ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ NKG2D ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ И МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ТАКИХ КАК ДИАБЕТ 2 ТИПА Российский патент 2015 года по МПК A61K38/17 A61P5/50 A61P9/00 

Исследования, финансируемые из федерального бюджета

Данное изобретение было осуществлено при государственной поддержке по гранту № PEN04143, присужденному Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов, и гранту № CA093678, присужденному Национальным институтом здоровья (NIH). Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.

Ссылки на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет по 35 U. S. C. § 119(e) в отношении предварительной патентной заявки США с регистрационным № 61/234425, поданной 17 августа 2009 г., и предварительной патентной заявки США с регистрационным № 61/304113, поданной 12 февраля 2010 г., полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылок.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения диабета 2 типа и/или патологических состояний, которые можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, например, сердечно-сосудистых заболеваний.

Уровень техники изобретения

Большое и все возрастающее число людей страдает от сахарного диабета. Сахарный диабет, также известный как диабет, представляет собой нарушение метаболизма, приводящее к повышению уровня глюкозы в крови вследствие относительной или абсолютной недостаточности гормона поджелудочной железы инсулина. Инсулин секретируется из поджелудочной железы в кровь, в зависимости от уровня глюкозы в крови и его основной функцией является направление находящейся в крови глюкозы в резервную систему организма, при этом уровень глюкозы остается под контролем.

Известно, что диабет существует в форме диабета 1 типа и 2 типа. Диабет 1 типа характеризуется прогрессирующей потерей бета-клеток поджелудочной железы вследствие неблагоприятного баланса между разрушительными аутоиммунными процессами, направленными на бета-клетки, с одной стороны и регенеративной способностью этих клеток с другой стороны. Этот дисбаланс в конечном итоге приводит к полной потере бета-клеток и эндогенной секреции инсулина. Диабет 1 типа составляет 5-10% от всех случаев диабета. Диабет 2 типа характеризуется резистентностью к инсулину и нарушением функции бета-клеток, что включает нарушение первой фазы высвобождения инсулина, уменьшение импульсного выброса бета-клетками и недостаток инсулина. Диабет 2 типа является наиболее распространенной формой заболевания, составляющей 90-95% всех случаев диабета.

Люди с диабетом в два-четыре раза более склонны к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, чем люди без диабета. Сердечно-сосудистые заболевания являются основным осложнением и основной причиной смерти у людей с диабетом 2 типа, несмотря на значительные улучшения в методах лечения на протяжении последних десятилетий. Повышенный риск сердечных приступов, инсульт и ампутация нижних конечностей являются основными причинами преждевременной смерти у людей с диабетом. Более высокая распространенность факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая ожирение, гипертонию, дислипидемию и отсутствие физической активности, как правило, сопутствует диабету 2 типа.

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее серьезной проблемой здравоохранения и основной причиной смертности в Соединенных Штатах Америки (США). По данным Американской кардиологической ассоциации, стоимость профилактики и терапии сердечно-сосудистых заболеваний составила поразительную сумму в 448,5 миллиардов долларов США в 2008 г. только в США, что является огромным финансовым бременем для общества. Атеросклероз является формой сердечно-сосудистого заболевания, при которой бляшки, состоящие из жировых веществ и клеточных компонентов, накапливаются на внутренней выстилке артериальных сосудов. Заболевание начинается с отложения аномальных метаболитов в восприимчивых участках артерий пациентов при дисфункциональных метаболических состояниях, таких как диабет, и прогрессирует с вовлечением множества факторов, включая иммунную активацию и воспаление.

Аномальные метаболические состояния, такие как диабет, являются причиной различных клеточных ответов на стресс, которые вызывают воспаление тканей и активацию иммунных клеток, что, в свою очередь, усиливает метаболические нарушения, создавая порочный круг, который поддерживает последующие события, лежащие в основе таких нарушений, как прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний. Однако молекулярные события, связывающие эти процессы, не до конца понятны, что создает помеху попыткам модулировать иммунную систему для лечения метаболической дисфункции и осложнений сердечно-сосудистых заболеваний.

Соответственно, существует потребность в эффективных методах прогнозирования, профилактики и лечения заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией, таких как диабет, а также сердечно-сосудистые заболевания и расстройства.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к открытию семейства иммуностимулирующих молекул, которые характеризуются повышенной регуляцией у пациентов и животных с диабетом 2 типа и/или метаболическими дисфункциями и могут играть важную роль в активации иммунных клеток для воспаления сосудов и печени, метаболической дисфункции и развития сердечно-сосудистого заболевания. В частности, повышенные уровни стимуляторных лигандов для NKG2D, эффективного иммуноактивирующего рецептора, были обнаружены у пациентов с диабетом 2 типа, а также в животных моделях дисфункционального липидного метаболизма и атеросклероза.

Соответственно, настоящее изобретение относится к новым способам, композициям и наборам для лечения диабета 2 типа и патологических состояний, которые можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, например, сердечно-сосудистых заболеваний. Настоящее изобретение также относится к новым способам выявления и диагностики предрасположенности к диабету 2 типа или сердечно-сосудистому заболеванию, либо наличия диабета 2 типа или сердечно-сосудистого заболевания.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диабета 2 типа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диабета 2 типа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, у субъекта для лечения диабета 2 типа. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, у субъекта для лечения диабета 2 типа. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, у субъекта для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, у субъекта для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент снижает опосредованную NKG2D активацию или сигнализацию экспрессирующей NKG2D клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с по меньшей мере одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D. В некоторых вариантах осуществления лиганд NKG2D представляет собой MICA/B.

В некоторых вариантах осуществления введение средства приводит к по меньшей мере одному из перечисленных далее событий у субъекта: снижению уровней глюкозы в крови, улучшению толерантности к глюкозе, снижению резистентности к инсулину, уменьшению массы тела, снижению артериального давления, уменьшению воспаления или снижению метаболических дисфункций.

В некоторых вариантах осуществления средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.

В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию и сигнализацию NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения диабета 2 типа. В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D представляет собой ингибитор MICA/B. В некоторых вариантах осуществления ингибитор MICA/B представляет собой специфичную для MICA/B киРНК.

В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, включающему: (a) терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и (b) инструкции по применению. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, включающему: (a) терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и (b) инструкции по применению.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения диабета 2 типа.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

В некоторых вариантах осуществления наборы по настоящему изобретению дополнительно включают по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа или наличия диабета 2 типа у субъекта, включающему: (a) получение образца от субъекта; (b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B; (c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и (d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию диабета 2 типа или наличием диабета 2 типа у субъекта. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления предрасположенности к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличия сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающему: (a) получение образца от субъекта; (b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B; (c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и (d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления реагент представляет собой антитело к MICA/B.

В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой сыворотку.

В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают измерение уровня экспрессии маркера сердечно-сосудистого заболевания, не являющегося MICA/B, в образце и установление корреляции между избыточной экспрессией или недостаточной экспрессией маркера сердечно-сосудистого заболевания и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена серия графиков, демонстрирующих обнаружение растворимых белков MICA в сыворотках пациентов с диабетом 2 типа и их связь с экспрессией других провоспалительных цитокинов. (A) Обнаружение растворимого MICA в крови пациентов с диабетом 2 типа. Сыворотки пациентов с диабетом анализировали на белки MICA при помощи набора для ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Рекомбинантные белки MICA использовали в качестве стандартов, исходя из которых, рассчитывали уровни MICA в сыворотках. На оси абсцисс каждый номер обозначает пациента. (B и C) Уровни IL-6 и TNF-α в сыворотках тех же пациентов, проанализированные с помощью 4-компонентной панели провоспалительных цитокинов человека (IL-6, TNF-α, IL-1β и IFN-γ) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). (D) Сывороточные уровни С-реактивного белка (CRP) в сыворотках пациентов с диабетом 2 типа, проанализированные с использованием набора ELISA для CRP (Calbiotech Inc. Spring Valley, CA). (E) Пациенты с диабетом в среднем имеют более высокие уровни MICA в сыворотках, чем протестированные пятьдесят пациентов с раком. Данные для пациентов с диабетом 2 типа сгруппированы, и сопоставлены с данными пятидесяти пациентов с раком.

На фиг.2 представлена серия микрофотографий замороженных срезов, демонстрирующих обнаружение MICA/B при иммуногистохимическом окрашивании в аортальных бляшках человека. Замороженные срезы бляшек окрашивали антителами против MICA/B (A, C, E, G). Соседние срезы окрашивали антителами против Mac-3 или CD31 для выявления макрофагов или эндотелиальных клеток (B, D, F, H). Срез нормальной аорты использовали в качестве контроля для окрашивания на MICA (I).

На фиг.3 представлена серия фотографий электрофоретических гелей и серия фотографий иммуногистохимически окрашенных замороженных срезов, демонстрирующие повышенную регуляцию лигандов NKG2D в атеросклеротических бляшках ApoE-/- мыши. (A) Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ транскриптов для лигандов NKG2D Rae-1δ, Rae-1ε и H60b в РНК аортальных бляшек. (B) Анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени транскриптов Rae-1δ, Rae-1ε и H60b в образцах РНК, выделенных из областей дуги аорты у ApoE-/- мышей, получавших в качестве корма «западную диету» (WD), и подобранных по возрасту мышей дикого типа, получавших в качестве корма «западную диету» и обычный корм. Эксперимент проводили дважды. (C) Иммуногистохимическое окрашивание замороженных срезов бляшек от ApoE-/- мышей, у которых бляшки развивались естественно (справа) или ускоренным образом в результате индуцированного STZ диабета (слева). Срезы одновременно окрашивали антителом против Rae-1 или H60 (коричневый цвет) и антителом против CD68 (синий цвет). (D) Иммуногистохимическое окрашивание атеросклеротических аорт ApoE-/- мышей, получавших в качестве корма «западную диету», на лиганды NKG2D Rae-1 и H60. Замороженные срезы областей дуги атеросклеротических аорт (верх и центр) и «свободных от бляшек» грудных областей (низ) тех же самых ApoE-/- мышей, получавших «западную диету», окрашивали поликлональными антителами козы против антител мыши к Rae-1 (R&D Systems) или антител к H60 (Santa Cruz Biotechnology). Фотографии в центре представляют собой большее увеличение (400×) зон, заключенных в рамки из верхних панелей (100×). (E) Анализ методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на клеточной поверхности макрофагов и эндотелиальных клеток, выделенных из атеросклеротических аорт ApoE1^-/- мышей или нормальных аорт мышей дикого типа. Селекцию макрофагов проводили на популяцию CD45⁺CD11b⁺CD16/32⁺, а селекцию эндотелиальных клеток проводили на популяцию CD45^-CD31⁺. Серые зоны соответствуют окрашиванию подобранным по изотипу контрольным антителом. (F) Вестерн-блот анализ на суммарные белки Rae-1 в обработанных in vitro макрофагах дикого типа. (G) Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ повышенной регуляции различных лигандов NKG2D в макрофагах дикого типа, культивированных в одной только среде и в присутствии дополнительных oxLDL, природного LDL (nLDL) и LPS (в качестве контроля). (H) Анализ методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на макрофагах дикого типа, культивированных in vitro в присутствии окисленного LDL (oxLDL) или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE). Макрофаги выделяли из брюшной полости и культивировали in vitro в течение двух дней в среде, содержащей 5 мкг/мл oxLDL или 200 мкг/мл AGE до проведения анализа методом проточной цитометрии так же, как на панели E, за исключением того, что пунктирные линии соответствовали окраске в присутствии 10-кратного избытка немеченых антител против всех форм Rae-1.

На фиг.4 представлена серия фотографий аорты от ApoE-null мышей, которые демонстрируют подавление образования бляшек анти-NKG2D антителом у ApoE-null мышей с диабетом. (A) Образование бляшек в аорте у репрезентативных ApoE-null мышей с диабетом, получавших анти-NKG2D или контрольное антитело. Проводили перфузию аорты PBS, и изучали под препаровальной лупой на наличие явных непрозрачных бляшек. Обратите внимание на резко уменьшенные размеры бляшек у мышей, получавших анти-NKG2D антитело (области, обведенные кружком). (B) Окрашивание анфас красителем Oil red O аорты на отложение липидного содержимого у ApoE-/- мышей, получавших анти-NKG2D (MI-6) и контрольное антитело (контроль) из одного репрезентативного эксперимента. Аорты открывали, фиксировали в 10%-ном формалине и окрашивали красителем Oil red O. Липидное содержимое окрашивалось в темно-красный цвет. Обратите внимание на меньшее окрашивание Oil red O в областях дуги аорты у мышей, получавших анти-NKG2D антитело.

На фиг.5 представлена серия графиков, демонстрирующих, что воздействие на взаимодействие NKG2D/лиганд предотвращает атеросклероз в различных моделях на мышах. (A) Эффект блокады с помощью анти-NKG2D антитела на развитие атеросклероза у ApoE-/-мышей с индуцированным стрептозотоцином диабетом. Размеры бляшек на аорте у контрольных и получавших анти-NKG2D антитело ApoE-/- мышей с диабетом рассчитывали на основании отношения положительных по окрашиванию Oil red O областей ко всей области дуги. (B и C) Эффект нокаута NKG2D на развитие атеросклероза у KLRK1-/-ApoE-/- мышей с индуцированным стрептозотоцином диабетом (B) или получавших «западную диету» (C) (ген KLRK1 кодирует белок NKG2D). Размеры бляшек рассчитывали так же, как и на панели A. ApoE-/- мышей использовали в качестве контроля.

На фиг.6 представлена серия графиков, демонстрирующих пониженное содержание провоспалительных цитокинов в сыворотках ApoE-null мышей с диабетом, получавших анти-NKG2D антитело. Сыворотки четырех, получавших анти-NKG2D антитело (Ат MI-6), и трех, получавших контрольное антитело (Ат Con), ApoE-null мышей с диабетом, наряду с сыворотками двух, каждый раз подобранных по возрасту, мышей дикого типа B6 (дикий тип), ApoE-/- мышей в возрасте одного месяца (молодые ApoE) или восьми месяцев (старые ApoE) анализировали напрямую с использованием 7-компонентного набора мышиных провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β и KC/CXCL1) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Звездочкой * отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для получавших анти-NKG2D антитело и контрольное антитело ApoE-/- мышей с диабетом.

На фиг.7 представлена серия графиков, демонстрирующих пониженное содержание провоспалительных цитокинов в сыворотках KLRK1-/-ApoE-/- мышей (имеющих дефектный ген NKG2D). Сыворотки получавших «западную диету» (12 мышей/группу) (панель A) или с индуцированным STZ диабетом (4 мыши/группу) (панель B) KLRK1-/-ApoE-/- и ApoE-/- мышей анализировали напрямую с использованием 7-компонентного набора мышиных провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β и KC/CXCL1) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), как на фиг.6. Звездочками отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для получавших анти-NKG2D антитело и контрольное антитело ApoE-/- мышей с диабетом (***p<0,01; *p<0,05).

На фиг.8 представлена пара фотографий сывороток и пара графиков, демонстрирующих облегченное метаболическое патологическое состояние у KLRK1-/-ApoE-/- мышей. (A) Более прозрачный внешний вид сывороток у получавших «западную диету» KLRK1-/-ApoE-/- мышей, чем у питающихся аналогично ApoE-/- мышей. (B) Пониженные уровни холестерина и триглицеридов в крови у KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Сыворотки на панели A анализировали на содержание общего холестерина и триглицеридов. Звездочками ** отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для KLRK1/ApoE двойных нокаутных и ApoE-нокаутных мышей (**p<0,05). В каждой группе использовали по меньшей мере 5 мышей.

На фиг.9 представлен график, демонстрирующий пониженные активности сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) у нокаутных по NKG2D KLRK1-/-ApoE-/- мышей по сравнению с ApoE-/- мышами. В каждой группе использовали по меньшей мере 5 мышей.

На фиг.10 представлена пара графиков, демонстрирующих, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд уменьшает воспаление в печени у получавших «западную диету» ApoE-/- мышей. (A) Сниженная продукция IL-6 в культивируемых ex vivo эксплантатах печени KLRK1-/-ApoE-/- мышей с нокаутом NKG2D. Перфузированную PBS печень извлекали из получавших «западную диету» ApoE-/- или NKG2D-нокаутных KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Куски извлеченной печени равного веса нарезали на кубики размером примерно 1 мм³, и культивировали в среде в течение 1 или 3 дней. Культуральные среды собирали, и анализировали на цитокины методом ELISA. Эксперимент повторяли дважды. (B) Пониженная инфильтрация иммунных клеток в печени получавших «западную диету» NKG2D-нокаутных KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Числа соответствуют иммунным клеткам каждого типа на печень, рассчитанным, исходя из общего количества мононуклеоцитов, выделенных из печени, и процентному содержанию клеток каждого типа. В каждой группе использовали по меньшей мере 3 мыши. В качестве примера приведен один из трех независимых экспериментов.

На фиг.11 представлены серии графиков и кривых анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток, демонстрирующих повышенную регуляцию лигандов NKG2D в клетках печени получавших «западную диету» ApoE-/- мышей, и, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд снижает активацию экспрессирующих NKG2D иммунных клеток в печени. (A) Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени транскриптов Rae-1δ в печени и других органах 12-недельных самцов ApoE-/- мышей, получавших «западную диету» в течение 8 недель, и мышей дикого типа того же возраста. (B) Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени транскриптов Rae-1δ в очищенных макрофагах из печени получавших «западную диету» ApoE-/- мышей и мышей дикого типа. (C и D) Анализ методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на макрофагах печени (C) и гепатоцитах (D) получавших «западную диету» ApoE-/- мышей. (E) Пониженная продукция IFN-γ и IL-4 клетками NKT печени NKG2D-нокаутных KLRK1-/-ApoE-/- мышей. (F) Более низкая продукция IFN-γ клетками NK печени NKG2D-нокаутных KLRK1-/-ApoE-/- мышей по сравнению с ApoE-/- мышами. (G) Отсутствие различий в продукции IL-6 макрофагами печени NKG2D-нокаутных KLRK1-/-ApoE-/- мышей и ApoE-/- мышей.

На фиг.12 представлен график, демонстрирующий, что направленное воздействие на NKG2D подавляет диабет 2 типа. 8-недельные ApoE-/- и дефицитные по NKG2D ApoE-/-KLRK1-/- мыши получали «западную диету» в течение 3 месяцев. Затем сыворотки крови собирали, и определяли в них уровни глюкозы. Уровни глюкозы у ApoE-/- и ApoE-/-KLRK1-/- мышей представляют собой среднее значение для шести мышей в каждой группе. Различие между двумя группами является статистически значимым (p<0,05).

На фиг.13 представлен эффект анти-NKG2D антитела на развитие диабета у песчанок Psammomys obesus (также известных как песчаные крысы), животной модели диабета 2 типа. Самцы и самки P. obesus (Harlan, Jerusalem, Israel) получали низкокалорийный корм (2,4 ккал/г) до достижения возраста 9 недель, когда они были переведены на высококалорийную (3,1 ккал/г) диету, даваемую ad libitum, в это время массу тела (BW) и утренний уровень глюкозы (mBG) контролировали в течение 10 дней (индукционный период). Животных, имеющих повышенные уровни mBG, определяемые как mBG>10 ммоль/л при двух последовательных измерениях, переводили обратно на низкокалорийную диету, и использовали в текущем исследовании (режим профилактики) через 10 дней после того, когда их уровни mBG возвращались к не диабетическому диапазону. Животных, у которых не обнаруживали увеличения mBG в индукционный период, умерщвляли, и далее не использовали. (Данные не представлены). P. obesus получали растворитель (N=19) или антитело к NKG2D-PE (клон CX5) (N=9) один раз в неделю внутрибрюшинными инъекциями. Исследование проводили на протяжении 6 недель, в течение которых регулярно контролировали mBG и BW. У всех животных в группе с растворителем развивался тяжелый диабет со средним значением mBG, равным 14,5±2,6 мМ (среднее ± SEM), тогда как животные, получавшие антитело к NKG2D, оставались нормогликемическими (mBG<8 мМ) и имели значительно более низкий уровень mBG, составляющий 8,0±1,9 мМ, p<0,0001 (среднее ± SEM). Лечение антителом к NKG2D полностью подавляло развитие диабета 2 типа у P. obesus, а пять животных в группе с растворителем пришлось умертвить в процессе исследования из-за тяжелого диабетического кетоацидоза. Разница в прибавлении BW отсутствовала в двух группах лечения.

На фиг.14 представлен анализ методом проточной цитометрии связывания антитела к NKG2D с клетками крови Psammomys obesus (песчаные крысы), животной модели диабета 2 типа. Дозозависимое связывание наблюдали для антитела против NKG2D-PE мыши (клон CX5) с NK клетками в крови песчаных крыс. Это связывание было специфическим, поскольку отсутствовало связывание контрольных по изотипу антител (контроль по изотипу IgG1-PE крысы (R3-34) и контроль по изотипу IgG1-PE мыши (MOPC-21)) или антител против NKG2D человека (клон 1D11 и клон ON72).

Определения

Если не определено иное, все технические термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, которое им обычно придают рядовые специалисты в области, к которой относится данное изобретение.

В данном документе термины «белок» и «полипептид» используют в качестве синонимов для обозначения любой соединенной пептидной связью цепи аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации, например, гликозилирования или фосфорилирования.

Используемые в данном документе термины «белки MICA/B» или «полипептид MICA/B» означают продукт экспрессии родственного цепи MHC класса I гена A или B, такой как природный человеческий белок MICA (регистрационный № L14848), или белок, обладающий по меньшей мере 65% (но, предпочтительнее, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99%) идентичности аминокислотной последовательности с вышеуказанным белком и проявляющий функциональную активность природного белка MICA или природного человеческого белка MICB (регистрационный № NM_005931), или белка, обладающего по меньшей мере 65% (но, предпочтительнее, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99%) идентичности аминокислотной последовательности с вышеуказанным белком и проявляющего функциональную активность природного белка MICB. «Функциональная активность» белка представляет собой любую активность, связанную с физиологической функцией белка. Например, функциональные активности природного белка MICA/B могут включать связывание с NKG2D и индукцию иммунной активации, например, секреции цитокинов.

Используемые в данном документе термины «белок NKG2D» или «полипептид NKG2D» означают продукт экспрессии гена KLRK1, такой как природный человеческий белок NKG2D (регистрационный № 574240) или белок, обладающий по меньшей мере 65% (но, предпочтительнее, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99%) идентичности аминокислотной последовательности с вышеуказанным белком и проявляющий функциональную активность природного белка NKG2D. Например, функциональные активности природного белка NKG2D могут включать связывание с его лигандами и передачу сигналов в иммунные клетки для модуляции их генной экспрессии и активации.

Используемый в данном документе термин «ген» означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую конкретный белок, или, в некоторых случаях, функциональную или структурную молекулу РНК.

Используемые в данном документе термины «ген MICA/B», «ген MICA», «ген MICB», «полинуклеотид MICA/B», «полинуклеотид MICA», «полинуклеотид MICB», «нуклеиновая кислота MICA/B», «нуклеиновая кислота MICA» или «нуклеиновая кислота MICB» означают природную человеческую кодирующую MICA или MICB последовательность нуклеиновой кислоты, например, природный человеческий ген MICA (регистрационный № L14848); например, природный человеческий ген MICB (регистрационный № NM_005931), нуклеиновую кислоту, обладающую последовательностью, с которой кДНК MICA или MICB может быть транскрибирована; и/или аллельные варианты и гомологи вышеуказанного. Термины охватывают двуспиральную ДНК, односпиральную ДНК и РНК.

Используемые в данном документе термины «KLRK1», «Klrk1», «ген KLRK1», «ген Klrk1», «ген NKG2D», «полинуклеотид NKG2D» или «нуклеиновая кислота NKG2D» означают природную человеческую кодирующую NKG2D последовательность нуклеиновой кислоты, например, природный человеческий ген KLRK1 (регистрационный № 574240); нуклеиновую кислоту, обладающую последовательностью, с которой кДНК KLRK1 может быть транскрибирована; и/или аллельные варианты и гомологи вышеуказанного. Термины охватывают двуспиральную ДНК, односпиральную ДНК и РНК.

Используемые в данном документе термины «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» означают цепочку из двух или более нуклеотидов, такую как РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Описанные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты могут находиться в форме РНК или в форме ДНК (например, кДНК, геномной ДНК и синтетической ДНК). ДНК может быть двуспиральной или односпиральной, и односпиральная молекула может быть кодирующей (смысловой) спиралью или не кодирующей (антисмысловой) спиралью.

В данном документе термины «пациент», «субъект» и «индивидуум» используются взаимозаменяемо, и означают субъекта - млекопитающего (например, человека), к которому применяют лечение или от которого получают образец.

Используемые в данном документе термины «связывать», «связывается» или «взаимодействует с» означают, что одна молекула узнает, и прикрепляется к конкретной второй молекуле в образце или организме, но существенным образом не узнает, и не прикрепляется к другим структурно не связанным молекулам в образце.

Используемый в данном документе термин «меченый», применительно к зонду или антителу, должен охватывать прямое мечение зонда или антитела путем присоединения (то есть физического связывания) обнаруживаемого вещества к зонду или антителу.

При использовании в данном документе применительно к молекуле нуклеиновой кислоты или полипептиду термин «природный» означает существующие в природе (например, WT) нуклеиновую кислоту или полипептид.

Используемые в данном документе термины «диагностический», «диагностировать» и «диагностированный» означают выявление наличия или природы патологического состояния.

В данном документе термин «образец» используется в самом широком смысле. Образец, содержащий полинуклеотиды, пептиды, антитела и тому подобное, может включать жидкость организма, растворимую фракцию клеточного препарата или среды, в которых выращивали клетки, геномную ДНК, РНК или кДНК, клетку, ткань, кожу, волосы и тому подобное. Примеры образцов включают слюну, сыворотку, образцы биопсии, кровь, мочу и плазму.

Используемый в данном документе термин «идентичность последовательности» означает процентное содержание идентичных субъединиц на соответствующих позициях в двух последовательностях, когда эти две последовательности выравнивают для получения максимального соответствия субъединиц, то есть, с учетом пробелов и вставок. Идентичность последовательности имеет место, когда субъединичная позиция в обеих из двух последовательностей занята одним и тем же нуклеотидом или аминокислотой, например, если данная позиция занята аденином в каждой из двух молекул ДНК, то эти молекулы идентичны по данной позиции. Например, если 7 позиций в последовательности из 10 нуклеотидов в длину идентичны соответствующим позициям во второй 10-нуклеотидной последовательности, то тогда две последовательности имеют 70% идентичности последовательности. Как правило, идентичность последовательности измеряют при помощи программы для анализа последовательностей (например, пакет программ для анализа последовательностей компании Genetics Computer Group, университета Биотехнологического центра Висконсина, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705).

Когда речь идет о мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, «молчащие» изменения являются такими, при которых происходит замена одной или нескольких пар оснований в нуклеотидной последовательности, но не происходит изменений в аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого данной последовательностью. «Консервативными» изменениями являются такие, при которых по меньшей мере один кодон в кодирующей белок области нуклеиновой кислоты был изменен таким образом, что по меньшей мере одна аминокислота полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, заменена другой аминокислотой, имеющей сходные характеристики.

В данном документе термины «олигонуклеотид», «киРНК», «киРНК олигонуклеотид» и «молекулы киРНК» используются взаимозаменяемо на протяжении всего описания и включают линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоаты, метилфосфонаты и тому подобное. Олигонуклеотиды способны специфически связываться с целевым полинуклеотидом согласно обычной схеме взаимодействия мономера с мономером, такой как тип спаривания оснований по принципу Уотсона-Крика, тип спаривания оснований по принципу Хугстена или тип спаривания оснований по обратному принципу Хугстена, или тому подобное.

В данном документе термин «антитело» используется в самом широком смысле и, в частности, включает полноразмерные моноклональные антитела, поликлональные антитела и, если не указано иное или не противоречит контексту, их антигенсвязывающие фрагменты, вариантные антитела и мультиспецифические молекулы, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. В целом, полноразмерное антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначенной в данном документе аббревиатурой VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из тех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначенной в данном документе аббревиатурой VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно далее подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, и называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Общие принципы строения молекулы антитела и различные методы производства антител изложены, например, в книге Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988). Например, анти-NKG2D антитела, описанные в данном документе, способны связывать участки NKG2D, что препятствует активации и/или сигнализации NKG2D. Анти-NKG2D антитела, описанные в данном документе, также способны связывать участки NKG2D, что препятствует взаимодействию связывания лиганда NKG2D.

Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела представляет собой молекулу, содержащую часть полноразмерного антитела, способную избирательно связывать антиген, и, как правило, содержащую один или несколько фрагментов по меньшей мере VH области. Антигенсвязывающие фрагменты включают мультивалентные молекулы, содержащие одну, две, три или более антигенсвязывающих частей антитела и одноцепочечные конструкты, в которых VL и VH области, или их избранные части, соединены синтетическими линкерами или при помощи рекомбинантных методов для образования функциональной антигенсвязывающей молекулы. При том что некоторые антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получать фактической фрагментацией большей по размеру молекулы антитела (например, ферментативным расщеплением), большинство, как правило, получают рекомбинантными методами.

Используемый в данном документе термин «человеческое антитело» должен охватывать антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR участки происходят из (то есть идентичны или практически идентичны) человеческих последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии. Более того, если антитело содержит константную область, константная область также «происходит из» человеческих последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo). Однако термин «человеческое антитело» при использовании в данном документе не должен включать антитела, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были присоединены к каркасным последовательностям человека.

Используемый в данном документе термин «гуманизированное» антитело означает человеческое/отличное от человеческого химерное антитело, содержащее минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, отличного от человеческого. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или приматы, отличные от человека, имеющими желаемую специфичность, аффинность и функциональную активность. В некоторых случаях остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих.

Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорском антителе. Данные модификации выполнены для дальнейшего усовершенствования характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют таковым у иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или практически все из остатков FR являются остатками последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может необязательно содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, области из человеческого иммуноглобулина. Для получения дополнительной информации см., например, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, патентную заявку США 20060073137 и патенты США 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761, 5530101, 5585089 и 5225539.

Используемые в данном документе термины «остатки «каркасной области» или «FR»» являются такими остатками VH или VL, которые отличаются от CDR, как они определены в данном документе.

Используемый в данном документе термин «эпитоп» или «сайт связывания» означает область или участок на антигене, с которым специфически связывается антигенсвязывающий пептид (такой как антитело). Белковый эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно вовлеченные в связывание (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, не вовлеченные непосредственно в связывание, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфически связывающим антиген пептидом (другими словами, аминокислотный остаток находится в пределах «недоступной растворителю поверхности» и/или «отпечатка» специфически связывающего антиген пептида). В данном документе термин «эпитоп» включает оба типа аминокислотных сайтов связывания в любой конкретной области hNKG2D, которые специфически связываются с анти-hNKG2D антителом, или другим специфическим для hNKG2D веществом по изобретению, если не указано иное (например, в некоторых контекстах изобретение относится к антителам, которые связываются напрямую с конкретными аминокислотными остатками). Молекулы NKG2D могут содержать ряд различных эпитопов, которые могут включать, без ограничения, (1) линейные пептидные антигенные детерминанты, (2) конформационные антигенные детерминанты, состоящие из одной или нескольких несмежных аминокислот, расположенных рядом друг с другом в конформации зрелого NKG2D; и (3) посттрансляционные антигенные детерминанты, которые состоят либо полностью, либо частично, из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к NKG2D, таких как углеводные группы. Если не указано иное или не противоречит контексту, конформационные антигенные детерминанты содержат аминокислотные остатки NKG2D в пределах расстояния примерно 4 Е от атома антигенсвязывающего пептида.

Используемая в данном документе фраза «связывается практически с тем же эпитопом или детерминантой, что и» интересующее антитело (например, MS или 21F2), означает, что антитело «конкурирует» с интересующим антителом за молекулы NKG2D, с которыми интересующее антитело специфически связывается.

При использовании в данном документе, способность анти-NKG2D антитела «блокировать» связывание молекулы NKG2D с природным лигандом NKG2D (например, MICA) означает, что в анализе с использованием растворимого или связанного с клеточной поверхностью NKG2D и молекул лиганда антитело способно заметно снижать связывание молекулы NKG2D с лигандом дозозависимым образом, при этом молекула NKG2D определенно связывается с лигандом в отсутствие антитела.

Используемая в данном документе фраза «взаимодействие связывания лиганда NKG2D» означает специфическое узнавание и взаимодействие связывания между NKG2D и его лигандом (например, MICA/B, ULBP/RAET1, Mult1, Rae-1δ, Rae-1ε и H60b). Примеры веществ, которые способны модулировать взаимодействие связывания лиганда NKG2D, включают растворимый NKG2D, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает NKG2D, лиганд NKG2D и ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D.

Высокие уровни холестерина и триглицеридов считаются нарушениями липидного метаболизма, которые увеличивают риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и диабета 2 типа.

При использовании в данном документе термин «диабет» означает нарушение метаболизма, которое приводит к повышению уровня глюкозы в крови из-за относительного или абсолютного дефицита гормона поджелудочной железы инсулина. Существуют две формы диабета: диабет 1 типа и диабет 2 типа. Диабет 1 типа характеризуется прогрессирующей потерей бета-клеток поджелудочной железы вследствие неблагоприятного баланса между разрушительными аутоиммунными процессами, направленными на бета-клетки, с одной стороны и регенеративной способностью этих клеток с другой стороны. Этот дисбаланс в конечном итоге приводит к полной потере бета-клеток и эндогенной секреции инсулина. Диабет 2 типа характеризуется резистентностью к инсулину и нарушением функции бета-клеток, что включает нарушение первой фазы высвобождения инсулина, уменьшение импульсного выброса бета-клетками и недостаток инсулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к лечению диабета 2 типа.

При использовании в данном документе термин «диабет 2 типа» означает хроническое патологическое состояние, при котором организм устойчив к действию инсулина или не производит достаточное количество инсулина для поддержания нормального уровня глюкозы. Кроме того, он также означает метаболические дисфункции, существующие у людей на ранних стадиях заболевания, такие как дислипидемия.

Используемое в данном документе определение «сердечно-сосудистое заболевание» означает аномальные состояния, влияющие на функции, связанные с сердцем и кровеносными сосудами.

Используемый в данном документе термин «безопасное и эффективное количество» означает количество компонента, достаточное для достижения желаемой терапевтической ответной реакции без неоправданных негативных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение, или аллергическая реакция), отвечающее разумному соотношению польза/риск при использовании, описанном в данном документе.

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество композиции, описанной в данном документе, эффективное для достижения желаемой терапевтической ответной реакции, например, количество, эффективное для задержки развития атеросклеротических бляшек, или количество, эффективное для снижения уровня глюкозы в крови и стимуляции снижения веса у пациентов с диабетом.

Конкретное безопасное и эффективное количество или терапевтически эффективное количество будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как конкретное излечиваемое патологическое состояние, физическое состояние пациента, тип млекопитающего или животного, подвергающегося лечению, продолжительность лечения, характер сопутствующей терапии (при наличии), конкретные используемые препараты, а также структура соединений или их производных.

Используемый в данном документе термин «лечение» означает применение или введение терапевтического средства пациенту, либо применение или введение терапевтического средства в выделенную ткань или клеточную линию, полученную от пациента, имеющего заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечить, исцелять, облегчать, освобождать, изменять, ликвидировать, ослаблять, улучшать состояние или влиять на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию. Например, «лечение» пациента, у которого не выявлено симптомов или клинически значимых проявлений заболевания или расстройства, является превентивной или профилактической терапией, в то время как клиническое, исцеляющее или паллиативное «лечение» пациента, у которого выявлены симптомы или клинически значимые проявления заболевания или расстройства, как правило, не является превентивной или профилактической терапией. Лечение диабета 2 типа у субъекта, например, включает снижение уровня глюкозы в крови и снижение массы тела субъекта. Ингибирование прогрессирования заболевания диабета 2 типа включает предотвращение или подавление патологического состояния липидного метаболизма, снижение резистентности к инсулину, предотвращение или подавление нарушений липидного метаболизма, повышение толерантности к глюкозе и так далее. Лечение диабета 2 типа и ингибирование прогрессирования заболевания диабета 2 типа может включать облегчение или предотвращение симптомов, расстройств или заболеваний, связанных с диабетом, например, метаболического синдрома, диабетической ретинопатии, почечной недостаточности, плохой циркуляции крови и вызванной этим проблемы с конечностями. Каждый вид лечения может рассматриваться как отдельный аспект изобретения.

В данном документе описаны способы с использованием общепринятых молекулярно-биологических методов. Такие методы, как правило, известны в данной области, и подробно описаны в методологических трактатах, таких как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^е изд., тома 1-3, под редакцией Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001; и Current Protocols in Molecular Biology, под редакцией Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (с периодическими обновлениями). Общепринятые методы переноса генов и генной терапии также можно адаптировать для использования по настоящему изобретению. См., например, Gene Therapy: Principles and Applications, под редакцией T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999; Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), под редакцией P.D. Robbins, Humana Press, 1997; и Retro-vectors for Human Gene Therapy, под редакцией C.P. Hodgson, Springer Verlag, 1996. Иммунологические методы, как правило, известны в данной области и подробно описаны в методологических трактатах, таких как Advances in Immunology, том 93, под редакцией Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, под редакцией Gary C. Howard и Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, 2006; Medical Immunology, 6^е изд., под редакцией Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, 2007; и Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Хотя способы, композиции и наборы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы в практике или тестировании изобретения, подходящие способы, композиции и наборы описаны ниже.

Полное содержание всех публикаций, патентных заявок и патентов, упомянутых в данном документе, включено в данный документ посредством ссылок. В случае конфликта, настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Конкретные варианты осуществления, обсуждаемые ниже, являются лишь иллюстративными, и не должны являться ограничивающими.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на том открытии, что семейство иммуностимуляторных молекул отличается повышенной регуляцией у пациентов и животных с диабетом или дисфункциями липидного метаболизма и является важным для развития сердечно-сосудистых заболеваний. Данные, приведенные в данном документе, служат первым доказательством того, что уровни белков MICA/B повышены в сыворотках пациентов-людей с диабетом 2 типа и что инъекция анти-NKG2D антитела мышам с диабетом блокирует взаимодействие с лигандом NKG2D и существенно подавляет образование атеросклеротических бляшек. Результаты, приведенные в данном документе, также свидетельствуют о том, что опосредованная комплексом NKG2D/лиганд иммунная активация играет роль в прогрессировании диабета 2 типа. Инъекция анти-NKG2D антитела животным в модели диабета 2 типа позволила лечить диабет и значительно снизить уровни глюкозы в крови. Блокирование взаимодействия NKG2D/лиганд также ослабляло аномальное состояние метаболизма, включая снижение уровней холестерина и триглицеридов.

Вследствие этого, MICA/B и другие лиганды NKG2D являются новыми молекулярными маркерами для прогнозирования диабета 2 типа, а также развития сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с диабетом, и они, как и взаимодействие NKG2D/лиганд, являются новыми мишенями в стратегии профилактики или лечения диабета 2 типа, а также других аномальных состояний метаболизма или заболеваний (например, дислипидемии, диабетической ретинопатии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями) и сердечно-сосудистых заболеваний (например, атеросклероза).

Соответственно, настоящее изобретение относится к новым способам, композициям и наборам для выявления и лечения диабета 2 типа, а также других аномальных состояний метаболизма, таких как сердечно-сосудистые заболевания или расстройства.

NKG2D представляет собой иммуностимуляторную молекулу, экспрессируемую многими иммунными клетками, такими как NK, NKT, ab T и gd T-клетки. Стимуляция NKG2D родственными ему лигандами приводит к активации экспрессирующих NKG2D иммунных клеток. Существует несколько молекул, которые могут служить в качестве лигандов для NKG2D, включая члены семейства Rae-1, H60 и Mult1 у мышей и семейства белков MICA/B и ULBP/RAET1 у людей. Большинство лигандов NKG2D не экспрессируются или экспрессируются на низких уровнях в нормальных клетках, но имеют повышенную регуляцию при различных болезненных состояниях, что может, в свою очередь, активировать экспрессирующие NKG2D иммунные клетки. При том, что такая иммунная активация играет важную роль в защитных силах организма, таких как, иммунитет к микробам и контроль за образованием опухолей, она может также вносить вклад в развитие опосредованных иммунными реакциями заболеваний.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам и наборам для обнаружения белков MICA/B в биологическом образце от субъекта с целью выявления наличия или прогнозирования возникновения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта. Заболевания, связанные с метаболической дисфункцией, включают гипергликемию, диабетическую ретинопатию, плохую циркуляцию крови, проблемы с конечностями и дислипидемию (например, высокий уровень холестерина и высокий уровень триглицеридов).

Данные, приведенные в данном документе в примере 1, указывают на то, что имеет место повышенная регуляция лигандов NKG2D у пациентов с диабетом 2 типа, что может способствовать воспалению органов и сопутствующим осложнениям. Данные, приведенные в данном документе, свидетельствуют, что повышенные уровни белков MICA/B обнаружены в сыворотках и атеросклеротических бляшках людей цервистатин пациентов с диабетом 2 типа. Также было установлено, что белки H60 и Rae-1 (индуцируемый ретиноевой кислотой ранний ген-1) отличаются повышенной регуляцией в кровеносных сосудах, особенно в зонах атеросклеротического поражения, и печени ApoE-/- мышей с диабетом или без диабета, животной модели нарушенного липидного метаболизма и атеросклероза, и что Mult1 отличался повышенной регуляцией в сыворотке таких животных (см. пример 2). Таким образом, повышенная регуляция лигандов NKG2D (например, белков MICA/B или белков ULBP/RAET1) может быть полезной для выявления наличия или прогнозирования возникновения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией.

Типичный способ выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, либо наличия диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, включает получение биологического образца от субъекта; создание контакта биологического образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии лиганда NKG2D (например, экспрессии MICA/B); измерение уровня экспрессии лиганда NKG2D в биологическом образце; и установление корреляции между избыточной экспрессией лиганда NKG2D и предрасположенностью к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта. Как проиллюстрировано данными, приведенными в примере 1, измеряли уровень экспрессии растворимого MICA/B. Однако в некоторых вариантах осуществления можно измерять уровень экспрессии мембранных форм MICA/B. Вместо или в дополнение к MICA/B можно анализировать экспрессию любого лиганда NKG2D. Например, белки семейства ULBP/RAET1 являются лигандами NKG2D и, как установлено, отделяются, и присутствуют в сыворотке, подобно MICA/B, что делает данные белки подходящими маркерами для способов, композиций и наборов, описанных в данном документе. Лиганды NKG2D описаны, например, в Waldhauer, I. and A. Steinle, Oncogene, 27:5932-5943 (2008).

В некоторых вариантах осуществления реагент, который выявляет экспрессию лиганда NKG2D (например, экспрессию MICA/B), может включать любой подходящий реагент, такой как антитела к MICA/B и растворимый NKG2D.

Как правило, биологическим образцом является сыворотка. Однако можно использовать любой подходящий биологический образец. Примеры дополнительных биологических образцов включают образцы биопсии, плазму, мочу, кожу, кровь и слюну.

Можно использовать любой подходящий метод или анализ для измерения уровня экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B) в биологическом образце субъекта. Многочисленные способы обнаружения на основе антител хорошо известны в данной области и включают ELISA (иммуноферментный анализ), радиоиммунный анализ, иммуноблоттинг, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, иммунофлюоресцентный анализ, иммунопреципитацию, анализы с использованием белка A, анализы с использованием иммуноэлектрофореза, а также другие сходные методы. В некоторых вариантах осуществления связывание антитела выявляют путем обнаружения метки на первичном антителе. В другом варианте осуществления первичное антитело выявляют путем обнаружения связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В следующем варианте осуществления вторичное антитело является меченым. Множество методов для обнаружения связывания в иммуноанализе известно в данной области и они находятся в рамках композиций, наборов и способов, описанных в данном документе. Антитела, специфичные для MICA/B или других лигандов NKG2D можно предоставлять в диагностическом наборе, который используется по меньшей мере в одном из данных методов обнаружения экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B). Набор может содержать другие компоненты, упаковку, инструкции, или другие материалы для облегчения обнаружения белка и использования набора.

Способы выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, либо наличия диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта включают установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B или другого лиганда(ов) NKG2D и предрасположенностью к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, либо наличием диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта. Являются ли один или несколько лигандов NKG2D (например, MICA/B) избыточно экспрессированными в биологическом образце, можно определять, сравнивая уровень экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B) в биологическом образце с базовым уровнем (также известным как контрольный уровень) экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B). «Базовый уровень» представляет собой контрольный уровень, и в некоторых вариантах осуществления нормальный уровень или уровень, не наблюдаемый у субъектов, имеющих диабет 2 типа, воспалительное заболевание или другое заболевание, связанное с метаболической дисфункцией, а также предрасположенность к сердечно-сосудистому заболеванию. Вследствие этого, можно определять, исходя из контрольного или базового уровня экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B), имеет ли образец, изучаемый на предмет развития диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, значительное увеличение (то есть избыточную экспрессию, повышенную регуляцию), уменьшение, либо практически отсутствие изменения экспрессии лиганда NKG2D, по сравнению с базовым уровнем. В некоторых вариантах осуществления базовый уровень можно устанавливать на основании предыдущего образца от тестируемого субъекта, таким образом можно контролировать состояние болезни субъекта с течением времени и/или таким образом можно оценивать эффективность данного терапевтического протокола с течением времени.

В некоторых вариантах осуществления способа выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, либо наличия диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта анализируют экспрессию одного или нескольких маркеров в дополнение к лиганду NKG2D (например, MICA/B). Один или несколько маркеров также могут являться лигандами NKG2D; можно анализировать экспрессию любого лиганда NKG2D. Примеры дополнительных маркеров, которые могут быть измерены, включают С-реактивный белок, IL-6, TNF-α, sICAM-1, sCD40, семейство белков ULBP/RAET1 (например, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAET1G, RAET1L) и другие. В вариантах осуществления, в которых анализируют экспрессию одного или нескольких маркеров в дополнение к лиганду NKG2D (например, MICA/B), сочетание лиганда NKG2D (например, MICA/B) и других биомаркеров может обеспечить более надежный прогноз развития сосудистого заболевания и/или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В таком варианте осуществления биологический образец контактирует с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет экспрессию лиганда NKG2D, и двумя или несколькими реагентами, которые выявляют наличие экспрессии одного или нескольких маркеров в дополнение к лиганду NKG2D (например, MICA/B), соответственно. Измеряют уровни экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B) и двух или более дополнительных маркеров в биологическом образце; и избыточная экспрессия лиганда NKG2D (например, MICA/B) коррелирует с предрасположенностью к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией (например, дислипидемии, диабетической ретинопатии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями и так далее), у субъекта. В зависимости от конкретных двух или более дополнительных маркеров, их недостаточная экспрессия или избыточная экспрессия может коррелировать с предрасположенностью к развитию диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и способам модулирования у лиганда NKG2D (например, белков MICA/B или ULBP/RAET1) экспрессии (например, ингибирования экспрессии MICA/B или ULBP/RAET1) и активности (например, связывания с NKG2D) для лечения субъекта, имеющего диабет 2 типа, сердечно-сосудистое заболевание, воспалительное заболевание и/или заболевание, связанное с метаболической дисфункцией. Описанные в данном документе композиции могут также быть полезны для лечения тех, кто имеет предрасположенность и/или уже возникшее сердечно-сосудистое заболевание (например, атеросклероз) и/или тех, кто имеет заболевание, связанное с метаболической дисфункцией, такое как высокий уровень холестерина или триглицеридов, диабет, дислипидемия, диабетическая ретинопатия, плохая циркуляция крови, проблемы с конечностями и так далее. Такие композиции, как правило, содержат терапевтически эффективное количество средства для модулирования экспрессии или активности/сигнализации одного или нескольких лигандов NKG2D (например, MICA/B или ULBP/RAET1) и фармацевтически приемлемый носитель. Ингибитор лиганда NKG2D (например, MICA/B или ULBP/RAET1) способен снижать уровень лиганда NKG2D в клетке и/или снижать активность лиганда NKG2D в клетке. Ингибитор лиганда NKG2D (например, MICA/B или ULBP/RAET1), способный снижать уровень лиганда NKG2D в клетке, может быть ингибитором транскрипции или трансляции гена, кодирующего лиганд NKG2D. Кроме того, ингибитор лиганда NKG2D, способный снижать уровень лиганда NKG2D в клетке, может стимулировать деградацию лиганда NKG2D и/или кодирующей лиганд NKG2D РНК. Ингибитор транскрипции и/или трансляции может представлять собой ингибитор на основе нуклеиновой кислоты, такой как антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные мРНК целевого лиганда NKG2D, а также рибозимы и ферменты ДНК, обладающие каталитической активностью для расщепления целевой мРНК.

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе композиция содержит киРНК, специфичную для гена, кодирующего лиганд NKG2D. Специфичные для последовательности киРНК связываются с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, ингибируя ее экспрессию. Предложены композиции для доставки киРНК и способы воздействия с ее помощью. Методы конструирования и использования рибозимов, киРНК и антисмысловых молекул известны в данной области (например, Isaka Y., Curr Opin. Mol. Ther, 9:132-136 (2007); Sioud M. and Iversen P.O., Curr Drug Targets, 6:647-653 (2005); Ribozymes and siRNA Protocols (Methods in Molecular Biology) by Mouldy Sioud, 2^е издание, 2004, Humana Press, New York, New York). «Антисмысловая» нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например, комплементарную кодирующей спирали двуспиральной молекулы кДНК или комплементарную последовательности мРНК. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарной всей кодирующей MICA/B спирали, либо только ее части. В другом варианте осуществления молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты является антисмысловой по отношению к «некодирующей области» кодирующей спирали нуклеотидной последовательности, кодирующей лиганд NKG2D (например, 5'- и 3'-нетранслируемым областям). Антисмысловые агенты могут содержать, например, от примерно 8 до примерно 80 нуклеиновых оснований (то есть от примерно 8 до примерно 80 нуклеотидов), например, от примерно 8 до примерно 50 нуклеиновых оснований или от примерно 12 до примерно 30 нуклеиновых оснований. Антисмысловые соединения включают рибозимы, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS) (олигозимы), и другие короткие каталитические РНК или каталитические олигонуклеотиды, которые гибридизуются с целевой нуклеиновой кислотой и модулируют ее экспрессию. Антисмысловые соединения могут содержать участок из не менее восьми последовательных нуклеиновых оснований, которые комплементарны последовательности в целевом гене. Олигонуклеотид не обязательно должен быть на 100% комплементарен последовательности его целевой нуклеиновой кислоты, чтобы обладать способностью специфически гибридизоваться. Олигонуклеотид способен специфически гибридизоваться, если связывание олигонуклеотида с целевой молекулой препятствует нормальному функционированию целевой молекулы, что приводит к утрате определенной функции, и существует достаточная степень комплементарности для избегания неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых желательно специфическое связывание, то есть при физиологических условиях в случае in vivo анализов или терапевтического применения, либо в случае in vitro анализов в условиях, в которых проводятся анализы.

В некоторых вариантах осуществления композиция для модулирования у лиганда NKG2D экспрессии (например, ингибирования экспрессии MICA/B или ULBP/RAET1) и активности (например, связывания с NKG2D) для лечения субъекта, имеющего воспалительное заболевание, связанное с метаболической дисфункцией, такое как диабет 2 типа, который предрасположен и/или уже имеет сердечно-сосудистое заболевание (например, атеросклероз) и/или который имеет аномальные метаболические состояния, такие как высокий уровень холестерина или триглицеридов, дислипидемия, диабетическая ретинопатия и так далее, содержит терапевтически эффективное количество средства для блокирования взаимодействия NKG2D с одним или несколькими из его лигандов (например, взаимодействия NKG2D/MICA/B), фармацевтически приемлемый носитель и известное средство для лечения сердечно-сосудистого заболевания, высокого кровяного давления или нарушения метаболизма, происходящего из-за пути, отличного от пути взаимодействия NKG2D/лиганд. Примером известного препарата для лечения сердечно-сосудистого заболевания является любой из ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (статинов). Примеры статинов включают церивастатин, флувастатин, аторвастатин, симвастатин, правастатин или ловастатин, либо их фармацевтически приемлемые соли. Композиции и способы с применением статинов известны в данной области (см., например, патент США № 6465454).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции для лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями, диабетической ретинопатии и так далее), содержащей средство для блокирования взаимодействия NKG2D с одним или несколькими из его лигандов (например, взаимодействия NKG2D/MICA/B) и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления композиция содержит средство, ингибирующее активацию или сигнализацию NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

Результаты, приведенные в данном документе в примере 3, указывают на то, что блокирование взаимодействия связывания лиганда NKG2D при помощи анти-NKG2D антитела было способно подавлять образование бляшек у ApoE-/- мышей с диабетом без изменения числа экспрессирующих NKG2D клеток.

Можно использовать любое подходящее средство для блокирования взаимодействия NKG2D с одним или несколькими из его лигандов (например, взаимодействия NKG2D/MICA/B) или ингибирования активации или сигнализации NKG2D. Например, средство можно выбирать из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

Типичным средством, ингибирующим активацию или сигнализацию NKG2D, или блокирующим взаимодействие NKG2D с одним или несколькими из его лигандов, является антитело, которое специфически связывает NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

Можно использовать любое подходящее антитело, специфически связывающее NKG2D. Описанные в данном документе анти-NKG2D антитела включают поликлональные и моноклональные человеческие антитела, либо любые части их антигенсвязывающих фрагментов, имеющие по меньшей мере одну антигенсвязывающую область вариабельной области иммуноглобулина, при этом антитела специфически связывают NKG2D. Антитело является специфическим для NKG2D, если оно получено против эпитопа полипептида и связывает по меньшей мере часть природного или рекомбинантного белка. Другим примером средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, является антитело, которое специфически связывает лиганд NKG2D (например, MICA/B, ULBPs). Можно использовать любое антитело, специфически связывающее лиганд NKG2D.

Методы определения специфичности и аффинности моноклонального антитела при помощи конкурентного ингибирования можно найти в Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988, Colligan et al., ред., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), полное содержание данных литературных источников включено в данный документ посредством ссылок.

В некоторых вариантах осуществления антитела, специфически связывающие NKG2D, являются человеческими моноклональными антителами 16F16, 16F31, MS и 21F2 с последовательностями, приведенными ниже. В некоторых вариантах осуществления антитела являются человеческими моноклональными антителами MS. Полноразмерные, вариабельные и CDR последовательности этих антител приведены в таблице 1.

Антитела против NKG2D и против лиганда NKG2D, описанные в данном документе, можно на регулярной основе получать методами, такими как, но, не ограничиваясь ими, инокуляция соответствующему животному полипептида или антигенного фрагмента, in vitro стимулирование популяций лимфоцитов, синтетические методы, гибридомы и/или рекомбинантные клетки, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, кодирующую такие анти-NKG2D антитела. Иммунизация животного с использованием очищенного рекомбинантного NKG2D или его пептидных фрагментов является примером метода получения анти-NKG2D антител. Аналогично, иммунизация животного с использованием очищенного рекомбинантного лиганда NKG2D (например, одного из белков ULBP/RAET1, MICA/B, Mult1 и так далее) или их пептидных фрагментов является примером метода получения антител против лиганда NKG2D.

Моноклональные антитела, которые специфически связывают NKG2D или лиганд NKG2D, можно получать методами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975; патент США № 4376110; Ausubel et al., ред., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Colligan et al., ред., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N. Y., (1992, 1993), полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылок. Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, и к любому их подклассу. Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело по настоящему изобретению, можно культивировать in vitro, in situ или in vivo.

В другом варианте осуществления средством, ингибирующим активацию или сигнализацию NKG2D, является растворимый NKG2D. Растворимый NKG2D можно получать любым подходящим способом, известным в данной области (см., например, Diefenbach et al., Nat Immunol, vol. 1(2):119-26, 2000). В одном варианте осуществления растворимый NKG2D вводят субъекту любым подходящим маршрутом и способом доставки. В другом варианте осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимый NKG2D, можно вводить субъекту для лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями, диабетической ретинопатии и так далее). Кодирующая последовательность, которая кодирует растворимый белок NKG2D, может быть идентичной нуклеотидной последовательности с регистрационным номером 574240, либо также может быть другой кодирующей последовательностью, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода кодирует тот же полипептид, что и полинуклеотид с регистрационным № 574240. Другие молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, включают варианты природного гена NKG2D, такие как те, что кодируют фрагменты, аналоги и производные природного белка NKG2D. Такие варианты могут представлять собой, например, существующий в природе аллельный вариант природного гена NKG2D, гомолог природного гена NKG2D, или не существующий в природе вариант природного гена NKG2D. Эти варианты имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от природного гена NKG2D по одному или нескольким основаниям. Например, нуклеотидная последовательность таких вариантов может отличаться делецией, добавлением или заменой одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с природным геном NKG2D.

В еще одном варианте осуществления средство, ингибирующее активацию или сигнализацию NKG2D, может представлять собой растворимый лиганд NKG2D. Показано, что отделившиеся (растворимые) формы MICA/B ингибируют функцию NKG2D во всем организме. В таком варианте осуществления растворимый лиганд NKG2D или нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимый лиганд NKG2D, можно вводить субъекту для лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или заболевания, связанного с метаболической дисфункцией (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями, диабетической ретинопатии и так далее).

В других вариантах осуществления вариантные белки NKG2D или лиганды NKG2D (например, белки MICA/B, ULBP/RAET1 и так далее), имеющие существенные изменения в структуре, можно получать, создавая нуклеотидные замены, которые вызывают менее чем консервативные изменения в кодированном полипептиде. Примерами таких нуклеотидных замен являются те, которые вызывают изменения в (a) структуре полипептидного каркаса; (b) заряде или гидрофобности полипептида; или (c) основном объеме боковых цепей аминокислот. Нуклеотидные замены, которые, как правило, предположительно приведут к наибольшим изменениям в свойствах белка, являются такими, которые вызывают неконсервативные изменения в кодонах. Примерами изменений кодонов, которые, по всей вероятности, вызовут крупные изменения в структуре белка, являются те, которые приводят к замене (a) гидрофильного остатка, например, серина или треонина, на гидрофобный остаток, например, лейцин, изолейцин, фенилаланин, валин и аланин; (b) остатка цистеина или пролина на любой другой остаток; (c) остатка с электроположительной боковой цепью, например, лизина, аргинина или гистидина, на электроотрицательный остаток, например, глютамин или аспарагин; или (d) остатка с объемной боковой цепью, например, фенилаланина, на остаток, не имеющий боковой цепи, например, глицин.

Существующие в природе аллельные варианты природного гена Klrk1 или природных мРНК Klrk1, описанных в данном документе, представляют собой нуклеиновые кислоты, выделенные из тканей человека, имеющие по меньшей мере 75% (например, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99%) идентичности последовательности с природным геном Klrk1 или природными мРНК Klrk1, и кодирующие полипептиды, обладающие структурным сходством с природным белком Klrk1. Гомологи природного гена Klrk1 или природных мРНК Klrk1, описанных в данном документе, представляют собой нуклеиновые кислоты, выделенные из других видов, имеющие по меньшей мере 75% (например, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99%) идентичности последовательности с природным человеческим геном Klrk1 или природными человеческими мРНК Klrk1, и кодирующие полипептиды, обладающие структурным сходством с природным человеческим белком NKG2D. Можно проводить поиск в государственных и/или частных базах данных нуклеиновых кислот для нахождения других молекул нуклеиновых кислот, имеющих высокий процент (например, 70, 80, 90% или более) идентичности последовательности с природным геном Klrk1 или природными мРНК Klrk1.

Неприродные варианты гена или мРНК Klrk1 представляют собой нуклеиновые кислоты, не существующие в природе (например, созданные руками человека), имеющие по меньшей мере 75% (например, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99%) идентичности последовательности с природным человеческим геном Klrk1 или природными человеческими мРНК Klrk1, и кодирующие полипептиды, обладающие структурным сходством с природным человеческим белком NKG2D.

Примерами неприродных вариантов гена Klrk1 являются те, которые кодируют фрагмент белка NKG2D, те, которые гибридизуются с природным геном Klrk1 или комплементом природного гена Klrk1 в строгих условиях, те, которые имеют по меньшей мере 65% идентичности последовательности с природным геном Klrk1 или его комплементом, и те, которые кодируют слитый белок NKG2D.

Нуклеиновыми кислотами, кодирующими фрагменты природного белка NKG2D, описанного в данном документе, являются те, которые кодируют, например, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 или более аминокислотных остатков природного белка NKG2D. Более короткие олигонуклеотиды (например, имеющие 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 50 пар оснований в длину), которые кодируют или гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими фрагменты природного белка NKG2D, можно использовать в качестве зондов, праймеров или антисмысловых молекул. Нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты природного белка NKG2D, можно получать ферментативным расщеплением (например, с использованием ферментов рестрикции) или химической деградацией полноразмерного природного гена Klrk1, мРНК или кДНК Klrk1, либо вариантов вышеперечисленного. Используя нуклеотидную последовательность природного человеческого гена Klrk1 и аминокислотную последовательность природного белка NKG2D, о которых сообщалось ранее, специалисты в данной области смогут создать молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие незначительные вариации в их нуклеотидной последовательности, при помощи, например, стандартных методов мутагенеза нуклеиновых кислот или путем химического синтеза. Вариантные молекулы нуклеиновой кислоты Klrk1 можно экспрессировать для получения вариантных белков NKG2D.

В некоторых вариантах осуществления композиция для ингибирования диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или лечения аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее) содержит средство (например, антитело против NKG2D или антитело против лиганда NKG2D) для блокирования взаимодействия NKG2D с одним или несколькими из его лигандов (например, взаимодействия NKG2D/MICA/B), фармацевтически приемлемый носитель и известный препарат для лечения сердечно-сосудистого заболевания. Примером известного препарата для лечения сердечно-сосудистого заболевания является любой из ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (статинов). Примеры статинов включают церивастатин, флувастатин, аторвастатин, симвастатин, правастатин или ловастатин, либо их фармацевтически приемлемые соли. Композиции и способы с применением статинов известны в данной области (см., например, патент США № 6465454).

Результаты, приведенные в данном документе в примере 3, иллюстрируют, что блокирование взаимодействия связывания лиганда NKG2D при помощи анти-NKG2D антитела значительно подавляет образование атеросклеротических бляшек у ApoE-/- мышей с диабетом, из чего следует, что взаимодействие NKG2D/лиганд является критическим путем в развитии сердечно-сосудистого заболевания и может служить лекарственной мишенью для профилактики и лечения сердечно-сосудистого заболевания. Результаты, приведенные в данном документе в примерах 3 и 4, дополнительно иллюстрируют критическую роль взаимодействия NKG2D/лиганд при атеросклерозе и воспалении, установленную в исследованиях с использованием нокаутных по NKG2D мышей и анти-NKG2D антитела. Блокирование взаимодействия NKG2D/лиганд также ослабляет аномальные состояния метаболизма, в том числе снижает уровни холестерина и триглицеридов, что проиллюстрировано в примере 5. Дальнейшее сопоставление профилей экспрессии цитокинов в получавших анти-NKG2D антитело и контрольных группах продемонстрировало, что лечение с применением анти-NKG2D антитела значительно подавляло продукцию различных провоспалительных цитокинов, из чего следует, что оно действует, предотвращая сосудистое воспаление (см. пример 4). Результаты, приведенные в данном документе, также предполагают, что опосредованная комплексом NKG2D/лиганд иммунная активация играет роль в прогрессировании диабета 2 типа. В экспериментах, описанных в данном документе в примере 7, показано, что по сравнению с получавшими «западную диету» ApoE-/- мышами, дефицитные по NKG2D ApoE-/-Klrk1-/- мыши, получавшие такую же диету, имели гораздо более низкие уровни глюкозы в крови, что демонстрирует целесообразность использования в качестве мишени NKG2D или его лигандов для лечения диабета 2 типа. Кроме того, лечение с применением анти-NKG2D антитела было способно предотвращать развитие и прогрессирование гипергликемии и диабета в модели диабета 2 типа на грызунах, как описано в примере 8.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к лечению диабета 2 типа. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D у субъекта. Такие патологические состояния включают, например, диабет 2 типа, сердечно-сосудистое заболевание, воспалительное заболевание и/или аномальные метаболические состояния (например, высокий уровень холестерина, высокий уровень триглицеридов, дислипидемия, диабетическая ретинопатия, проблемы с конечностями, плохая циркуляция крови и так далее). В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является диабетом 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является сердечно-сосудистым заболеванием.

Типичный способ включает введение терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, для подавления диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или лечения аномальных метаболических состояний, а также фармацевтически приемлемого носителя субъекту. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D. Средство может быть любым из описанных выше, например, растворимым NKG2D, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, специфически связывающим NKG2D, растворимым лигандом NKG2D, антителом, специфичным для лиганда NKG2D, ингибитором активности или экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B). В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент снижает опосредованную NKG2D активацию или сигнализацию экспрессирующей NKG2D клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с по меньшей мере одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D. В некоторых вариантах осуществления лиганд NKG2D представляет собой MICA/B.

В некоторых вариантах осуществления введение средства приводит к по меньшей мере одному из следующих событий у субъекта: снижению уровней глюкозы в крови, улучшению толерантности к глюкозе, снижению резистентности к инсулину, уменьшению массы тела, снижению артериального давления, уменьшению воспаления или снижению метаболических дисфункций.

Терапевтические методы, описанные в данном документе (которые включают профилактическое лечение), в целом, включают введение терапевтически эффективного количества композиций, описанных в данном документе, субъекту (например, животному, человеку), нуждающемуся в этом, в том числе млекопитающему, в частности, человеку. Такое лечение подходит для применения к субъектам, в частности, людям, страдающим от, имеющим, подверженным или находящимся в группе риска по заболеванию, нарушению или их симптомам. Определение таких субъектов как «находящихся в группе риска» может быть сделано, исходя из любого объективного или субъективного результата диагностического теста либо на основании мнения субъекта или врача (например, генетического теста, ферментативного или белкового маркера (определенного в данном документе), семейного анамнеза и тому подобного). Композиции по данному документу можно также использовать в лечении любых других заболеваний, при которых может иметь место избыточная сигнализация, экспрессия или активность NKG2D.

В одном варианте осуществления способ лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее) у субъекта включает мониторинг хода лечения. Можно контролировать ход лечения, определяя уровень диагностического маркера (например, любой описанной в данном документе мишени, модулируемой композицией или средством, описанными в данном документе, белка или его индикатора и так далее), либо с помощью диагностического измерения (например, скрининга, теста) у субъекта, страдающего от, или подверженного заболеванию или его симптомам, связанным с диабетом 2 типа, сердечно-сосудистым заболеванием, воспалительным заболеванием и/или аномальными метаболическими состояниями (например, высоким уровнем холестерина, высоким уровнем триглицеридов, дислипидемией, диабетической ретинопатией, проблемами с конечностями, плохой циркуляцией крови и так далее), при котором субъекту было введено терапевтически эффективное количество композиции, описанной в данном документе, достаточное для лечения заболевания или его симптомов. Уровень маркера, определенный по данному способу, можно сравнивать с известными уровнями маркера либо у здоровых нормальных контролей, либо у других страдающих пациентов для установления статуса заболевания у субъекта. Как правило, второй уровень маркера у субъекта определяют в момент времени, более поздний, чем тот, когда определяют первый уровень, и оба уровня сравнивают для мониторинга течения заболевания или эффективности терапии. В некоторых вариантах осуществления предварительный уровень маркера у субъекта определяют до начала лечения, описанного в данном документе; этот предварительный уровень маркера затем можно сравнивать с уровнем маркера у субъекта после начала лечения для определения эффективности лечения.

Введение композиций, содержащих ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D (например, ингибитор MICA/B), растворимый NKG2D, растворимый лиганд(ы) NKG2D, антитело против NKG2D, антитело против лиганда NKG2D и так далее, для лечения диабета, сердечно-сосудистого заболевания (например, атеросклероза) и/или аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее) можно осуществлять любым подходящим способом, приводящим к концентрации терапевтического средства, которое в сочетании с другими компонентами является эффективным для облегчения, уменьшения или устранения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания (например, подавляет образование атеросклеротических бляшек), воспалительного заболевания и/или аномальных метаболических состояний (например, высокого уровня холестерина, высокого уровня триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее). Ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D (например, ингибитор MICA/B), растворимый NKG2D, растворимый лиганд(ы) NKG2D, антитело против NKG2D, антитело против лиганда NKG2D и так далее, может содержаться в любом подходящем количестве любого подходящего вещества носителя и, как правило, присутствует в количестве 1-95% по весу от общего веса композиции. Композицию можно предоставлять в лекарственной форме, подходящей для местного или системного введения (например, парентерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного или внутрибрюшинного). В некоторых вариантах осуществления композицию вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. Фармацевтические композиции можно составлять в соответствии с обычной фармацевтической практикой (см., например Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20^е издание), под редакцией A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, под редакцией J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).

Композиции, описанные в данном документе, можно вводить парентерально путем инъекции, инфузии или имплантации (подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной и тому подобных) в лекарственных формах, препаратах или с помощью подходящих устройств доставки или имплантатов, содержащих общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и адъюванты. Составление и приготовление таких композиций хорошо известно специалистам в области фармацевтики. Препараты можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, выше.

Композиции для парентерального применения можно предоставлять в форме единичной дозы (например, ампулы с одной дозой) или во флаконах, содержащих несколько доз, в которые можно добавлять соответствующий консервант (см. ниже). Композиция может находиться в форме раствора, суспензии, эмульсии, инфузионного устройства или устройства доставки для имплантации, либо ее можно предоставлять в виде сухого порошка для разведения в воде или другом подходящем растворителе перед использованием. Помимо активного средства композиция может содержать подходящие приемлемые для парентерального введения носители и/или эксципиенты. Активное терапевтическое средство(ва) можно заключать в микросферы, микрокапсулы, наночастицы, липосомы или тому подобное для контролируемого высвобождения. Кроме того, композиция может содержать суспендирующие, солюбилизирующие, стабилизирующие, регулирующие pH вещества, вещества, регулирующие тоничность, и/или диспергирующие вещества.

Как указано выше, фармацевтические композиции по изобретению могут находиться в форме, подходящей для стерильной инъекции. Для получения такой композиции подходящее активное терапевтическое средство(ва) растворяют или суспендируют в приемлемой для парентерального введения жидкой среде. Среди приемлемых сред и растворителей, подходящих для использования, можно назвать воду, воду, доведенную до подходящего значения pH путем добавления соответствующего количества соляной кислоты, гидроксида натрия или подходящего буфера, 1,3-бутандиол, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и раствор декстрозы. Водный препарат может также содержать один или несколько консервантов (например, метил-, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат). В случаях, когда одно из соединений является лишь умеренно или слаборастворимым в воде, можно добавлять улучшающее растворение или солюбилизирующее вещество, либо растворитель может содержать 10-60% по весу пропиленгликоля или тому подобного.

Материалы для использования в изготовлении микросфер и/или микрокапсул, представляют собой, например, биоразлагаемые/биоразрушаемые полимеры, такие как полигалактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2-гидроксиэтил-L-глютамин) и поли(молочная кислота). Биологически совместимыми носителями, которые можно использовать при составлении парентерального препарата с контролируемым высвобождением, являются углеводы (например, декстраны), белки (например, альбумин), липопротеины или антитела. Материалы для использования в имплантатах могут являться не биоразлагаемыми (например, полидиметилсилоксан) или биоразлагаемыми (например, поли(капролактон), поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) или поли(ортоэфиры), либо их сочетания).

По меньшей мере, два препарата для лечения сердечно-сосудистого заболевания (например, ингибитор NKG2D или MICA/B и статин) можно смешивать вместе в одном препарате.

Композиции, описанные в данном документе, можно также объединять со вторым или несколькими фармакологически активными веществами, например, выбранными из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. Примерами таких фармакологически активных веществ являются: GLP-1 и производные и аналоги GLP-1, GLP-2 и производные и аналоги GLP-2, эксендин-4 и производные и аналоги эксендина-4, амилин и производные и аналоги амилина, сульфонилмочевины, бигуаниды, меглитиниды, ингибиторы глюкозидазы, антагонисты глюкагона, ингибиторы DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторы SGLT2, ингибиторы SGLT1, ингибиторы печеночных ферментов, участвующих в стимуляции глюконеогенеза и/или гликогенолиза, модуляторы поглощения глюкозы, соединения, изменяющие метаболизм липидов, такие как антигиперлипидемические средства, например, ингибиторы HMG CoA (статины), соединения, снижающие потребление пищи, агонисты RXR и вещества, действующие на АТФ-зависимые калиевые каналы β-клеток; холестирамин, колестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол, декстротироксин, натеглинид, репаглинид; β-блокаторы, такие как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторы ACE (ангиотензинпревращающего фермента), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин; агонисты CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином), антагонисты NPY (нейропептида Y), агонисты PYY (полипептида YY), агонисты PP (панкреатического полипептида), агонисты рецептора Y2, агонисты рецептора Y4, агонисты смешанного рецептора Y2/Y4, агонисты адипонектина, агонисты PPAR, агонисты MC4 (меланокортина 4), антагонисты орексина, агонисты TNF (фактора некроза опухолей), агонисты CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонисты CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонисты урокортина, агонисты β3, агонисты MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонисты MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонисты CCK (холецистокинина), ингибиторы обратного захвата серотонина, ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанные серотониновые и норадренергические соединения, агонисты 5HT (серотонина), агонисты бомбезина, антагонисты галанина, гормон роста, соединения, высвобождающие гормон роста, агонисты TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторы UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонисты лептина, агонисты DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторы липазы/амилазы, модуляторы RXR (ретиноидного X-рецептора), агонисты TR β; антагонисты гистамина H3, гастрин и аналоги и производные гастрина, глюкагон и производные и аналоги глюкагона, FGF-21 (фактор роста фибробластов 21) и производные и аналоги FGF-21, ингибиторы протонного насоса, такие как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, а также активаторы глюкокиназы.

Следует понимать, что любое подходящее сочетание композиций по изобретению с одним или несколькими из вышеупомянутых соединений и, возможно, одним или несколькими другими фармакологически активными веществами считается находящимся в рамках настоящего изобретения.

Хотя многие из композиций, способов и наборов, описанных выше, относятся к лечению диабета 2 типа и сердечно-сосудистого заболевания, композиции и способы, описанные в данном документе, можно также использовать для профилактики любого связанного с метаболической дисфункцией заболевания у субъекта, включая диабет 2 типа и сердечно-сосудистые заболевания. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению способны предотвращать или ликвидировать симптомы заболевания, отодвигать начало проявления симптомов заболевания или снижать тяжесть заболевания.

В других вариантах осуществления композиции и способы, описанные в данном документе, можно использовать для выявления, профилактики и/или лечения любого связанного с метаболической дисфункцией заболевания у субъекта, независимо от того, имеет ли субъект диабет 2 типа. Например, в данном документе описан способ выявления повышенных уровней холестерина и триглицеридов у субъекта, и он включает получение биологического образца от субъекта; создание контакта биологического образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии лиганда NKG2D (например, экспрессии MICA/B); измерение уровня экспрессии лиганда NKG2D в биологическом образце; и установление корреляции между избыточной экспрессией лиганда NKG2D (например, MICA/B) и предрасположенностью к появлению повышенных уровней холестерина и триглицеридов, либо наличием повышенных уровней холестерина и триглицеридов у субъекта. Способ лечения субъекта (который может иметь или не иметь диабет 2 типа), имеющего повышенные уровни холестерина и триглицеридов, включает введение терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, для снижения уровней холестерина и триглицеридов и фармацевтически приемлемого носителя субъекту. В качестве другого примера в данном документе описан способ лечения субъекта, страдающего диабетической ретинопатией. Такой способ включает введение терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, для ингибирования диабетической ретинопатии и фармацевтически приемлемого носителя субъекту. Средство, ингибирующее активацию или сигнализацию NKG2D, для ингибирования диабетической ретинопатии или снижения уровней холестерина и триглицеридов может быть любым из описанных выше, например, растворимым NKG2D, антителом, специфичным для NKG2D, растворимым лигандом NKG2D, антителом, специфичным для лиганда NKG2D, ингибитором активности или экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B) и так далее. Средство и фармацевтически приемлемый носитель можно упаковывать в набор, описанный выше.

В дополнительных вариантах осуществления композиции способы для лечения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией (например, высоких уровней холестерина, высоких уровней триглицеридов, дислипидемии, плохой циркуляции крови, проблем с конечностями, диабетической ретинопатии и так далее), могут включать средство, стимулирующее отделение лиганда NKG2D от поверхности клеток. Лиганды NKG2D часто отщепляются от поверхности клеток в результате действия протеаз (так называемое «сбрасывание») и, как правило, считается, что такое сбрасывание ингибирует сигнализацию NKG2D за счет связывания отделенного лиганда NKG2D и понижающей регуляции активности NKG2D (например, сигнализации). Любое вещество, которое стимулирует или ингибирует сбрасывание, способно модулировать сигнализацию и активность NKG2D и может быть использовано в таком варианте осуществления. Например, антитела или антигенсвязывающий фрагмент, направленные против белка, принимающего участие в сбрасывании, можно вводить субъекту в количестве, эффективном для стимулирования сбрасывания по меньшей мере одного лиганда NKG2D.

Кроме того, композиции, наборы и способы, описанные в данном документе, можно использовать для профилактики заболевания, связанного с метаболической дисфункцией, у субъекта. Например, врач может применять композиции и способы, описанные в данном документе, к субъекту, имеющему предрасположенность к сердечно-сосудистому заболеванию и/или заболеванию, связанному с метаболической дисфункцией, либо вследствие семейного анамнеза (генетики), либо из-за факторов окружающей среды (например, питания, малоподвижного образа жизни и так далее).

Композиции, описанные выше, предпочтительно водят субъекту (например, человеку) в эффективном количестве, то есть количестве, способном обеспечить желаемый результат у проходящего лечение субъекта (то есть ингибирование или профилактику диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, такого как атеросклероз, снижения уровня глюкозы в крови и стимуляцию снижения массы тела у пациента с диабетом 2 типа, снижения уровней холестерина или триглицеридов у субъекта, снижения резистентности к инсулину у субъекта, профилактику или облегчение дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее, у субъекта). Токсичность и терапевтическую эффективность композиций, описанных в данном документе, можно определять стандартными фармацевтическими методами. Как хорошо известно, в области медицины и ветеринарии, дозировка для любого животного зависит от многих факторов, включая размер субъекта, площадь поверхности тела, возраст, особенности композиции, которая будет вводиться, время и маршрут введения, общее состояние здоровья, а также другие лекарственные средства, вводимые параллельно.

Количество терапевтического средства, которое будет введено, варьируется в зависимости от способа введения, возраста и массы тела пациента, а также клинических симптомов рака. Композиции, описанные в данном документе, как правило, вводят в дозе, которая ингибирует активность и/или сигнализацию NKG2D, что можно анализировать, обнаруживая уменьшение образования атеросклеротических бляшек, уровней глюкозы в крови, массы тела, уровней холестерина, уровней триглицеридов, резистентности к инсулину и так далее, либо используя любой анализ, который позволяет измерить экспрессию или биологическую активность лиганда NKG2D (например, MICA/B или ULBP/RAET1), либо активность или сигнализацию NKG2D.

В данном документе описаны наборы для обнаружения лигандов NKG2D (например, белков MICA/B или ULBP/RAET1) в биологическом образце от субъекта (например, человека) с целью выявления наличия или прогнозирования возникновения диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и/или аномальных метаболических состояний (например, высоких уровней холестерина, высоких уровней триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее) у субъекта. Типичный набор включает по меньшей мере один реагент для обнаружения экспрессии лиганда NKG2D (например, MICA/B или ULBP/RAET1) в биологическом образце от субъекта и инструкции по применению. В одном варианте осуществления набор включает моноклональное или поликлональное антитело к белку ULBP/RAET1 или к MICA/B, детектируемую метку и инструкции по применению. Как правило, биологическим образцом является сыворотка. Однако можно использовать любой подходящий биологический образец. Примеры дополнительных биологических образцов включают кровь, плазму, мочу, слюну, кожу и образцы биопсии.

В данном документе также описаны наборы для применения лечения к субъекту (например, человеку), имеющему диабет или любые патологические состояния, которые можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, такие как диабет 2 типа, сердечно-сосудистое заболевание, воспалительное заболевание и/или аномальные метаболические состояния (например, высокий уровень холестерина, высокий уровень триглицеридов, дислипидемия, диабетическая ретинопатия, проблемы с конечностями, плохая циркуляция крови и так далее). В одном варианте осуществления набор включает терапевтическую или профилактическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество средства для блокирования взаимодействия NKG2D и одного или нескольких из его лигандов (например, взаимодействие NKG2D/MICA/B, взаимодействие NKG2D и одного из белков ULBP/RAET1 и так далее) или для ингибирования активации или сигнализации NKG2D и фармацевтически приемлемый носитель в форме единичной дозы. Средство может представлять собой растворимый NKG2D, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D, лиганд NKG2D и ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает человеческий NKG2D (hNKG2D).

При желании, набор также содержит эффективное количество известного препарата для лечения сердечно-сосудистого заболевания (например, статина) и/или препарата для лечения аномального метаболического состояния (например, высоких уровней холестерина, высоких уровней триглицеридов, дислипидемии, диабетической ретинопатии, проблем с конечностями, плохой циркуляции крови и так далее).

В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно включает по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

Как правило, описанный в данном документе набор включает упаковку и инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления набор включает стерильный контейнер, содержащий терапевтическую или профилактическую композицию; такие контейнеры могут представлять собой коробки, ампулы, бутылки, флаконы, тюбики, пакеты, мешки, блистерные упаковки, либо другие подходящие формы контейнеров, известные в данной области. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластмассы, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, пригодных для хранения медикаментов.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими конкретными примерами. Примеры приведены только для иллюстрации, и никоим образом не должны быть истолкованы как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Обнаружение MICA, лиганда для NKG2D, в сыворотках и атеросклеротических бляшках пациентов с диабетом 2 типа, и его связь с экспрессией других провоспалительных цитокинов

Для определения того, может ли метаболическая дисфункция вызывать повышенную регуляцию некоторых иммуностимулирующих молекул стрессовой реакции, оценивали экспрессию MICA/B в группе пациентов с диабетом 2 типа, которые имели подтвержденный диабет, и некоторые из них также имели дислипидемию. Пациенты с диабетом 1 типа не были включены, поскольку у них преимущественно были аутоиммунные заболевания, и у них могла наблюдаться повышенная регуляция MICA независимо от метаболического состояния, что следует из исследований, проведенных с мышами линии NOD с диабетом 1 типа (Ogasawara et al., Immunity, 20:757-767 (2004)). Поскольку было нереально анализировать экспрессию MICA/B на кровеносных сосудах пациентов, анализировали уровни растворимых белков MICA (sMICA) в крови. Молекулы sMICA представляют собой продукты ферментативного расщепления мембранного MICA (mMICA), экспрессированного на клеточной поверхности, и, как сообщалось ранее, обнаруживаются в крови пациентов с различными видами рака и у пациентов с иммунными заболеваниями, но не у здоровых людей. Вследствие этого, обнаружение sMICA в крови пациентов с диабетом будет указывать на повышенную регуляцию MICA в кровеносных сосудах или других тканях.

Двадцать два пациента были протестированы, и повышенные уровни sMICA были обнаружены у значительного числа из них (фиг.1A). Из 22 пациентов, шесть (27%) имели сывороточный MICA на уровнях, выше, чем 400 пг/мл с максимальным значением 12250 пг/мл (фиг.1A, пациенты № 1-6). Кроме того, четыре пациента (18%) имели поддающиеся определению уровни сывороточного sMICA (50-350 пг/мл) (фиг.1A, пациенты № 7-10). Для определения того, насколько уровни sMICA у пациентов с диабетом сравнимы с таковыми у пациентов с раком, также тестировали 50 образцов сыворотки от различных пациентов с раком. Пациенты с диабетом 2 типа имели более существенно повышенные уровни белков sMICA, чем пациенты с раком, так как уровни sMICA у всех 50 пациентов с раком были ниже 20 пг/мл (фиг.1E). Хотя уровни sMICA у пациентов с раком сильно варьировались в зависимости от вида и стадии рака, уровни у пациентов с диабетом 2 типа всегда были более высоки по сравнению с уровнями sMICA пациентов с раком, о которых сообщалось в литературе (Salih et al., J Immunol., 169:4098-4102 (2002); Groh et al., Nature, 419:734-738 (2002)).

Принимая во внимание, что у этих пациентов был диагностирован диабет в течение 1-20 лет при различном состоянии здоровья, не удивительно, что они имели различные уровни sMICA. Несмотря на различия, были обнаружены определенные тенденции, связанные с высоким уровнем сывороточного sMICA, особенно при сравнении пациентов с высоким уровнем MICA с MICA-отрицательными пациентами. В частности, средний уровень глюкозы в крови был выше у пациентов с высоким уровнем MICA, чем у MICA-отрицательных пациентов (190±65 против 157±47; p=0,1). Высокие уровни белков sMICA в крови указывали на то, что мембранный MICA был экспрессирован на клетках определенных типов, что, в случае артерий, может влиять на сосудистое воспаление через взаимодействие с его рецептором NKG2D, экспрессированным на различных иммунных клетках. Следует отметить, что хотя как мембранная, так и растворимая формы белков MICA связываются с NKG2D, они по-разному влияют на иммунную активацию. Взаимодействие NKG2D/mMICA активирует иммунные клетки, тогда как взаимодействие NKG2D/sMICA не активирует. Действительно, sMICA может препятствовать опосредованной взаимодействием NKG2D/mMICA иммунной активации из-за конкуренции с mMICA за связывание NKG2D. Вследствие этого, был проведен анализ экспрессии некоторых связанных с воспалением цитокинов, и факторов в сыворотках пациентов с диабетом и сделана попытка установить их корреляцию с экспрессией растворимого MICA.

Уровни цитокинов IL-6, TNF-α, IL-1β, интерферона-γ (IFN-γ) и C-реактивного белка (CRP) в сыворотках тех же пациентов с диабетом были оценены для определения того, связана ли повышенная регуляция sMICA с любым из этих параметров (фиг.1B-D). Уровни IL-1β и IFN-γ были ниже предела обнаружения анализов. Не было корреляции между уровнями sMICA/B и TNF-α или CRP (фиг.1A, C и D), из чего следует, что экспрессия MICA регулируется иным образом, нежели у TNF-α или CRP, двух четко определенных маркеров воспаления. Интересно, что существует обратная корреляция между экспрессией sMICA/B и IL-6 в сыворотках (фиг.1A и B). Сывороточный уровень IL-6 в MICA-положительной группе (пациенты № 1-10) был значительно ниже, чем уровень в MICA-отрицательной группе (пациенты № 11-22) (1,21±0,51 нг/мл против 1,85±1,13 нг/мл, P=0,05), что указывало на взаимозависимое отношение между этими двумя факторами.

В совокупности, эти данные демонстрируют, что молекулы MICA/B характеризуются повышенной регуляцией у пациентов с диабетом 2 типа, и могут быть причастны к сосудистому воспалению и атеросклерозу. Хотя высокий уровень sMICA четко указывает на повышенную регуляцию MICA у пациентов с диабетом, чистый эффект повышенной регуляции MICA на воспаление и атеросклероз зависит от относительного вклада растворимого и мембранного белков MICA. Возникновение sMICA обычно является механизмом компенсации взаимодействия mMICA/NKG2D для регуляции иммунной активации. Вследствие этого, использовали модели на мышах для прямой оценки повышенной регуляции лигандов NKG2D в артериях и ее важности для воспаления и атеросклероза.

Для дальнейшего установления клинической значимости экспрессии лиганда NKG2D, проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов атеросклеротических аорт пациентов-людей, чтобы определить, повышена ли регуляция лигандов NKG2D в этих тканях. В отличие от аорт без бляшек (фиг.2I), много клеток в атеросклеротических аортах положительно окрашивались антителом к MICA/B (фиг.2A, C, E и G). Перекрывающиеся картины окрашивания MICA/B и Mac-3 или CD31 в соседних срезах свидетельствовали о том, что как макрофаги, так и эндотелиальные клетки атеросклеротических аорт экспрессировали MICA/B (фиг.2B, D, F, H), из чего следует, что у людей в пораженных тканях имеют место аналогичные паттерны экспрессии лигандов NKG2D.

Пример 2

Повышенная регуляция лигандов NKG2D в клетках атеросклеротических бляшек и других тканях ApoE-/- мышей

Для прямой проверки того, повышена ли регуляция лигандов для NKG2D в кровеносных сосудах мышей с диабетом и дислипидемией, экспрессию лигандов NKG2D определяли у ApoE-/- мышей, животной модели дислипидемии и атеросклероза. Хорошо известно, что хронический дисфункциональный метаболизм у ApoE-/-мышей приводит к развитию атеросклеротических бляшек, в которых иммунные клетки составляют значительную часть. У этих мышей нарушен липидный метаболизм и с возрастом развивается атеросклероз. Анализировали повышенную регуляцию лигандов NKG2D в аортах ApoE-null мышей, у которых развивались атеросклеротические бляшки.

Во-первых, анализировали экспрессию мРНК лигандов NKG2D в аортах 8-10 месячных ApoE-/- мышей (без индукции диабета), имеющих атеросклеротические бляшки в аорте, особенно в областях дуги. Как видно из фиг.3A, для конкретного определения того, имеют ли поражения в виде бляшек различные уровни экспрессии лигандов NKG2D, выделяли РНК отдельно из дуги атеросклеротической аорты («с бляшками») и грудного отдела аорты, не имеющего видимых бляшек («без бляшек») у 8-10 месячных ApoE-/- мышей без диабета («атеросклеротические ApoE-/-»). РНК из соответствующих частей аорты от 2-месячных ApoE-/- мышей без бляшек использовали в качестве контролей («ApoE-/- без бляшек»). Чтобы более конкретно определить повышенную регуляцию различных индивидуальных лигандов NKG2D, использовали специфичные для изоформ праймеры для различных изоформ генов Rae-1, а также генов H60 и Mult-1. Rae-1, H60 и MULT-1 все являются лигандами NKG2D, принадлежащими к различным семействам (Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000); Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)). У мышей имеется пять близкородственных генов Rae-1 (>98% идентичности) и были идентифицированы три различные изоформы генов H60 (H60a, b и c) (Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000); Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)). Транскрипты для Rae-1δ, Rae-1ε и H60 анализировали полуколичественной радиоактивной ОТ-ПЦР. Вкратце, образцы РНК были обратно транскрибированы при помощи обратной транскриптазы РНКазы Н Superscript II с использованием олиго-dT праймеров. Продукты ОТ серийно разводили (каждый раз 5-кратно) и подвергали ПЦР, используя геноспецифичные праймеры в присутствии P³²-дЦТФ. Применяемые праймеры были основаны на известных последовательностях генов (Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000); Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)). Проводили электрофорез продуктов ПЦР в полиакриламидном геле, который затем высушивали, и экспонировали на экран Phospho-Image. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки.

По сравнению с контрольными образцами транскрипты для Rae-1δ, Rae-1ε и H60b отличались значительной повышенной регуляцией в областях бляшек ApoE-null мышей с атеросклерозом (фиг.3A). По сравнению с более молодыми ApoE-null контрольными животными без атеросклероза, было обнаружено вплоть до 100-кратного увеличения транскриптов Rae-1δ, Rae-1ε и H60b в областях бляшек (фиг.3A). Даже при сравнении части аорты без бляшек от той же мыши было обнаружено 10-20-кратное увеличение генов Rae-1δ, Rae-1ε и H60β в области бляшек (фиг.3A). В области аорты без бляшек у старых ApoE-/- мышей наблюдали умеренную повышенную регуляцию Rae-1δ и ε по сравнению с соответствующей областью у молодых ApoE-/- мышей без атеросклероза. Гораздо более высокие уровни транскриптов для лигандов NKG2D Rae-1δ, Rae-1ε и H60b (10-30-кратное увеличение) также обнаруживали в дугах аорт получавших «западную диету» (WD) ApoE^-/- мышей, чем у подобранных по возрасту контролей дикого типа (WT) (фиг.3B). Эти данные свидетельствуют, что некоторые клеточные компоненты атеросклеротических бляшек отличаются очень сильной повышенной регуляцией экспрессии лигандов NKG2D.

Для дальнейшего подтверждения повышенной регуляции лигандов NKG2D в бляшках проводили иммуногистохимическое окрашивание замороженных срезов атеросклеротических бляшек ApoE-null мышей поликлональными антителами против Rae-1 и H60. Поскольку диабет и «западная диета» с высоким содержанием жира ускоряют образование бляшек, и могут играть роль в повышенной регуляции лигандов NKG2D, также изучали бляшки у ApoE-null мышей с индуцированным инъекцией стрептозотоцина (STZ) диабетом, либо получавших в качестве корма «западную диету». Как видно из фиг.3C, в случае воздействия STZ, у шестинедельных ApoE-null мышей (Jackson Lab, Bar Harbor, Maine) развитие диабета индуцировали внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (STZ) (55 мг/кг массы тела, растворенного непосредственно перед использованием в цитратном буфере с pH 4,5) в течение шести последовательных дней и подтверждали измерением концентрации глюкозы в крови (>300 мг/дл). Через два месяца после индукции диабета аорты выделяли, и замораживали. Замороженные срезы окрашивали поликлональным антителом козы против Rae-1 или H60 (R&D Systems и Santa Cruz Biotechnology, соответственно), с последующей обработкой конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом осла против IgG козы и системой окрашивания ABC-HRP для обнаружения положительного окрашивания (коричневая окраска) (Santa Cruz Biotechnology). Срезы дополнительно окрашивали моноклональным антителом крысы против CD68 мыши (Serotec), с последующей обработкой конъюгированным со щелочной фосфатазой (AP) антителом осла против иммуноглобулинов крысы и набором для окрашивания ABC-AP (синяя окраска) (Vector Laboratory). В случае модели атеросклероза с использованием ApoE-/-мышей, получавших «западную диету», шестинедельных ApoE-null мышей переводили с нормального корма на «западную диету». Через два месяца кормления «западной диетой» аорты выделяли, замораживали, и анализировали при помощи окрашивания антителами против Rae-1 и H60 (фиг.3D).

Положительное окрашивание как на Rae-1, так и на H60 было хорошо заметно на срезах областей бляшек, но гораздо меньше в средней оболочке или адвентициальной оболочке областей дуги атеросклеротических аорт ApoE-null мышей как с диабетом, так и без диабета (фиг.3C и 3D). В качестве контролей, практически никакого окрашивания на Rae-1 или H60 не было обнаружено в свободных от бляшек областях аорты у тех же мышей (фиг.3D, нижние панели). Окрашивание на CD68, маркер для тканевых резидентных макрофагов, значительно перекрывалось с окрашиванием на RAE-1 и H60, свидетельствуя о том, что инфильтрирующие бляшки макрофаги являлись по меньшей мере одной клеточной популяцией из бляшек, экспрессирующей лиганды NKG2D, что было дополнительно подтверждено анализом методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на макрофагах, непосредственно выделенных из атеросклеротических аорт (фиг.3E). Кроме того, эндотелиальные клетки, выделенные из аорт ApoE-/- мышей с атеросклерозом, также демонстрировали повышенную экспрессию Rae-1 (фиг.3E).

Учитывая дефектный метаболизм животных, макрофаги ApoE-/- мышей, по всей вероятности, имели повышенную регуляцию лигандов NKG2D в ответ на увеличение аномальных метаболитов в крови и тканях. Вследствие этого, определяли, могут ли макрофаги быть индуцированы в in vitro культуре окисленным LDL (oxLDL) или конечными продуктами усиленного гликозилирования (AGE), двумя аномальными метаболитами, связанными с дислипидемией и диабетом. Как показано, у макрофагов мышей дикого типа значительно повышалась регуляция экспрессии ими различных лигандов NKG2D на уровне как транскриптов, так и белков, при культивировании в присутствии oxLDL и AGE (фиг.3F-H). Как видно из фиг.3F, через 2 дня культивирования мРНК выделяли из по-разному обработанных макрофагов, обратно транскрибировали для получения кДНК, которые пятикратно серийно разводили, и подвергали ПЦР для определения лигандов NKG2D Rae-1δ, Rae-1ε и H60b. Как видно из фиг.3G, макрофаги, обработанные таким же образом, как на и фиг.3F, лизировали, разделяли в ПААГ-гелях, и анализировали вестерн-блоттингом с анти-Rae1 антителом, которое реагирует со всеми изоформами молекул Rae-1. Как видно из фиг.3H, макрофаги дикого типа, культивированные с oxLDL или AGE, также имели на клеточной поверхности более высокие уровни окрашивания на Rae-1, согласно данным анализа методом проточной цитометрии. Окрашивание Rae-1 вытеснялось неокрашенными «холодными» анти-RAE-1 антителами, что подтверждало специфическую повышенную регуляцию лиганда NKG2D (фиг.3H).

В совокупности, данные эксперименты демонстрировали повышенную регуляцию различных лигандов NKG2D в артериях мышей с нарушением метаболизма липидов и/или глюкозы. Масштабная повышенная регуляция лигандов NKG2D в бляшках предполагала непосредственную роль лигандов NKG2D в распространении сосудистого воспаления и атеросклероза. Интересно, что только клетки в бляшках, такие как макрофаги, имели наиболее масштабную повышенную регуляцию транскриптов и белков лигандов NKG2D. С учетом того, что многие клетки в бляшках активируются в ответ на липидные компоненты, эти данные показывают, что повышенная регуляция лигандов NKG2D, по всей вероятности, индуцируется как через отвечающие за стресс пути, так и через пути иммунной активации в клетках различных типов.

Пример 3

Подавление образования бляшек у ApoE-null мышей путем блокады взаимодействия NKG2D/лиганд моноклональными анти-NKG2D антителами или нокаута NKG2D

Повышенная регуляция лиганда NKG2D в артериях, особенно в бляшках, может активировать экспрессирующие NKG2D иммунные клетки для стимуляции сосудистого воспаления и атеросклероза. Для проверки этого, моноклональное анти-NKG2D антитело (клон MI-6) водили инъекцией ApoE-null мышам с диабетом для блокирования потенциального взаимодействия NKG2D/лиганды, и определяли, может ли такая блокада подавлять образование бляшек. Как показано, инъекция анти-NKG2D антитела блокировала взаимодействие NKG2D/лиганд у мышей без делеции экспрессирующих NKG2D иммунных клеток (Jamieson and Raulet, неопубликованные данные). У шестинедельных гомозиготных самцов ApoE-null мышей на генетической основе C57BL/6 индуцировали диабет инъекцией STZ для ускорения образования бляшек. За одну неделю и три дня до введения STZ ApoE-null мышам внутрибрюшинной инъекцией вводили 200 микрограмм/инъекцию моноклонального анти-NKG2D антитела (клон MI-6, IgG2a крысы). В контрольной группе на мышей воздействовали аналогичным образом, за исключением того, что они получали подобранное по изотипу контрольное антитело вместо анти-NKG2D антитела. Мышей содержали на нормальном корме в течение восьми недель после индукции диабета, и в течение данного периода мышам вводили анти-NKG2D или контрольные антитела один раз в неделю на всем протяжении эксперимента. Через неделю после последней инъекции антител мышей умерщвляли, и анализировали на наличие атеросклеротических повреждений в аорте.

По сравнению с мышами, которым вводили подобранные по изотипу контрольные антитела, у ApoE-null мышей с диабетом, которым вводили анти-NKG2D антитело, наблюдали резкое уменьшение образования бляшек (фиг.4). Из всех семи получавших анти-NKG2D антитело и восьми получавших контрольное антитело мышей (в трех отдельных экспериментах), размеры бляшек у получавших анти-NKG2D антитело мышей всегда были значительно меньше, чем таковые у мышей, получавших контрольное антитело (фиг.4A). Для дальнейшего определения степени подавления образования бляшек, проводили анфас окрашивание аорт красителем Oil Red O для выявления отложений липидного содержимого у пяти из семи получавших анти-NKG2D антитело и у шести из восьми получавших контрольное антитело мышей (из двух отдельных экспериментов). Наблюдали обширное окрашивание oil red O в областях дуги аорты у получавших контрольное антитело мышей (фиг.4B, три справа). Напротив, окрашивание было гораздо менее интенсивным у получавших анти-NKG2D антитело мышей (фиг.4B, два слева), что дополнительно свидетельствовало о том, что блокада анти-NKG2D антителом подавляла отложение липидов и образование бляшек. В среднем, положительная по окрашиванию Oil Red O площадь была примерно в пять раз меньше у получавших анти-NKG2D антитело мышей по сравнению с контролями (фиг.5A).

В подтверждение того, что воздействие антитела к NKG2D специфически блокировало NKG2D, не вызывая делецию экспрессирующих NKG2D клеток, было обнаружено, что у получавших анти-NKG2D антитело и контрольное антитело мышей были одинаковые количества NK1.1 + NK клеток и NKT клеток и, что NK клетки получавших анти-NKG2D антитело мышей нормально экспрессировали NKG2D. Кроме того, воздействие анти-NKG2D антитела не приводило к глобальной энергии экспрессирующих NKG2D иммунных клеток. В in vitro анализах NK клетки от получавших анти-NKG2D антитело мышей отвечали на стимуляцию анти-NK1.1 антителом, экспрессируя интерферон-γ так же эффективно, как и клетки получавших контрольное антитело мышей. В совокупности, данные эксперименты демонстрировали, что опосредованная взаимодействием NKG2D/лиганд иммунная активация играет важную роль в атеросклерозе, и блокада такого взаимодействия подавляет атеросклероз.

Для подтверждения критически важной роли взаимодействия NKG2D/лиганд при атеросклерозе ApoE-/- мышей скрещивали с нокаутными по NKG2D мышами для получения мышей с двойным нокаутом ApoE/NKG2D (ApoE-/-KLRK1-/-). Использовали две модели для тестирования эффекта двойного нокаута ApoE/NKG2D на развитие атеросклероза. Первая модель представляла собой индуцированный STZ диабет, как и та, что использовали в анализе блокады с помощью анти-NKG2D антитела (фиг.4). Вторая модель представляла собой ускоренный за счет «западной диеты» атеросклероз, при этом мыши получали диету с высоким содержанием жира, начиная с возраста шесть недель. Через восемь-десять недель после начала диабета или начала получения «западной диеты» ApoE-/-KLRK1-/- мышей анализировали на образование бляшек на аорте путем анфас окрашивания красителем Oil Red O. По сравнению с подвергавшимися аналогичному воздействию ApoE-/-KLRK1 +/+ мышами, у ApoE-/-KLRK1-/- мышей как с диабетом, так и получавших «западную диету», были значительно уменьшены размеры бляшек, судя по площадям, положительным по окрашиванию Oil Red O (фиг.5B и C). Данные результаты предоставили генетические доказательства важной роли взаимодействия NKG2D/лиганд при атеросклерозе. Кроме того, они также предоставили доказательства широкого вовлечения этого взаимодействия в развитие как диабета, так и связанного с дислипидемией атеросклероза, что предполагает потенциальное использование данного молекулярного взаимодействия в качестве мишени при лечении и профилактике атеросклероза различного происхождения.

Пример 4

Блокада взаимодействия NKG2D/лиганд снижает экспрессию провоспалительных цитокинов у ApoE-null мышей с атеросклерозом

Поскольку взаимодействие NKG2D/лиганд опосредует иммунную активацию в экспрессирующих NKG2D иммунных клетках различного типа, подавление атеросклероза с помощью блокады анти-NKG2D антителом предполагает, что оно действует через ингибирование воспаления. Для проверки этого, сыворотки от получавших анти-NKG2D и контрольное антитело ApoE-/- мышей с диабетом собирали во время анализа бляшек, и анализировали уровни различных провоспалительных цитокинов в сыворотках, наряду с сыворотками других контрольных мышей, используя 7-компонентный набор мышиных провоспалительных цитокинов (Meso Scale Discovery). Из 7 изучаемых цитокинов пять (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-10 и IL-12p70) присутствовали в меньшем количестве у получавших анти-NKG2D антитело мышей по сравнению с мышами, получавшими контрольное антитело (фиг.6). Следует особо отметить, что уровень IL-6 был значительно снижен до уровней соответствующих по возрасту здоровых B6 мышей дикого типа или молодых ApoE-/- мышей, у которых не было дислипидемии или диабета (более чем 10-кратное уменьшение, P<0,001). Количество TNF-α было сокращено до не поддающихся обнаружению уровней у получавших анти-NKG2D антитело мышей. Эти данные продемонстрировали, что блокирование с помощью антитела взаимодействия NKG2D/лиганд подавляло воспаление у ApoE-/- мышей с диабетом и предотвращало атеросклероз.

Уменьшение содержания IL-6 у получавших анти-NKG2D антитело мышей коррелирует с обратным соотношением растворимого MICA и IL-6 в сыворотке пациентов с диабетом (фиг.1). Учитывая, что как анти-NKG2D антитело, так и sMICA действуют, препятствуя опосредованной NKG2D иммунной активации, высокие уровни sMICA у пациентов-людей могут быть естественным механизмом для подавления воспаления.

Пониженную продукцию провоспалительных цитокинов также наблюдали у KLRK1-/-ApoE-/- мышей. По сравнению с ApoE-/- мышами с достаточным количеством NKG2D, имеющими диабет или получавшими «западную диету», у подвергшихся аналогичному воздействию KLRK1-/-ApoE-/- мышей были пониженные уровни в сыворотке большинства провоспалительных цитокинов (фиг.7). Количество различных воспалительных цитокинов (IL-6, IFN-γ, IL-12 и TNF-α) также было снижено в сыворотке получавших антитело к NKG2D KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Примечательно, что во всех моделях уровни IL-6 и IFN-γ были резко снижены. В совокупности, данные результаты свидетельствуют, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд подавляет воспаление, и уменьшает атеросклероз.

Пример 5

Предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд облегчает аномальные метаболические состояния у ApoE-/- мышей

Помимо уменьшения атеросклероза и воспаления, предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд также значительно облегчает метаболические нарушения. Составляя разительный контраст с мутными сыворотками от получавших «западную диету» ApoE-/- мышей, сыворотки получавших аналогичное питание KLRK1-/-ApoE-/- мышей были прозрачными (фиг.8A), что указывало на пониженное накопление липидных компонентов в их крови. В подтверждение этого, сывороточные уровни холестерина и триглицеридов были значительно ниже у KLRK1-/-ApoE-/- мышей, чем у ApoE-/- мышей (фиг.8B). Учитывая, что аномальное состояние липидного метаболизма вносит вклад непосредственно в атеросклероз, и стимулирует воспаление, данные результаты свидетельствуют о том, что взаимодействие NKG2D/лиганд воспроизводит положительный цикл обратной связи воспаления и метаболической дисфункции для поддержания прогрессирования атеросклероза.

В целом, эти результаты показывают, что связанная с аномальным метаболическим состоянием повышенная регуляция лигандов NKG2D критическим образом вовлечена в развитие атеросклероза, и ингибирование взаимодействия NKG2D/лиганд подавляет прогрессирование заболевания, уменьшая воспаление и облегчая нарушения, связанные с аномальным метаболизмом, что создает привлекательную терапевтическую мишень в лечении от атеросклероза.

Пример 6

Предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд подавляет печеночное воспаление у ApoE-/- мышей

Исходя из пониженных сывороточных уровней холестерина и триглицеридов у получающих «западную диету» нокаутных по NKG2D ApoE^-/- мышей, можно предположить, что опосредованная взаимодействием NKG2D/лиганд иммунная активация усиливает метаболические дисфункции. Поскольку печень является основным органом метаболизма липидов, опосредованное взаимодействием NKG2D/лиганд воспаление, очевидно, усугубляет аномальные метаболические состояния путем нарушения функции. Действительно, по сравнению с ApoE^-/- мышами, у нокаутных по NKG2D ApoE^-/- мышей наблюдается гораздо более низкая активность сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) (фиг.9), что указывает на облегчение печеночной дисфункции. Активности ALT в сыворотке определяли при помощи набора от Bioo Scientific (Austin, TX) в соответствии с инструкцией производителя. В каждой группе использовали по меньшей мере 5 мышей. **P<0,01.

Было протестировано, приводит ли предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд к снижению воспаления печени. По сравнению с таковыми от ApoE^-/- мышей, печеночные эксплантаты нокаутных по NKG2D ApoE^-/- мышей, культивируемые ex vivo, продуцировали значительно меньше IL-6, что указывало на меньшую степень воспаления (фиг.10A). Кроме того, по сравнению с таковыми от ApoE^-/- мышей, число различных иммунных клеток, включая макрофаги, NKT и NK клетки, было во всех случаях снижено в печени нокаутных по NKG2D ApoE^-/- мышей (фиг.10B), свидетельствуя о том, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд действительно уменьшает воспаление печени.

Было исследовано, какие иммунные клетки подвергаются влиянию взаимодействия NKG2D/лиганд, и вносят вклад в воспаление печени. Подобно атеросклеротическим аортам, в печени ApoE^-/- мышей была обнаружена сильная повышенная регуляция лигандов NKG2D (фиг.11A). Как макрофаги, так и гепатоциты печени отличались повышенной регуляцией экспрессии Rae-1 у ApoE^-/- мышей, по сравнению с контролями дикого типа (фиг.11B-D). В соответствии с повышенной регуляцией лигандов в печени получавших «западную диету» ApoE^-/- мышей, экспрессирующие NKG2D иммунные клетки, такие как NK и особенно NK T-клетки, из печени этих мышей демонстрировали значительную продукцию цитокинов, включая IFN-γ и IL-4, которая была существенно снижена, если у мышей также отсутствовал NKG2D (фиг.11E и F). Напротив, печеночные макрофаги, которые не экспрессировали NKG2D, продуцировали высокие уровни IL-6 у ApoE^-/- мышей, независимо от того, была ли у мышей экспрессия NKG2D (фиг.11G). Однако, как уже отмечалось, количество макрофагов было существенно снижено у Klrk1^-/-ApoE^-/- мышей, указывая на то, что на макрофаги косвенно влияло опосредованное NKG2D воспаление. Эти результаты демонстрируют, что аномальные метаболические состояния индуцируют повышенную регуляцию лигандов NKG2D, особенно в тканях, в которых накапливаются аномальные метаболиты, таких как атеросклеротические бляшки и печень, и вследствие этого, взаимодействие NKG2D/лиганд является полезной мишенью для интервенции при лечении атеросклероза.

Пример 7

Предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд снижает уровни глюкозы у получающих «западную диету» ApoE-/- мышей

В одном эксперименте 8-недельные ApoE-/- и дефицитные по NKG2D ApoE-/-Klrk1-/- мыши получали в качестве корма «западную диету» в течение 3 месяцев. Затем сыворотки крови были собраны, и оценены на содержание глюкозы в конце режима кормления. В среднем, ApoE-/- Kirk-/- мыши имели значительно более низкие уровни глюкозы, чем ApoE-/- мыши, после кормления «западной диетой» в течение трех месяцев (фиг.12), из чего следует, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд способно подавлять прогрессирование гипергликемии.

Пример 8

Анти-NKG2D антитело предотвращает развитие и прогрессирование гипергликемии и диабета в модели диабета 2 типа на грызунах

Для дальнейшего определения эффекта блокирования NKG2D на развитие и прогрессирование диабета 2 типа, анти-NKG2D антитело вводили Psammomys obesus (также известным, как песчаные крысы), животной модели диабета 2 типа на песчанках.

Самцов и самок P. obesus (Ηarlan, Jerusalem, Israel), кормили низкокалорийным кормом (2,4 ккал/г) до достижения возраста 9 недель, когда они были переведены на высококалорийную (3,1 ккал/г) диету, в это время массу тела (BW) и утренний уровень глюкозы (mBG) контролировали в течение 10 дней (индукционный период). Животных, имеющих повышенные уровни mBG, определяемые как mBG>10 ммоль/л при двух последовательных измерениях, переводили обратно на низкокалорийную диету, и использовали в текущем исследовании (режим профилактики) через 10 дней после того, когда их уровни mBG возвращались к не диабетическому диапазону. Животных, у которых не обнаруживали увеличения mBG в индукционный период, умерщвляли, и далее не использовали.

P. obesus получали растворитель (N=19) или антитело к NKG2D-PE (клон CX5) (N=9) один раз в неделю внутрибрюшинными инъекциями. Препарат антитела грызунов к NKG2D содержал CX5 OP001 - ca. в концентрации 10 EU/мл или 0,96 мг/мл. Содержимое одного 45-мл флакона, растворенное в буфере PBS, хранили при 4°C, и используемый объем дозы составлял 0,52 мл/кг массы тела или 0,5 мг/кг массы тела.

Исследование проводили на протяжении 6 недель, в течение которых mBG и BW контролировали регулярно. Для определения mBG (ммоль/л), образцы крови отбирали из капилляров кончика хвоста в 10-мкл стеклянные капилляры, немедленно суспендировали в буфере (500 мкл буфера для анализа Biosen) в пробирках эппендорф и анализировали на глюкозу в день отбора пробы.

В процессе исследования пять животных в группе с растворителем и одно в группе с антителом к NKG2D пришлось умертвить из-за чрезвычайно высоких показателей mBG и кетоацидоза. Исследование было одобрено инспекцией по проведению экспериментов на животных Министерства юстиции Дании.

Как показано на фиг.13, через шесть недель после первой дозы растворителя или антитела к NKG2D, у всех животных в группе с растворителем развивался тяжелый диабет со средним значением mBG, равным 14,5±2,6 мМ (среднее ± SEM), тогда как животные, получавшие антитело к NKG2D, оставались нормогликемическими (mBG<8 мМ) и имели значительно более низкий уровень mBG, составляющий 8,0±1,9 мМ, p<0,0001 (среднее ± SEM). Разница в прибавлении BW отсутствовала в двух группах лечения. Эти результаты показывают, что NKG2D играет очень важную роль в развитии выраженного диабета 2 типа (вероятно, посредством уменьшения воспаления, резистентности к инсулину и отказа бета-клеток) в животной модели на грызунах, которая имеет много сходных особенностей с диабетом 2 типа у людей. Путем блокирования эффектов NKG2D антителом, индуцированное употреблением высококалорийной диеты развитие диабета 2 типа у P. obesus было полностью ликвидировано.

Для подтверждения специфичности анти-NKG2D антитела проводили анализ методом проточной цитометрии связывания антитела NKG2D с клетками крови от P. obesus.

Вкратце, стабилизированную ЭДТА кровь от песчаных крыс в 100-мкл аликвотах окрашивали антителами против NKG2D или контрольными по изотипу антителами: антителом против NKG2D-PE мыши (клон CX5), контрольным по изотипу IgG1-PE антителом крысы, антителом против NKG2D-PE человека (клон 1D11), контрольным по изотипу IgG1-PE антителом мыши и антителом против NKG2D-PE человека (клон ON72). Затем кровь лизировали, фиксировали и промывали, используя лизирующий/фиксирующий раствор для BD FACS и PBS, и измеряли связывание конъюгированных с PE антител на проточном цитометре LSRII. FSC/SSC использовали для выявления негранулоцитов.

Как показали результаты анализа методом проточной цитометрии на фиг.14, наблюдали дозозависимое связывание антитела против NKG2D-PE мыши (клон CX5) с NK клетками в крови песчаных крыс. Это связывание было специфическим, поскольку не наблюдали связывания контрольных по изотипу антител (контрольного по изотипу IgG1-PE антитела крысы (R3-34) и контрольного по изотипу IgG1-PE антитела мыши (MOPC-21)) или антител против NKG2D человека (клон 1D11 и клон ON72).

Результаты продемонстрировали целесообразность использования в качестве мишени NKG2D при лечении диабета 2 типа и гипергликемии.

Материалы и методы

Модели на мышах и пациенты-люди: ApoE^-/- мышей на генетической основе C56BL/6 приобретали у Jackson Lab. Klrk1^-/- мыши описаны ранее. Мышей Klrk1^-/-ApoE^-/- получали путем скрещивания ApoE^-/- и Klrki^-/- мышей и скрещивания между собой потомства. Для ускорения атеросклероза шестинедельных самцов кормили без ограничения «западной диетой» или вводили инъекцией стрептозотоцин (STZ) для индукции диабета (Park et al., Nat Med, 4:1025-1031 (1998)) и анализировали через 8-10 недель после начала воздействия. Для экспериментов по блокаде с помощью антитела к NKG2D, ApoE^-/- мышам вводили инъекцией моноклональное антитело к NKG2D (клон MI-6, IgG2a крысы) (Jamieson et al., Immunity, 17:19-29 (2002)) за одну неделю и три дня до введения STZ и еженедельно в последующем в течение восьми недель (200 мкг/1ю инъекцию и 100 мкг/инъекцию в последующем).

Антитела и реагенты: Антитело к NKG2D (клон MI-6) получали в своей лаборатории. Антитело ко всем формам Rae-1 приобретали у R&D Systems, тогда как остальные приобретали у BD Biosciences или eBioscience или у компаний, указанных в следующих далее относящихся к вопросу разделах.

Анфас окрашивание красителем Oil Red O: Аорты мышей, получавших различное лечение, раскрывали, фиксировали в 10% формалине, и окрашивали красителем Oil Red O dye. Размеры бляшек, положительных по окрашиванию Oil Red O, рассчитывали на основании цифровых фотографий окрашенных аорт при помощи Adobe Photoshop.

Иммуногистохимическое окрашивание: Замороженные срезы бляшек аорты мышей окрашивали поликлональным антителом козы против Rae-1 или H60 мыши (R&D Systems и Santa Cruz Biotechnology, соответственно), с последующей обработкой конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом осла против IgG козы и системой окрашивания ABC-HRP (коричневая окраска) (Santa Cruz Biotechnology). Срезы дополнительно окрашивали моноклональным антителом крысы против CD68 мыши (Serotec), с последующей обработкой конъюгированным со щелочной фосфатазой (AP) антителом осла против иммуноглобулинов крысы и набором для окрашивания ABC-AP (синяя окраска) (Vector Laboratory). Прилегающие замороженные срезы бляшек аорты человека окрашивали моноклональным антителом мыши против MICA/B человека (клон 6D4, eBioscience), анти-Mac-3 или анти-CD31 антителом.

Выделение клеток: Мононуклеоциты, эндотелиальные клетки и гепатоциты выделяли из аорты или печени согласно описанным методам. Выделенные клетки подсчитывали, и использовали для различных анализов.

Проточная цитометрия: Клетки окрашивали надлежащим сочетанием флуоресцентно меченых антител и анализировали методом проточной цитометрии при помощи проточного цитометра FC500 (Beckman Counter).

Полуколичественный и в реальном времени анализ ОТ-ПЦР: РНК анализировали на транскрипты Rae-1δ, Rae-1ε и H60b методами полуколичественной радиоактивной ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени.

In vitro обработка макрофагов: Перитонеальные макрофаги культивировали in vitro в течение двух дней в средах, содержащих oxLDL (10 мкг/мл), природный LDL (nLDL) (10 мкг/мл), AGE (200 мкг/мл) или LPS (200 нг/мл), и анализировали на экспрессию лигандов NKG2D.

Анализ вестерн-блоттинг на суммарные белки Rae-1: Макрофаги лизировали, разделяли в ПААГ-гелях, переносили на PEGF мембрану, обрабатывали анти-Rae1 антителом (C20, Santa Cruz Biotechnology) и проявляли системой SEL.

Многокомпонентный анализ сывороточных цитокинов: Сыворотки мышей анализировали напрямую при помощи 7-компонентного набора мышиных провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β и KC/CXCL1) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

Оценка уровней холестерина и триглицеридов в сыворотке: Уровни холестерина и триглицеридов анализировали на химическом анализаторе VetTest^® (IDEXX Laboratories, Inc. Maine).

Анализ активности ALT: Активности ALT в сыворотке определяли при помощи набора от Bioo Scientific (Austin, TX) в соответствии с инструкцией производителя.

Ex vivo культивирование печеночных эксплантатов: Перфузированную PBS печень извлекали из получавших «западную диету» ApoE-/- или KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Куски извлеченной печени равного веса нарезали на кубики размером примерно 1 мм³, и культивировали в среде в течение 1 или 3 дней. Культуральные среды собирали, и анализировали на цитокины методом ELISA.

Внутриклеточное окрашивания цитокинов: Мононуклеоциты, выделенные из печени, культивировали в среде в течение ночи в присутствии брофелдина A, и анализировали путем внутриклеточного окрашивания цитокинов на продукцию IL-6, IFN-γ и IL-4 в селектированных подмножествах иммунных клеток в соответствии с инструкциями производителя (eBioscience и Biolegend).

Определение методом ELISA растворимого MICA: Сыворотки пациентов с диабетом 2 типа и с раком анализировали на наличие белков MICA при помощи набора для ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Статистический анализ: Все данные выражали в виде средних значений ± S.E.M. Статистическую значимость определяли при помощи двустороннего критерия Стьюдента. Величину P<0,05 считали статистически значимой.

Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в данном документе, включены в данный документ в той же степени, как если бы было отдельно и специально указано, что полное содержание каждой ссылки изложено, и включено в данный документ посредством ссылки.

Любое сочетание вышеуказанных элементов во всех возможных их вариациях охвачено данным изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом четко не противоречит контексту.

Термины, употребленные в единственным числе, используемые для описания изобретения, следует расширенно толковать как относящиеся и к единственному, и к множественному числу, если иное не указано в данном документе или иным образом четко не противоречит контексту.

Использование любого и всех примеров или иллюстративных выражений (например, «такой как»), встречающихся в данном документе, предназначено лишь для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничений на объем изобретения, если не указано иное. Ни одно выражение в описании не должно быть истолковано как указывающее на то, что какой-либо элемент имеет важное значение для практики изобретения, если прямо не указано иное.

Приведенное в данном документе описание любого аспекта или варианта осуществления изобретения с использованием таких терминов, как «включающий», «имеющий», «охватывающий» или «содержащий», применительно к элементу или элементам, предназначено для поддержания аналогичного аспекта или варианта осуществления изобретения, который «состоит из», «состоит практически из» или «содержит практически» данный конкретный элемент или элементы, если иное не указано или иным образом четко не противоречит контексту (например, композицию, описанную в данном документе как содержащую конкретный элемент, следует также рассматривать как описание композиции, состоящей из этого элемента, если иное не указано или иным образом четко не противоречит контексту).

Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, изложенного в аспектах или пунктах формулы изобретения, приведенных в данном документе, в максимальной степени, разрешенной действующим законодательством.

Примерные варианты осуществления

Далее следуют примерные варианты осуществления изобретения.

1. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D.

2. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D.

3. Способ лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией.

4. Способ лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией.

5. Способ по варианту осуществления 3 или 4, в котором патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа.

6. Способ по варианту осуществления 3 или 4, в котором патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

7. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором субъект является человеком.

8. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

9. Способ по варианту осуществления 8, в котором средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D.

10. Способ по варианту осуществления 9, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

11. Способ по варианту осуществления 9, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

12. Способ по варианту осуществления 9, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент снижает опосредованную NKG2D активацию или сигнализацию экспрессирующей NKG2D клетки.

13. Способ по любому из вариантов осуществления 9-12, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с по меньшей мере одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D.

14. Способ по варианту осуществления 13, в котором лиганд NKG2D представляет собой MICA/B.

15. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором введение средства приводит к по меньшей мере одному из перечисленных далее событий у субъекта: снижению уровней глюкозы в крови, улучшению толерантности к глюкозе, снижению резистентности к инсулину, уменьшению массы тела, снижению артериального давления, уменьшению воспаления или снижению метаболических дисфункций.

16. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.

17. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного дополнительного средства, выбранного из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

18. Способ по варианту осуществления 17, в котором дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

19. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию и сигнализацию NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

20. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

21. Композиция по варианту осуществления 19 или 20, в которой средство полезно для лечения диабета 2 типа.

22. Композиция по варианту осуществления 19 или 20, в которой средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

23. Композиция по варианту осуществления 22, в которой патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией.

24. Композиция по варианту осуществления 23, в которой патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа.

25. Композиция по варианту осуществления 23, в которой патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

26. Композиция по любому из предшествующих вариантов осуществления 19-25, в которой средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

27. Композиция по варианту осуществления 26, в которой средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D.

28. Композиция по варианту осуществления 27, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

29. Композиция по варианту осуществления 27, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

30. Композиция по варианту осуществления 26, в которой средство представляет собой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D.

31. Композиция по варианту осуществления 30, в которой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D представляет собой ингибитор MICA/B.

32. Композиция по варианту осуществления 31, в которой ингибитор MICA/B представляет собой специфичную для MICA/B киРНК.

33. Композиция по любому из вариантов осуществления 19-32, дополнительно содержащая по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

34. Композиция по варианту осуществления 33, в которой дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

35. Набор, включающий:

(a) терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и

(b) инструкции по применению.

36. Набор, включающий:

(a) терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и

(b) инструкции по применению.

37. Набор по варианту осуществления 35 или 36, в котором средство полезно для лечения диабета 2 типа.

38. Набор по варианту осуществления 35 или 36, в котором средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

39. Набор по варианту осуществления 38, в котором патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией.

40. Набор по варианту осуществления 39, в котором патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа.

41. Набор по варианту осуществления 39, в котором патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

42. Набор по любому из предшествующих вариантов осуществления 35-41, в котором средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

43. Набор по варианту осуществления 42, в котором средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D.

44. Набор по варианту осуществления 43, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

45. Набор по варианту осуществления 43, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

46. Набор по любому из предшествующих вариантов осуществления 35-45, дополнительно содержащий по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

47. Набор по варианту осуществления 46, в котором дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

48. Способ выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа или наличия диабета 2 типа у субъекта, включающий:

(a) получение образца от субъекта;

(b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B;

(c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и

(d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию диабета 2 типа или наличием диабета 2 типа у субъекта.

49. Способ выявления предрасположенности к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличия сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающий:

(a) получение образца от субъекта;

(b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B;

(c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и

(d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

50. Способ по варианту осуществления 48 или 49, в котором реагент представляет собой антитело к MICA/B.

51. Способ по варианту осуществления 48 или 49, в котором образец представляет собой сыворотку.

52. Способ по варианту осуществления 48 или 49, в котором субъект является человеком.

53. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления 48-52, дополнительно включающий измерение уровня экспрессии маркера сердечно-сосудистого заболевания, не являющегося MICA/B, в образце и установление корреляции между избыточной экспрессией или недостаточной экспрессией маркера сердечно-сосудистого заболевания и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается лечения сахарного диабета 2 типа. Для этого вводят терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, или блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D. Это обеспечивает эффективное лечение диабета 2 типа, в том числе коррекцию таких его проявлений, как патология сердечно-сосудистой системы, воспалительный и метаболический компоненты. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.

1. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, или средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D.

2. Способ по п. 1, в котором субъект является человеком.

3. Способ по п. 1, в котором средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

4. Способ по п. 3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

5. Способ по п. 3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

6. Способ по п. 3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент снижает опосредованную NKG2D активацию или сигнализацию экспрессирующей NKG2D клетки.

7. Способ по п. 3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с по меньшей мере одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D.

8. Способ по п. 7, в котором лиганд NKG2D представляет собой MICA/B.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором введение средства приводит к по меньшей мере одному из перечисленных далее событий у субъекта: снижению уровней глюкозы в крови, улучшению толерантности к глюкозе, снижению резистентности к инсулину, уменьшению массы тела, уменьшению воспаления или снижению метаболических дисфункций.

10. Способ по любому из пп. 1-8, в котором средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.

11. Способ по любому из пп. 1-8, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного дополнительного средства, выбранного из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

12. Способ по п. 11, в котором дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (а) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG СоА (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (с) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов РР (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов МС4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов МСН (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов ССК (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5НТ (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного Х-рецептора), антагонистов гистамина Н3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином).

13. Композиция для лечения диабета 2 типа, содержащая терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, или средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Композиция по п. 13, в которой средство выбрано из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

15. Композиция по п. 14, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

16. Композиция по п. 14, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (HNKG2D).

17. Композиция по п. 14, в которой средство представляет собой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D.

18. Композиция по п. 17, в которой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D представляет собой ингибитор MICA/B.

19. Композиция по п. 18, в которой ингибитор MICA/B представляет собой специфичную для MICA/B киРНК.

20. Композиция по любому из пп. 13-19, дополнительно содержащая по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

21. Композиция по п. 20, в которой дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (а) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG СоА (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (с) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов РР (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов МС4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов МСН (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов ССК (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5НТ (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного Х-рецептора), антагонистов гистамина Н3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином).

22. Набор для лечения диабета 2 типа, включающий:
(a) терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, или средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и
(b) инструкции по применению.

23. Набор по п. 22, в котором средство выбрано из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D.

24. Набор по п. 23, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

25. Набор по п. 23, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

26. Набор по любому из пп. 22-25, дополнительно содержащий по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением.

27. Набор по п. 26, в котором дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из (а) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG СоА (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (с) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов РР (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов МС4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов МСН (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов ССК (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5НТ (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного Х-рецептора), антагонистов гистамина Н3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином).