СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СИСТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕНОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 G01N33/543 

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. Наличие в образцах кала антигенов (патогенных микроорганизмов, вирусов и маркеров) является эффективным критерием, позволяющим с высокой достоверностью диагностировать соответствующее инфекционное заболевание. Преимуществами данного подхода, особенно для диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта, является неинвазивность забора пробы, низкая стоимость и высокая достоверность результатов. Хотя в настоящее время активно используются как микробиологические, так и иммунологические способы диагностики инфекционных заболеваний, для проведения массового первичного скрининга оптимально определение наличия в образцах стула определяемых диагностически значимых антигенов, которое может быть реализовано с высокой экспрессностью и производительностью. Особенный интерес вызывают иммунохроматографические подходы в тех случаях, когда в силу особенностей роста микроорганизмов получение результатов микробиологического тестирования может потребовать значительного времени.

Всемирно, желудочно-кишечные нарушения, в ходе инфекционного заражения или токсического отравления, являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что нарушение работы желудочно-кишечного тракта является причиной смертности около 25% всех смертей постнеонатального периода (Bryce J et al., 2005). Проблемы, связанные с нарушением функций кишечника, в настоящее время наблюдаются у 20% населения в развитых странах. В странах третьего мира они несут ответственность за множество смертей, а в развитых странах они являются основной причиной экономических потерь. В большинстве острых и хронических случаев нарушений работы желудочно-кишечного тракта возбудитель остается неизвестным, а единственным вариантом лечения является поддерживающая терапия, симптоматическое лечение и усердное внимание к питанию.

Точная и своевременная диагностика лежит в основе всей медикаментозной терапии, но при этом современные возможности для диагностики кишечных инфекций остаются ограниченными, устаревшими и дорогими.

Благодаря экспрессности, достаточно высокой чувствительности и специфичности иммунохроматографические тесты незаменимы при массовых обследованиях. Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ.

Особенностью иммунохроматографических тест-систем является то, что все необходимые для анализа реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов. Эти комплексы благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора.

Общая схема иммунохроматографии заключается в следующем.

Проба, потенциально содержащая анализируемый антиген, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбированы специфические антитела. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным специфическими антителами на другой эпитоп определяемого соединения. Степень связывания маркера в аналитической зоне, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией антигена в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, адсорбированный на окрашенной частице, связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом (например, антивидовыми антителами).

Эффективность иммунохроматографической тест-системы как диагностического средства в значительной степени зависит от того, какие иммунореагенты в ней используются и какие комплексы они образуют. Это относится к выбору и антител, и формата анализа.

Ниже представлено описание методики иммунохроматографического определения специфических антител к Helicobacter pylori, реализуемой в тест-системе «CerTest Н. pylori test» фирмы «CerTest» (Испания). Данная методика рассматривается в настоящей заявке в качестве прототипной.

CerTest Н. pylori представляет собой иммунохроматографический тест для качественного выявления Helicobacter pylori в кале. В процессе анализа корпускулярные антигены бактериальной природы, находящиеся в растворенном образце кала, реагируют с окрашенным конъюгатом (моноклональные антитела-окрашенные латексные частицы), предварительно высушенном на мембране тест-полоски. Под действием капиллярных сил смесь продвигается вдоль по мембране. В случае положительного результата в аналитической зоне происходит связывание конъюгата коллоидного маркера с антителами, антигеном и иммобилизованным на мембране специфическими антителами, в результате чего появится линия красного цвета. Отсутствие этой линии указывает на отрицательный результат. При низкой концентрации антигена окрашенная полоса в тестовой зоне не образуется. Несвязавшийся конъюгат взаимодействует с реагентом в контрольной зоне тестового устройства, образуя окрашенную полосу, что указывает на правильное проведение теста.

Существенным фактором, препятствующим достоверной диагностике заболеваний во всех случаях, является наличие некоторого количества антигена в образцах стула при отсутствии заболевания. Причинами этого может быть бактерионосительство и контакт с непатогенными микобактериями. В связи с этим медики вводят пороговый уровень содержания детектируемого антигена, превышение которого является основанием для вывода о наличии инфекционного процесса, а недостижение позволяет с высокой степенью достоверности делать вывод об отсутствии заболевания.

Однако контроль превышения порогового уровня легко реализуется лишь для систем количественного анализа, таких как микропланшетный иммуноферментный анализ с фотометрической регистрацией результатов. Такая диагностика требует использования специального оборудования для промывки планшетов и заключительной фотометрии, сопряжена с использованием ряда реагентов и поэтому существенно менее эффективна как средство высокопроизводительного массового скрининга по сравнению с иммунохроматографией. В случае же иммунохроматографии различение проб с концентрацией антигена выше и ниже установленного порогового уровня по яркости окрашивания в аналитической зоне становится исключительно субъективным решением, снижающим достоверность получаемых результатов.

Для преодоления указанного ограничения в настоящей заявке предложен иммунохроматографический анализ Helicobacter pylori, в котором связывание в аналитической зоне антигена пробы предотвращается добавлением стандартного количества специфических антител, взаимодействующих с пробой до достижения ей аналитической зоны. Тем самым диагностический вывод становится основанным на отличии не между менее и более ярким окрашиванием, а между ее отсутствием (все специфические антигены блокированы антителами) и наличием (антигена достаточно много, и антител в используемом препарате недостаточно, чтобы блокировать его полностью).

Эффективность предложенного в патенте подхода подтверждается представленным ниже примером.

Пример 1. Определение Helicobacter pylori иммунохроматографическим методом

Для изготовления тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045 и ламинирующую защитную пленку МТ-1.

На мембраны были нанесены следующие реагенты:

1. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и специфических антител 2 в смеси со свободными специфическими антителами 1.

2. Специфические антитела на отличный эпитоп определяемого антигена - аналитическая зона тест-полоски (антитела 1).

3. Препарат антивидовых антител против иммуноглобулинов мыши - контрольная зона тест-полоски.

На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора специфических антител (1,0 мг/мл) и 2 мкл раствора антивидовых антител (0,5 мг/мл) в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Конъюгат коллоидного золота со специфическими антителами наносили в разведении, соответствующем D₅₂₀=2,0, в объеме 8 мкл на 1 см полосы, и добавляли раствор антител из расчета 0,02 мкг на 1 см полосы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 4 мм.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально или получая цифровое изображение тест-полоски с помощью сканера.

Пример 2. Определение Helicobacter pylori иммунохроматографическим методом

Для изготовления тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045 и ламинирующую защитную пленку МТ-1. На мембраны были нанесены следующие реагенты:

4. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и специфических антител 2 в смеси со свободными специфическими антителами 1.

5. Специфические антитела на отличный эпитоп определяемого антигена - аналитическая зона тест-полоски (антитела 2).

6. Препарат антивидовых антител против иммуноглобулинов мыши - контрольная зона тест-полоски.

На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора специфических антител (1,0 мг/мл) и 2 мкл раствора антивидовых антител (0,5 мг/мл) в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Конъюгат коллоидного золота со специфическими антителами наносили в разведении, соответствующем D₅₂₀=2,0, в объеме 8 мкл на 1 см полосы, и добавляли раствор антител из расчета 0,02 мкг на 1 см полосы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 4 мм.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально или получая цифровое изображение тест-полоски с помощью сканера.

Проведено тестирование выборки из 20 проб кала больных и 20 лиц без симптоматики заболевания (см. Таблицу 1). Окрашивание в аналитической зоне выявлено для 18 больных и 1 здорового обследуемого, т.е. диагностическая эффективность тест-системы превосходит 90% (для традиционных аналитических систем эта величина варьирует от 50 до 90%), данные результаты были достигнуты как при реализации схемы анализа по примеру 1, так и по схеме анализа на основе примера 2.

Таблица 1 Результаты сравнительного испытания предложенной иммунохроматографической системы качественного определения специфических антител и иммуноферментного количественного анализа Обследуемая группа Количество человек Положительный результат по данным иммунохроматографии Отрицательный результат по данным иммунохроматографии Наличие антител в концентрации выше 0,1 мг/мл по данным ИФА Наличие антител в концентрации, не превосходящей 0,1 мг/мл, по данным ИФА Отсутствие антител по данным ИФА Больные туберкулезом 20 18 2 20 0 0 Лица без симптомов заболевания 20 1 19 1 4 15

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. В основе способа лежит контакт мембранной тест-полоски с анализируемой жидкой пробой и инициируемое этим контактом движение по мембранам тест-полоски реагентов, которые содержатся в пробе или нанесены на мембрану и в ходе взаимодействий в порах мембраны или на ее поверхности формируют детектируемые иммунные комплексы. Отличительной особенностью предлагаемого способа определения антигенов является то, что на тест-полоску в зоне контакта с тестируемой пробой дополнительно наносится определенное количество специфических антител, которые при движении фронта жидкости взаимодействуют с определяемым антигеном, потенциально содержащимся в пробе, и блокируют определенное количество сайтов связывания. Количество наносимых свободных антител подбирается таким образом, чтобы при низком их содержании в анализируемой пробе, не имеющем диагностического значения, происходило полное блокирования центров связывания, предотвращающее связывание антигена в аналитической зоне тест-полоски и развитие детектируемой окраски в аналитической зоне. Предлагаемый подход позволяет проводить достоверную диагностику на основании результатов определения антигенов заболеваний желудочно-кишечного тракта, исключая получение положительных результатов тестирования для проб с низким содержанием детектируемых антигенов, не свидетельствующем о протекании у лица - источника тестируемой пробы - процесса развития заболевания. 1 табл., 2 пр.

Способ определения патогенных микроорганизмов, включающий проведение иммунохроматографического анализа, при котором на мембранной тест-полоске формируются комплексы, в состав которых входят молекулы антител 1 и 2, специфичные к отличным эпитопам антигена микроорганизма, при котором специфические антитела 1 иммобилизованы в аналитической зоне тест-полоски, антиген содержится в тестируемой жидкой пробе, а специфические антитела 2 иммобилизованы на частицах коллоидного золота; также на тест-полоску наносят фиксированное количество свободных специфических антител 1 или 2, которые взаимодействуют с определяемым антигеном при движении по мембране тестируемой жидкой пробы.