СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СПОНТАННОГО НАСТУПЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ У ЖЕНЩИН С I И II СТАДИЕЙ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования спонтанного наступления беременности в течение года у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза после проведения хирургического лечения бесплодия.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что в настоящее время отсутствуют эффективные методы лечения бесплодия у женщин с I и II стадией (так называемыми «малыми формами») наружного генитального эндометриоза. «Золотым стандартом» лечения эндометриоза в настоящее время является хирургическое удаление очагов в сочетании с гормональной терапией (Budinetz Т, Sanfilippo JS Treatment of endometriosis: a hormonal approach Minerva Ginecol., 2010, 62 (4): 373-80; Ozkan S, Murk W, Arici A Endometriosis and infertility: epidemiology and evidence-based treatments Ann N Y Acad Sci. 2008; 1127: 92-100). Однако комбинированное хирургическое и гормональное лечение применяют у женщин с бесплодием только при распространенных формах эндометриоза (Ge CX, Zhu XH, Tang XQ. Efficacy of conservative laparoscopic surgery combined with goserelin in treatment of 206 patients with severe ovarian endometriosis at short-term and long-term follow-up. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2012 Aug; 47 (8): 603-7), тогда как у пациенток с I-II стадией эндометриоза проводят только лишь хирургическое удаление эндометриоидных очагов. Хотя лечебная лапароскопия и оказывает позитивное влияние на восстановление репродуктивной функции (Jacobson TZ, Duffy JM, Barlow D, Farquhar C, Koninckx PR, Olive D. Laparoscopic surgery for subfertility associated with endometriosis. Cochrane Database Syst Rev. 2010 Jan 20; (1): CD001398. dot: 10.1002/14651858.CD001398.pub2), но по данным литературы хирургическое лечение бесплодия у женщин с «малыми» формами эндометриоза позволяет достичь наступления беременности только у 1 из 12 оперированных женщин (Diwadkar GB, Falcone T. Surgical management of pain and infertility secondary to endometriosis. Semin Reprod Med. 2011 Mar; 29(2): 124-9). Для повышения эффективности хирургического лечения бесплодия при «малых» формах наружного генитального эндометриоза рекомендуют после проведения хирургического лечения эндометриоза включать женщин в протоколы ЭКО (Chen ML, Lee КС, Yang CT, Hung KH, Wu МН. Simultaneous laparoscopy for endometriotic women undergoing in vitro fertilization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2012 Mar; 51(1): 66-70). В связи с этим, врачу необходимо правильно оценить шанс спонтанного наступления беременности после лечебной лапароскопии. Прогнозирование эффективности лапароскопического лечения поможет врачу скорректировать тактику ведения пациенток и оценить необходимость назначения им такого дорогостоящего метода, как ЭКО.

Ранее было предложено прогнозировать наступление беременности у инфертильных пациенток с эндометриозом по индексу EFI (индекс фертильности эндометриоза, который рассчитывают с учетом анамнестических данных (возраст, длительность бесплодия и акушерский анамнез) и данных, полученных при гистероскопическом и лапароскопическом обследовании (состояние труб, яичника, фимбрий справа и слева, распространенность эндометриоза по классификации AFS), при этом градацию каждого признака оценивают по шкале от 0 до 4 баллов и в результате определяют общую сумму баллов, которая может варьировать от 0 до 10. При значении индекса EFI, равном 0, наступление беременности в течение 1-3 лет после хирургического удаления очагов эндометриоза прогнозируют в 10% случаев, а при значении индекса EFI, равном 10, наступление беременности через 1 год после операции прогнозируют в 56% случаев, после 2-х лет - в 72%, после 3-х лет - в 75% случаев (Adamson G.D., Pasta D.J. Endometriosis fertility index: the new, validated endometriosis staging system // Fertility and Sterility. - 2010. - Vol.94. - No. 5. - P.1609-1615).

Данный способ имеет ряд недостатков:

- многие используемые признаки оцениваются врачом субъективно, что снижает диагностическую значимость индекса;

- расчет индекса требует больших временных затрат;

- способ имеет относительно невысокую точность прогноза (70%).

Одним из аналогов заявленного способа является способ прогнозирования частоты наступления беременности у женщин с наружным генитальным эндометриозом после проведения у них лечебных лапароскопических операций по определению у них до лечения показателей содержания в сыворотке крови эмбриональных антител с помощью ЭЛИ-П-теста. В тех случаях, когда показатели эффективности реакций ЭЛИ-П-теста составляют 41 усл.ед. и более у женщин с эндометриозом прогнозируют наступление беременности в 57,4% случаев, при отклонении всех антигенов тест-системы в сторону снижения до 50% от нормативных показателей прогноз частоты наступления беременности составляет 28,4%, а в случае снижения всех антигенов тест-системы свыше 50% от нормативных показателей прогнозируется 100% отсутствие наступления беременности (Боровкова Л.В. Репродуктивная функция у больных с генитальным эндометриозом: Автореф. дис. д.м.н. - М., 2004. - 34 с. ) Однако в данном способе используется метод ИФА, который имеет достаточно низкую воспроизводимость и требует постановки проб в дубликатах, что значительно увеличивает стоимость способа и время его проведения. Также данный способ имеет низкую точность.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ прогнозирования частоты наступления беременности у женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии путем иммунологического исследования периферической венозной крови до оперативного лечения, отличающийся тем, что в крови определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+ и при его значении, равном 2,6% или менее, прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза (Патент №2318215 Россия. Способ прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом / Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Д.Н. Шишков и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2008. - №6).

Данный способ был выбран нами в качестве прототипа - способ имеет точность - 77,8%.

Техническим результатом является расширение арсенала технических средств, а также повышение точности и специфичности способа прогнозирования спонтанного наступления беременности у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза. Технический результат достигается тем, что до оперативного лечения в периферической крови женщин с I-II стадией эндометриоза определяют относительное количество IL-1β + моноцитов и при его значении, равном или более 50%, в моноцитарном гейте прогнозируют спонтанное наступление беременности в течение года после хирургического лечения.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать спонтанное наступление беременности у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза после проведения хирургического лечения бесплодия по определению относительного содержания в периферической крови моноцитов, продуцирующих внутриклеточно IL-1β.

Ранее этот показатель использовали для оценки ответа моноцитов на стимуляцию липополисахаридов у пациентов с гиперхолистеринемией (Moutzouri Е., Tellis C.C., Rousouli K., Liberopoulos E.N., Milionis H.J., Elisaf M.S., Tselepis A.D. Effect of simvastatin or its combination with ezetimibe on Toll-like receptor expression and lipopolysaccharide - induced cytokine production in monocytes of hypercholesterolemic patients // Atherosclerosis.- 2012.- Vol. 225. - N. 2. - P. 381-387). Было также показано, что количество IL-1β - продуцирующих моноцитов повышалось при болезни Альцгеймера (de Lima Torres KC, de Lima GS, Fiamoncini CM, de Rezende VB, de Araujo Pereira P, Bicalho MA, de Moraes EN, Romano-Silva MA. Increased frequency of cluster of differentiation 14 (CD14+) monocytes expressing interleukin 1 beta (IL-1β) in Alzheimer′s disease patients and intermediate levels in late-onset depression patients // Int J Geriatr Psychiatry. 2013 May 14. doi: 10.1002/gps.3973. [Epub ahead of print]). У беременных женщин с гестозом в периферической крови было выявлено повышение количества IL-1β + моноцитов (Мание С.С. Роль провоспалительного цитокина интерлейкина-1β в патогенезе гестоза // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Иваново, 2006, 24 с.). Для прогнозирования наступления беременности у женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом, после проведения хирургического лечения бесплодия этот показатель не использовался.

Известно, что система интерлейкина-1β играет важную роль в регуляции репродуктивных процессов, в частности в обеспечении рецептивности эндометрия (Bulletti С, Flamigni С, de Ziegler D. Implantation markers and endometriosis // Reprod Biomed Online. - 2005. - Vol.11. - N.4. - P.464-468). Показано, что IL-1β участвует в развитии иммунологической толерантности в плаценте, а также способствует успешному наступлению беременности путем регуляции активности ядерного фактора NF-κВ (Geisert R., Fazleabas A., Lucy M., Mathew D. Interaction of the conceptus and endometrium to establish pregnancy in mammals: role of interleukin 1β // Cell Tissue Res. - 2012. - Vol.349. - N.3. - P.825-838). Сообщалось также, что продукция IL-1β на системном уровне коррелирует с наступлением беременности у пациенток, участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения, при этом высокие значения сывороточного содержания IL-1β отмечались у женщин с успешно наступившей беременностью (Bonetti T.C., Salomao R., Bruniaiti M., Braga D.P., Borges E. Jr., Silva I.D. Cytokine and hormonal profile in serum samples of patients undergoing controlled ovarian stimulation: interleukin-1βeta predicts ongoing pregnancy // Hum Reprod. - 2010. - Vol.25. - N.8. - P.2101-2106). Сниженная внутриклеточная продукция IL-1β моноцитами крови у женщин с бесплодием при I-II стадии наружного генитального эндометриоза может быть причиной нарушения процессов имплантации. Поэтому проведение только хирургического удаления очагов эндометриоза у пациенток с низким содержанием IL-1R+ моноцитов неэффективно для восстановления репродуктивной функции и требует назначения дополнительных лечебных мероприятий.

Способ осуществляется следующим образом:

1) К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл RPMI 1640 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования (Bourn A. Isolation of rnononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest - 1968. - v.21. - N 97. - p.77).

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мл. Затем проводят процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с использованием коммерческого набора Fixative Solution IOTest®3 10x Concentrate (Beckman Coulter, USA) и моноклональных антител к IL-1β, коньюгированных с флюоресцеин изотиоцианатом (eBioscience, USA) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для этого к 50 мкл клеточной суспензии добавляют 100 мкл фиксирующего буфера А из набора Fixative Solution IOTest®3 10x Concentrate и инкубируют клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Далее клетки отмывают от фиксирующего буфера и добавляют 100 мкл пермеабилизирующего буфера В и 2 мкл моноклональных антител к IL-1β, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (FITC). Клетки инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix™ (BD Biosciences, Belgium).

3) Определяют относительное количество IL-1β клеток в моноцитарном гейте на проточном цитометре. При его значении, равном 50% или более, прогнозируют спонтанное наступление беременности в течении года.

Отличительные признаки способа: установлен прогностический параметр относительного содержания IL-1β + моноцитов, при значении которого 50,0% или более, в моноцитарном гейте прогнозируют спонтанное наступление беременности.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная И., 37 лет, обратилась по поводу вторичного бесплодия в течение 3 лет. В анамнезе 1 медицинский аборт без осложнений и 1 самопроизвольный выкидыш на раннем сроке беременности; кольпит - пролечен. При влагалищном исследовании: шейка матки без патологии, конической формы; матка нормальных размеров, подвижная, безболезненная. Придатки не увеличены, безболезненны с обеих сторон. Пальпация крестцово-маточных связок безболезненна. Обследована по поводу бесплодия: цикл - двухфазный по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования эндометрия, по данным гистеросальпингографии -полость матки не деформирована, просвет маточных труб имеет неизмененный вид, трубы контрастируются на всем протяжении, контраст свободно поступает в брюшную полость. Муж обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест положительный.

Клинический диагноз: вторичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IL-1β+ моноцитов, которое составило 66,2%.

Заключение: прогнозируется спонтанное наступление беременности в течение одного года после проведения оперативной лапароскопии и деструкции очагов эндометриоза.

На 9 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: брюшная полость свободна, матка нормальных размеров. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации. Яичники не изменены. На брюшине правой крестцово-маточной связке обнаружены единичные поверхностные очаги эндометриоза площадью менее 3 см². Произведена коагуляция очагов эндометриоза монополярным коагулятором. Выполнена биопсия брюшины. Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины.

Диагноз при выписке: Бесплодие вторичное. Наружный генитальный эндометриоз I-II стадии.

Спустя два месяца после операции наступила беременность, завершившаяся своевременными родами.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2. Пациентка П., 33 года, со вторичным бесплодием в течение 4 лет. В анамнезе 3 медицинских аборта, поступила на отделение эндохирургии для уточнения причины бесплодия. Состоит в браке, гинекологические заболевания отрицает. Предъявляет жалобы на тянущие постоянные боли внизу живота, не связанные с менструальным циклом, физической нагрузкой, половым актом, актом дефекации и слабо купирующиеся приемом нестероидных противовоспалительных средств. В ходе предшествующего обследования выявлено наличие двухфазного менструального цикла (по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования эндометрия), по данным гистеросальпингографии полость матки не изменена, маточные трубы умеренно извиты, контрастируются на всем протяжении, контраст в брюшную полость поступает с обеих сторон. Супруг обследован - отклонений от нормы не выявлено. Посткоитальный тест положительный. При влагалищном исследовании: тело матки нормальных размеров, подвижное, безболезненное, придатки не увеличены с обеих сторон, безболезненны при пальпации. Болезненность при пальпации в области крестцово-маточных связок и заднего свода.

Клинический диагноз: вторичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IL-1β+ моноцитов, которое составило 33,5%.

Заключение: прогнозируется отсутствие спонтанного наступления беременности в течение одного года после лапароскопии.

На лапароскопии: брюшная полость свободна, матка нормальных размеров. Маточные трубы визуально не изменены, при хромогидротубации заполняются красителем. На брюшине крестцово-маточных связок - поверхностные и глубокие очаги эндометриоза >3 см². Яичники нормальных размеров, в правом - постовуляторная «стигма».

Проведено иссечение и деструкция очагов эндометриоза. Эндометриоз верифицирован гистологически. Диагноз при выписке: Бесплодие вторичное. Наружный генитальный эндометриоз I-II стадии.

В течение года регулярной половой жизни без контрацепции беременность не наступила.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился. Больной рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение.

Пример 3. Больная К., 26 лет. Обратилась с жалобами на боли внизу живота перед менструацией и умеренную боль при половом акте. Бесплодие в одном браке в течение 3 лет. Состоит в первом браке, гинекологических заболеваний в анамнезе не отмечает.

При дооперационном обследовании установлен двухфазный менструальный цикл (по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования эндометрия). По данным гистеросальпингографии полость матки имеет правильную форму, маточные трубы заполняются контрастом на всем протяжении, не расширены; контраст в брюшную полость поступает с обеих сторон. Муж обследован - нормозооспермия. Посткоитальный тест положительный. При осмотре: матка нормальных размеров, подвижная, безболезненная. Придатки не определяются. Резко болезненен задний свод. Выделения слизистые, умеренные. Направлена на лапароскопию для уточнения причины бесплодия.

Диагноз: первичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IL-1β+ моноцитов, которое составило 50,0%.

Заключение: прогнозируется наступление беременности в течение одного года после проведения оперативной лапароскопии и деструкции очагов эндометриоза.

На 7 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: брюшная полость свободна, матка нормальных размеров. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации. Яичники не изменены. На брюшине задних листков широких маточных и крестцово-маточных связок обнаружены множественные поверхностные и глубокие очаги эндометриоза, площадью более 3 см². Произведена коагуляция и иссечение очагов эндометриоза монополярным коагулятором. Выполнена биопсия брюшины. Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины.

Диагноз при выписке: Бесплодие первичное. Наружный генитальный эндометриоз I-II стадии.

Через 6 месяцев наступила беременность, завершившаяся своевременными родами.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Указанным способом обследовано 30 женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии. Данные исследований приведены в таблице.

Показатель Количество обследованных Всего женщин 30 истинно-положительный результат 4 ложно-положительный результат 4 истинно-отрицательный результат 21 ложно-отрицательный результат 1 Итого: точность заявляемого способа - 83,3% чувствительность заявляемого способа - 80,0% специфичность заявляемого способа - 84,0%

Преимущества заявляемого способа:

1. Высокая точность - 83,3%, чувствительность - 80,0%, специфичность - 84,0%.

2. Простота в интерпретации результатов обследования.

3. Способ позволяет правильно оценить шанс спонтанного наступления беременности после проведения лечебной лапароскопии, скорректировать тактику ведения пациенток и оценить необходимость назначения им такого дорогостоящего метода, как ЭКО.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования спонтанного наступления беременности у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза. Сущность изобретения состоит в том, что до лечения в периферической крови женщин с бесплодием, ассоциированным с I и II стадией наружного генитального эндометриоза, определяют относительное количество IL- IL-1β + моноцитов и при значении этого показателя, равном 50,0% или более, в моноцитарном гейте прогнозируют спонтанное наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза. Использование данного способа позволяет с высокой точностью прогнозировать спонтанное наступление беременности у женщин с бесплодием при I и II стадии наружного генитального эндометриоза в течение года после лечебной лапароскопии, что дает возможность выбрать оптимальную тактику ведения пациенток и оценить необходимость назначения им методов вспомогательных репродуктивных технологий. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования спонтанного наступления беременности в течение года у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза после проведения хирургического лечения бесплодия путем иммунологического исследования периферической венозной крови до оперативного лечения, отличающийся тем, что определяют относительное количество IL-1β + моноцитов и при его значении, равном 50,0% или более, в моноцитарном гейте прогнозируют спонтанное наступление беременности в течение года у женщин с I и II стадией наружного генитального эндометриоза.