечения или профилактики перечисленных выше заболеваний или состояний (например, диабета 1 типа, диабета 2 типа, гипергликемии, гиперинсулинемии, ожирения, резистентности к инсулину) антитело к IL-1β или его фрагмент вводят людям согласно перечисленному выше количеству доз, размерам доз и/или интервалам между введениями доз. Альтернативно, антитело к IL-1β или фрагмент можно ввести в виде одной или более начальных доз в указанных выше количествах, которые меньше, чем величины одной или более последующих доз. Уменьшение величины начальной дозы (доз) может повысить эффективность и/или переносимость лечения. Например, в одном из нелимитирующих вариантов выполнения изобретения можно ввести одну или более начальных доз (например, 1, 2, 3, 4, 5) антитела или фрагмента в количестве ≤1 мг/кг (например, ≤0.9 мг/кг, ≤0.8 мг/кг, ≤0.7 мг/кг, ≤0.6 мг/кг, ≤0.5 мг/кг, ≤0.4 мг/кг, ≤0.3 мг/кг, ≤0.2 мг/кг, ≤0.1 мг/кг, ≤0.05 мг/кг, ≤0.03 мг/кг, ≤0.01 мг/кг), с последующим введением одной или более последующих доз, величина которых больше, чем величина начальных доз(ы) (например, ≥0.01 мг/кг, ≥0.03 мг/кг, ≥0.01 мг/кг, ≥0.3 мг/кг≥0.5 мг/кг, ≥0.6 мг/кг, ≥0.7 мг/кг, ≥0.8 мг/кг, ≥0.9 мг/кг, ≥1.0 мг/кг, ≥1.5 мг/кг, ≥2 мг/кг, ≥2.5 мг/кг, ≥3 мг/кг, ≥3.5 мг/кг, ≥4 мг/кг, ≥4.5 мг/кг, ≥5 мг/кг). Изобретение предусматривает, что каждая доза антитела или фрагмента может быть введена в одно или несколько мест.

Способы лечения или профилактики заболевания или состояния в соответствии с данным изобретением могут подразумевать заранее определенный или «рутинный» график введения антитела или фрагмента. В данном контексте рутинный график введения относится к заранее определенному и назначенному временному интервалу между введениями. Рутинный график может подразумевать одинаковые или различные по продолжительности временные интервалы, заранее заданные расписанием. Любая индивидуальная комбинация является рутинным графиком до тех пор, пока заранее определено, что подходящий график включает введение в определенный день.

Изобретение также предусматривает, что антитела к IL-1β или фрагменты, используемые согласно заявленным способам, могут быть введены в совокупности с более традиционными способами лечения и фармацевтическими композициями (например, активными агентами). Такие композиции могут включать, например, ингибиторы DPP-IV, инсулин, аналоги инсулина, агонисты PPAR-гамма, агонисты PPAR двойного действия, агонисты или аналоги GLP-1, ингибиторы РТР1 В, ингибиторы SGLT, средства, повышающие секрецию инсулина, агонисты RXR, ингибиторы гликоген-синтазы-киназы-3, сенсибилизаторы инсулина, иммуномодуляторы, агонисты адренорецептора бета-3, агонисты Pan-PPAR, ингибиторы 11beta-HSD1, аналоги амилина, бигуаниды, ингибиторы альфа-глюкозидазы, меглитиниды, тиазолидиндионы, сульфонилмочевины и пр. (см., например, Nathan, 2006, N. Engl. J. Med. 355:2477-2480; Kahn и др., 2006, N. Engl. J. Med. 355:2427-2443). В некотором варианте выполнения изобретения антитела и фрагменты, используемые согласно изобретению, могут предотвращать или откладывать необходимость в дополнительных способах лечения или фармацевтических композициях. В других вариантах выполнения изобретения антитела или фрагменты могут уменьшать количество, частоту или длительность дополнительных способов лечения или фармацевтических композиций.

Альтернативно, способы лечения или профилактики заболевания или состояния согласно данному изобретению могут подразумевать график введения антитела или фрагмента, основанный на наличии симптомов заболевания и/или на изменениях любых упомянутых оценок состояния (например, HbA1c, уровней сахара в крови натощак, результатов перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT), AUC глюкоза/С-пептид инсулина, использования медикаментозного лечения диабета, чувствительности к инсулину, уровней цитокинов в сыворотке, уровней CRP, показателей качества жизни, улучшения BMI) в качестве средств для определения, когда следует вводить одну или более последующих доз. Аналогично, этот подход может быть использован в качестве средства для определения, следует ли увеличить или уменьшить последующую дозу исходя из эффекта, вызванного введением предыдущей дозы.

Диагностика таких заболеваний и состояний у пациентов или, альтернативно, риска развития таких заболеваний и состояний может быть осуществлена в соответствии со стандартной медицинской практикой, известной из уровня техники. Клинические исследования (оценки) лечебного или профилактического эффекта на упомянутые выше заболевания и состояния, проведенные после введения антител против IL-1β или фрагментов, хорошо известны из уровня техники и могут быть использованы в качестве способов мониторинга (контроля) эффективности способов по данному изобретению.

Например, ответ на лечение диабета 2 типа можно оценить на основании эффективности улучшения гемоглобина A1c (HbA1c) в первичной конечной точке, см., например, Reynolds и др., BMJ, 333(7568):586-589, 2006). Улучшение HbA1c, являющееся индикатором терапевтической эффективности, может варьироваться в зависимости от измерения исходного базового значения у пациента, причем большее уменьшение часто соответствует более высокому исходному базовому значению, а меньшее уменьшение часто соответствует более низкому исходному базовому значению. Согласно одному аспекту данного изобретения способ должен приводить к снижению HbA1c, по крайней мере, примерно на 0.5% (например, по крайней мере примерно 0.5%, по крайней мере примерно 1%, по крайней мере примерно 1.5%, по крайней мере примерно 2%, по крайней мере примерно 2.5%, по крайней мере примерно 3%, по крайней мере примерно 3.5%, по крайней мере примерно 4% или более) по сравнению с уровнями до введения доз.

Для того чтобы оценить эффективность лечения, можно также определить одну или несколько последующих вторичных конечных точек исследования), таких как, например, уровень сахара в крови натощак (например, глюкозы) (например, уменьшение до ≤130, ≤125, ≤120, ≤115, ≤110, ≤105, ≤100; альтернативно, уменьшение на >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95% по сравнению с уровнями до введением дозы), 120 минутный пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) (например, ≤200, ≤190, ≤180, ≤170, ≤160, ≤150, ≤140), AUC глюкоза/ С-пептид инсулина (например, >25%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >100% возрастание по сравнению с исходной, до введения дозы), сокращение медикаментозного лечения диабета (например, инсулина, перорального гипогликемического средства), повышение чувствительности к инсулину, уровни цитокинов в сыворотке (например, нормализация), уровни CRP (например, снижение на ≥0.2, ≥0.4, ≥0.6, ≥0.8, ≥1.0, ≥1.4, ≥1.8, ≥2.2, ≥2.6, ≥3.0 мг/л; альтернативно, снижение на >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95% по сравнению с исходным, до введения дозы), показатели качества жизни, улучшение BMI (снижение на 1%, 3%, 5%), фармакокинетика и пр. (Saudek, и др., JAMA, 295:1688-97, 2006; Pfutzner и др., Diabetes Technol Ther. 8:28-36, 2006; Norberg, и др., J Intern Med. 260:263-71, 2006).

Аналогичным образом можно оценить эффективность по отношению к другим заболеваниям или состояниям с использованием одной или нескольких упомянутых ранее конечных точек и/или других, известных из уровня техники. Например, влияние на гипергликемию можно оценить путем измерения уровней сахара (т.е., глюкозы) в крови натощак, влияние на гиперинсулинемию можно оценить путем измерения уровней инсулина и/или уровней С-пептида, влияние на ожирение можно оценить путем измерения массы и/или BMI, и влияние на резистентность к инсулину можно оценить с помощью OGTT.

Альтернативно или дополнительно у субъектов, которых лечили в соответствии с изобретением, может отмечаться снижение уровня триглицеридов в крови, по крайней мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или больше по сравнению с исходным (до лечения) уровнем. Альтернативно или дополнительно у субъектов, которых лечили в соответствии с изобретением, может отмечаться снижение уровня свободных жирных кислот, по крайней мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или больше по сравнению с исходным (до лечения) уровнем.

ПРИМЕРЫ

Приведенные далее примеры предназначены исключительно для иллюстрации осуществления на практике данного изобретения и не ограничивают изобретение. Все упомянутые патенты и литературные источники во всей своей полноте включены в изобретение в виде ссылок.

ПРИМЕР 1

Ингибирование IL-1β высокоаффинным антителом против IL-1β в исследованиях in vitro на клетках с использованием индуцированного IL-1 высвобождения IL-8 в качестве средства для получения информации

Ингибиторный эффект IL-1β-специфичного антитела сравнили с эффектом ингибитора пути метаболизма IL-1 Kineret® (анакинры, anakinra), не являющегося антителом и представляющего собой рекомбинантный антагонист рецептора IL-1. Свежую гепаринизированную периферическую кровь отобрали у здоровых доноров. 180 мкл цельной крови поместили в 96-луночный планшет и инкубировали с различными концентрациями антитела АВ7 (заявка на патент США №11/472813, WO 2007/002261) и 100 пМ rhIL-1β. Для образцов, обработанных Kineret®, Kineret® и rhIL-1β объединяли в соотношении 1:1 до смешивания с кровью. Образцы инкубировали в течение 6 часов при 37°C с 5% CO₂. Клетки цельной крови лизировали 50 мкл 2.5% тритоном Х-100. Концентрации интерлейкина-8 (IL-8) в очищенных лизатах определяли с помощью ELISA (Quantikine human IL-8 ELISA kit, R&D Systems) согласно инструкциям производителя. Концентрации IL-8 в образцах, обработанных АВ7 и Kineret®, сравнили с контрольным образцом, обработанным анти-KLH для контроля. Результаты приведены на Фиг.1 и суммированы в Таблице 6. IC₅₀ - это концентрация антител, необходимая для 50% ингибирования высвобождения IL-8, индуцированного IL-1β.

Таблица 1   IC₅₀ (пМ) АВ7 1.9 Kineret® 53.4

Эти результаты показывают эффективность АВ7 in vitro по данным измерений ингибирования индуцированного IL-1 β высвобождения IL-8. Эти результаты, показывающие большую эффективность антитела по сравнению с Kineret®, указывают на то, что антитело будет обладать ингибиторной активностью по отношению к IL-1β in vivo.

ПРИМЕР 2

Ингибирование биологической активности человеческого IL-1β in vivo IL-1β-специфичными антителами по данным о влиянии на индуцированное IL-1 высвобождение IL-6

Для того чтобы подтвердить эффективность АВ7 in vivo, его способность блокировать биологическую активность человеческого IL-1β протестировали на мышах. Детали исследования описаны Economides и др., Nature Med., 9: 47-52 (2003). Если коротко, самцам мышей С57/В16 mice (Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine) с помощью интраперитонеальных инъекций ввели оттитрованные дозы АВ7, другого антитела к IL-1β, AB5, или контрольного антитела. Через 24 часа после введения антител мышам сделали подкожную инъекцию рекомбинантного человеческого IL-1β (rhIL-1β) (производства PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) в количестве 1 мкг/кг. Через два часа после инъекции rhIL-1β (время пика ответа IL-6), мышей умертвили, собрали кровь и обработали ее для получения сыворотки. Уровни IL-6 в сыворотке определили с помощью ELISA (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), следуя указаниям протокола производителя. Процент ингибирования рассчитали на основании отношения количества IL-6, измеренного в сыворотке экспериментальных животных, к количеству IL-6, определенному в сыворотке контрольных животных (умноженное на 100).

Результаты приведены на Фиг.2. Способность ингибировать активность IL-1β in vivo оценили как функцию стимулированных IL-1β уровней IL-6 в сыворотке. Как видно из Фиг.2, антитела АВ7 и АВ5 антитела являются эффективными ингибиторами активности человеческого IL-1β in vivo. Эти результаты также показывают, что единичная инъекция АВ7 или АВ5 может блокировать системное действие стимуляции IL-1β и что такие антитела полезны для ингибирования активности IL-1β in vivo.

Аналогичный эксперимент провели для дальнейшей демонстрации способности АВ7 нейтрализовать мышиный IL-1β in vivo, чтобы обосновать использование этого антитела на мышиных моделях болезней. Было установлено, что АВ7 обладает аффинностью по отношению к человеческому IL-1β, превышающую аффинность по отношению к мышиному IL-1β примерно в 10000 раз, и эффективность in vitro (no данным исследований D10.G4.1) примерно в 1000 раз больше, чем для мышиного IL-1β. В модели на мышах C57BL/6 с использованием IL-6 для получения информации, мышам делали внутрибрюшинные инъекции АВ7 (3 или 300 мкг) или носителя PBS в качестве контроля за 24 часа до подкожных инъекций человеческого (Фиг.2 В, вставка А) или мышиного (Фиг.2B, вставка В) IL-1β (20 нг). Через 2 часа отбирали кровь и анализировали образцы сыворотки на уровни IL-6 с помощью ELISA. Эти данные показывают, что максимальное подавление уровней IL-6 (~ 75%), индуцированных человеческим IL-1β, наблюдается при 3 мкг (вставка А), в то время как субмаксимальное подавление уровней IL-6 (~ 50%), индуцированных мышиным IL-1β, наблюдается при 300 мкг (вставка В). Эти результаты согласуются с данными наблюдений, показывающими значительно большую аффинность и эффективность in vitro антитела АВ7 по отношению к человеческому IL-1β, чем к мышиному IL-1β. Кроме того, данные показывают, что это антитело может быть использовано in vivo на подходящих мышиных моделях болезней с использованием подходящей большей дозировки, чем это было бы необходимо для лечения людей, для которых антитело обладает значительно большей аффинностью и эффективностью. В случае других антител к IL-1β, таких как, например, описанные или процитированные здесь антитела, которые не обладают таким свойством значительно более высокой аффинности и эффективности по отношению к человеческому IL-1β по сравнению с мышиным IL-1β, аналогичные более высокие дозы на мышиных моделях не обязательно будут необходимыми.

ПРИМЕР 3

Фармакокинетика антитела к IL-1β после введения крысам единичной дозы внутривенно или подкожно

Для изучения фармакокинетического профиля антитело к IL-1β, обозначенное АВ7, вводили взрослым самцам крыс в виде внутривенного (IV) болюса в хвостовую вену в количестве 0.1, 1.0 или 10 мг/кг (группы 1, 2 и 3 соответственно) или подкожно между лопатками в количестве 1.0 мг/кг (группа 4). Образцы крови отбирали через канюлю из яремной вены или из глазничного синуса в определенные моменты времени вплоть до 91 дня после введения дозировки. Образцы крови центрифугировали для получения сыворотки. Образцы анализировали для определения концентрации антитела против IL-1β с помощью ELISA, основанного на использовании щелочной фосфатазы, следующим образом.

IL-1β (Preprotech) разбавляли до концентрации 0.5 мкг/мл в PBS, 50 мкл этого раствора добавляли в ячейки титрационных микропланшетов Nunc-Immuno Maxisorp (VWR) и инкубировали в течение ночи при 2-8°С. Раствор антигена удаляли, после чего во все ячейки добавляли по 200 мкл блокирующего буфера [1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в 1X PBS, содержащем 0.05% твин 20] и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После блокирования ячейки трижды промывали буфером для промывки (1X PBS, содержащим 0.05% твин 20). Стандарты, образцы и контроли разбавляли раствором для разбавления образца (25% крысиная сыворотка в 1X PBS, содержащем 1% BSA и 0.05% твин 20). Стандартные растворы антитела к IL-1β готовили с помощью последовательных двукратных разбавлений от 2000 до 0.24 нг/мл. Каждый повтор и разбавление стандартных растворов, образцов и контрольных растворов (50 мкл) переносили в блокированные титрационные микропланшеты и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После инкубации ячейки трижды промывали буфером для промывки. Щелочную фосфатазу, конъюгированную с козьим антителом (H+L) к человеческому IgG (Southern Biotech Associates Inc, Birmingham, AL) разбавляли 1/1000 раствором для разбавления конъюгата (1% BSA в 1X PBS, содержащем 0.05% твин 20). 50 мкл разбавленного конъюгата добавляли во все ячейки, за исключением контрольных (BLANK) ячеек, в которые добавляли по 50 мкл чистого раствора для разбавления конъюгата. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С, после чего все ячейки трижды промывали раствором для промывания и трижды деионизованной водой. Субстрат п-нитрофенилфосфат (1 мг/мл в 10% буфере с диэтаноламином, рН 9.8) добавляли во все ячейки, появление цвета происходило в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего реакцию останавливали добавлением 50 мкл IN NaOH. Поглощение (оптическую плотность) при 405 нМ измеряли с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов SPECTRAmax M2 Plate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA) и строили стандартную зависимость А405 от концентрации (нг/мл) антитела-стандарта. Проводили регрессионный анализ и определяли концентрации для образцов и контрольных растворов из стандартных кривых с помощью интерполяции. Предел количественного определения составлял 40 нг/мл.

Как показано на Фиг.3, концентрации в сыворотке падают би-экспоненциально среди IV групп дозировок. Компартментный анализ провели по данным для отдельных животных, и полученные в результате фармакокинетические параметры усреднили для каждой группы дозирования за исключением тех животных, у которых был генерирован RAHA-ответ. Уровни антитела к IL-1β в сыворотке падали со средним временем полувыведения в альфа-фазе от 0.189±0.094 до 0.429±0.043 дней (от 4.54 до 10.3 часов) и со средним временем полувыведения в бета-фазе от 9.68±0.70 до 14.5±1.7 дней. Среди крыс, получивших подкожно дозу АВ7 1 мг/кг, уровни в сыворотке достигли пика 4.26±0.065 мкг/мл на 2-3 день и падали со временем полувыведения 2.59±0.25 дней.

ПРИМЕР 4

Фармакокинетика антитела к IL-1β после введения внутривенно единичной дозы обезьянам cynomolgus

Антитело против IL-1β, обозначенное АВ7, однократно вводили взрослым самцам и самкам обезьян cynomolgus в виде внутривенного болюса в количестве (дозе) 0.3, 3.0 или 30 мг/кг. Образцы крови животных отбирали до введения дозы, через 5 минут, 4 часа, 8 часов, и через 1, 2, 4, 8, 11, 15, 22, 29, 43 56 дней. Образцы анализировали для определения концентрации антитела против IL-1β с помощью ELISA, основанного на использовании щелочной фосфатазы, следующим образом.

Раствор IL-1β разбавляли до концентрации 0.5 мкг/мл в PBS, 50 мкл этого раствора добавляли в ячейки титрационных микропланшетов Nunc-Immuno Maxisorp (VWR) и инкубировали в течение ночи при 2-8°С. Раствор антигена удаляли, после чего во все ячейки добавляли по 200 мкл блокирующего буфера [1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в 1X PBS, содержащем 0.05% твин 20] и инкубировали в течение 1-4 часов при комнатной температуре. После блокирования ячейки каждого планшета трижды промывали буфером для промывки (1X PBS, содержащий 0.05% твин 20). Стандарты, образцы и контроли разбавляли раствором для разбавления образца (2% нормальная сыворотка Cynomolgus (NCS) в 1X PBS, содержащем 1% BSA и 0.05% твин 20). Стандартные растворы антитела к IL-1β готовили с помощью последовательных двукратных разбавлений от 8000 нг/мл. Каждый повтор и разбавление стандартных растворов, образцов и контрольных растворов (50 мкл) переносили в блокированные титрационные микропланшеты и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После первичной инкубации ячейки трижды промывали буфером для промывки, добавляли во все ячейки 50 мкл биотинилированного rhIL-1β. Затем планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Ячейки трижды промывали буфером для промывки и проводили третью инкубацию с 50 мкл разбавленной щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином, которую добавляли во все ячейки, за исключением контрольных (BLANK) ячеек, в которые добавляли по 50 мкл чистого раствора для разбавления. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при 37°С, после чего все ячейки трижды промывали буфером для промывки и трижды деионизованной водой. Субстрат п-нитрофенилфосфат (1 мг/мл в 10% буфере с диэтаноламином, рН 9.8) добавляли во все ячейки. Появление цвета происходило в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего реакцию останавливали добавлением 50 мкл IN NaOH. Поглощение (оптическую плотность) при 405 нм измеряли во всех ячейках с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов SPECTRAmax M2 Plate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Строили стандартную зависимость A₄₀₅ от концентрации (нг/мл) используемого в качестве стандарта антитела к IL-1β. Проводили 4-параметрический регрессионный анализ и определяли концентрации для образцов и контрольных растворов из стандартных кривых с помощью интерполяции. Предел количественного определения составлял 40 нг/мл.

Для групп, получивших единичные дозы 0.3 и 3 мг/кг, уровни антитела к IL-1β в сыворотке падали со средним временем полувыведения в альфа-фазе 9.40±2.00 часов, с последующим временем полувыведения в бета-фазе 13.3±1.0 дней (Фиг.5). У обезьян cynomolgus, получивших единичную внутривенную инъекцию 30 мг/кг, уровни антитела к IL-1β в сыворотке падали быстрее, со средним временем полувыведения в альфа-фазе 10.9±3.2 часов, с последующим временем полувыведения в бета-фазе 7.54±1.79 дней. Моделирование профилей в координатах концентрация в плазме - время для доз 0.1, 0.3, 1 и 10 мг/кг, введенных с пятью месячными интервалами, также было проведено и показано на Фиг.5.

Пример 5

Влияние антител к IL-1β в исследованиях на системе человеческих инсулоцитов

Выделенные в качестве модели in vitro человеческие островные клетки (инсулоциты) обработали высокими уровнями глюкозы для имитации микроокружения при диабете 2 типа. Антитела к IL-1β можно использовать в системе человеческих инсулоцитов для проверки влияния на функцию бета-клеток (высвобождение инсулина в ответ на глюкозу), пролиферацию бета клеток и апоптоз.

Островки выделили из поджелудочной железы многих доноров человеческих органов, не имеющих в истории болезни диабета или метаболического заболевания, как описано (Linetsky и др., Diabetes 46:1120-1123, 1997; Oberholzer и др., Transplantation 69:1115-1123, 2000; Ricordi и др., Diabetes 37:413-420, 1988, Maedler и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:8138-8143, 2004; WO 2004/0002512). Островки культурировали на планшетах, покрытых внеклеточным матриксом, выделенным из бычьих корнеальных эндотелиальных клеток (Novamed Ltd, Jerusalem), давая возможность клеткам прикрепиться к плашкам и сберегая их функциональную целостность. Островки культурировали в среде CMRL 1066, содержащей 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (GIBCO, Gaithersburg, MD). Для стимуляции секреции инсулина культуральную среду замещали культуральной средой, дополнительно содержащей 5, 11 или 33 мМ глюкозы, с или без добавления жирной кислоты.

Для измерения высвобождения инсулина в ответ на глюкозу, инсулоциты промывали и преинкубировали в течение 30 минут в бикарбонатном буфере Кребса-Рингера (KRB), содержащем 3.3 мМ глюкозы и 0.5% BSA. Затем KRB замещали на KRB, содержащий 3.3 мМ глюкозу на 1 час, после чего выдерживали дополнительно 1 час в KRB, содержащем 16.7 мМ глюкозу. Инсулоциты экстрагировали 0.18 М HCl в 70% этаноле для определения содержания инсулина с использованием набора для определения человеческого инсулина методом радиоиммуноанализа (CIS Biointemational, Gif-sur-Yvette, France). Апоптоз бета-клеток можно измерить различными способами. Например, клетки подвергают двойному окрашиванию стандартным способом концевого мечения разрывов dUTP, медиированного дезоксинуклеотидил-трансферазой (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL), и также для инсулина. Параллельно, апоптоз был подтвержден детекцией активации каспазы-3 или экспрессии Fas, как описано (см., например, WO 2004/002512; Maedler и др., 2004, там же).

Пример 6

Влияние антител к IL-1β в исследованиях на системе крысиных псевдоинсулоцитов

Альтернативно или в дополнение к модели человеческих инсулоцитов, может быть использована система крысиных псевдоинсулоцитов в качестве модели in vitro для выяснения эффекта антител против IL-1β. Например, псевдоостровки могут быть получены и протестированы, как описано в патенте США 20060094714. Поджелудочную железу (pancreata) четырех крыс Sprague Dawley разделили на маленькие кусочки, трижды промыли буфером с солями Хэнкса и HEPES (буфер Hanks-Hepes) и обработали (расщепили) коллагеназой (Liberase, 0.25 мг/мл, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, Ind., USA) при 37°С в шейкере на водяной бане в течение 10 минут. Затем расщепленную ткань поджелудочной железы трижды промыли 50 мл буфера Hanks-Hepes для удаления коллагеназы, а осадок остатков ткани профильтровали через фильтр с размером пор 250 микрон. Фильтрат смешали с 16 мл 27% (масса/объем) Ficoll (Sigma, St. Louis, Mo., USA) в буфере Hanks-Hepes и центрифугировали в градиенте Ficoll (23%, 20.5% и 11% соответственно; 8 мл каждой концентрации) при 1600 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Островки поджелудочной железы концентрировались в интерфазах между 11% и 20.5% и между 20.5% и 23% в зависимости от размеров островков. Островки собрали из двух интерфаз, дважды промыли буфером Hanks-Hepes, не содержащим кальция, и суспендировали в 5 мл буфера Hanks-Hepes без кальция, содержащего 1 мМ ЭДТА, и инкубировали в течение 8 минут при комнатной температуре. Трипсин и ДНКазу I добавили к суспензии островков до конечной концентрации 25 мкг/мл и 2 мкг/мл соответственно, и инкубировали суспензию при взбалтывании при 30°С в течение 10 минут. Расщепление трипсином останавливали добавлением 40 мл среды RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) с 10% FBS. Затем, расщепленные трипсином клетки островков фильтровали через нейлоновый фильтр с размером пор 63 микрона (PGC Scientific, Frederick, Md.) для удаления больших клеточных кластеров. Затем диспергированные клетки островков промывали, подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты с V-образным дном (2500 клеток на лунку). Затем диспергированную суспензию клеток островков центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Буфер Hanks-Hepes удаляли и заменяли 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Следующим шагом 96-луночные планшеты центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, чтобы собрать диспергированные клетки островков, сконцентрировавшиеся на V-образном дне планшета, образуя псевдоостровки. Эти псевдоостровки затем культурировали в течение ночи в термостате для клеточных культур при 37°C с 5% CO₂, после чего использовали для исследований.

Пример 7

Влияние антитела к IL-1β на чувствительность к инсулину на модели у животных.

Эффективность антитела к IL-1β в качестве инсулин-сенсибилизирующего агента in vivo можно измерить по действию антитела на инсулин и влиянию на снижение уровня глюкозы с помощью основанной на режиме питания модели резистентности к инсулину. Самцов крыс Sprague-Dawley 6-недельного возраста содержали на диете с высоким содержанием жиров и углеводов, содержащую 60% фруктозы, 10% свиного жира (лярда) и 0.06% магния. Через два дня после начала такого питания крыс случайным образом делили на группы в зависимости от доз антитела (варьируемых от 0.1 до 5 мг/кг массы тела), способа введения (подкожно, внутривенно или интраперитонеально) и частоты введения (ежедневно или дважды в неделю). Животные контрольных групп получали либо только буфер (носитель), либо не относящееся к делу антитело. Потребление жидкости и пищи измеряли каждый день и двойной протокол питания использовали, чтобы удостовериться, что три группы потребляли одинаковое питание. Через 5 недель определяли уровни глюкозы, инсулина и триглицеридов в сыворотке в полуголодном состоянии (ночью перед отбором крови животным давали ограниченное количество пищи, а утром отбирали кровь). Протокол продолжали дополнительно еще 9 недель, во время которых проводили тесты на толерантность к глюкозе (OGTT) у находящихся в сознании животных в полуголодном состоянии путем отбора крови для измерения глюкозы и инсулина после перорального введения нагрузки глюкозой (100 мг/100 г массы тела). Уровни глюкозы и триглицеридов в сыворотке измеряли спектрофотометрически, уровни инсулина измеряли с помощью радиоиммуноанализа (Linco, St. Louis, МО).

Пример 8

Антитела к IL-1β для лечения модели диабета 2 типа (T2D) у животных Psammomys obesus

Терапевтическую эффективность антитела к IL-1β в отношении предотвращения снижения массы бета-клеток, наблюдаемого у пациентов, страдающих от диабета 2 типа, оценили у грызунов (песчанок) Psammomys obesus, обладающих резистентностью к инсулину и подверженных диабету, связанному с ожирением, индуцированным режимом питания, причем диабет изначально связан с гиперинсулинемией и гипергликемией, постепенно прогрессирующей до степени тяжелой гипергликемии, сопровождающейся временным увеличением пролиферативной активности бета клеток и продолжительным увеличением скорости гибели бета-клеток с разрушением архитектуры островков (Donath и др., Diabetes 48:738-744, 1999). Для определения эффекта антитела к IL-1β на индуцированный гипергликемией апоптоз бета-клеток и ослабленную пролиферацию в островках поджелудочной железы Psammomys obesus в ходе развития диабета, антитело вводили предрасположенным к диабету животным (переключенным на высококалорийную диету) в различных дозах в диапазоне от 0.1 до 5 мг/кг массы тела подкожно, внутривенно или интраперитонеально, причем введения антитела повторяли с интервалами в диапазоне от ежедневного до еженедельного. Животных контрольных групп либо содержали на низкокалорийной диете, либо переключали на высококалорийную диету и «лечили» одним буфером (носителем) или антителом, не имеющим отношения к делу. Подгруппы животных умертвили на 4, 7, 14, 21 и 28 день, сразу после этого кровь собирали и использовали для определения уровней глюкозы, инсулина и триглицеридов в плазме. Поджелудочную железу также удаляли, часть замораживали при -70°С для дальнейшего определения содержания инсулина, а оставшуюся часть фиксировали 10% раствором формалина в фосфатном буфере, запечатывали парафином и делали срезы для анализа экспрессии Fas, IL-1β и инсулина, а также пролиферации и апоптоза бета-клеток. Такой анализ позволяет определить действие по предотвращению или задержке проявления диабета, защите от индуцированного гипергликемией апоптоза бета-клеток, сниженной пролиферации и уменьшенной массы бета-клеток, а также нормализации содержания инсулина в поджелудочной железе.

Пример 9

Использование антитела к IL-1β для лечения диабета 2 типа у людей

Описанные в изобретении антитела к IL-1β или фрагменты можно вводить пациентам (людям) согласно изобретению для терапевтического лечения и/или профилактики диабета 2 типа. Конкретно, в одном примере, антитело к IL-1β, обладающее упомянутыми выше свойствами (описанное ранее АВ7) использовано для терапевтического лечения пациентов, имеющих признаки и симптомы диабета 2 типа. Более конкретно, безопасность и эффективность применения антитела к IL-1β для лечения диабета 2 типа была продемонстрирована на одном или более клинических исследованиях на людях, включая, например, следующие испытания.

Были проведены клинические исследования лечения у пациентов, страдающих диабетом 2 типа, по двойному слепому методу с использованием плацебо в качестве контроля. Пациенты, удовлетворяющие следующим критериям отбора для таких исследований в соответствии с диагностическими критериями диабета 2 типа Американской Ассоциации Диабета (American Diabetes Association, ADA):

- концентрация глюкозы в крови натощак ≥126 мг/дл (≥7.0 мМ/л) (должно быть измерено в пределах 28 дней до нулевого дня);

ИЛИ

- симптомы гипергликемии (например, жажда, полиурия, потеря веса, расплывчатость зрения) И нерегулярный/случайный уровень глюкозы в плазме ≥200 мг/дл (≥11.1 мМ/л) (должно быть измерено в пределах 28 дней до нулевого дня), и HbA1c>7.5% и ≤12% (DCCT стандарт) были включены в исследование последовательно группами, причем внутри каждой группы случайным образом были установлены пациенты, получавшие антитело к IL-1β или плацебо. Для сведения к минимуму риска для пациентов, безопасность и переносимость проверяли на каждом уровне дозирования до перехода к следующему, более высокому уровню дозировок. Группы пациентов и количество субъектов, принимавших участие в исследовании, приведены ниже в таблице:

    Антитело Плацебо Группа Способ введения Количество субъектов Доза Количество субъектов 1 iv* или sc** 5 0.01 мг/кг 1 2 iv или sc 5 0.03 мг/кг 1 3 iv или sc 5 0.1 мг/кг 1 4 iv или sc 5 0.3 мг/кг 1 5 iv или sc 5 1.0 мг/кг 1 6 iv или sc 5 3.0 мг/кг 1 * iv - intravenously, внутривенно ** sc - subcutaneous, подкожно

В первый день исследования антитело или плацебо вводят подкожно или с помощью внутривенной инфузии с постоянной скоростью в течение 30 минут. Оценки безопасности, включая запись нежелательных эффектов, медицинские осмотры, основные показатели состояния организма, клинические лабораторные исследования (например, химия крови, гематология, анализ мочи), уровни цитокинов в плазме и электрокардиограммы (ЭКГ) проводили с использованием стандартных способов врачебной практики, известных из уровня техники. Образцы крови отбирали до введения дозы и через различные промежутки времени (например, дни) после введения для определения HbA1c, липидного профиля, включая свободные жирные кислоты, холестерин высокой плотности и холестерин низкой плотности, уровни антитела к IL-1β (фармакокинетику), ответы на антитело к IL-1β, уровни цитокинов (например, IL-1β, IL-6, TNFα), CRP, натрий, калий, креатинин, AST, ALT кровяное давление. Могут быть проведены также исследования других цитокинов и лимфокинов, таких как, например, описанные в изобретении. Можно отобрать дополнительные образцы крови позже, чем было намечено исходно, в тех случаях, когда уровни введенного антитела к IL-1β не падали ниже предела обнаружения. Измерения проведены в определенные моменты после лечения.

Клинические наблюдения лечения диабета 2 типа проводили на основании эффективности улучшения гемоглобина A1c (HbA1c) в первичной конечной точке (см., например, Reynolds и др., BMJ, 333(7568):586-589, 2006). Улучшение уровня HbA1c является индикатором терапевтической эффективности лечения антителом к IL-1β и обычно должно приводить к уменьшению, по крайней мере, примерно на 0.5% или больше. Также определяют одну или больше вторичных конечных точек, чтобы оценить эффективность лечения диабета 2 типа, такую как, например, уровни сахара (например, глюкозы) в крови натощак (например, ≤130, ≤120), 120-минутный пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), AUC глюкоза/ С-пептид инсулина (например, увеличение >50%, >60%), сокращение медикаментозного лечения диабета (например, инсулина, перорального гипогликемического средства), повышение чувствительности к инсулину, уровни цитокинов в сыворотке (например, нормализация), уровни CRP, показатели качества жизни, улучшение BMI (снижение на 1%, 3%, 5%), фармакокинетика и пр. (Saudek, и др., JAMA, 295:1688-97, 2006; Pfutzner и др., Diabetes Technol Ther. 8:28-36, 2006; Norberg, и др., J Intern Med. 260:263-71, 2006). Дополнительный анализ липидного профиля образцов включает следующие исследования, осуществленные в соответствии со стандартными общепринятыми способами, известными из уровня техники.

Исследование Способ Электрофорез липопротеинов Гель-электрофорез Аполипопротеин A-I (аро А-I) в сыворотке Нефелометрия Аполипопротеин A-II (аро A-II) в сыворотке Нефелометрия Аполипопротеин В-48 (аро В-48) в сыворотке ELISA Аполипопротеин В-100 (аро В-100) в сыворотке Нефелометрия Аполипопротеин Cs (аро Cs) в сыворотке Иммунонефелометрия Аро CII и Apo CIII Аполипопротеин Е (аро Е) в сыворотке Нефелометрия Аполипопротеин J (аро J) в сыворотке ELISA Амилоид А в сыворотке Нефелометрия Свободные жирные кислоты в плазме (FFA) Колориметрия Глицерин в плазме Колориметрия LCAT в сыворотке ELISA Белок-переносчик эфиров холестерина в сыворотке (БПЭХ) Serum cholesteryl ester transfer protein (CETP) ELISA Печеночная липаза в сыворотке Serum hepatic lipase (HL) Флюорометрия Параоксоназа 1 в сыворотке paraoxonase 1 (PON1) УФ/колориметрия

Фармакокинетический анализ

Образцы для фармакокинетического анализа получали на 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9±1, 11±1, 14±1, 21±2, 28±2, 42±3 и 56±3 день. Предварительный анализ фармакокинетики АВ7 у субъектов с диабетом 2 типа, получивших единичную дозу 0,01 мг/кг внутривенно, показал, что профили зависимости концентрации в сыворотке от времени имеют терминальный период полувыведения 22 дня, клиренс 2,9 мл/день/кг и объем распределения центрального компартмента 50 мл/кг, что очень близко к объему сыворотки (Фиг.7).

Анализ глюкозы и HbA1c в крови

Образцы получали и измеряли уровни глюкозы в крови на 0, 7, 14±1, 21±2, 28±2, 42±3 и 56±3 день, а также в день скрининга (массового обследования). Данные исследований этих образцов по снижению уровней глюкозы в крови показаны ниже для образцов, полученных от первых двух групп, разделенных по дозировкам (верхняя строчка для каждого субъекта). Образцы получали и измеряли HbA1c на 0, 28±2, 42±3 и 56±3 день, а также в день скрининга. Данные исследований этих образцов по снижению уровней HbA1c показаны ниже для образцов, полученных от первых двух групп, разделенных по дозировкам (нижняя строчка для каждого субъекта).

Группа с дозой 0.01 мг/кг

Субъект Скрининг День 0 (лаборатория) День 7 (лаборатория) День 14 (лаборатория) День 21 (лаборатория) День 28 (лаборатория) День 42 (лаборатория) День 56 (лаборатория) 5 200.00 247.00 212.00 179.00 213.00 242.00 235.00 200.00   8.40 8.60       8.50 7.10 9.30 1 211.00 232.00 235.00 236.00 199.00 221.00 252.00 204.00   9.30 9.60       9.50 9.10 9.80 2 229.00 131.00 160.00 191.00 193.00 224.00 204.00 207.00   9.00 8.80       8.40 8.60 9.00 11 290.00 283.00 300.00 177.00 308.00 278.00 292.00 302.00   11.80 11.60       11.40 11.20 11.80 3 175.00 158.00 175.00 154.00 154.00 162.00 183.00 170.00   8.20 8.20       7.70 7.80 8.10 4 238.00 255.00 270.00 275.00 289.00 278.00 255.00 245.00   8.50 9.40       10.50 10.60 10.40

Группа с дозой 0.03 мг/кг

Субъект Скрининг День 0 (лаборатория) День 7 (лаборатория) День 14 (лаборатория) День 21 (лаборатория) День 28 (лаборатория) День 42 (лаборатория) День 56 (лаборатория) 6 222.00 164.00 148.00 166.00 162.00 145.00 207.00     8.40 8.40       8.20 8.40   7 208.00 109.00 101.00 120.00 81.00 108.00 113.00     8.00 7.50       6.70 6.40   8 364.00 287.00 289.00 260.00 237.00         12.40 12.00             9 204.00 128.00 124.00 117.00 112.00 113.00       7.90 7.50       7.10     12 275.00 235.00 250.00 126.00 168.00         9.90 10.30             10 332.00 398.00 243.00 187.00 220.00         11.50 11.50            

Эти данные показывают, что заявленные в изобретении нижние пределы дозировок антитела к IL-1β оказываются полезными для достижения терапевтического эффекта (например, снижения уровней глюкозы и/или HbA1c) у субъекта после однократного введения антитела.

Анализ C-реактивного белка

C-реактивный белок (CRP), который секретируется печенью в ответ на различные стрессовые пусковые механизмы, включая IL-6, продуцируемый в ответ на IL-1, также измеряли в сыворотке в те же самые моменты времени, что и образцы для фармакокинетических исследований. Была разработана PK/PD модель (моделирование фармакокинетики/фармакодинамики), включающая двухкомпартментную модель для уровня антитела в сыворотке и концентрационно-зависимый непрямой ответ антитела на скорость продуцирования CRP с линейным коэффициентом элиминации CRP. На основании модельных расчетов после единичной дозы антитела в количестве 0.01 мг/кг внутривенно у субъектов с диабетом 2 типа CRP падал в пределах 7-10 дней до 66±22% относительно 100% до введения дозы (Фиг.8). После единичной дозы антитела в количестве 0.03 мг/кг внутривенно у субъектов с диабетом 2 типа CRP падал в пределах 7-10 дней до 40±12% по сравнению со 100% до введения дозы (Фиг.9). Контрольные данные для плацебо приведены на Фиг.10. На основании этих данных и модельных прогнозов ожидаемые поддерживаемые уровни CRP после ежемесячных инъекций антитела составляют примерно 40% при 0.03 мг/кг, 16.5% при 0.1 мг/кг, 6.2% при 0.3 мг/кг, 1.9% при 1 мг/кг и 0.66% при 3 мг/кг в месяц (Фиг.11). Эти данные показывают, что для получения терапевтического эффекта у субъекта после однократного введения антитела (например, снижения уровней CRP) предусмотренное изобретением антитело к IL-1β можно вводить с частотой один раз в месяц или реже.

На основании результатов первого клинического исследования провели дополнительные клинические испытания. Такие испытания могут включать одну или более указанных выше дозировок, а также, или альтернативно, одну или более иных дозировок антитела к IL-1β, большую продолжительность лечения и/или периодов наблюдения и большее количество пациентов в группе (по крайней мере, примерно 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000) согласно изобретению. Кроме того, эти и другие исследования можно использовать для определения времени, необходимого для получения желаемого терапевтического эффекта, на основании изменения конкретного параметра (например, снижения сахара в крови, снижения HbA1c, снижения CRP), a также для определения длительности благоприятного терапевтического воздействия на основании изменения конкретного параметра (например, снижения сахара в крови, снижения HbA1c, снижения CRP) до введения дополнительных доз.

Пример 10

Влияние антитела к IL-1β на функцию адипоцитов и резистентность к инсулину

Исследования in vitro с использованием культурированных адипоцитов можно использовать для демонстрации снижения (например, блокирования) индуцированной IL-1β резистентности к инсулину с помощью антител к IL-1β. Клетки преадипоцитов линии 3T3-L1, полученные из АТСС (№ CL-173), растили в 7% CO₂ при 37°С в DMEM, с 25 мМ глюкозой и 10% телячьей сыворотки и индуцировали их дифференциацию в адипоциты. Если коротко, через 2 дня после конфлюэнции среду заменяли на DMEM, содержащую 25 мМ глюкозы и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), дополненную изобутилметилксантином (0.25 мМ), дексаметазоном (0.25 мкМ), инсулином (5 мкг/мл) и пиоглитазоном (10 мкМ). Среду удалили через 2 дня и заменили на среду DMEM, содержащую 25 мМ глюкозы и 10% FCS, дополненную инсулином (5 мкг/мл) и пиоглитазоном (10 мкМ) на 2 дня. Затем каждые 2 дня проводили обновление среды DMEM с 25 мМ глюкозы и 10% FCS. Адипоциты 3T3-L1 использовали через 8-15 дней после начала протокола дифференцировки.

Человеческие преадипоциты (Biopredic International, Rennes, France) растили в 5% CO₂ при 37°С в среде DMEM Ham's F12, содержащей 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин, 5% FCS, 1% противогрибковый раствор, ECGS/H-2, hEGF-5 и НС-500 из дополнительного набора для среды для выращивания преадипоцитов (Promocell, Heidelberg, Germany). Дифференциацию в адипоциты индуцировали после конфлуенции путем замены среды на DMEM Ham's F12, 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин и 3% FCS, дополненную биотином (33 мкМ), инсулином (100 нМ), пантотенатом (17 мкМ), изобутилметилксантином (0.2 мМ), дексаметазоном (1 мкМ) и розиглитазоном (10 мкМ). Среду удалили через 3 дня и заменила на Ham's F12, содержащую 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин и 10% FCS, дополненную биотином (33 мкМ), инсулином (100 нМ), пантотенатом (17 мкМ) и дексаметазоном (1 мкМ). Затем каждые 2 дня проводили обновление той же среды для клеток. Человеческие адипоциты использовали через 15 дней после начала протокола дифференцировки. Человеческие преадипоциты можно также получить из альтернативных источников, таких как, например, клеточные линии ХА15А1 и ХМ18В1 (Lonza, Allendale, NJ).

Роль IL-1β в индуцировании резистентности к инсулину (снижении чувствительности к инсулину) культурированных адипоцитов показана путем инкубации адипоцитов с IL-1β (например, 20 нг/мл, 48 часов), последующей инкубации с различными концентрациями инсулина (например, 0.5 нМ, 100 нМ; 20 минут) и последующего измерения транспорта глюкозы после добавления 2-[³H]дезоксиглюкозы. Резистентность к инсулину определяли как снижение потребления глюкозы, причем эффект антитела к IL-1β на снижение (например, блокирование) резистентности к инсулину легко измеряли на этой системе культуры клеток адипоцитов.

Роль IL-1β в прямой стимуляции продуцирования адипокинов и цитокинов адипоцитами (например, лептина, резистина, висфатина, IL-6, MCP-1 (CCL2), RANTES, PAI-1, белка, стимулирующего ацилирование, SAA3, пентраксина-3, фактора ингибирования миграции макрофага, IL-1RA, IL-12, IL-8, IL-6, TNF-α) определяли с помощью культурирования адипоцитов в отсутствие или в присутствии различных концентраций IL-1β в течение различных промежутков времени как описано выше и измерения уровней адипоцитов и цитокинов в кондиционированной культуральной среде, с использованием ELISA или других обычно используемых способов. Кроме того, определили влияние обработки культур адипоцитов, стимулированных IL-1β, нейтрализующим антителом против IL-1β на индукцию секреции адипокинов и/или цитокинов, связанную с резистентностью к инсулину. Аналогично, измерили влияние обработки антителом к IL-1β на подавление инсулин-сенсибилизирующего адипокина, адипонектина. Для того чтобы выяснить, нейтрализует ли обработка антителом против IL-1β эффекты эндогенно продуцированного IL-1, выделившегося из иммуно/воспалительных клеток (например, макрофагов) в ходе воспаления жировой ткани, различное количество человеческих макрофагов (полученных из моноцитов или различных клеточных линий моноцитов) культурировали с описанными выше культурами адипоцитов в отсутствие или в присутствии антитела к IL-1β и измеряли модуляцию адипокинов и цитокинов. Кроме того, модуляторное воздействие на секрецию адипокинов и цитокинов после обработки субъекта in vivo антителом к IL-1β измеряли в циркуляции (например, сыворотке, плазме) в качестве способа демонстрации эффективности.

Пример 11

Ингибирование продукции цитокина в цельной крови людей антителом к IL-1β

Измерение цитокинов в крови при заболевании или в ходе лечения заболевания может быть полезным для определения тяжести заболевания или ответа на терапию. Обычно уровни цитокинов определяют в сыворотке, но этим способом не обязательно измеряются общие (суммарные) цитокины. Многие цитокины могут находиться внутри клеток (внутриклеточные). Кроме того, способность клетки продуцировать цитокин может оказаться более полезной информацией, чем уровень циркулирующих цитокинов.

Способ стимуляции цельной крови был использован для определения выработки цитокина и эффекта лечения антителом к IL-1β. Кровь отбирали у пациентов в стерильные гепаринизировнные пробирки, затем 250 мкл цельной крови добавляли в каждую стерильную криопробирку Coming на 4 мл с оранжевым верхом, подготовленную следующим образом:

Контрольные серии

Все пробирки предварительно заполняли 550 мкл RPMI. В пробирку 1 (контроль) добавляли 200 мкл RPMI, а в пробирки 2-10 добавляли по 100 мкл RPMI. В каждую из пробирок 2-10 добавляли по 100 мкл раствора антитела к IL-1β (AB7).

Серии для исследований

Аналогичные серии растворов антитела были подготовлены как детально описано ниже.

Все пробирки хорошо перемешали, используя вортекс в течение 10 секунд. В пробирки контрольных серий А1-10 затем добавили дополнительно 100 мкл RPMI, снова перемешали на вортексе в течение 10 секунд, крышки плотно закрутили и зафиксировали, и поместили пробирки в термостат. В пробирки серий для исследований В1-10 добавили по 100 мкл убитых нагреванием Staphylococcus epidermidis (конечная концентрация 1:1000 исходного раствора, что в результате дало соотношение бактерии:лейкоциты 10:1), пробирки перемешали на вортексе в течение 10 секунд, закрыли крышками и поместили в термостат на 37°С. После 24 часов инкубации культуры лизировали тритоном Х (конечная концентрация 0.5%) для выделения содержания клеток, лизаты заморозили. После лизиса культур цельной крови пробирки трижды подвергли циклу замораживания-оттаивания и измерили уровни цитокинов стандартными способами исследования цитокинов с помощью ELISA для человеческих TNFα, IL-6, IFNγ, IL-8, IL-1α, IL-1Ra и IL-1β (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Цитокины, измеренные в пробирках контрольных серий, содержащих только стерильную культуральную среду и антитело (где указано), отражают спонтанный уровень стимуляции. Было обнаружено, что у здоровых людей уровни различных цитокинов, измеренные после инкубации в течение 24 часов, очень низки. У пациентов, заболевания которых не лечили, уровни могут быть выше. Пробирки серий для исследований дополнительно содержали убитые нагреванием Staphylococcus epidermidis, стимулирующие продуцирование ряда цитокинов. Если лечение антителом к IL-1β является эффективным, это должно проявляться в снижении продуцирования цитокинов.

Как показано на Фиг.6, высокоаффинное антитело к IL-1β AB7 было очень эффективным ингибитором продуцирования IL-1β в человеческой крови. В среднем по трем человеческим образцам антитело ингибировало продуцирование IL-1β, индуцированное Staphylococcus epidermidis, на 50% при 0.1 пМ и на 75% при 3 пМ. При 100 пМ ингибирование было 100%. Интерферон гамма (IFNγ) индуцируется Staphylococcus epidermidis, a AB7 снизил IFNγ, индуцированный Staphylococcus epidermidis, на 75% при 100 пМ.

Пример 12

Влияние антитела против IL-1β на диабет нетучных диабетических мышей

Для того чтобы продемонстрировать эффективность антитела к IL-1β на модели диабета у мышей, самок нетучных мышей с диабетом (Non-Obese Diabetic (NOD) mouse, NOD мыши) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) в возрасте 3-4 недель помещали в виварий в условия отсутствия патогенных микроорганизмов. Различные дозы антитела против IL-1β (например, от 3 до 600 мкг) разбавляли в подходящем носителе (например, PBS) и вводили предиабетическим самкам NOD мышей, начиная не позже чем с 6-недельного возраста, используя различные способы введения (например, интраперитонеально, подкожно, внутривенно) через определенные промежутки времени (например, еженедельно, раз в две недели, раз в месяц). Уровень глюкозы в крови контролировали с помощью глюкометра (Encore Glucometer; Bayer, Elkhart, IN) с интервалами в неделю, начиная с 10-недельного возраста. Мышей с уровнями глюкозы 200 мг/дл в двух последовательных измерениях признавали диабетическими (проявление диабета наступало обычно в возрасте примерно от 15 до 20 недель и коэффициент заболеваемости достигал максимума около 90% к 30-недельному возрасту). Данные пересчитали в виде процента животных, не заболевших диабетом в ходе эксперимента. Различие между кривыми протестировали с использованием логарифмического рангового критерия, который позволяет сравнить распределения в течение всего периода наблюдения.

В другой модели на NOD мышах эффективность антитела против IL-1b была продемонстрирована на модели заболевания, ускоряемого циклофосфамидом (CY) (Reddy и др., Histochem J. 33:317-327, 2001; Cailleau и др., Diabetes 46:937-940, 1997; Reddy и др., Histochem J., 34:1-12, 2002; Harada и др., Diabetologia 27:604-606, 1984; Nicoletti, и др., Eur J Immunol 24:1843-7, 1994). Самцов (или самок) недиабетических NOD мышей (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) в возрасте 4-8 недель помещали в виварий в условия отсутствия патогенных микроорганизмов. Мышам инъекцией вводили однократную дозу CY (Sigma) в количестве 200 мг/кг и через различные прогрессивно уменьшающиеся промежутки времени из-за «ускоряющейся» природы модели (например, раз в неделю, два раза в неделю) в течение от 2 до 3 недель вводили либо различные дозы антитела к IL-1β (например, 3 мкг, 30 мкг, 150 мкг, 600 мкг), либо изотип антитела в качестве контроля, разведенный в подходящем носителе (например, PBS), используя различные способы введения (например, интраперитонеально, подкожно, внутривенно). Уровни глюкозы в моче (глюкозурию) контролировали трижды в неделю, а уровни глюкозы в крови один раз в неделю с помощью глюкометра, начиная с дня, предшествующего инъекции CY. Мышей с уровнями глюкозы в моче >20 мМ/л в двух последовательных измерениях признавали диабетическими, а снижение уровней глюкозы в моче под действием антитела к IL-1β считали мерой эффективности.

В другой модели эффективность антитела к IL-1β оценивали на модели возвратного диабета при трансплантации островков поджелудочной железы (при неотторжении трансплантанта) (Mellgren и др., Diabetologia 29:670-2, 1986; Sandberg, и др., Clin Exp Immunol 108:314-7, 1997). Самок недиабетических NOD мышей (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) в возрасте 4-8 недель помещали в виварий в условия отсутствия патогенных микроорганизмов. Островки поджелудочной железы получали от самцов или самок недиабетических NOD мышей 5-6-недельного возраста до заметной (отмеченной) лейкоцитарной инфильтрации и трансплантировали под капсулу почки самкам спонтанно диабетических NOD мышей 15-20-недельного возраста (от 400 до 450 островков/мышь). Временная нормализация уровня сахара в крови (транзиторная нормогликемия) наблюдается вскоре после трансплантации, но приблизительно через 6 дней после трансплантации гипергликемия обычно появляется вновь. Мышам вводили либо различные дозы антитела к IL-1β (например, 3 мкг, 30 мкг, 150 мкг, 600 мкг), либо изотип антитела в качестве контроля, разведенный в подходящем носителе (например, PBS), используя различные способы введения (например, интраперитонеально, подкожно, внутривенно). Уровни глюкозы в крови контролировали до и после трансплантации один или два раза в неделю с помощью глюкометра. Мышей с уровнями глюкозы >200 мг/дл в двух последовательных измерениях признавали диабетическими, а снижение уровней глюкозы в крови под действием антитела к IL-1β считали мерой эффективности.

Пример 13

Лечение модели диабета, индуцированного введением малых доз стрептозотоцина, у мышей C57BL/K.

Для того чтобы продемонстрировать эффективность антитела к IL-1β на модели гипергликемии, вызванной многократным введением стрептозотоцина (STZ) в малых дозах, и на модели инсулинового диабета (Sandberg, и др., Biochem Biophys Res CoмMun 202:543-548, 1994; Reddy, и др., Ann N Y Acad Sci 1079:109-113, 2006), мышей линии C57BL/K 4-8-недельного возраста (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) помещали в виварий в условия отсутствия патогенных микроорганизмов. Согласно этой «ускоренной» модели мыши получали по пять инъекций STZ (40 мг/кг) ежедневно и подвергались ускоренному лечению (начиная с дня, предшествующего инъекции STZ) через различные временные интервалы (например, один, два или три раза в неделю) в течение от одной до трех недель с или без различных доз антитела к IL-1β (например, 3 мкг, 30 мкг, 150 мкг, 600 мкг) или изотипичного антитела в качестве контроля, разведенного в подходящем носителе (например, PBS), используя различные способы введения (например, интраперитонеально, подкожно, внутривенно). Уровни глюкозы в крови контролировали один раз в неделю с помощью глюкометра, начиная с дня, предшествующего инъекции STZ. Мышей с уровнями глюкозы >200 мг/дл в двух последовательных измерениях признавали диабетическими, а снижение уровней глюкозы в крови под действием антитела к IL-1β считали мерой эффективности.

Пример 14

Лечение диабета 2 типа на модели ожирения, вызванного рационом питания

Эффективность антитела к IL-1β протестировали на модели диабета 2 типа - ожирении, вызванном пищевым рационом (DIO). Согласно этой модели, мыши, которых содержали на диете с высоким содержанием жиров, через несколько недель становились тучными и обладали пониженной переносимостью глюкозы и ослабленной секрецией инсулина в ответ на инъекцию ударной дозы глюкозы. Самцов мышей C57BL/6 6-недельного возраста держали на нормальной диете (ND, Teklad, 5% ккал из жира) или на диете с высоким содержанием жира и сахарозы (Surwit's high fat, high sucrose diet, HFD, Research Diets #D12331, 58% ккал из жира). Дозированное введение антитела начали на день раньше. Тестируемое антитело к IL-1β (AB7) и изотип человеческого антитела к IgG2 в качестве контроля вводили интраперитонеальными инъекциями. Антитела вводили дважды в неделю в течение 4 недель. Массу тела также контролировали дважды в неделю. Через 4 недели мышам сделали тест на толерантность к глюкозе (GTT). В ходе этого GTT теста мыши голодали с течение ночи, а затем интраперитонеальной инъекцией получили глюкозу в количестве 1 г/кг. Глюкозу в крови, отобранной из хвостовых надрезов, измерили на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минутах после инъекции, используя глюкометр FreeStyle. На Фиг.12 показано, что мыши, содержавшиеся на диете с высоким содержанием жира в течение 4 недель, имели ослабленную толерантность к глюкозе по сравнению с мышами, содержавшимися на нормальной диете (Фиг.12). Введение тестируемого антитела к IL-1β защитило HFD мышей от пониженной толерантности к глюкозе. В течение 60 минут проведения GTT тестирования мыши, которым дозированно вводили антитело к IL-1β в количестве 1 мг/кг, проявляли себя значительно лучше, чем мыши, получавшие контрольное антитело к IgG2 (*, p<0.05). Следует подчеркнуть, что положительные результаты на этой мышиной модели были получены несмотря на то, что антитело АВ7 обладает существенно меньшей аффинностью (~10000 раз) и эффективностью in vitro по отношению к мышиному IL-1β по сравнению с человеческим IL-1β, как описано в Примере 2 выше.

Все процитированные в изобретении ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты во всей своей полноте включены в изобретение в виде ссылок.

Термины «включая», «имеющий», «содержащий» использованы для обозначения открытых терминов, т.е. в значении «включая, но не ограничиваясь только этим(и)», за исключением особо оговоренных случаев. Во всех случаях использования открытых терминов для описания свойства или элемента по данному изобретению предусматривается, что вместо открытого термина может быть использован закрытый без нарушения духа и области действия изобретения. Перечисление интервалов значений, за исключением особо оговоренных случаев, служит единственной цели сокращения объема при перечислении по отдельности уменьшения каждого значения внутри интервала, и каждое отдельное значение включено в описание, как если оно было указано отдельно. Все описанные способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если не указано иначе и не противоречит контексту. Приведенные примеры или связанные с примерами термины (например, "такой как") даны исключительно для лучшего освещения изобретения и никак не ограничивают сущность и сферу действия изобретения, если не указано по другому. Никакие слова в описании не могут быть трактованы как незаявленные элементы, если они являются существенными для практического использования согласно данному изобретению.

В описании приведены предпочтительные варианты выполнения изобретения, включая наилучшие из известных авторам способы. Вариации этих предпочтительных вариантов выполнения изобретения могут стать очевидными для специалистов при чтении приведенного выше описания. Авторы полагают, что осуществлять такие варианты в качестве подходящих будут специалисты, более того, авторы полагают, что изобретение будет практически использовано не только так, как оно конкретно описано. Соответственно, изобретение включает все модификации и эквивалентные замены перечисленных в Формуле Изобретения предметов обсуждения (объектов), являющейся частью изобретения в соответствии с применимым законом. Более того, любая комбинация описанных выше элементов в любых возможных сочетаниях включена в изобретение, если не указано иначе и не противоречит контексту.

Группа изобретений относится к способам лечения диабета 2 типа, резистентности к инсулину, пониженной продукции инсулина, ожирения, гипергликемии и гиперинсулинемии, включающим введение субъекту эффективного количества антитела к IL-1β или его фрагмента, а также к применению антитела к IL-1β или его фрагмента в производстве композиции, предназначенной для лечения вышеуказанных заболеваний или состояний. Группа изобретений эффективна в лечении диабета 2 типа, резистентности к инсулину, пониженной продукции инсулина, ожирения, гипергликемии и гиперинсулинемии. 2 н. и 65 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 14 пр.

1. Способ лечения у людей заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей диабет 2 типа, резистентность к инсулину, пониженную продукцию инсулина, гипергликемию, гиперинсулинемию и ожирение, характеризующийся тем, что способ включает введение человеку антитела к IL-1β или его фрагмента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой диабет 2 типа.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой резистентность к инсулину.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой гипергликемию.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой гиперинсулинемию.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой ожирение.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела осуществляют введение одной или более последующих доз.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела осуществляют введение двух или более последующих доз.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела осуществляют введение одной или более последующих доз, и величины указанных одной или более последующих доз являются примерно такими же или меньше, чем величина начальной дозы.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела осуществляют введение одной или более последующих доз, причем, по крайней мере, одна из последующих доз по величине превышает начальную дозу.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 250 пМ или меньше.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 10 пМ или меньше.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 1 пМ или меньше.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с человеческим IL-1β с константой диссоциации примерно 0.5 пМ или меньше.

15. Способ согласно любому из пп.7-14, отличающийся тем, что начальная доза и каждая (одна или более) последующая доза отделены друг от друга интервалом, по крайней мере, примерно 2 недели.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что начальная доза и каждая (одна или более) последующая доза отделены друг от друга интервалом, по крайней мере, примерно 1 месяц.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что начальная доза и каждая (одна или более) последующая доза отделены друг от друга интервалом, по крайней мере, примерно 3 месяца.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что начальная доза и каждая (одна или более) последующая доза отделены друг от друга интервалом, по крайней мере, примерно 6 месяцев.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что начальная доза и каждая (одна или более) последующая доза отделены друг от друга интервалом, по крайней мере, примерно 12 месяцев.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 3 мг/кг или меньше.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 1 мг/кг или меньше.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 0.5 мг/кг или меньше.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 0.1 мг/кг или меньше.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 0.03 мг/кг или меньше.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела вводят в виде одной или более доз антитела или фрагмента по 0.01 мг/кг или меньше.

26. Способ согласно любому из пп.20-25, отличающийся тем, что величина одной или более доз составляет, по крайней мере, 0.01 мг антитела или фрагмента на кг.

27. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело к IL-1β или фрагмент антитела является нейтрализующим антителом.

28. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело к IL-1β или фрагмент антитела связывается с эпитопом IL-1β таким образом, что связанное антитело или фрагмент в значительной степени допускает связывание IL-1β с рецептором I IL-1 (IL-1Ra).

29. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела не связывается с IL-1α, IL-1R или IL-IRa в степени, доступной для обнаружения.

30. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом, содержащимся в последовательности ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE.

31. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом, включающим Glu64 интерлейкина-1β.

32. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела связывается с аминокислотами 1-34 N-конца IL-1β.

33. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела являются разработанными для человека или гуманизированными.

34. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент антитела являются человеческими.

35. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело к IL-1β или фрагмент вводят подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекцией.

36. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде фиксированной дозы, независимо от соотношения дозы и массы тела субъекта.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз по 500 мг или меньше антитела или фрагмента.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз по 250 мг или меньше антитела или фрагмента.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз по 100 мг или меньше антитела или фрагмента.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз по 25 мг или меньше антитела или фрагмента.

41. Способ по п.36, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз, по крайней мере, по 1 мг антитела или фрагмента.

42. Способ по п.36, отличающийся тем, что антитело или фрагмент вводят в виде одной или более доз величиной от примерно 10 мг до примерно 100 мг антитела или фрагмента.

43. Способ по п.11, отличающийся тем, что доза антитела или фрагмента является достаточной для улучшения гемоглобина А1с, по крайней мере, на 0.5 процента.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что доза антитела или фрагмента является достаточной для улучшения гемоглобина А1с, по крайней мере, на 1 процент.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что доза антитела или фрагмента является достаточной для улучшения гемоглобина А1с, по крайней мере, на 2 процента.

46. Способ по п.45, отличающийся тем, что доза антитела или фрагмента является достаточной для улучшения гемоглобина А1с, по крайней мере, на 3 процента.

47. Способ по п.11, отличающийся тем, что способ является достаточным для достижения, по крайней мере, одного из следующих изменений: снижения уровня сахара в крови натощак, ослабления резистентности к инсулину, уменьшения гиперинсулинемии, повышения толерантности к глюкозе, уменьшения C-реактивного белка (CRP), уменьшения гипергликемии, снижения необходимости медикаментозного лечения диабета, снижения BMI, изменения AUC глюкоза / C-пептид инсулина, уменьшения реактантов острой фазы, уменьшения липидов в сыворотке при улучшении липидного профиля.

48. Способ по п.11, отличающийся тем, что способ уменьшает или предотвращает осложнение или состояние, связанное с диабетом 2 типа, выбранное из группы, включающей ретинопатию, почечную недостаточность, заболевание сердечно-сосудистой системы и заживление ран, при этом способ включает введение антитела к IL-1β или его фрагмента людям.

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что осложнение или состояние является заболеванием сердечно-сосудистой системы, и это заболевание сердечно-сосудистой системы является атеросклерозом или заболеванием периферических сосудов.

50. Способ по п.48, отличающийся тем, что осложнение или состояние является заживлением ран, причем это заживление ран представляет собой диабетическую язву.

51. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ осуществляют совместно, по крайней мере, с одним дополнительным способом лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом.

52. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ предотвращает или вызывает отсрочку необходимости использования, по крайней мере, одного дополнительного способа лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом.

53. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ приводит к уменьшению количества, частоты или длительности, по крайней мере, одного дополнительного способа лечения, причем этот дополнительный способ лечения включает введение, по крайней мере, одной фармацевтической композиции, содержащей активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом.

54. Способ согласно любому из пп.51-53, отличающийся тем, что указанная, по крайней мере, одна фармацевтическая композиция, содержащая активный агент, не являющийся антителом к IL-1β или фрагментом, выбрана из группы, включающей сульфонилмочевину, меглитинид, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, тиазолидинедион, пептид, аналогичный глюкагону, и инсулин.

55. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является сульфонилмочевиной.

56. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является меглитинидом.

57. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является бигуанидом.

58. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является ингибитором альфа-глюкозидазы.

59. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является тиазолидинедионом.

60. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является пептидом, аналогичным глюкагону.

61. Способ по п.54, отличающийся тем, что активный агент является инсулином.

62. Способ по п.1, отличающийся тем, что после введения начальной дозы антитела или фрагмента антитела осуществляют введение одной или более последующих доз, причем концентрацию указанного антитела или фрагмента антитела в плазме людей поддерживают на постоянном уровне, по крайней мере, примерно 0.03 мкг/мл в ходе курса лечения начальной дозой и одной или более последующими дозами.

63. Способ по п.62, отличающийся тем, что концентрацию указанного антитела или фрагмента антитела в плазме поддерживают на постоянном уровне, по крайней мере, примерно 0.1 мкг/мл в ходе курса лечения.

64. Способ по п.63, отличающийся тем, что концентрацию указанного антитела или фрагмента антитела в плазме поддерживают на постоянном уровне, по крайней мере, примерно 0.3 мкг/мл в ходе курса лечения.

65. Способ по п.1, отличающийся тем, что по данным исследований ингибирования IL-1β в цельной крови людей, в которых измеряют индуцированную IL-1β продукцию IL-8, антитело или его фрагмент обладает меньшим значением IC₅₀, чем антагонист рецепторов IL-1.

66. Способ по п.65, отличающийся тем, что антагонистом рецепторов IL-1 является анакинра.

67. Применение антитела к IL-1β или его фрагмента, обладающего меньшим значением IC₅₀, чем антагонист рецепторов IL-1 по данным исследований ингибирования IL-1β в цельной крови людей, в которых измеряют индуцированную IL-1β продукцию IL-8, в производстве композиции, предназначенной для использования в лечении диабета 2 типа, резистентности к инсулину, пониженной продукции инсулина, гипергликемии, гиперинсулинемии и ожирения, при этом антагонистом рецепторов IL-1 является анакинра.