СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА Российский патент 2021 года по МПК G01N33/577 A61B5/145 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и позволяет повысить точность и эффективность неинвазивной диагностики наружного генитального эндометриоза.

Эндометриоз - это заболевание, которое характеризуется наличием ткани, сходной с эндометрием вне полости матки, чаще всего диагностируется в репродуктивном возрасте и является процессом с хроническим, рецидивирующим и прогрессирующим характером течения. Клинически заболевание проявляется хронической тазовой болью, дисменореей и бесплодием, однако в 20-25% случаев может иметь бессимптомное течение [Bulun S.E., Yilmaz B.D., Sison С., Miyazaki K., Bernardi L., Liu S., Kohlmeier A., Yin P., Milad M., Wei J. Endometriosis. Endocr Rev. 2019, 40(4):1048-1079].

Учитывая разнообразные симптомы этого заболевания, которые могут имитировать различные хронические воспалительные заболевания органов малого таза, кишечника и мочевого пузыря, золотой стандарт для окончательного диагноза состоит из хирургического этапа с последующим гистопатологическим обследованием полученного материала. Этим можно объяснить значительную диагностическую задержку на 8-12 лет, приводящую к запоздалому назначению адекватного лечения [Culley L., Law С., Hudson N., Denny E., Mitchell H., Baumgarten M., Raine-Fenning N. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: a critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013, 19(6):625-639].

До сих пор не обнаружены достоверные лабораторные биомаркеры этой гинекологической патологии. Поэтому постоянно разрабатываются новые неинвазивные биомаркеры для ранней диагностики, адекватного лечения и выбора пациенток для хирургического вмешательства [Rogers Р.А., Adamson G.D., Al-Jefout М., Becker С.М., d'Hooghe Т.М., Dunselman G.A., et al. Research priorities for endometriosis: recommendations from a global consortium of investigators in endometriosis. Reprod Sci. 2016; 24:202-26].

Центральная роль при эндометриозе принадлежит местному воспалительному процессу, который способствует возникновению и дальнейшему развитию заболевания, вызывая болевой синдром и бесплодие [Riccio L., Santulli P., Marcellin L., Abrao M.S., Batteux F., Chapron C. Immunology of endometriosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2018, 50:39-49]. В подтверждение этого утверждения на основании большого количества исследований показано, что перитонеальная жидкость пациенток с эндометриозом содержит повышенное количество макрофагов и других иммунных клеток, которые секретируют факторы роста, цитокины и ангиогенные факторы [Gazvani R., Templeton A. Peritoneal environment, cytokines and angiogenesis in the pathophysiology of endometriosis. Reproduction. 2002, 123(2):217-226]. Поэтому провоспалительные цитокины рассматриваются как потенциальные неинвазивные биомаркеры в крови или перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом.

Было продемонстрировано, что группа маркеров, а не один показатель, имеют более высокую чувствительность и специфичность для постановки диагноза эндометриоз. Показана возможность диагностики заболевания с использованием комбинации показателей (интерлейкин (IL)-6, IL-8, фактор некроза опухоли (TNF)a, опухолевый антиген (СА)-125, СА-19-9 и высокочувствительный С-реактивный белок) со специфичностью 60-71% и чувствительностью 87-92% [Mihalyi A., Gevaert О., Kyama С.М., Simsa P., Pochet N., de Smet F. et al. Noninvasive diagnosis of endometriosis based on a combined analysis of six plasma biomarkers. Hum Reprod. 2010; 25:654-64]. С использованием многофакторного статистического подхода, исследована специфичность и чувствительность 28 биомаркеров в образцах плазмы женщин с эндометриозом и без данного заболевания. Была определена панель биомаркеров (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), аннексии V, СА-125, гликоделин и растворимая молекула внутриклеточной адгезии 1(ICAM-1)), которая показала специфичность 63-81% и чувствительность 81-90% по способности диагностировать у женщин эндометриоз [Vodolazkaia A., El-Aalamat Y., Popovic D., Mihalyi A., Bossuyt X., Kyama C. et al. Evaluation of a panel of 28 biomarkers for the noninvasive diagnosis of endometriosis. Hum Reprod. 2012; 27:2698-711]. Однако авторы обнаружили повышенный уровень других провоспалительных маркеров, включая TNFa, IL-6 и IL-1β в контрольной группе пациенток, а не в группе женщин с эндометриозом, отмечая, что на состав цитокинов периферической крови могут влиять различные воспалительные процессы в малом тазу.

Таким образом, провоспалительные цитокины не могут рассматриваться в качестве высокоспецифических и высокочувствительных маркеров неинвазивной диагностики эндометриоза, так как их уровень может быть повышен при острых и хронических воспалительных процессах в малом тазу, сопровождающихся болевым синдромом или протекающих бессимптомно.

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием [патент RU №2291439, G01N 33/577, дата приоритета 04.07.2005, дата публикации 10.01.2007] путем исследования периферической венозной крови и определения относительного количества CD16+ моноцитов в моноцитарном гейте и при значениях этого показателя, равного или менее 45%, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.

Данный способ неспецифичен, поскольку количество CD16+ моноцитов значительно варьирует в венозной крови при различных заболеваниях, патологических и экстремальных состояниях (вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания, гастроэнтерологические заболевания, воспалительные процессы, стресс), а также недостаточно чувствителен, так как измерение диагностического показателя проводится в относительных количествах.

Известен диагностический тест, при котором учитывается абсолютное количество макрофагов в перитонеальной жидкости - 13⋅10⁶, позволяющее диагностировать наличие эндометриоза [Oosterlynk D.J., Lacquaet F.A., Waer М. et al. Lymphokine - activated killer activity in women with endometriosis. Gyn. Obstet. Invest. 1994; 37(3):185-190].

Недостатком способа является его инвазивность, так как для диагностики эндометриоза этим методом необходимо получить перитонеальную жидкость в ходе проведения лапароскопической операции.

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (НГЭ) [патент RU №2211454, G01N 33/53, дата приоритета 29.10.2001, дата публикации 27.08.2003] у женщин, при котором для установки диагноза эндометриоз в сыворотке крови пациенток определяют концентрацию интерферона-γ и при его содержании, равном 1000 пкг/мл и менее, диагностируют заболевание.

Недостатками данного способа являются: неспецифичность, поскольку содержание интерферона-γ в крови изменяется в зависимости от многих эндо- и экзогенных факторов: стресса, наличия бронхиальной астмы, аллергии, аутоиммунных заболеваний, вирусных инфекций, иммунодефицитных состояний [Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. - М.: Медицина, 1996. - 240 с]. Вышеперечисленные сопутствующие заболевания могут наблюдаться у многих женщин, сочетаться с эндометриозом, что обуславливает недостаточно высокую прогностическую точность (77%) данного маркера в диагностике заболевания.

Вышеперечисленные способы диагностики НГЭ взяты за прототип настоящего изобретения.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств, повышение специфичности и точности ранней неинвазивной диагностики НГЭ.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики эндометриоза, включающем исследование плазмы крови, для определения количества микровезикул лейкоцитарного происхождения с фенотипом CD54+CD14+ и при их содержании 5,22% и выше диагностируют НГЭ.

Микровезикулы (MB) - внеклеточные структуры, которые производятся практически всеми типами клеток во время их жизнедеятельности, межклеточных взаимодействий, а также при апоптозе [Burger D., Schock S., Thompson C.S., Montezano A.C., Hakim A.M., Touyz R.M. Microparticles: biomarkers and beyond. Clinical science 2013, 124(7):423-441]. Показано, что активация клеток приводит к усилению скорости и интенсивности продукции MB. В настоящий момент они рассматриваются в качестве важнейших регуляторов межклеточных взаимодействий и участников физиологических и патофизиологических процессов [Antonyak М.А, Cerione R.A. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer. Methods in molecular biology. 2014, 1165:147-173]. Определено, что MB могут выступать диагностическими маркерами различных заболеваний. Взаимодействуя с клетками-реципиентами, MB способны передавать им «биологическую информацию», в виде белков, нуклеиновых кислот, сигнальных молекул, мембранно-ассоциированных рецепторов, биоактивных липидов, и, тем самым, изменять их фенотипические и функциональные характеристики [Mause S.F., Weber С. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circulation research. 2010, 107(9): 1047-1057].

В настоящее время существует ограниченное число исследований по изучению состава микровезикул в периферической крови (ПК) пациенток с эндометриозом. В одном из исследований изучали количественный состав MB в ПК пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом (ГИЭ) и у пациенток с эндометриомами, сравнивая их с пациентками без данного заболевания. Определены более высокие уровни циркулирующих MB у пациенток с ГИЭ в сравнении с пациентками с эндометриомами и без данного заболевания, что возможно объяснить более интенсивной степенью воспаления и ангиогенеза при этой агрессивной форме эндометриоза. Остается неизвестным, являются ли эти уровни MB причиной или следствием у пациенток с ГИЭ. Тем не менее, эти результаты показали, что уровни циркулирующих MB могут играть роль в патофизиологических механизмах ГИЭ [Munros J., Martinez-Zamora M.A., Tassies D., Coloma J.L., Torrente M.A., Reverter J.C., Carmona F., Balasch J. Total circulating microparticle levels are increased in patients with deep infiltrating endometriosis. Hum Reprod. 2017, 32(2):325-331].

Эта же группа авторов опубликовала результаты пилотного исследования в 2019 году у пациенток с эндометриомами. Было показано, что количество MB ПК увеличивается после удаления эндометриом методом эксцизии, но не при использовании лазерной абляция. Увеличение уровня циркулирующих MB является временным и возвращается к базальному уровню через 3 месяца после процедуры удаления. Эти результаты показывают, что по сравнению с лазерным испарением, метод эксцизии вызывает более выраженный кратковременный воспалительный ответ [Munros J., Martinez-Zamora М.А., Tassies D., Reverter J.C., Rius M., Gracia M., Ros C., Carmona F. Total Circulating Microparticle Levels After Laparoscopic Surgical Treatment for Endometrioma: A Pilot, Prospective, Randomized Study Comparing Stripping with CO2 Laser Vaporization. J Minim Invasive Gynecol. 2019, 26(3):450-455].

Результаты этих исследований не позволяют сделать выводы об изменении содержания MB в ПК пациенток с НГЭ.

Для верификации заявляемого способа проведено исследование по определению количества микровезикул лейкоцитарного происхождения с фенотипом CD54+CD14+ среди:

- 97 пациенток с наружным генитальным эндометриозом I/II степени распространенности. Степень распространенности процесса определяли в баллах по пересмотренной классификации Американского Общества Фертильности в соответствии с результатами лапароскопического исследования. Диагноз у всех больных был установлен на основании лапароскопической операции и подтвержден гистологически.

- 20 пациенток контрольной группы, обследовавшихся в связи с мужским фактором бесплодия перед проведением ЭКО, у которых на основании проведенного интраоперационного обследования не было найдено гинекологических заболеваний.

Для пациенток с НГЭ I и II степени характерно увеличение в ПК относительного содержания MB с рецепторами CD54+CD14+ в 1,55 раз по сравнению с этими показателями у пациенток из группы контроля: 5,7(2,0;9,2) и 3,71(1,48;5,1) соответственно (р<0,01).

Моноциты являются источником CD54+CD14+ микровезикул. Они представляют собой крупные лейкоциты системы мононуклеарных макрофагов. Активированные макрофаги принимают участие в патогенезе эндометриоза путем синтеза растворимых медиаторов, таких как цитокины, простагландины, компоненты комплемента и ферменты. Через секрецию этих иммуномедиаторов, макрофаги могут вызывать воспаление, восстановление тканей, неоваскуляризацию, а также способствовать привлечению фибробластов и эндотелиальных клеток [Riccio L., Santulli P., Marcellin L., Abrao M.S., Batteux F., Chapron C. Immunology of endometriosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2018, 50:39-49]. Показано, что макрофаги перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом обладают повышенной способностью секретировать моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1), который играет роль в привлечении моноцитов периферической крови к участкам повреждения и воспаления.

Для проведения оценки качества (диагностическую эффективность) прогностической модели использовался метод построения кривой взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (ROC-кривой). Площадь под ROC-кривой соответствующей взаимосвязи прогноза НГЭ и содержания микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в плазме крови, составила 0,7±0,056 с 95% ДИ: 0,59-0,81. Полученная модель соответствует хорошему прогностическому качеству и была статистически значимой (р<0,01). Пороговое значение содержания микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в точке порога классификации составляло 5,22%. Относительное содержание микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в плазме крови равное 5,22% или превышающее данное значение соответствовало прогнозу наличия НГЭ. Чувствительность и специфичность метода составили 80,5% и 71% соответственно.

Таким образом, данные нашего исследования показывают, что можно диагностировать НГЭ I/II степени с использованием определения содержания в ПК микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ у больных с болевым синдромом, а также бесплодием с высокой чувствительностью (80,5%) и приемлемой специфичностью (71%).

Способ клинически эффективен и может быть рекомендован к использованию в гинекологической практике. Ранняя неинвазивная диагностика эндометриоза минимальной или легкой степени (r-ASRM) будет способствовать своевременному направлению пациенток для хирургического лечения, что в свою очередь предотвратит прогрессирование заболевания до средней и тяжелой степени и улучшит показатели фертильности.

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения количества микровезикул образцы крови собирают из локтевой вены натощак в полипропиленовую пробирку, содержащую цитрат натрия 3,2%. Для выделения микровезикул используют метод, описанный авторами Gelderman М. Semak J (Gelderman М.Р, Simak J. Flow cytometric analysis of cell membrane microparticles. Methods Mol Biol. 2008, 484:79-93). Все растворы для работы с микровезикулами заранее фильтруют через ультрафильтр с диаметром пор 0,2 мкм (Corning, США), и при их содержании 5,22% и выше диагностируют НГЭ.

Для длительного хранения микровезикул, полученных из периферической крови, используют метод криоконсервации плазмы. Хранение образцов производят в сосуде Дьюара при температуре -196°C. Разморозку образцов плазмы, хранящихся в жидком азоте, осуществляют незамедлительно. Процедуру проводят на водяной бане при 37°C. Далее полученную плазму центрифугируют в течение 20 минут при 19800g + 10°C с целью осаждения микровезикул. Далее полученные MB отмывают холодным раствором Хенкса без CaCl₂ (Sigma, США), содержащим гепарин натрия в концентрации 30 Ед/1 мл раствора, путем центрифугирования в течение 20 минут при 19800g+10°C. Полученный осадок MB ресуспендируют в растворе Хенкса («БиолоТ» Россия), содержащего 0,35% сывороточного альбумина (Sigma, США) и гепарин натрия в концентрации 30 Ед/1 мл раствора, и обрабатывают антителами к CD14 и CD54 в соответствии с указаниями производителя. Оценку экспрессии указанных маркеров производят при помощи проточного цитофлюориметра BD FACS Canto II (BD, США). Гейт MB по показателям светорассеяния выделяют при помощи полистироловых бус, калиброванных по размерам 1,0 мкм и 0,2 мкм (Invitrogen, США).

При содержании микровезикул с фенотипом CD54+CD14 + 5,22% и выше диагностируют НГЭ.

Сущность способа иллюстрируется следующими клиническими примерами:

Пример 1. Пациентка М., 32 лет, обратилась с жалобами на болезненные менструации с периода менархе, периодические тянущие боли внизу живота не связанные с циклом в течение 3-х лет, а также отсутствие наступления беременности на протяжении 2-х лет регулярной половой жизни без контрацепции. В анамнезе у пациентки 1 беременность, которая завершилась искусственным прерыванием с выскабливанием полости матки. Предварительный диагноз: Наружный генитальный эндометриоз? Содержание микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в периферической крови пациентки до проведения хирургического этапа составило 7,55%. Выполнено: Операционная лапароскопия. Электрокоагуляция очагов эндометриоза, хромогидротубация, гистероскопия, биопсия эндометрия. Послеоперационный диагноз: наружный генитальный эндометриоз II степени, что подтверждает диагноз, установленный по заявленному методу. Верификация диагноза проведена на основании результатов гистологического исследования.

Пример 2. Пациентка 3., 28 лет обратилась на прием с жалобами на отсутствие наступления беременности в течении 1 года регулярной половой жизни без контрацепции, боли при половой жизни и болезненные менструации, которые беспокоят пациентку в течение 2-х лет. Из анамнеза известно, что у пациентки была проведена гистерорезектоскопия, полипэктомия. По результатам гистологии: железисто - фиброзный полип эндометрия. Пациентке рекомендовано проведение лапароскопии в связи с предполагаемым диагнозом наружный генитальный эндометриоз. Перед проведением оперативного вмешательства в периферической крови пациентки определено содержание микровезикул с фенотипом CD54+CD14+, которое составило 11,2%. В ходе хирургического этапа произведена абляция очагов эндометриоза, овариолизис справа, хромогидротубация, гистероскопия, биопсия эндометрия. Установлен диагноз наружный генитальный эндометриоз II степени, который подтвержден результатами гистологического исследования, и соответствует диагнозу, установленному по заявленному методу.

Пример 3. Пациентка В., 29 лет, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 3-х лет регулярной половой жизни без контрацепции. Из анамнеза менструации умеренно болезненные, иногда требующие приема нестероидных противовоспалительных средств, регулярные, диспареунии нет, болей в малом тазу нет. Спермограмма супруга без патологии. Пациентке дважды проводилась искусственная инсеминация с овариальной стимуляцией без эффекта. Предполагаемый диагноз: наружный генитальный эндометриоз? Пациентке с целью уточнения причины бесплодия предложено проведение оперативного вмешательства. Перед проведением хирургической операции пациентке проведено исследование периферической крови с определением количества микровезикул с фенотипом CD54+CD14+, которое составило 5,5%. Выполнено: операционная лапароскопия, аблация очагов эндометриоза, хромогидротубация, гистероскопия, биопсия эндометрия. Послеоперационный диагноз: наружный генитальный эндометриоз I степени. Верификация диагноза проведена на основании гистологического исследования. Таким образом, диагноз по заявленному методу подтвердился.

Пример 4. Пациентка Т., 27 лет, обратилась с жалобами на тянущие боли внизу живота не связанные с менструальным циклом, которые беспокоят ее в течение 3-х лет, периодически болезненные менструации. В беременности на настоящий момент не заинтересована. Пациентка применяла нестероидные противовоспалительные средства, а также низкодозированные гормональные контрацептивы в течение года, однако болевой синдром на фоне терапии сохранялся. Предполагаемый диагноз: наружный генитальный эндометриоз? С целью выявления причины болевого синдрома, а также его устранения, предложено проведение лапароскопической операции. Перед проведением оперативного вмешательства в периферической крови женщины определено содержание микровезикул с фенотипом CD54+CD14+, которое составило 2,6%. Выполнено: операционная лапароскопия, двухсторонний сальпингоовариолизис, хромогидротубация, сальпингэктомия слева. Послеоперационный диагноз: Хронический аднексит, гидросальпинкс слева, спаечный процесс органов малого таза 2 степени. Таким образом, диагноз наружный генитальный эндометриоз не подтвердился, что соответствует заявленному методу.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и предназначено для диагностики наружного генитального эндометриоза. В плазме крови определяют количество микровезикул лейкоцитарного происхождения с фенотипом CD54+CD14+. При их содержании 5,22% и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, повышение специфичности и точности ранней неинвазивной диагностики наружного генитального эндометриоза. 4 пр.

Способ диагностики наружного генитального эндометриоза, включающий исследование плазмы крови, отличающийся тем, что в плазме крови определяют количество микровезикул лейкоцитарного происхождения с фенотипом CD54+CD14+, при их содержании 5,22% и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз.