СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что для лечения женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом, наиболее часто используют хирургический метод (1, 2). В то же время не всегда механическое удаление очагов эндометриоза дает положительный эффект в восстановлении репродуктивной функции женщины. По данным ряда авторов эффективность лечебных лапароскопических операций у данного контингента женщин составляет около 36% (3). Неуспех хирургического метода лечения может быть связан с наличием дополнительных факторов, являющихся причиной нарушения фертильности у больных с эндометриозом и требующих назначения особого комплекса лечебных мероприятий, в том числе и проведения экстракорпорального оплодотворения. Своевременное прогнозирование эффективности хирургического лечения позволит выбрать оптимальную тактику ведения больной. В связи с этим разработка новых методов прогноза эффективности восстановления репродуктивной функции у женщин с наружным генитальным эндометриозом после проведения хирургического лечения имеет несомненную актуальность для практического здравоохранения.

Ранее было показано, что у больных с наружным эндометриозом проведение лапароскопии с элиминацией эндометриоидных очагов не приводило к наступлению беременности в течение 24 месяцев после хирургического лечения в том случае, когда у них отмечалось повышенное эмбриотоксическое действие перитонеальной жидкости при 50% ее разведении (Gomez-Torres M.-J., Acien P., Campos A., Velasco I. Embriotoxicity of peritoneal fluid in women with endometriosis. Its relation with cytokines and lymphocyte populations//Human Reproduction. - 2002. - V.17. - P.777. - 781).

Однако прогнозирование наступления беременности у женщин с эндометриозом по этому показателю имеет ряд недостатков:

- данный способ является инвазивным, так как забор перитонеальной жидкости производится только во время хирургических операций,

- определение уровня эмбриотоксичности перитонеальной жидкости связано с использованием дорогостоящих и чрезвычайно трудоемких работ по культивированию мышиных эмбрионов, на которых традиционно испытывают уровень эмбриотоксичности биологических сред,

- авторами не приводятся данные о прогностическом значении показателя эмбриотоксичности перитонеальной жидкости.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ прогнозирования частоты наступления беременности у женщин с наружным эндометриозом после проведения у них лечебных лапароскопических операций по определению у них до лечения показателей содержания в сыворотке крови уровня эмбриотропных антител с помощью ЭЛИ-П-теста. В тех случаях, когда показатели интенсивности реакций ЭЛИ-П_теста составляют 41 усл.ед и более у женщин с эндометриозом прогнозируют наступление беременности в 57,4% случаев, при отклонении всех антигенов тест-системы в сторону снижения до 50% от нормативных показателей прогноз частоты наступления беременности составляет 28,4%, а в случае снижения всех антигенов тест-системы свыше 50% от нормативных показателей прогнозируется 100% неуспех наступления беременности (Боровкова Л.В. Репродуктивная функция у больных с генитальным эндометриозом: Автореф. дис.... д.м.н. - Москва, 2004. - 34 с.).

Данный способ был выбран нами в качестве прототипа. Однако он имеет ряд недостатков:

- определение концентрации эмбриотропных антител в сыворотке предлагается проводить методом ИФА, который имеет достаточно низкую воспроизводимость и требует постановки исследуемых проб в дубликатах (в зависимости от рекомендации фирмы-производителя), что значительно увеличивает стоимость способа;

- для проведения анализа требуется достаточно много времени - от 3-х до 5-ти часов, в зависимости от используемой тест-системы;

- предлагаемый способ имеет низкую точность,

- отсутствие единого прогностического параметра затрудняет интерпретацию результата обследования. Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической крови женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом, до оперативного лечения определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+ и при значении этого показателя, равного 2,6% или менее, прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза с точностью 77,8%.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать эффективность хирургического лечения бесплодия у женщин с эндометриозом по определению относительного содержания в периферической крови CD20+CD5+ лимфоцитов. Ранее этот показатель использовали для диагностики острых нарушений мозгового кровообращения (4). Кроме того, было показано, что увеличение содержания в крови этой популяции лимфоцитов коррелирует с потерей беременности (5). Для прогнозирования наступления беременности после проведения хирургического лечения бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом, этот показатель не использовался. Популяцию лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+ относят к В-лимфоцитам 1 типа (В-1 клетки) (6). Известно, что В-1 лимфоциты продуцируют низкоаффинные антитела, которые перекрестно реагируют со многими бактериальными антигенами и с различными аутоантигенами, такими, например, как иммуноглобулины, одноцепочечная ДНК и тимоциты (6). Доказано, что способность В-1 лимфоцитов продуцировать аутоантитела определяет их участие в развитии аутоиммунных патологий (7). Существует мнение, что развитие бесплодия у женщин с эндометриозом имеет аутоиммунную природу (8). Высокое содержание В-1 лимфоцитов в периферической крови женщин с бесплодием при наружном эндометриозе, по-видимому, отражает вовлечение аутоиммунных механизмов в нарушение фертильности. Поэтому проведение только хирургического удаления очагов эндометриоза у пациенток с высоким содержанием В-1 лимфоцитов не эффективно для восстановления репродуктивной функции.

Способ осуществляется следующим образом:

1) К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования (9).

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют 20 мкл моноклинальных антител анти-СD20, коньюгированных с фикоэритрином, и 20 мкл моноклональных антител анти-СР5, коньюгированных с флюоресцеинизотионатом (ООО «Сорбент», г.Москва, регистрационное удостоверение 29/24030301/1104-01 от 24 сентября 2001 г.). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix™ (BD Biosciences, Belgium).

3) Определяют относительное (процентное) количество двойных позитивных CD20+CD5+ лимфоцитов в лимфоцитарном гейте на проточном цитометре.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью, 77,8% прогнозировать эффективность хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом.

Отличительными признаками способа являются:

установлен прогностический параметр относительного содержания CD20+CD5+ лимфоцитов в периферической крови женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом, при значении которого 2,6% или менее прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Пример 1. Больная С., 26 лет, обратилась по поводу вторичного бесплодия в течение 3 лет. В анамнезе 2 медицинских аборта без осложнений. Неоднократно проводилась противовоспалительная терапия по поводу жалоб на периодические боли внизу живота и диагноза «обострение хронического двухстороннего аднексита» - с переменным эффектом. При влагалищном исследовании: матка нормальных размеров, подвижная, безболезненная. Придатки не увеличены, безболезненны с обеих сторон. Пальпация крестцово-маточных связок болезненна. Обследована по поводу бесплодия: цикл - двухфазный по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования «ЦУГ» эндометрия, по данным гистеросальпингографии - полость матки не изменена, просвет маточных труб имеет неизмененный вид, контрастируются на всем протяжении, контраст свободно поступает в брюшную полость. Муж обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест - положительный.

Клинический диагноз: вторичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания CD20+CD5+ лимфоцитов, которое составило 0,9%.

Заключение: прогнозируется наступление беременности после проведения оперативной лапароскопии, деструкции очагов эндометриоза.

На 9 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации. Яичники не изменены. На брюшине задних листков широких маточных и крестцово-маточных связок обнаружены множественные поверхностные и глубокие очаги эндометриоза, площадью более 3 см². Произведена коагуляция и иссечение очагов эндометриоза монополярным коагулятором. Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины.

Спустя два месяца после операции наступила беременность, завершившаяся родами.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2. Пациентка Н., 30 лет, со вторичным бесплодием в течение 7 лет после медицинского аборта, поступила на отделение эндохирургии для уточнения причины бесплодия. Состоит в браке, гинекологические заболевания отрицает. Отмечает появление болей внизу живота, слабо купирующихся приемом нестероидных противовоспалительных средств. В ходе предшествующего обследования выявлено наличие двухфазного менструального цикла (по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования «ЦУГ» эндометрия), по данным гистеросальпингографии полость матки не изменена, маточные трубы умеренно извиты, контрастируются на всем протяжении, контраст в брюшную полость поступает с обеих сторон. Супруг обследован -здоров. Посткоитальный тест - положительный. При влагалищном исследовании: тело матки нормальных размеров, подвижная, безболезненная, придатки не увеличены с обеих сторон, безболезненны при пальпации. Болезненность при пальпации заднего свода.

Клинический диагноз: первичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания CD20+CD5+ лимфоцитов, которое составило 8,9%.

Заключение: прогнозируется неэффективность оперативного лечения в плане восстановления фертильности.

На лапароскопии: Брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров. Маточные трубы визуально не изменены, при хромогидротубации заполняются красителем. На брюшине ректовагинальной перегородки, крестцово-маточных связок - глубокие очаги эндометриоза >3 см². Яичники нормальных размеров, в правом - постовуляторная «стигма».

Проведено иссечение и деструкция очагов эндометриоза. Эндометриоз верифицирован гистологически.

В течение года регулярной половой жизни без контрацепции беременность не наступила.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился. Больной рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение.

Пример 3. Больная П., 25 лет. Обратилась по поводу вторичного бесплодия, а также жалоб на боли внизу живота перед менструацией, диспареунию. Бесплодие в одном браке в течение 4 лет. Имел место один медицинский аборт без видимых осложнений. Состоит в первом браке, гинекологических заболеваний в анамнезе не отмечает.

При дооперационном обследовании установлен двухфазный менструальный цикл (по тестам функциональной диагностики и гистологического исследования «ЦУГ» эндометрия). По данным гистеросальпингографии полость матки имеет правильную форму, маточные трубы заполняются контрастом на всем протяжении, не расширены; контраст в брюшной полости. Муж обследован - нормозооспермия. Посткоитальный тест положительный. При осмотре: матка нормальных размеров, подвижная, безболезненная. Придатки не определяются. Резко болезненен задний свод. Выделения слизистые, умеренные. Направлена на лапароскопию для уточнения причины бесплодия.

Диагноз: вторичное бесплодие. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз.

Обследование по заявляемому способу показало, что содержание CD20+CD5+ лимфоцитов в периферической крови составило 2,6%.

Заключение: прогнозируется наступление беременности после проведения оперативной лапароскопии, деструкции очагов эндометриоза.

На 7 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: Брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации. Яичники не изменены. На брюшине задних листков широких маточных и крестцово-маточных связок обнаружены множественные поверхностные и глубокие очаги эндометриоза площадью более 3 см². Произведена коагуляция и иссечение очагов эндометриоза монополярным коагулятором. Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины.

Через 4 месяца наступила беременность, завершившаяся родами.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился. Указанным способом обследовано 18 женщины с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом. Данные исследований приведены в таблице.

ТаблицаПоказательКоличество обследованныхВсего женщин18истинно-положительный результат6ложно-положительный результат3истинно-отрицательный результат8ложно-отрицательный результат1Итого: точность заявляемого способа - 77,8%
чувствительность заявляемого способа - 85,7%
специфичность заявляемого способа - 72,7%

Преимущества заявляемого способа:

1) высокая точность - 77,8%, чувствительность - 85,7%, специфичность - 72,7%;

2) хорошая воспроизводимость метода;

3) простота и доступность выполнения методики;

4) длительность проведения методики определения уровня CD20+CD5+ лимфоцитов не превышает 2-х часов;

5) простота в интерпретации результатов обследования.

Литература

1. Marcoux S., Maheua R., Berube S, Laparoscopic surgery in infertile women with minimal or mild endometriosis // N.Engl. J.Med. - 1997. - V.337. - P.217-222.

2. Vignali M., Infantino M., Matrone R., Chiodo I., Somigliana E., Busacca M., Vigano P. Endometriosis: novel etiopathogetic concepts and clinical perspectives // Fertil. Syeril. - 2002. - V.78, N.4. - P.665-678.

3. Milingos S., Mavrommatis C., Elsheikh A., Kallipolitis G., Loutradis D., Diakomanolis E., Michalas S. Fecundity of infertile women with minimal or mild endometriosis. A clinical study // Arch. Gynecol. Obstet. - 2002. - V.267. - P.37-40.

4. Токарева Н.В., Велижиннская Т.А., Аглиуллина Д.Г., Абашеев Р.З., Дзугаева И.Н. Иммунодиагностика при острых нарушениях мозгового кровообращения // Медицинская иммунология. - 2006. - Т8, №2-3. - С.409.

5. Велижинская Т.В., Тухбатуллин М.Г., Голованова С.Ю., Сабирова В.Л., Ситкина К.В., Крайнева Н.В. Оценка содержания иммунокомпетентеных клеток у пациенток с привычным невынашиванием беременности // Медицинская иммунология. - 2005. - Т.7, №2-3. - С.182.

6. Youinou P., Jamin С., Lydyard P.M. CD5 expression in human B-cell populations // Immunology Today. - 1999. - V.20, N.7. - P.312-316.

7. Marakami M., Honjo T. Involvement of B-1 cells in mucosal immunity and autoimmunity // Immunology Today. - 1995. - V.16, N.11. - P.534-539.

8. Nothnick W.B. Treating endometriosis as an autoimmune disease // Fertil. Steril. - 2001. V.76, N2. - P.223-231.

9. Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - V.21, N97. - P.77.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам в области гинекологии. Предложенный способ заключается в том, что в периферической крови женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом, до оперативного лечения определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+ и при значении этого показателя 2,6% или менее прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза с точностью 77,8%. Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении точности, чувствительности и специфичности способа прогнозирования наступления беременности у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе после хирургического лечения эндометриоза. Своевременное прогнозирование эффективности хирургического лечения позволит выбрать оптимальную тактику ведения больной. 1 табл.

Способ прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом путем иммунологического исследования периферической венозной крови до оперативного лечения, отличающийся тем, что в крови определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+и при его значении равном 2,6% или менее прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения эндометриоза.