ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ АНТРАФУРАНДИОН И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2015 года по МПК C07D405/06 A61K31/343 A61K31/40 A61P35/00 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к сфере лекарственных препаратов, в частности к новому производному антрафурандиона формулы I, обладающему более выраженным противоопухолевым эффектом и активностью в отношении опухолевых заболеваний с резистентностью к другим лекарственным средствам, а также фармацевтическим композициям на его основе и их медицинскому применению. Более конкретно, изобретение относится к 3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диону, его стереохимическому составу и применению его 5-изомера в качестве активной основы в противоопухолевых фармацевтических композициях с улучшенными характеристиками, такими как эффективность, переносимость, растворимость и стабильность.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Онкологические заболевания остаются одной из основных причин смертности в большинстве развитых стран, причем в последние десятилетия прослеживается тенденция к росту числа диагностированных заболеваний. Эффективность борьбы с онкологическими заболеваниями во многом зависит от лекарственной терапии. Наряду с хирургическим и лучевым методами, химиотерапия злокачественных опухолей получила широкое распространение, тем более что при ряде локализаций опухолевого процесса она является единственным методом лечения.

Несмотря на высокую клиническую эффективность противоопухолевых средств, их применение ограничивается рядом недостатков. Помимо общей токсичности для нормальных тканей, эффективность противоопухолевых агентов зачастую ограничивается развитием у опухолевых клеток множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) в ответ на химиотерапию или приобретенной из-за прогрессирования болезни [Shtil A.A. J. Hematother. Stem Cell Res., 2002, 11, 437]. Экспрессия АТР-связывающих кассетных транспортеров, например p-гликопротеина (p-gp), на поверхности опухолевых клеток [Ambudkar S.V., et. al. Oncogene, 2003, 22, 7468], мутации или изменения уровня экспрессии мишеней [Heisig P. Mutagenesis, 2009, 24(6), 465], а также потеря функционирующего проапоптического гена опухолевого супрессора р53 [Vousden K.H., et. al. Cell, 2005, 120, 7] являются наиболее типичными механизмами резистентности, развивающимися в опухолевых клетках в ответ на химиотерапию [Knez L., et. al. Lung Cancer, 2011, 72(3), 271]. Следовательно, одним из способов повышения эффективности химиотерапии является разработка лекарственных средств, способных воздействовать на опухолевые клетки с МЛУ, индуцированную химиотерапевтическими агентами.

Известно, что природные и синтетические производные антрахинона обладают высокой биологической активностью, а ряд из них (например, доксорубицин, фармрубицин, митоксантрон) применяют в клинике для терапии опухолевых заболеваний. Поэтому антрахиноновое ядро широко используется в медицинской химии в качестве основы для разработки новых противоопухолевых средств. Так, ряд гетероциклических производных запатентован в качестве противоопухолевых агентов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами [WO 2006031719, RU 2412166]. В патенте RU 2412166 нами был найден оригинальный химотип производных линейных гетероаренантрацендионов с высокой активностью в отношении опухолевых клеток с различными механизмами множественной лекарственной устойчивости. Настоящее изобретение является дальнейшим развитием изобретения, описанного в RU 2412166. Целью настоящего изобретения ставилось повышение эффективности одного из производных антра[2,3-b]фуран-5,10-диона, описанного в RU 2412166, за счет оптимизации его стереохимии и солевой формы. Другой целью изобретения являлась разработка на основе этого антрафурандиона фармацевтических композиций с улучшенными свойствами, применимых для лечения опухолевых заболеваний, включая резистентные к другим препаратам новообразования.

Раскрытие изобретения

Известно, что производные гетероаренантрацендионов, содержащие в боковой цепи циклические диамины, обладающие высокой антипролиферативной активностью, способны ингибировать рост ряда резистентных линий опухолевых клеток [Shchekotikhin А.Е. et al. Bioorg. Med. Chem., 2005, 13 (6), 2285; RU 2412166]. Так, ранее гидрохлорид 3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диона (1) был запатентован в качестве потенциального противоопухолевого средства.

Однако описанный ранее гидрохлорид антрафурандиона 1 малорастворим в воде (<1 мг/мл при 20°C), причем его растворимость в водных фармакологически приемлемых средах, например в «изотоническом растворе» или в «растворе глюкозы для инъекций», еще ниже. Хотя растворимость гидрохлорида в воде возрастает при нагревании, при охлаждении его концентрированных растворов наблюдается образование гелеобразного осадка, видимо, за счет формирования межмолекулярных ассоциатов. Таким образом, дальнейшие исследования и практическое применение гидрохлорида антрафурандиона 1 в качестве парентерального лекарственного средства затрудняются его низкой растворимостью. В связи с этим было бы желательно на основе антрафурандиона 1 разработать препарат с улучшенной растворимостью, способный образовывать стабильные водные растворы. Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования по поиску новой солевой формы антрафурандиона 1, имеющей лучшую растворимость, чем ранее известный гидрохлорид. В результате исследования других солей антрафурандиона 1 с минеральными или органическими кислотами обнаружено, что алкансульфокислоты или гидроксиалкансульфокислоты образуют с антрафурандионом 1 устойчивые соли, имеющие лучшую растворимость, чем гидрохлорид. Так, мезилат (метансульфонат) и изетионат (2-гидроксиэтансульфонат) обладают из всех протестированных солей антрафурандиона 1 наибольшей растворимостью в дистиллированной воде (3-5 мг/мл при 20°C) и высокой стабильностью как в твердом виде, так и в растворах. Поэтому в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения используются соли антрафурандиона 1 с алкансульфокислотами (предпочтительно метансульфокислотой) или гидроксиалкансульфокислотами (предпочтительно 2-гидроксиэтансульфокислотой), более предпочтительно с метансульфокислотой.

Антрафурандион 1, описываемый в настоящем изобретении, можно получить различными способами. Один из типичных подходов, разработанный нами для получения рацемического антрафурандиона 1 [RU 2412166], включает последовательную активацию 4,11-дигидрокси-5,10-диоксо-2-метилантра[2,3-b]фуран-3-карбоновой кислоты [Горелик М.В., Мишина Е.В. ЖОрХ., 1983, 2185], взаимодействие с защищенным по экзоциклической аминогруппе 3-аминопирролидином, последующее удаление защитной группы и получение соответствующей солевой формы целевого антрафурандиона 1. Для активации исходной карбоновой кислоты могут быть использованы различные методы, хорошо известные специалистам в области органического синтеза, включая превращение 4,11-дигидрокси-5,10-диоксо-2-метилантра[2,3-b]фуран-3-карбоновой кислоты в соответствующий хлорангидрид, смешанный ангидрид, имидазолид, активированный эфир или другие производные, применяемые для получения амидов. Так, для активации можно использовать обработку исходной кислоты тионилхлоридом, хлорокисью фосфора, пентахлоридом фосфора, карбонилдиимидазолом, производными карбодиимида (например, DCC или EDC), дифенилфосфорилазидом (DPPA), реагентами Кастро (BOP или PyBOP) или другими конденсирующими агентами (TBTU и HBTU), предпочтительно тионилхлоридом. Очевидно, что для региоселективного ацилирования необходимо использование защиты аминогруппы исходного 3-аминопирролидина, в качестве которой можно использовать различные защитные группы, хорошо известные специалистам в области органического синтеза, предпочтительно трет-бутоксикарбонильную группу (Вос-группу). В этом предпочтительном варианте удаление защитной Вос-группы промежуточного амида можно проводить действием метансульфокислоты, что позволяет совместить стадии удаления защитной группы и получение предпочтительной водорастворимой солевой формы целевого антрафурандиона - метансульфоната. В альтернативных вариантах осуществления изобретения для получения необходимых солевых форм антрафурандиона на заключительной стадии можно использовать взаимодействие свободного основания антрафурандиона с соответствующими кислотами (например, метансульфоновой и изетионовой кислотами) или реакции обмена.

Одна из подходящих схем синтеза антрафурандиона, подробно описанная в примерах настоящего изобретения и приведенная на схеме А, включает:

1. Превращение исходной антрафуран-3-карбоновой кислоты a при нагревании с тионилхлоридом в соответствующий хлорангидрид b;

2. Ацилирование хлорангидридом b 3-(трет-бутоксикарбониламино)пирролидина с образованием амида c;

3. Расщепление защитной группы амида c действием метансульфокислоты, приводящее к метансульфонату целевого антрафурандиона 1.

Хорошо известно, что индивидуальные стереоизомеры могут существенно отличаться друг от друга и от их рацемической смеси как по физико-химическим, так и биологическим свойствам. Прежде всего, вещества с различным стереоизомерным составом часто различаются по специфической биологической активности, по токсикологическим и фармакокинетическим параметрам, а также побочным эффектам [The Practice of Medicinal Chemistry (Third Edition). C.G. Wermuth (ed.), 2008, 537-545]. Поэтому авторы настоящего изобретения провели исследования по синтезу и изучению свойств индивидуальных стереоизомеров антрафурандиона 1, ранее известного в виде рацемической смеси. С использованием в схеме A коммерчески доступных стереоизомеров производных 3-аминопирролидина были получены R- и 5-изомеры антрафурандиона (формулы 2 и 3).

Изучение антипролиферативной активности метансульфонатов индивидуальных стереоизомеров антрафурандиона 2 и 3 выявило их различие в способности ингибировать рост опухолевых клеток. S-Изомер антрафурандиона 3 более активен, чем его антипод 2 в отношении опухолевых клеток различного гистогенеза, включая клетки с активированными механизмами МЛУ (пример 7, таблица 1). Так, он практически одинаково токсичен для клеток человеческого лейкоза линии K562 и Pgp-положительной сублинии K.562/4. Экспрессия ABC-транспортеров (например, P-гликопротеина p-gp) является одной из наиболее распространенных причин возникновения множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) в опухолевых клетках [Shtil A.A. J. Hematother. Stem Cell Res., 2002, 11, 437]. Другой механизм развития МЛУ, связанный с мутациями, приводящими к инактивации гена проапоптического опухолевого супрессора р53, тоже часто встречается в опухолевых клетках и может приводить к резистентности ко многим химиотерапевтическим агентам, включая доксорубицин [Vousden K.H., et. al. Cell, 2005, 120, 7]. В противоположность доксорубицину, S-изомер антрафурандиона 3 практически одинаково действует как на клетки линии НСТ116 (с фенотипом р53^+/+), так и на сублинию HCT116p53KO с МЛУ, обусловленной делецией гена р53 (фенотип р53^-/-).

Кроме того, авторы изобретения установили, что стереоизомеры антрафурандиона 2 и 3 значительно отличаются и по специфической (противоопухолевой) активности in vivo. Так, R-изомер 2 при пятикратном применении в дозе 30 мг/кг вызывает увеличение продолжительности жизни мышей с лимфолейкозом Р388 на уровне минимального порогового значения (УПЖ=22%), в то время как 5-изомер 3 в 6 раз более активен (УПЖ=140%). Более того, по противоопухолевой активности 5-изомер 3 в 2-3 раза более активен, чем гидрохлорид и метансульфонат рацемического антрафурандиона 1 (пример 8, таблица 2).

Таким образом, проведенные авторами исследования показывают, что S-изомер антрафурандиона 3 более активно ингибирует рост опухолевых клеток и обладает значительно большей противоопухолевой активностью, чем его антипод 2 и рацемическая форма 1, поэтому данное изобретение в дальнейшем относится к лекарственным препаратам, имеющим в составе 5-изомер антрафурандиона 3 или его соли, предпочтительно алкансульфонаты или гидроксиалкансульфонаты, более предпочтительно метансульфонат.

Исследование метансульфоната индивидуального стереоизомера антрафурандиона 3 показало, что его растворимость в дистиллированной воде в нормальных условиях (~1.0 мг/мл при комнатной температуре) ниже растворимости метансульфоната рацемата 1. Растворение антрафурандиона 3 в воде при нормальных условиях протекает медленно, причем растворимость возрастает при увеличении температуры. В кипящей дистиллированной воде растворимость составляет около 20 мг/мл, однако при охлаждении полученного раствора происходит кристаллизация антрафурандиона 3. Эти обстоятельства затрудняют практическое применение антрафурандиона 3 в качестве парентерально вводимого лекарственного средства, поэтому согласно с еще одним аспектом настоящего изобретения, антрафурандион 3 может быть использован для приготовления фармацевтических композиций для парентерального применения, например, в виде жидкой лекарственной формы для инъекции.

Фармацевтические композиции для парентерального введения обычно являются водными или неводными стерильными изотоническими растворами для инъекций, которые, помимо терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержат фармакологически приемлемый носитель (растворитель), а также различные эксципиенты (вспомогательные вещества). Фармацевтические композиции могут являться как жидкими готовыми растворами для инъекций, так и суспензиями, стерильными порошками или лиофилизированными композициями, для применения которых необходимо добавление стерильного растворителя (например, воды для инъекций) непосредственно перед использованием. Методики получения парентеральных лекарственных композиций хорошо известны из уровня техники.

В фармакологически приемлемых водосодержащих носителях (растворителях или разбавителях), наиболее часто используемых для приготовления фармацевтических композиций для парентерального применения, например в «изотоническом физиологическом растворе (0.9% водный раствор хлорида натрия)» или в «изотоническом растворе глюкозы (5%) для внутривенных инъекций», растворимость антрафурандиона 3 ниже, чем в дистиллированной воде. Авторами настоящего изобретения обнаружено, что субстанция антрафурандиона 3 в «физиологическом растворе» растворяется существенно хуже, чем в «растворе глюкозы». Эта выявленная фармацевтическая несовместимость антрафурандиона и «физиологического раствора», очевидно, связана с высоким содержанием в «физиологическом растворе» ионов хлора, вызывающих трансформацию метансульфоната антрафурандиона 3 в менее растворимую солевую форму - гидрохлорид. Поэтому в качестве носителя (растворителя) для приготовления жидких фармацевтических композиций в настоящем изобретении предпочтительно используется «раствор глюкозы», в котором субстанция растворяется лучше, чем в «физиологическом растворе». Кроме «раствора глюкозы», для приготовления жидких лекарственных форм могут быть применены и другие менее предпочтительные носители, включая водные изотонические солевые растворы, растворы электролитов, а также неводные фармацевтически приемлемые полярные растворители, такие как масла, спирты, амиды, сложные эфиры, простые эфиры, кетоны, углеводороды и их смеси.

Помимо лекарственного средства и носителя, фармацевтические композиции могут содержать один или несколько известных из уровня техники фармацевтически приемлемых эксципиентов (вспомогательных компонентов). В частности, в настоящем изобретении эксципиенты могут быть выбраны из сорастворителей, солюбилизаторов, соединений, способствующих поддержанию pH и/или изотоничности, наполнителей, эмульгаторов, консервантов, антиоксидантов и других веществ. Эти хорошо известные компоненты фармацевтических композиций способствуют улучшению их потребительских или полезных свойств за счет облегчения применения, повышения стабильности, регулирования значения pH, изменения времени удерживания лекарственного соединения в месте введения. Так, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения растворимость метансульфоната антрафурандиона 3, а также стабильность его фармацевтических композиций и их эффективность могут быть повышены за счет одного или нескольких эксципиентов, выбранных независимо из группы сорастворителей, солюбилизаторов, наполнителей, эмульгаторов, консервантов, антиоксидантов, буферных солей и веществ для поддержания изотоничности. Количество производного антрафурандиона 3 или его фармацевтически приемлемой соли в фармацевтической композиции не ограничивается, но предпочтительно составляет от 0.1% до 10% (мас./об.), более предпочтительно от 0.1% до 5% (мас./об.). Количество растворителя (наполнителя или разбавителя) не ограничивается, но может достигать до 99 масс.% в расчете на общую массу композиции, как хорошо известно в технологии приготовления лекарственных форм. Количество сорастворителя в композиции не ограничивается и может варьироваться, например, от 1% до 60%. Количество солюбилизирующего агента в композиции не ограничивается и может варьироваться, например, от 0.1% до 20%. Количество стабилизатора и антиоксиданта в композиции не ограничивается, но может достигать, например, от 0.1 до 1%. Количество агента для поддержания изотоничности в композиции не ограничивается, но может достигать, например, от 0.5 до 10%. Количество консерванта не ограничивается и может составлять, например, от 0.001 до 5%.

В качестве сорастворителей фармацевтические композиции антрафурандиона 3 могут содержать один или несколько фармакологически приемлемых растворителей, пригодных для приготовления жидких парентеральных форм. Такие сорастворители хорошо знакомы специалистам в области фармацевтики (без ограничения перечисленным): спирты или полиолы (например, этанол, 1,2-пропиленгликоль, глицерин, 1,3-бутиленгликоль), модифицированные полиоксиалкиленом алкиленоксиды или липиды (например, полиэтиленгликоль ПЭГ), сложные полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, эфиры полиэтиленгликоля, сложные полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ). Другие фармацевтически приемлемые сорастворители, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, хорошо известны специалистам и описаны в литературе [например, в Modern Pharmaceutics (Fourth Edition). G. Banker et al. (eds.), 2002, 864; Remington's Pharmaceutical Sciences (21th Edition) D B. Troy, P. Beringer (ed.), 2006, 2393, A.J. Spiegel et al. J. Pharm. Sci., 1963, 52 (10), 917-927]. Эти эксципиенты могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники, или от промышленных поставщиков.

В качестве эксципиентов, повышающих растворимость антрафурандиона 3, его фармацевтические композиции могут содержать один или несколько фармакологически приемлемых солюбилизирующих агентов, хорошо знакомых специалистам в области фармацевтики, такие как (без ограничения перечисленным) поливинилпирролидон (ПВП), декстран, полисорбат 80 (твин 80), кремофор ЕН, гидроксиалкилированые β-циклодекстрины и γ-циклодекстрины и т.п. Добавление к «раствору глюкозы» в качестве вспомогательных компонентов ПВП, полисорбата 80 или кремофора ЕН, хотя и не ускоряют растворение субстанции при комнатной температуре, однако 0.5% растворы, полученные после растворения субстанции при нагревании, устойчивы при хранении в холодильнике (+5°C) в течение 3 месяцев. Полиэтиленгликоли (ПЭГ400 или ПЭГ200), а также β- или γ-гидроксипропилциклодекстрины не только стабилизируют раствор субстанции, но и способствуют ее растворению при комнатной температуре. Поэтому в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения для приготовления стабильных жидких фармацевтических композиций для парентерального применения антрафурандиона 3, являющихся предметом настоящего изобретения, используются ПВП, твин 80, кремофор EH, полиэтиленгликоли и β- или γ-гидроксипропилциклодекстрины.

В качестве консервантов, предохраняющих композицию от воздействия микроорганизмов, в настоящем изобретении могут быть применены различные противомикробные вещества, хорошо знакомые специалистам в области фармацевтики, такие как (без ограничения перечисленным) сульфиты, бензиловый спирт, хлорбутанол, сорбит, ксилит, сорбиновая кислота, бензойная кислота, тимеросал, парабены и их различные соли.

В качестве вспомогательных буферных компонентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут быть предпочтительно использованы кислоты (например, лимонная, уксусная, фосфорная и др.) или их соли с щелочными металлами (например, цитрат, ацетат или дигидрофосфат натрия и др.), или их сочетания (например, лимонная кислота и цитрат натрия). Ионная сила буферного раствора, используемого как компонент жидкой композиции в настоящем изобретении, не ограничивается и может быть, например, на уровне 0.01-0.6.

В качестве антиоксидантов могут быть использованы, например, глюкоза, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия, бисульфит натрия, сульфит натрия, фенолы и тиофенолы.

В одном из вариантов приготовления жидких фармацевтических композиций фармацевтически приемлемую соль антрафурандиона 3 и необходимые эксципиенты (например, солюбилизирующие или стабилизирующие агенты, буферы, антиоксиданты и т.п.) растворяют или суспендируют в подходящем фармакологически приемлемом носителе (например, в «воде для инъекций» или в «растворе глюкозы», или ПЭГ) с выдерживанием смеси при температуре от 20 до 100°C до полного растворения всех ингредиентов. После образования раствора pH композиции доводят до значения 5-8, более предпочтительно pH 6-7, с помощью подходящего буфера (например, лимонной кислоты и цитрата натрия и др.). При необходимости раствор разбавляют водой для инъекций для получения желаемой концентрации антрафурандиона 3 (предпочтительно 0.1% до 5%), после чего, для удаления нерастворимых материалов и пирогена, раствор фильтруют через мембранный фильтр, и затем раствором заполняют герметизируемый стеклянный сосуд (ампулу или флакон), после чего стерилизуют, укупоривают и хранят в защищенном от действия света месте.

Таким образом, настоящее изобретение описывает готовые жидкие фармацевтические композиции для парентерального применения, содержащие антрафурандион 3. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления композиция является сухой (как, например, лиофилизированной) композицией, которая может быть восстановлена, ресуспендирована или регидратирована для получения стабильной жидкой композиции фармацевтического вещества. Так, авторы настоящего изобретения путем лиофилизации жидких композиций получили ряд лиофилизированных препаратов, обладающих превосходной лекарственной стабильностью в процессе приготовления и хранения и легко восстанавливающихся в жидкую композицию при добавлении водного растворителя. Соответственно, настоящее изобретение также включает лиофилизированные композиции антрафурандиона 3. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть промежуточной жидкой (как, например, водной) композицией, которую можно высушить (как, например, лиофилизировать) или жидкой (как, например, водной) композицией, полученной посредством восстановления или ресуспендирования сухой композиции.

Для получения лиофилизированных композиций, являющихся предметом настоящего изобретения, жидкую композицию антрафурандиона 3, полученную, как описано выше, заливают в жесткий сосуд, такой как стерильная ампула, флакон или пузырек и подвергают лиофилизации традиционным способом. Количество жидкого препарата, которым заполняют сосуд, составляет, например от 5 до 50% (об./об.) от объема сосуда, особенно предпочтительно 10-25% (об./об.). Внешнюю температуру при лиофилизации предпочтительно поддерживают от -70 до 0°C, особенно предпочтительно от -60 до -40°C, и применяемое давление для сублимации растворителя предпочтительно составляет от 0.01 до 0.2 мм рт. ст., более предпочтительно от 0.01 до 0.1 мм рт. ст. Предпочтительно скорость лиофилизации регулируется таким образом, чтобы растворитель (в расчете на раствор) сублимировался со скоростью от 10 мкл до 100 мкл на 1 см площади поверхности, с которой сублимируется растворитель в течение 1 часа.

В случае лиофилизации жидкой композиции, особенно содержащей декстран, маннит, и/или карбонат натрия и др., защита от разрушения сосуда, содержащего лиофилизируемый раствор, обеспечивается введением добавок, например сульфатов щелочных металлов (например, сульфата натрия, сульфата калия и др.) в указанный жидкий препарат. Кроме того, лиофилизируемые композиции могут содержать дополнительные криозащитные компоненты, предотвращающие осаждение лекарственного соединения, такие как поверхностно-активные вещества, смачивающие или эмульгирующие агенты (как, например, лецитин, полисорбат 80, полиоксиэтиленстеарат). Содержание указанных эксципиентов может составлять 0.01-10% от веса лекарственного препарата.

Лиофилизированные композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, приготовленные, как указано выше, обладают отличными свойствами в отношении стабильности действующего вещества (антрафурандиона 3) в процессе приготовления или хранения. Вышеописанные лиофилизированные формы, как и жидкие композиции для парентерального применения антрафурандиона 3, могут быть упакованы в стерильные флаконы, ампулы или пакеты, пузырьки для однократного или многократного применения. Фармацевтические композиции в сухой (лиофилизированной) или жидкой концентрированной форме, как известно из уровня техники, перед использованием могут быть восстановлены или разбавлены посредством добавления стерильного фармацевтически приемлемого растворителя с получением необходимой концентрации терапевтического агента. Это дает возможность, при необходимости, легко приготовить стерильную жидкую композицию для парентерального применения антрафурандиона 3, которая может быть непосредственно введена пациенту.

Антрафурандион 3 и жидкие фармацевтические композиции, содержащие от 0.1 до 5% соединения формулы 3 или его соли, могут быть применены парентерально (например, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, ректально, интраспинально, интраперитонеально, внутриполостно) для лечения опухолевых болезней, включая заболевания, осложненные резистентностью к другим лекарственным средствам.

Термин "антрафурандион", использованный в настоящем описании, означает, 3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-дион.

Термином "защитная группа" в настоящем изобретении обозначается группа, подходящая для блокирования функциональной группы в условиях проведения реакций, как описано литературе [Green Т.W.; Wuts P.G. М. Protective Groups in Organic Synthesis. 1991, 351]. Пример таких групп для блокирования аминогруппы включает, без ограничения перечисленным, трет-бутоксикарбонильную (Boc), адамантилоксикарбонильную (Adoc), флуоренилметоксикарбонильную (Fmoc), ацетил, карбонибензилокси (Cbz), метоксикарбонильную, этоксикарбонильную.

Термин "фармацевтическая композиция", использованный в настоящем описании, означает, например, смесь, содержащую определенное количество терапевтического агента, например, терапевтически эффективное количество лекарственного соединения, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, предназначенную для введения млекопитающему, например человеку, для лечения опухолевых заболеваний.

Термин "фармацевтически приемлемый", использованный в настоящем описании, относится к соединениям, композициям и/или лекарственным формам, которые при контакте с тканями млекопитающих, прежде всего, тканями человека, не вызывают аллергических реакций, раздражения, осложнений или других токсических проявлений, и указанные соединения характеризуются достаточно высоким соотношением польза/риск.

"Фармацевтически приемлемая соль" в настоящем изобретении означает обычные соли, получаемые прибавлением кислоты к основанию, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства антрафурандиона 3 и образуются из его свободного основания и подходящих органических или неорганических кислот. Примеры солей, получаемых прибавлением кислоты, включают соли, полученные из органических кислот, например, метансульфоновой, этансульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, п-толуолсульфоновой кислот или неорганических кислот, например, хлористоводородной, бромистоводородной, йодистоводородной, серной, сульфаминовой кислот и т.п. Кроме того, термин "фармацевтически приемлемая соль" также включает фармацевтически приемлемые сольваты, предпочтительно гидраты. Химическое превращение антрафурандиона 3 в соль осуществляется способом, хорошо известным химикам-фармацевтам, обеспечивающим улучшенную физическую и химическую стабильность, гигроскопичность, сыпучесть и растворимость соединений [см., например, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Edition). R.C. Rowe (Ed.), 1995, 1456-1457].

Термин "фармакологически приемлемый носитель" в настоящем изобретении означает один или несколько совместимых жидких или твердых разбавителей или наполнителей, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку. Предпочтительно в качестве фармацевтически приемлемого носителя в фармацевтических композициях по изобретению используются протон-содержащие среды, более предпочтительно водные среды.

Концентрация терапевтического агента в фармацевтической композиции составляет определенное значение, обеспечивающее введение терапевтически эффективного количества лекарственного средства, которое зависит от скорости абсорбции, инактивации и выведения из организма препарата, а также от тяжести состояния пациента или от других факторов, известных специалистам в данной области техники.

"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" соединения в настоящем изобретении означает количество антрафурандиона 3 или его фармацевтически приемлемой соли, которое значительно подавляет пролиферацию опухолевых клеток и эффективно для предупреждения, ослабления или смягчения симптомов заболевания или увеличения продолжительности жизни субъекта, подвергающегося лечению. Определение терапевтически эффективного количества относится к компетенции специалиста в данной области техники. Терапевтически эффективное количество или дозировка соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, может меняться в широких пределах и может определяться способом, известным в данной области техники.

Для конкретного реципиента соответствующий курс лечения подбирается с учетом индивидуальной потребности и мнения врача, который вводит фармацевтические композиции пациенту или назначает введение фармацевтических композиций. Суточную дозу терапевтического агента можно вводить однократно в виде разовой дозы или многократно в виде разделенных доз, которые вводят через определенные периоды времени, или, при парентеральном введении, ее можно вводить путем непрерывного вливания. Таким образом, необходимое количество терапевтического агента, например необходимое терапевтически эффективное количество, определяет специалист в данной области медицины. Например, доза терапевтического агента может варьироваться в зависимости от возраста, веса тела или условий в интервале от приблизительно 1 мг до приблизительно 100 мг в расчете на антрафурандион 3 или его фармацевтически приемлемую соль на килограмм массы тела реципиента в сутки.

Следующие ниже неограничивающие примеры даны для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалисты в данной области техники легко поймут, что для стабилизации лекарственных композиций на основе антрафурандиона 3 могут быть использованы разные эксципиенты и варианты осуществления настоящего изобретения.

Пример 1

Синтез метансульфоната (R,S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-диона (1)

Смесь 0.5 г (1.6 ммоль) 4,11-дигидрокси-5,10-диоксо-2-метилантра[2,3-b]фуран-3-карбоновой кислоты (a, схема A), бензола (25 мл) и 0.6 мл (8.5 ммоль) тионилхлорида кипятят при интенсивном перемешивании 60 мин, и отгоняют летучие компоненты смеси в вакууме. Полученный хлорангидрид b (схема A) суспендируют в хлороформе (25 мл), и при перемешивании прибавляют раствор 0.7 г (3.3 ммоль) (R,S)-3-(трет-бутоксикарбониламино)пирролидина в смеси хлороформа (10 мл) и пиридина (0.6 мл). Реакционную смесь кипятят 10 мин, переносят в делительную воронку, разбавляют теплым хлороформом (50 мл) и промывают разбавленным раствором HCl, водой, сушат Na₂SO₄, и отгоняют растворитель в вакууме. Остаток растворяют в хлороформе, раствор вносят в хроматографическую колонку с силикагелем, и элюируют продукт смесью хлороформ-метанол (20:1). Фракции, содержащие продукт, объединяют, и отгоняют растворитель в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из диоксана, промывают диоксаном и сушат. Выход Boc-производного c (схема A) 0.65 г (83%) в виде красного порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil 100-5 C18, 4.6×250 мм (Akzo Nobel); элюэнты: A - H₃PO₄ (0.01 м), В - MeCN; градиент В 20→60% (30 мин); LW=260 нм): t_R=8.9 мин, чистота 96%. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д.: 8.18 (2H, м, Н-6,7); 7.90 (2Н, м, Н-8,9); 7.19 (1Н, м, NH); 4.08 (1Н, м, NCH₂); 3.95 (1Н, м, NCH₂); 3.69 (2Н, м, NCH₂); 3.69 (1Н, м, CH); 2.51 (3H, с, Me); 2.08 (1Н, м, CH₂CH₂CH); 1.80 (1H, м, CH₂CH₂CH), 1.28 (9Н, с, OBu^t). Найдено: m/z (ESI), 507.1769 [М+Н]⁺. C₂₇H₂₇N₂O₈. Вычислено: 507.1762.

В круглодонной колбе, снабженной обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, растворяют 0.6 г (1.2 ммоль) карбоксамида с в теплом хлороформе (25 мл), и при перемешивании прибавляют раствор метансульфокислоты (0.15 мл) в хлороформе (2 мл). Смесь перемешивают 1.5-2 ч, и отфильтровывают красный осадок на воронке Бюхнера, промывают ацетоном (10 мл), эфиром (10 мл) и сушат. Выход 0.5 г (80%) метансульфоната (R,S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-дион-3-карбоксамида (1) в виде кирпично-красного порошка с Т. пл. >250°C. ТСХ (SilicaGel 60 F₂₅₄ (Merck)): Rf=0.1, хлороформ-метанол-вода (10:10:1). ВЭЖХ (колонка Kromasil 100-5 C18, 4.6×250 мм (Akzo Nobel); элюэнты: A - H₃PO₄ (0.01 м), B - MeCN; градиент B 20 → 60% (30 мин); LW=260 нм): t_R=17.2 мин, чистота 99.2%. ЭСП (EtOH), λ_макс., нм, (lgε): 261 (4.4), 479 (4.0). ИК-спектр, ν_max, см^-1: 1615, 1584, 1462, 1419, 1351, 1301, 1166, 1044, 1021, 968. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆), δ, м.д.: 8.21 (2Н, м, Н-6,7); 7.92 (2Н, м, H-8,9); 3.89 (1H, м, NCH₂); 3.80 (1H, м, NCH₂); 3.55 (3H, м, NCH₂, CH); 2.53 (3H, c, Me); 2.32 (3H, c, Me); 2.22 (1H, м, CH₂CH₂CH); 1.98 (1H, м, CH₂CH₂CH). Найдено, %: C 51.64, H 4.67, N 5.13. C₂₂H₁₈N₂O₆*CH₄O₃S*2H₂O. Вычислено, %: C 51.30, H 4.87, N 5.20. Масс-спектр найдено, m/z (ESI): 407.1221 [М+H]⁺. C₂₂H₁₉N₂O₆. Вычислено: 407.1238.

Пример 2

Синтез метансульфоната (R)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-диона (2)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-дигидрокси-5,10-диоксо-2-метилантра[2,3-6]фуран-3-карбоновой кислоты (a, схема A) и (R)-3-(трет-бутоксикарбониламино)пирролидина. Выход антрафурандиона 2 - 85%. Т.пл. >250°C. ТСХ (SilicaGel 60 F₂₅₄ (Merck)): Rf=0.1, хлороформ-метанол-вода (10:10:1). ВЭЖХ (колонка Kromasil 100-5 C18, 4.6×250 мм (Akzo Nobel); элюэнты: А - H₃PO₄ (0.01 м), B - MeCN; градиент В 20 → 60% (30 мин); LW=260 нм): t_R=17.2 мин, чистота 99.2%. ЭСП (EtOH), λ_макс., нм, (lgε): 261 (4.4), 479 (4.0). ИК-спектр, ν_max, см^-1: 1615, 1584, 1462, 1419, 1351, 1301, 1166, 1044, 1021, 968. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д.: 8.21 (2H, м, H-6,7); 7.92 (2H, м, H-8,9); 3.89 (1H, м, NCH₂); 3.80 (1H, м, NCH₂); 3.55 (3H, м, NCH₂, CH); 2.53 (3H, c, Me); 2.32 (3H, c, Me); 2.22 (1H, м, CH₂CH₂CH); 1.98 (1H, м, CH₂CH₂CH). Найдено, %: C 51.32, H 4.60, N 5.07. C₂₂H₁₈N₂O₆*CH₄O₃S*2H₂O. Вычислено, %: C 51.30, H 4.87, N 5.20. Масс-спектр найдено, m/z (ESI): 407.1221 [М+H]⁺. C₂₂H₁₉N₂O₆. Вычислено: 407.1238.

Пример 3

Синтез метансульфоната (5)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диона (3)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-дигидрокси-5,10-диоксо-2-метилантра[2,3-6]фуран-3-карбоновой кислоты (a, схема A) и (S)-3-(трет-бутоксикарбониламино)пирролидина. Выход антрафурандиона 3 - 83%. Т. пл. >250°C. ТСХ (SilicaGel 60 F₂₅₄ (Merck)): Rf=0.1, хлороформ-метанол-вода (10:10:1). ВЭЖХ (колонка Kromasil 100-5 C18, 4.6×250 мм (Akzo Nobel); элюэнты: A - H₃PO₄ (0.01 м), B - MeCN; градиент B 20 60% (30 мин); LW=260 нм): t_R=17.2 мин, чистота 99.8%. ЭСП (EtOH), λ_макс., нм, (lgω): 261 (4.4), 479 (4.0). ИК-спектр, ν_max, см^-1: 1615, 1584, 1462, 1419, 1351, 1301, 1166, 1044, 1021, 968. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д.: 8.21 (2H, м, H-6,7); 7.92 (2H, м, Н-8,9); 3.89 (1H, м, NCH₂); 3.80 (1H, м, NCH₂); 3.55 (3H, м, NCH₂, CH); 2.53 (3H, с, Me); 2.32 (3H, c, Me); 2.22 (1H, м, CH₂CH₂CH); 1.98 (1H, м, CH₂CH₂CH). Найдено, %: C 51.45, H 4.60, N 5.01. C₂₂H₁₈N₂O₆*CH₄O₃S*2H₂O. Вычислено, %: C 51.30, H 4.87, N 5.20. Масс-спектр найдено, m/z (ESI): 407.1221 [М+H]⁺. C₂₂H₁₉N₂O₆. Вычислено: 407.1238.

Полученный метансульфонат (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-диона (3), обладающий превосходной стабильностью, использован в качестве терапевтического агента для приготовления фармацевтических композиций, приведенных ниже в примерах 5, 6. Указанный терапевтический агент характеризуется ограниченной растворимостью в водной среде. Примеры описывают приготовление стерильных дозированных инъекционных композиций из антрафурандиона 3 и вспомогательных компонентов фармацевтической чистоты, пригодных для использования в парентеральных лекарственных формах. Приготовление дозированных инъекционных форм антрафурандиона 3 проводилось весо-объемным методом согласно указаниям Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Пример 4

Исследование стабильности антрафурандиона 3

Исследование образцов метансульфоната (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диона (3) (полученного методом, описанным в примере 3), хранившихся 1 год в естественных условиях (25°C, в затемненном месте) и 2 месяца в условиях ускоренного старения (64 дня при 60°C), не выявили достоверных изменений ни по одному из показателей, включая элементный и стереохимический состав субстанции. Исследование образцов антрафурандиона 3, хранившихся при 95%-ой относительной влажности (камера с 10%-ной серной кислотой) и в условиях нулевой влажности (камера с фосфорным ангидридом), показало, что после 3 месяцев хранения изменение веса образцов не превышает 0.5-1%, что позволяет считать субстанцию антрафурандиона 3 стабильной. Качество образцов по показателям «Внешний вид», «Цвет» и «Посторонние примеси», хранившихся в указанных условиях, по сравнению с исходными образцами не изменилось. Таким образом, полученные данные свидетельствует о негигроскопичности субстанции антрафурандиона 3 и высокой стабильности ее состава при хранении.

Пример 5

Приготовление фармацевтических композиций антрафурандиона 3 для парентерального применения

Для соблюдения изотоничности жидкие фармацевтические композиции антрафурандиона 3 готовят в «изотоническом растворе глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» в стерильной посуде. В мерный сосуд наливают 3/4 от требуемого объема растворителя, растворяют в нем отвешенное количество антрафурандиона 3 и вспомогательных компонентов, при необходимости нагревая и помешивая смесь. Растворы субстанции предварительно стерилизуют, нагревая до 95-98°C и выдерживая при этой температуре 10 мин. После охлаждения удаляют бактериальную контаминацию и механические примеси фильтрованием раствора через микропористый фильтр (размер пор 35 µm) в асептических условиях. Полученный раствор переносят в мерный сосуд и доводят стерильным растворителем до требуемого объема. После проверки содержания антрафурандиона 3 методом ВЭЖХ (требуемая концентрация 2±0.1 мг/мл) растворы дозируют по 10 мл в стерильные флаконы из нейтрального стекла. Флаконы с растворами закрывают стерильной пергаментной бумагой, повторно стерилизуют 10 мин при 95°C и после охлаждения закупоривают стерильными резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками и маркируют. Таким образом были приготовлены 0.2%-ные растворы антрафурандиона 3 для парентерального применения (каждый флакон содержит 10 мл раствора), иллюстративные рецептуры которых приведены ниже (представлены только концентрации антрафурандиона 3 и вспомогательных компонентов).

Состав 1: 2 мг/мл антрафурандиона 3; 200 мг/мл полиэтиленгликоля (ПЭГ 400); 0.5 мг/мл бензилового спирта.

Состав 2: 2 мг/мл антрафурандиона 3; 200 мг/мл полисорбата 80 (твин 80); 0.5 мг/мл натрия бензоата, 0.2 мг/мл аскорбиновой кислоты.

Состав 3: 2 мг/мл антрафурандиона 3; 10 мг/мл 3-гидроксипропил-β-циклодекстрина (степень замещения 5); 0.5 мг/мл сорбата калия, 0.1 мг/мл цитрата натрия.

Полученные фармацевтические композиции антрафурандиона 3 стабильны при хранении в естественных условиях в течение 6 месяцев (при 25°C, в затемненном месте). Мониторинг состава инъекционных растворов антрафурандиона 3 (составы 1-3), хранившихся 2 месяца в условиях ускоренного старения (64 дня при 60°C), показал, что снижение содержания действующего вещества в них составляет 2.7% (состав 1), 1.2% (состав 2) и <0.5% (состав 3). Изменений по другим показателям в составах 1-3 не выявлено.

Пример 6

Получение лиофилизированных фармацевтических композиций для парентерального применения антрафурандиона 3

Растворы антрафурандиона 3 для получения лиофилизированных фармацевтических композиций готовят в дистиллированной воде в стерильной посуде. В мерный сосуд наливают 3/4 от требуемого объема воды, растворяют в ней отвешенное количество антрафурандиона 3 и вспомогательных компонентов, при необходимости нагревая и помешивая смесь. Растворы антрафурандиона 3 предварительно стерилизуют, нагревая до 95-98°C, и выдерживают при этой температуре 10 мин. После охлаждения удаляют бактериальную контаминацию и механические примеси фильтрованием раствора через микропористый фильтр в асептических условиях. Полученный раствор переносят в мерный сосуд и доводят стерильной водой до требуемого объема. После проверки содержания антрафурандиона 3 методом ВЭЖХ (требуемая концентрация 10±0.5 мг/мл) растворы дозируют по 2 мл в стерильные флаконы из нейтрального стекла. Флаконы с растворами закрывают стерильными марлевыми тампонами, повторно стерилизуют 10 мин при 95°C и после охлаждения до комнатной температуры выдерживают при -70°C 12 ч. Флаконы с замороженным раствором вносят в установку для лиофильной сушки и выдерживают 12 ч при давлении 0.01 мм рт. ст. После извлечения из установки флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

Иллюстративные рецептуры лиофилизированных фармацевтических композиций антрафурандиона 3 для приготовления инъекционных растворов приведены ниже (представлен состав композиций антрафурандиона 3 из расчета на один флакон объемом 10 мл).

Состав 4: 20 мг антрафурандиона 3; 200 мг поливинилпирролидона; 1 мг сорбита.

Состав 5: 20 мг антрафурандиона 3; 200 мг 3-гидроксипропил-γ-циклодекстрина; 1 мг полисорбата 80.

Состав 6: 20 мг антрафурандиона 3; 80 мг 3-гидроксипропил-β-циклодекстрина (степень замещения 5), 1 мг цитрата натрия.

Приготовленные составы стабильны при хранении как в естественных условиях (1 год, 25°C, в затемненном месте), так и в условиях ускоренного старения (64 дня при 60°C). Лиофилизированные композиции составов 4-6 легко восстанавливаются в исходный гомогенный раствор при комнатной температуре менее чем через 5 минут при добавлении стерильной воды или «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций». Для приготовления 10 мл 0.2% раствора антрафурандиона 3 к содержимому флакона прибавляют 10 мл «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций», периодически помешивая содержимое флакона до полного растворения композиции.

Пример 7

Сравнительное исследование антипролиферативной активности стереоизомеров антрафурандиона

Сравнительное исследование антипролиферативной активности R- и S-изомеров антрафурандиона 2 и 3 проводилось на метансульфонатах, описанных в примерах 2 и 3, в тестах in vitro на расширенной панели опухолевых клеток мыши и человека, включающей линии с активированными механизмами множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Данные об антипролиферативной активности (IC₅₀ - концентрация, ингибирующая рост клеток на 50%) приводятся в таблице 1, где для каждой линии указан тип. Определение IC₅₀ проводилось с помощью МТТ-теста по методике, описанной в литературе [Т. Mossman, Immunol. Methods, 1983, 65, 55]. Как видно из представленных данных, оба стереоизомера антрафурандиона 2 и 3, описанные в примерах 2, 3, ингибируют рост опухолевых клеток в микромолярных и субмикромолярных концентрациях. Для всех тестированных линий опухолевых клеток антипролифератвная активность S-антрафурандиона 3, описанного в примере 3, выше, чем его антипода 2, полученного в примере 2.

Важно отметить, что S-антрафурандион 3 более активен, чем его антипод 2 в отношении тестированных линий опухолевых клеток с активированными механизмами МЛУ. Так, он практически одинаково токсичен для клеток человеческого лейкоза линии K562 и Pgp-положительной резистентной сублинии K562/4. Кроме того, S-антрафурандион 3 практически одинаково действует как на клетки линии НСТ116 (с фенотипом р53^+/+), так и на резистентную сублинию HCT116p53KO с делецией гена р53 (с фенотипом р53^-/-).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-дион (3), являющийся предметом настоящего изобретения, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, включая ряд резистентных линий, и более активно, чем его энантиомер 2.

Пример 8

Сравнительное исследование противоопухолевой активности различных солевых и стреоизомерных форм антрафурандиона на мышах с внутрибрюшинно перевитым лимфолейкозом Р388

В опытах использованы мыши-самки гибридов BDF₁ с массой тела 20-21 г. Перед опытом мышей ранжировали по группам, в каждой группе 6 особей. Одну группу мышей с опухолью (n=5) оставляли без специфического воздействия и считали контрольной. Основные группы получали лечение различными солевыми и стереоизомерными формами антрафурандиона. Для исследования использован штамм лимфолейкоза Р388. В опытах использованы 2-9 пассажи опухоли in vivo на мышах-самках линии DBA₂. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам в брюшную полость по 1 млн клеток на мышь. Проведение терапевтического эксперимента с оценкой результатов исследования выполнено в соответствии с рекомендованной методикой [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657].

Основные группы животных получали раствор метансульфонатов различных стереоизомерных форм антрафурандиона (примеры 1-3) или гидрохлорида рацемического антрафурандиона 1 (полученного по методике, описанной в патенте RU 2412166). Все тестируемые растворы содержали 2 мг/мл действующего вещества. Соли антрафурандиона растворяли в необходимом объеме «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» при нагревании до 50-60°C и после охлаждения раствора вводили животным. Мыши контрольной группы получали в/б 5% раствор глюкозы в адекватном объеме и режиме лечения. Введение растворов животным осуществляли в соответствующих индивидуальным дозам объемах один раз в сутки. Лечение проводили на 2-6-е сутки после перевивки опухоли.

Оценка противоопухолевого эффекта выполнена по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей в леченых группах в сравнении с контрольной. Для этого определяли индивидуальную и среднюю в группе продолжительность жизни мышей (ПЖ, СПЖ), которые затем были использованы для расчета УПЖ. Показатель, составляющий разницу в СПЖ контрольной и леченой группах, выражали в процентах к группе контроля. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при р≤0.05.

Результаты сравнительного изучения различных солевых и стереоизомерных форм антрафурандиона (примеры 1-3), представленные в таблице 2, показывают, что при пятикратном ежедневном внутрибрюшинном введении в оптимальных разовых дозах 20 мг/кг (гидрохлорид рацемической формы антрафурандиона 1) и 30 мг/кг (метансульфонаты антрафурандиона 1-3) все исследованные формы антрафурандиона обладают достоверным противоопухолевым действием. Гидрохлорид и метансульфонат антрафурандиона 1 в оптимальных режимах применения показали значимый (более минимального критерия эффективности) противоопухолевый эффект без достоверного отличия (УПЖ=71 и 51% соответственно). Стереоизомеры метансульфоната антрафурандиона 2 и 3 существенно различаются по способности ингибировать развитие лейкоза Р388. Так, противоопухолевая активность. R-антрафурандиона 2 (пример 2) находится на уровне минимального критерия эффективности (25%), в то время как активность 5-изомера 3 (пример 3) значительно выше. Более того, противоопухолевой активность S-изомера метансульфоната антрафурандиона 3 значительно (в 2-2.5 раза) достоверно выше активности различных солей рацемической формы антрафурандиона 1. Как видно из представленных данных, S-антрафурандион 3, являющийся предметом настоящего изобретения, значительно превосходит по противоопухолевой активности антипод 2 и рацемический антрафурандион 1.

Пример 9

Сравнительное исследование противоопухолевой активности фармацевтических композиций антрафурандиона 3 на мышах с внутрибрюшинно перевитым лимфолейкозом Р388

В опытах использованы мыши-самки гибридов BDFi с массой тела 20-21 г. Перед опытом мышей ранжировали по группам, в каждой группе 4-6 особей. Одну группу мышей с опухолью (n=5) оставляли без специфического воздействия и считали контрольной. Основные группы получали лечение одним из вариантов жидких фармацевтических композиций антрафурандиона 3 (составы 1, 2, пример 5) или субстанцией антрафурандиона 3, получение которой описано в примере 3. Для исследования использован штамм лимфолейкоза Р388. В опытах использованы 2-9 пассажи опухоли in vivo на мышах-самках линии DBA₂. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам в брюшную полость по 1 млн клеток на мышь. Проведение терапевтического эксперимента с оценкой результатов исследования выполнено в соответствии с рекомендованной методикой [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657].

Основные группы животных получали раствор субстанции антрафурандиона 3 (пример 3) или жидкие композиции на его основе (составы 1, 2). Все тестируемые растворы антрафурандиона 3 содержали 2 мг/мл действующего вещества. Субстанцию антрафурандиона 3 растворяли в необходимом объеме «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» при нагревании до 50-60°C и после охлаждения раствора вводили животным. Мыши контрольной группы получали в/б 5% раствор глюкозы в адекватном объеме и режиме лечения. Введение растворов животным осуществляли в соответствующих индивидуальным дозам объемах один раз в сутки. Лечение проводили на 2-6-е сутки после перевивки опухоли.

Оценка противоопухолевого эффекта выполнена по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей в леченых группах в сравнении с контрольной. Для этого определяли индивидуальную и среднюю в группе продолжительность жизни мышей (ПЖ, СПЖ), которые затем были использованы для расчета УПЖ. Показатель, составляющий разницу в СПЖ контрольной и леченой групп, выражали в процентах к группе контроля. При аутопсии павших в опыте мышей определяли наличие лейкозного асцита в брюшной полости. Число мышей без асцита использовали в качестве одного из параметров эффективности лечения. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при p≤0.05.

Результаты сравнительного исследования противоопухолевой активности фармацевтических композиций антрафурандиона 3 (составы 1, 2), представленные в таблице 3, показывают, что при пятикратном ежедневном внутрибрюшинном введении в разовой дозе 30 мг/кг (суммарно 150 мг/кг) все композиции обладают значимым (более минимального критерия эффективности) высоким противоопухолевым эффектом на уровне субстанции антрафурандиона 3, получение которой описано в примере 3: УПЖ=144-148% (без достоверных отличий, р<0.05). Переносимость субстанции и обеих лекарственных форм хорошая, их применение не вызывает гибели мышей от токсичности, однако, лекарственные формы различаются по способности ингибировать развитие лейкозного асцита: применение состава 1 полностью блокирует развитие асцита у всех леченых животных, в то время как при использовании состава 2 отмечено формирование асцита у одного животного. Как видно из представленных данных, приведенные примеры жидких фармацевтических композиций антрафурандиона 3, являющиеся предметом настоящего изобретения, обладают высокой противоопухолевой активностью, советующей действующему веществу (5-антрафурандиону 3), но более удобны для практического применения.

Пример 10

Сравнительное исследование противоопухолевой активности лиофилизированных фармацевтических композиций антрафурандиона 3 на мышах с внутрибрюшинно перевитым лимфолейкозом Р388

В опытах использованы мыши-самки гибридов BDF₁ с массой тела 20-21 г. Перед опытом мышей ранжировали по группам, в каждой группе 5-6 особей. Одну группу мышей с опухолью (n=5) оставляли без специфического воздействия и считали контрольной. Основные группы получали лечение одним из вариантов лиофилизированных фармацевтических композиций антрафурандиона 3 (составы 4-6, пример 6) или субстанцией антрафурандиона 3, описанной в примере 3. Для исследования использован штамм лимфолейкоза Р388. В опытах использованы 2-9 пассажи опухоли in vivo на мышах-самках линии DBA₂. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам в брюшную полость по 1 млн клеток на мышь. Проведение терапевтического эксперимента с оценкой результатов исследования выполнено в соответствии с рекомендованной методикой [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657].

Основные группы животных получали раствор субстанции антрафурандиона 3 (пример 3) или растворы антрафурандиона 3, полученные восстановлением лиофилизированных составов 4-6 (примечание 6). Все тестируемые растворы антрафурандиона 3 содержали 2 мг/мл действующего вещества. Субстанцию антрафурандиона 3 (пример 3) растворяли в необходимом объеме «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» при нагревании до 50-60°C и после охлаждения раствора вводили животным. Раствор лиофилизированных составов 4-6 (пример 6) готовили прибавлением необходимого количества (10 мл на 1 флакон) «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» с периодическим помешиванием содержимого флакона до полного растворения композиции. Мыши контрольной группы получали в/б 5% раствор глюкозы в адекватном объеме и режиме лечения. Введение растворов животным осуществляли в соответствующих индивидуальным дозам объемах один раз в сутки. Лечение проводили на 2-6-е сутки после перевивки опухоли.

Оценка противоопухолевого эффекта выполнена по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей в леченых группах в сравнении с контрольной. Для этого определяли индивидуальную и среднюю в группе продолжительность жизни мышей (ПЖ, СПЖ), которые затем были использованы для расчета УПЖ. Показатель, составляющий разницу в СПЖ контрольной и леченой групп, выражали в процентах к группе контроля. При аутопсии павших в опыте мышей определяли наличие лейкозного асцита в брюшной полости. Число мышей без асцита использовали в качестве одного из параметров эффективности лечения. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при р≤0.05.

Результаты сравнительного исследования противоопухолевой активности лиофилизированных фармацевтических композиций антрафурандиона 3 (составы 4-6), представленные в таблице 4, показывают, что при пятикратном ежедневном внутрибрюшинном введении в разовой дозе 30 мг/кг (суммарно 150 мг/кг) все лекарственные композиции дают значимый (более минимального критерия эффективности) высокий противоопухолевый эффект на уровне субстанции антрафурандиона 3, полученной в примере 3: УПЖ=115-162%, без достоверных отличий (р<0.05). Переносимость субстанции и обеих лекарственных форм хорошая, их применение не вызывает гибели мышей от токсичности, однако, лекарственные формы различаются по способности ингибировать развитие лейкозного асцита: применение субстанции антрафурандиона 3 и составов 4, 6 полностью блокирует развитие асцита у всех леченых животных, в то время как при использовании состава 5 отмечено формирование асцитов у ряда животных. Как видно из представленных данных, приведенные примеры лиофилизированных фармацевтических композиций антрафурандиона 3, являющихся предметом настоящего изобретения, обладают высокой противоопухолевой активностью, соответствующей действующему веществу (S-изомеру антрафурандиона 3), но более удобны для практического применения.

Пример 11

Исследование противоопухолевой активности лиофилизированной фармацевтической композиции антрафурандиона 3 на мышах с внутрибрюшинно перевитым лимфолейкозом P388/DOX с множественной лекарственной устойчивостью

В опытах использованы мыши-самки гибридов DBA₂ с массой тела 18-22 г. Перед опытом мышей ранжировали по группам, в каждой группе 5-7 особей. Одну группу мышей с опухолью (n=5) оставляли без специфического воздействия и считали контрольной. Основные группы (n=7) получали лечение лиофилизированной фармацевтической композицией антрафурандиона 3 (состав 6, пример 6) или доксорубицином для подтверждения устойчивости штамма. Для исследования использована линия лимфолейкоза Р388 с множественной лекарственной устойчивостью, индуцированной действием доксорубицина (P388/DOX). В результате активации механизма резистентности опухолевая клеточная линия P388/DOX нечувствительна не только к доксорубицину, но и к большинству традиционных противоопухолевых средств, включая рубомицин, карминомицин, винкристин, винбластин, митомицин C, блеомицетин [Доненко Ф.В. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1993, 116 (№9), 309-311]. Штамм поддерживали in vivo на половозрелых мышах-самках линии DBA₂ при введении доксорубицина в поддерживающей дозе 0.1 мг/кг в 0.05 мл стерильного физиологического раствора. В опытах использован лейкозный асцит, полученный из 3-го пассажа in vivo. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам-самкам DBA₂ в брюшную полость по 1 млн клеток на мышь. Проведение терапевтического эксперимента с оценкой результатов исследования выполнено в соответствии с рекомендованной методикой [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657].

Основная группа животных получала ежедневно пятикратно в разовой дозе 40 мг/кг раствор антрафурандиона 3 (содержащий 2 мг/мл действующего вещества), полученный восстановлением лиофилизированного состава 6 (пример 6). Раствор лиофилизированного состава 6 готовили прибавлением необходимого количества (10 мл на 1 флакон) «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» с периодическим помешиванием содержимого флакона до полного растворения композиции. Лечение проводили на 2-6-е сутки после перевивки опухоли. Мыши контрольной группы получали в/б 5% раствор глюкозы в адекватном объеме и режиме лечения. Введение растворов животным осуществляли в соответствующих индивидуальным дозам объемах один раз в сутки. Для контроля устойчивости штамма использована группа мышей (n=7), которым проводили внутрибрюшинную терапию доксорубицином («Лэнс-Фарм», РФ, во флаконах по 10 мг) в однократной эффективной дозе 7.5 мг/кг в 0.3 мл физиологического раствора для инъекций.

Оценка противоопухолевого эффекта выполнена по стандартному показателю увеличения продолжительности жизни (УПЖ), рассчитанному по разнице средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей в леченой и контрольной группах в процентах к контролю. О степени лейкозного поражения судили по наличию асцита и узлов в брюшной полости (+/-). Полученные данные обрабатывались статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. В качестве минимального критерия эффективности использовали УПЖ≥25% [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657]. Достоверными считали различия при р≤0.05.

Как видно из результатов, приведенных в таблице 5, фармацевтическая композиция антрафурандиона 3, являющаяся предметом настоящего изобретения, в отличие от доксорубицина, обладает высокой достоверной специфической (противоопухолевой) активностью в отношении лимфолейкоза P388/DOX с множественной лекарственной устойчивостью. Терапия составом 6 в эффективной схеме применения (пятикратно в разовой дозе 40 мг/кг) приводит к достоверному пролонгированию жизни мышей (УПЖ=36%, p<0.05). При этом у животных не наблюдалось накопления асцита. В группе мышей, получавших лечение доксорубицином, значимого увеличения продолжительности жизни не получено, и у всех животных отмечено накопление асцита.

Пример 12

Исследование противоопухолевой активности фармацевтических композиций антрафурандиона 3 на мышах с внутрибрюшинно перевитой меланомой B16/F10

В опытах использованы мыши-самки гибридов BDF₁ с массой тела 18-22 г. Перед опытом мышей ранжировали по группам, в каждой группе 11 особей. Одну группу мышей с опухолью (n=5) оставляли без специфического воздействия и считали контрольной. Вторая группа получала лечение лиофилизированной фармацевтической композицией антрафурандиона 3 (состав 6, пример 6). Для исследования использован штамм высокометастазирующей в легкие меланомы B16/F10. Штамм поддерживали in vivo на половозрелых мышах линии C57B16j обоего пола. В опытах использован опухолевый инокулят, полученный из 2 или 3 пассажей in vivo. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам-гибридам BDF₁ в брюшную полость по 1 млн клеток на мышь. Исследование выполнено в соответствии с рекомендованной методикой [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, 2012, 642-657].

Основные группы животных получали раствор антрафурандиона 3, содержащий 2 мг/мл действующего вещества, полученный восстановлением лиофилизированного состава 6 (пример 6). Раствор лиофилизированного состава 6 готовили прибавлением необходимого количества (10 мл на 1 флакон) «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» с периодическим помешиванием содержимого флакона до полного растворения композиции. Мыши контрольной группы получали в/б 5% раствор глюкозы в адекватном объеме и режиме лечения. Введение раствора животным осуществляли в соответствующих индивидуальным дозам объемах один раз в сутки. Лечение проводили на 2-6-е сутки после перевивки опухоли.

Оценка противоопухолевого эффекта выполнена по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей в леченых группах в сравнении с контрольной. Для этого определяли индивидуальную и среднюю в группе продолжительность жизни мышей (ПЖ, СПЖ), которые затем использованы для расчета УПЖ. Показатель, составляющий разницу в СПЖ контрольной и леченой групп, выражали в процентах к группе контроля. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. В качестве минимального критерия эффективности использовали УПЖ≥25% или Т/С≥125% (в контроле T/C=100%). Достоверными считали различия при p≤0.05.

Полученные результаты свидетельствуют, что лиофилизированная фармацевтическая композиция антрафурандиона 3 (состав 6), являющаяся предметом настоящего изобретения, обладает достоверной высокой противоопухолевой активностью, давая при пятикратном ежедневном внутрибрюшинном введении в разовой дозе 30 мг/кг (суммарно 150 мг/кг) УПЖ=50% (p<0.001), что выше минимального критерия эффективности. Переносимость фармацевтической композиции хорошая и ее применение не вызывает гибели мышей от токсичности.

Пример 13

Исследование острой токсичности антрафурандиона 3 и фармацевтической композиции на его основе

Изучение острой токсичности антрафурандиона 3 и фармацевтической композиции на его основе при однократном внутрибрюшинном введении проведено по методу Литчфилда-Уилкоксона на мышах самках линии BDF₁, массой 20-24 г. Животные, разделенные на группы по 6 особей, получали раствор субстанции антрафурандиона 3 (пример 3) или растворы, полученные восстановлением лиофилизированного состава 6 (пример 6). Субстанцию антрафурандиона 3 (пример 3) растворяли в необходимом объеме «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» при нагревании до 50-60°C и после охлаждения раствора вводили животным. Раствор лиофилизированной композиции состава 6 (пример 6) готовили прибавлением необходимого количества (10 мл на 1 флакон) «изотонического раствора глюкозы (5%) для внутривенных инъекций» и периодически помешивали содержимое флакона до полного растворения композиции. Растворы антрафурандиона 3 вводили мышам в 0.2% концентрации однократно внутрибрюшинно в диапазоне доз от 20 до 90 мг/кг. Расчет доз, характеризующих токсичность, проводили при помощи программы «StatPlus-2006».

Результаты исследования острой токсичности при внутрибрюшинном введении, представленные в таблице 6, показывают, что по основным токсикологическим параметрам ЛД₅₀ (доза, вызывающая гибель 50% животных) и МИД (максимально переносимая доза) токсичность для мышей фармацевтической композиции состава 6 (пример 6) достоверно ниже токсичности субстанции антрафурандиона 3 (пример 3).

Таблица 6 Параметры токсичности антрафурандиона 3 и фармацевтической композиции на его основе Препарат ЛД₅₀, мг/кг МПД (ЛД₁₀) Пример 3 52.5±5.4 39.4±3.9 Состав 6 68.3±6.2 47.6±2.3

Изобретение относится к сфере лекарственных препаратов, в частности к новому производному антрафурандиона формулы I или его фармацевтически приемлемым солям, обладающим высоким противоопухолевым эффектом и активностью в отношении опухолевых заболеваний с резистентностью к другим лекарственным средствам.

Кроме того, изобретение относится к противоопухолевым фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I, фармакологически приемлемый носитель и один или несколько эксципиентов, выбранных из сорастворителей, солюбилизаторов, наполнителей, эмульгаторов, консервантов, антиоксидантов, буферных соединений, веществ для поддержания изотоничности. Данные композиции обеспечивают эффективное применение антрафурандиона, поскольку обладают высокой стабильностью при хранении как в форме лиофилизата, так и в форме раствора, а также другими улучшенными характеристиками, включая растворимость, эффективность и переносимость. Изобретение также касается способа лечения опухолевых заболеваний, предусматривающий парентеральное введение пациенту антрафурандиона формулы I или фармацевтических композиций. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 табл., 13 пр.

1. Соединение формулы I, обладающее противоопухолевой активностью и представляющее собой (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-дион, или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, в котором фармацевтически приемлемой солью является метансульфонат.

3. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включающая терапевтически эффективное количество соединения по пп.1, 2, фармакологически приемлемый носитель и один или несколько эксципиентов, выбранных из сорастворителей, солюбилизаторов, наполнителей, эмульгаторов, консервантов, антиоксидантов, буферных соединений, веществ для поддержания изотоничности.

4. Фармацевтическая противоопухолевая композиция по п.3, в которой фармакологически приемлемый носитель содержит воду.

5. Фармацевтическая композиция по пп.3, 4, в которой эксципиентом является один или несколько сорастворителей, выбранных из полиэтиленгликоля, этанола, глицерина, 1,2-пропиленгликоля, 1,3-бутиленгликоля.

6. Фармацевтическая композиция по пп.3-5, в которой эксципиентом является один или несколько солюбилизаторов, выбранных из β-циклодекстрина или его производного, γ-циклодекстрина или его производного, поливинилпирролидона, полисорбата, кремофора, декстрана.

7. Лиофилизированная композиция, полученная путем лиофилизации противоопухолевой композиции по пп.3-6.

8. Фармацевтическая композиция, полученная растворением композиции по п.7 в водной среде.

9. Способ лечения опухолевых заболеваний, предусматривающий парентеральное введение нуждающемуся пациенту терапевтически эффективного количества вещества по пп.1, 2 или фармацевтических композиций по пп.2-8.

10. Способ лечения пациента с опухолевым заболеванием по п.9, имеющим лекарственную резистентность в отношении других лекарственных средств.