СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИЕЛОФИБРОЗА Российский патент 2015 года по МПК A61K47/10 A61K9/127 A61K31/7105 A61K45/08 A61P19/04 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к носителю, доставляющему вещество целенаправленно к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам костного мозга, а также к средству для лечения миелофиброза и способу лечения миелофиброза с применением лекарственного средства, контролирующего активность и рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки костного мозга.

Уровень техники

Миелофиброз - это общий термин, относящийся к заболеваниям, которые вызывают обширный диффузный фиброз в костном мозге, и включает первичный миелофиброз, чья этиология неизвестна, и вторичный миелофиброз с основной болезнью.

Первичный миелофиброз относится к хроническому миелопролиферативному расстройству, которое характеризуется вовлечением в патологический процесс фиброза костного мозга всего организма и экстрамедуллярным гемопоэзом в печени и селезенке, так же как проявлением лейкоэритробластоза, при котором незрелые гранулоциты и эритробласты появляются в периферической крови. Основной чертой первичного миелофиброза считается моноклональная пролиферация кроветворных клеток благодаря генетической аномалии, включающей мутацию гена Jak2, произошедшую на уровне стволовых кроветворных клеток. Различные цитокины, продуцированные пролиферированными кроветворными клетками (в основном мегакариоцитами), действуют на клетки стромы костного мозга, вызывая пролиферацию реактивных поликлональных клеток стромы костного мозга, что приводит к фиброзу костного мозга, остеосклерозу и ангиогенезу. Это приводит к типичным клиническим симптомам, таким как неэффективный гемопоэз, появление дакриоцитов в периферической крови, лейкоэритробластоз и экстрамедуллярный гемопоэз, вызывающий спленомегалию.

Около 40% первичных миелофиброзов имеют генную мутацию в Jak2, тирозинкиназе, необходимой для сигнальной трансдукции цитокинов, приводящую к конститутивной активации Jak2 даже в отсутствие стимуляции цитокинами. Кроме Jak2, есть несколько случаев генной мутации в c-mp1 (рецептор тромбопоэтина).

В настоящее время считают, что первичный миелофиброз трудно вылечить медикаментозной терапией, и что единственная эффективная терапия - это аллогенная трансплантация кроветворных стволовых клеток. Однако уровень смертности, связанный с трансплантацией, составляет от 25% до 48%, ограничивая общий уровень выживаемости до около 50%. Недавно было широко освещено применение неразрушающей трансплантации стволовых клеток костного мозга (мини-трансплантация) с меньшей, связанной с лечением, токсичностью, до сих пор было изучено только ограниченное число случаев, и связанные с ними долгосрочные прогнозы еще предстоит узнать.

В качестве лекарственной терапии, хотя и паллиативной, была показана эффективность анаболических гормонов, таких как даназол и примоболан, ингибиторов ангиогенеза, таких как талидомид и леналидомид, противоопухолевых лекарственных средств, таких как гидроксикарбамид, анагрелид, иматиниб, 2-хлордеоксиаденозин, мелфалан, бусульфан и этопозид, и других лекарственных средств, таких как эритропоэтин для анемии, тромбоцитопении и спленомегалии (смотрите непатентную литературу 1 и 2).

С другой стороны, вторичный миелофиброз возникает на фоне таких болезней, как острый миелолейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический миелолейкоз, истинная полицитемия, первичная тромбоцитопения, миелодиспластический синдром, множественная миелома, злокачественная лимфома, карцинома, системная красная волчанка и прогрессирующий системный склероз, или лучевая болезнь, и демонстрирует сходную с первичным миелофиброзом картину костного мозга. Лечение вторичного миелофиброза сосредоточено на улучшении основного заболевания. Однако многие из этих основных заболеваний трудно излечить радикально. Таким образом, есть острая необходимость в уменьшении неблагоприятного действия самого миелофиброза.

В связи с этим было проведено много исследований для разработки лекарственных средств против миелофиброза. В результате сообщили, что были получены результаты, успешные до определенной степени, при исследовании животных моделей или при проведении клинических испытаний, например, с применением ингибиторов тирозинкиназы JAK2V617F, ингибиторов TGF-β, таких как растворимый TGF-β рецептор, ингибиторов NFκB, таких как бортезомиб, ингибиторов ДНК метилтрансферазы, таких как децитабин, ингибиторов гистондеацетилазы, таких каким трихостатин А, ингибиторов VEGF, таких как PTK787/ZK222584 и бевасизумаб (см. Непатентную литературу 1), и некоторых видов антител к лимфоцитам человека (см. Патентную литературу 1). Однако ни одно из этих лекарственных средств не является удовлетворительным и была желательна разработка других средств для лечения миелофиброза.

[Патентная литература 1] JP А №8-002799

[Патентная литература 2] WO 2006/068232

[Непатентная литература 1] Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007; 2007:346-54

[Непатентная литература 2] The Journal of the Japanese Society of Internal Medicine, Vol.96, No. 7, July 10, 2007, pp.1398-1404

Целью настоящего изобретения является обеспечение нового средства лечения миелофиброза и способа лечения миелофиброза.

В процессе изучения нового терапевтического средства для лечения миелофиброза исследователи обнаружили, что миелофиброз можно эффективно лечить с помощью введения композиции, в которой ингибитор продукции внеклеточного матрикса доставляется носителем, содержащим ретиноид.

Хотя было известно, что носитель, содержащий витамин А, может доставить лекарственное средство в звездчатые клетки, которые накапливают витамин А (см. Патентную литературу 2), его связь с миелофиброзом была совершенно неизвестна до настоящего времени. Также не было никаких сообщений, что миелофиброз мог быть вылечен композицией, содержащей в качестве активного ингредиента ингибитор продукции внеклеточного матрикса. Поэтому данные результаты исследования достаточно удивительны.

А именно, данное изобретение касается следующего:

(1) Доставляющий вещество носитель для доставки вещества к клетке костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента.

(2) Носитель по пункту (1), где ретиноид содержит ретинол.

(3) Носитель по пункту (1) или (2), где содержание ретиноида составляет 0,2-20 мас.% от общей массы носителя.

(4) Носитель по любому из пунктов (1)-(3), где носитель имеет форму липосомы, и молярное соотношение ретиноида к липидам, содержащимся в липосоме, составляет 8:1 - 1:4.

(5) Композиция для лечения миелофиброза, содержащая лекарственное средство, которое контролирует активность или рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс.

(6) Композиция по пункту (5), дополнительно содержащая носитель по любому из пунктов (1)-(4).

(7) Композиция по пункту (5) или (6), где лекарственное средство, которое контролирует активность или рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, выбрано из группы, состоящей из средства для ингибирования активности или продуцирования биоактивного вещества, выбранного из группы, состоящей из желатиназы А, желатиназы В и ангиотензиногена, ингибитора клеточной активности, ингибитора роста, апоптоз-индуцирующего средства, а также миРНК (siRNA), рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты, и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на, по меньшей мере, одну из молекул, образующих внеклеточный матрикс, или молекул, вовлеченных в продукцию или секрецию указанных молекул, образующих внеклеточный матрикс, и вектора, который экспрессирует указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и ДНК/РНК химерный полинуклеотид.

(8) Композиция по пункту (7), где молекулой, вовлеченной в продукцию или секрецию образующих внеклеточный матрикс молекул, является HSP47.

(9) Композиция по любому из пунктов (5)-(8), где лекарственное средство и носитель смешивают на месте медикаментозного лечения или поблизости.

(10) Набор для приготовления композиции по любому из пунктов (6)-(9), содержащий один или более контейнеров, которые содержат либо отдельно, либо в комбинации лекарственное средство, которое контролирует активность или рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, ретиноид и, если необходимо, вещество, являющееся составляющей частью носителя, отличное от ретиноида.

(11) миРНК, нацеленная на часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13, где часть выбирается из участков от позиции 1130 до позиции 1145, от позиции 1485 до позиции 1500, от позиции 1501 до позиции 1516, от позиции 1654 до позиции 1678 и от позиции 1951 до позиции 1978 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13.

(12) миРНК по пункту 11, состоящая из любой из следующих комбинаций от А до Е смысловой цепи и антисмысловой цепи:

А: комбинация 5'-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3' (смысловая цепь, SEQ ID NO:1) и 3'-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5' (антисмысловая цепь, SEQ ID NO:2),

В: комбинация 5'-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3' (смысловая цепь, SEQ ID NO:3) и 3'-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5' (антисмысловая цепь, SEQ ID NO:4),

С: комбинация 5'-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3' (смысловая цепь, SEQ ID NO:5) и 3'-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5' (антисмысловая цепь, SEQ ID NO:6),

D: комбинация 5'-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3' (смысловая цепь, SEQ ID NO:7) и 3'-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5' (антисмысловая цепь, SEQ ID NO:8),

Е: комбинация 5'-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3' (смысловая цепь, SEQ ID NO:9) и 3'-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5' (антисмысловая цепь, SEQ ID NO:10).

Несмотря на то что точный механизм действия композиции для лечения миелофиброза по настоящему изобретению еще не совсем выяснен, механизм рассматривается следующим образом: ретионоид в композиции действует как направляющий агент к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам костного мозга, таким как фибробласты костного мозга, и доставляет к таким клеткам активные ингредиенты, такие как фармацевтические агенты, которые контролируют активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток костного мозга, тем самым показывая эффект против миелофиброза.

Так как активные ингредиенты могут быть эффективно доставлены к месту действия и далее к клеткам-мишеням, с помощью применения носителя по настоящему изобретению, стало возможным лечение, подавление прогрессирования и предотвращение развития миелофиброза, в частности первичного миелофиброза, лечение которого до настоящего момента было затруднительно; таким образом, носитель по настоящему изобретению вносит существенный вклад в медицину и ветеринарию.

Кроме того, так как композиция по настоящему изобретению содержит в качестве активного агента лекарственное средство, которое контролирует активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток костного мозга, чья эффективность по отношению к миелофиброзу не была известна, лечение миелофиброза может происходить по механизму, отличному от известных на данный момент. Поэтому ожидают улучшение патологических состояний, которые не могут быть вылечены лекарственными средствами обычного механизма действия, и увеличение терапевтического эффекта при совместном применении с обычными лекарственными средствами.

Более того, носитель по настоящему изобретению может быть объединен с любыми фармацевтическими лекарственными средствами (например, с существующими терапевтическими средставами против миелофиброза) для увеличения эффективности их действия; поэтому широкий спектр его применения также полезен с точки зрения технологии производства лекарственных средств, облегчая производство эффективных терапевтических агентов.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показаны фотографии, демонстрирующие изображения костного мозга пациентов с идиопатическим миелофиброзом. Пациент 1 и Пациент 2 демонстрируют трабекулярное утолщение при окрашивании ГЭ (левая колонка), гиперплазию ретикулярного волокна при окрашивании по Гиттеру (Gitter staining) (центральная колонка) и отложение коллагена при окрашивании по Азану (Azan staining) (правая колонка).

На Фиг.2 приведена диаграмма, демонстрирующая патогенез миелофиброза на мышиной модели.

На Фиг.3 показаны фотографии, демонстрирующие изображения костного мозга ТРО трансгенных мышей, возраст 4 и 7 месяцев. В левой колонке показано окрашивание ГЭ, в центральной колонке показано окрашивание по Гиттеру, и в правой колонке показано окрашивание по Азану.

На Фиг.4 показаны фотографии, демонстрирующие изображения костного мозга ТРО трансгенных мышей, возраст 9 и 12 месяцев. В левой колонке показано окрашивание ГЭ, в центральной колонке показано окрашивание по Гиттеру, и в правой колонке показано окрашивание по Азану.

На Фиг.5 показаны фотографии, демонстрирующие переход к трабекулярному утолщению в ТРО трансгенных мышах. Верхняя левая панель - это окрашивание ГЭ костного мозга 4-х месячной мыши (4М), верхняя правая панель - возраст 7 месяцев (7М), нижняя левая панель - возраст 9 месяцев (9М), и нижняя правая панель - возраст 12 месяцев (12М).

На Фиг.6 показана фотография, демонстрирующая морфологию первично культивированных фибробластов костного мозга ТРО мышей, полученная под инвертированным микроскопом (увеличение x400).

На Фиг.7 показаны диаграммы, демонстрирующие результаты анализа экспрессии Виментина и α-SMA с помощью проточной цитометрии в первично культивированных фибробластах костного мозга ТРО мышей. Вертикальная ось показывает количество клеток.

На Фиг.8 показаны изображения вестерн-блота, демонстрирующие эффект различных миРНК HSP47 на экспрессию HSP47 в NIH3T3 (А) и первичных культурах фибробластов костного мозга ТРО мышей (Первичные фибробласты В и С).

На Фиг.9 показаны диаграммы, демонстрирующие эффект витамина А (VA) на введение заключенной в липосомы миРНК HSP47 (Lip-siRNA) в первично культивированные фибробласты костного мозга ТРО мышей. (А) и (В) показывают результаты анализов с помощью проточной цитометрии и изображения под флуоресцентным микроскопом соответственно.

На Фиг.10 показана диаграмма, демонстрирующая воздействие миРНК HSP47 на секрецию коллагена в первично культивированных фибробластах костного мозга ТРО мышей.

На Фиг.11 показаны изображения образцов под микроскопом, окрашенных по Гиттеру, которые демонстрируют воздействие миРНК HSP47 на фибриллизацию костного мозга ТРО мышей in vivo.

На Фиг.12 приведен график, показывающий количественную оценку уровня улучшения гиперплазии ретикулярного волокна у ТРО мышей с помощью миРНК HSP47 по анализу изображений. Вертикальная ось показывает соотношение точек ретикулярного волокна и всех точек в каждом поле.

На Фиг.13 показаны изображения под микроскопом образцов, окрашенных по Азану, которые демонстрируют воздействие миРНК HSP47 на фибриллизацию костного мозга ТРО мышей in vivo.

На Фиг.14 показаны изображения под микроскопом образцов при окрашивании ГЭ, которые демонстрируют воздействие миРНК HSP47 на фибриллизацию костного мозга ТРО мышей in vivo.

Описание вариантов выполнения настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к доставляющему вещество носителю для доставки вещества к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга, содержащему ретиноид в качестве направляющего агента.

В настоящем изобретении, продуцирующая внеклеточный матрикс клетка костного мозга специально ограничена только упоминанием, что эта клетка присутствует в костном мозге и способна производить внеклеточный матрикс, и обычно является фибробластом костного мозга. Для фибробласта костного мозга характерна экспрессия α-SMA (альфа-актин гладкой мышцы). В настоящем изобретении фибробласт костного мозга представляет собой один из идентифицированных, например, иммуноокрашиванием с использованием меченных анти-α-SMA антител.

В настоящем изобретении, ретиноид не ограничен специальным образом, за исключением упоминания, что он содействует доставке вещества к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга, и его примеры включают производные ретиноида, такие как ретинол (витамин А), этретинат, третиноин, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен, и ретинол пальмитат, так же как и аналоги витамина А, такие как фенретинид (4-HPR, 4-гидроксифенилретинамид) и бексаротен.

Ретиноид согласно настоящему изобретению является одним из тех веществ, которые содействуют специфической доставке вещества к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга. Механизм содействия ретиноида при доставке вещества еще не полностью ясен; тем не менее, например, считается, что ретиноид, специфически связанный с ретинол-связывающим белком (RBP), захватывается внутрь клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, через определенный рецептор, представленный на поверхности этой клетки.

Ретиноид является членом класса соединений, имеющих скелет, в котором четыре единицы изопреноида связаны способом "голова-к-хвосту" (см. G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents", 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992)). Витамин А является типичным дескриптором ретиноида, который качественно демонстрирует биологическую активность ретинола. Ретиноид, который может применяться в настоящем изобретении, специально не ограничен, и примеры его включают производные ретиноида, такие как ретинол, ретинал, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты, сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты, этретинат, третиноин, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен и ретинол пальмитат, и аналоги витамина А, такие как фенретинид (4-HPR) и бексаротен.

Средин них ретинол, ретинал, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты (такие, как ретинил ацетат, ретинил пальмитат, ретинил стеарат и ретинил лаурат) и сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты (такой, как этилретиноат) являются предпочтительными с точки зрения эффективности специфической доставки вещества к клеткам костного мозга, продуцирующим внеклеточный матрикс.

Все изомеры ретинола, включая цис-транс изомеры, входят в объем данного изобретения. Ретиноид может быть заменен одним или более заменителей. Ретиноид согласно настоящему изобретению включает ретиноид в выделенной форме, так же как в форме раствора или смеси со средой, которая может растворять или удерживать ретиноид.

Носитель по настоящему изобретению может быть образован из самого ретиноида или может быть получен путем связывания ретиноида с образующим носитель компонентом, отличным от ретиноида, или путем включения ретиноида в компонент, являющийся составляющей частью носителя, отличный от ретиноида. Поэтому носитель по настоящему изобретению может содержать компонент, являющийся составляющей частью носителя, отличный от ретиноида. Такой компонент специальным образом не ограничен, и может применяться любой известный компонент в области медицины или фармацевтики, но предпочтительны те, которые могут окружать ретиноид или связываться с ретиноидом.

Примеры таких компонентов включают липиды, например фосфолипид, такой как глицеролфосфолипид, сфинголипид, такой как сфингомиелин, стерол, такой как холестерол, растительное масло, такое как соевой масло или маковое масло, минеральное масло и лецитин, такой как лецитин яичного желтка, но примеры этим не ограничены. Среди них являются предпочтительными те, которые могут образовывать липосомы, например природный фосфолипид, такой как лецитин, полусинтетический фосфолипид, такой как димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) или дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), и диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилауроилфосфатидилхолин (DLPC) и холестерол.

Особенно предпочтительным компонентом является компонент, который может избежать захвата ретикулоэндотелиальной системой, и его примеры включают катионные липиды, такие как N-(α-триметиламмоний ацетил)-дидодецил-D-глутамат хлорид (TMAG), N,N',N",N"'-тетраметил-N,N',N",N"'-тетрапальмитилспермин (TMTPS), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия трифторацетат (DOSPA), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA), диоктадецилдиметиламмония хлорид (DODAC), дидодециламмония бромид (DDAB), 1,2-диолеилокси-3-триметиламмоний пропан (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерол (DC-Chol), 1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE), и 0,0'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмоний ацетил)диэтаноламин хлорид (DC-6-14).

Связывание ретиноида с носителем по настоящему изобретению или заключение ретиноида в него также возможно путем связывания ретиноида с или заключения его в компонент носителя, отличный от ретиноида, с помощью химического и/или физического способа. Альтернативно, ретиноид может быть связан с или заключен в носитель по настоящему изобретению, путем смешивания ретиноида и компонентов носителя, отличных от ретиноида, в процессе подготовки носителя. Количество ретиноида, связанного с или заключенного в носитель по настоящему изобретению, может составлять по отношению к массе компонентов, являющихся составляющей частью носителя, от 0,01% до 100%, предпочтительно от 0,2% до 20% и более предпочтительно от 1% до 5%. Ретиноид может быть связан с или заключен в носитель до добавления лекарственного средства к носителю; или носитель, ретиноид и лекарственное средство могут быть смешаны одновременно; или ретиноид может быть подмешан к уже несущему лекарственное средство носителю, и так далее. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, специфичной к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга, где способ содержит стадию связывания ретиноида с любым существующим связывающим лекарственное средство носителем или капсулирующим лекарственное средство носителем, например липосомальная композиция, такая как DaunoXome®, Doxil, Caelyx® или Myocet®.

Носитель по настоящему изобретению может быть в любой форме, позволяющей переносить требуемое вещество или объект к заданной клетке костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, и примеры вышеуказанного, но без ограничения к этому, включают макромолекулярную мицеллу, липосому, эмульсию, микросферы и наносферы. В данном изобретении, среди этих форм липосомальная форма является предпочтительной с точки зрения высокой эффективности доставки, широкого выбора доставляемого вещества и удобства получения, и так далее, и особенно предпочтительна катионная липосома, включая катионный липид. В случае, когда носитель в форме липосомы является предпочтительным, молярное отношение ретиноида к другим компонентам липосомы от 8:1 до 1:4, более предпочтительно от 4:1 до 1:2, еще более предпочтительно от 3:1 до 1:1 и особенно предпочтительно 2:1, принимая во внимание эффективность связывания ретиноида с или заключения в носитель.

Носитель по настоящему изобретению может содержать транспортируемое вещество внутри себя, может быть прикреплен к внешней части транспортируемого вещества или может быть смешан с транспортируемым веществом, пока он содержит ретиноид в такой форме, что ретиноид способен действовать как направляющий агент. Фраза "действовать как направляющий агент" в настоящем документе означает, что содержащий ретиноид носитель достигает и/или захватывается клеткой-мишенью, то есть клеткой костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, более быстро и/или в большем количестве, чем несодержащий ретиноид носитель, и это может быть легко подтверждено с помощью, например, добавления меченого носителя или носителя, содержащего метку, к культуре клеток-мишеней и анализа распределения метки после определенного периода времени. Конструктивно это требование может быть удовлетворено, например, если ретиноид, по меньшей мере частично, оказывается на внешней части композиции, содержащего носитель, не позднее того момента, когда достигает клетки-мишени. Выставлен или нет ретиноид на внешней части композиции может быть оценено путем взаимодействия композиции с веществом, которое специфически связывает ретиноид, таким как ретинолсвязывающий белок (RBP), и оценки его связывания с композицией.

Вещество или объект, доставляемое данным носителем, специальным образом не ограничено и предпочтительно имеет такой размер, что может физически передвигаться в организме от места введения к месту поражения, где присутствует клетка-мишень. Поэтому носитель по настоящему изобретению может транспортировать не только такое вещество, как атом, молекула, соединение, белок, или нуклеиновая кислота, но также такой объект, как вектор, вирусная частица, клетка, высвобождающая лекарственное средство система, состоящая из одного или более элементов, или микромашина. Вещество или объект предпочтительно имеют свойство оказывать некоторое влияние на клетку-мишень, например метить клетку-мишень или контролировать (например, усиливать или подавлять) активность роста клетки-мишени.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, то, что доставляется носителем, представляет собой "лекарственное средство, контролирующее активность или рост клеток костного мозга, продуцирующих внеклеточный матрикс". Активность клеток костного мозга, продуцирующих внеклеточный матрикс, согласно настоящему изобретению относится к разным активностям, таким как секреция, поглощение или миграция, проявляемым клеткой костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, и по настоящему изобретению активность предпочтительно представляет собой активность, вовлеченную в начало, прогрессирование, и/или рецидив миелофиброза. Примеры таких активностей включают, но без ограничения к этому, производство/секрецию биологически активного вещества, такого как желатиназа А и желатиназа В (ММР2 и ММР9 соответственно) и ангиотензиногена, и компонента внеклеточного матрикса, такого как коллаген, протеогликан, тенасцин, фибронектин, тромбоспондин, остеопонтин, остеонектин и эластин.

Таким образом, лекарственное средство, контролирующее активность и рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, может быть любым лекарственным средством, которое непосредственно или опосредованно подавляет физическое, химическое и/или физиологическое действие указанной клетки, связанное с началом, прогрессированием и/или рецидивом миелофиброза, и включает, но без ограничения к этому: лекарственное средство, подавляющее активность или производство указанных выше биологически активных веществ, ингибитор ММР, такой как батимастат, и антитела и фрагменты антител, нейтрализующие указанные выше биологически активные вещества, и вещество, подавляющее экспрессию указанных выше биологически активных веществ, такое как миРНК (siRNA), рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК (пептидо-нуклеиновая кислота) или их смесь), или вещество, имеющее доминантный негативный эффект, такое как доминантный негативный мутант, или вектор их экспрессирующий, или лекарственное средство, ингибирующее производство или секрецию указанного выше компонента внеклеточного матрикса, например вещество, подавляющее экспрессию компонента внеклеточного матрикса, такое как миРНК (siRNA), рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК или их смесь), или вещество, имеющее доминантный негативный эффект, такое как доминантный негативный мутант, или вектор их экспрессирующий, ингибитор клеточной активности, такой как блокатор натриевых каналов, ингибиторы клеточного роста, такие как алкилирующий агент (такой, как ифосфамид, нимустин, цикпофосфамид, дакарбазин, мелфалан и ранимустин), противоопухолевый антибиотик (такой, как идарубицин, эпирубицин, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митоксантрон и митомицин С), антиметаболит (такой, как гемцитабин, эноцитабин, цитарабин, тегафур/урацил, тегафур/гимерацил/отерацил калия, доксифлуридин, гидроксикарбамид, фторурацил, метотрексат и меркаптопурин), алкалоид, такой как этопозид, иринотекан гидрохлорид, винорелбин дитартрат, доцетаксел гидрат, паклитаксел, винкристин сульфат, виндезин сульфат и винбластин сульфат, и комплексы платины, такие как карбоплатин, цисплатин и недаплатин, а так же как индукторы аппоптоза, такие как соединение 861, глиотоксин, ловастатин и Берактант. Более того, "лекарственное средство, контролирующее активность и рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс" по настоящему изобретению может быть любым лекарственным средством, непосредственно или опосредованно содействующим физическим, химическим и/или физиологическим действиям клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, непосредственно или опосредованно связанным с подавлением начала, прогрессирования и/или рецидива миелофиброза.

Среди "лекарственных средств, контролирующих активность и рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс" по настоящему изобретению предпочтение отдается лекарственным средствам, ингибирующим производство/секрецию компонента внеклеточного матрикса, например коллагена, протеогликана, тенасцина, фибронектина, тромбоспондина, остеопонтина, остеонектина и эластина, и особенно предпочтительно ингибиторы Белка теплового шока 47 (HSP47), в том числе миРНК (siRNA) против HSP47.

Доставляемое носителем вещество по изобретению включает, без ограничения к этому, лекарственные средства, которые подавляют начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза, и лекарственные средства, которые не были отмечены ранее, и примеры включают, без ограничения, анаболические гормоны, такие какданазол и Примоболан, ингибиторы ангиогенеза, такие как талидомид и леналидомид, противоопухолевые лекарственные средства, такие как гидроксикарбамид, анагрелид, иматиниб, 2-хлородеоксиаденозин, мелфалан, бусульфан и этопозид, эритропоэтин, ингибиторы тирозинкиназы JAK2V617F, ингибиторы TGF-β, такие как растворимый рецептор TGF-β, ингибиторы NFκB, такие как бортезомиб, ингибиторы ДНК метилтрансферазы, такие как децитабин, ингибиторы гистондеацетилазы, такие как трихостатин А, ингибиторы VEGF, такие как PTK787/ZK222584 и бевасизумаб, и противоопухолевые лимфоцитарные антитела, описанные в Патентной литературе 1, приведенной выше.

Доставляемое носителем вещество или объект по изобретению может быть меченым и немеченым. Мечение делает возможным мониторинг успеха или неуспеха транспортировки, или увеличения и уменьшения в клетках-мишенях, и так далее, и особенно полезно на уровне тестирования/исследования. Метка может быть выбрана из любых меток, известных специалистам в данной области техники, таких как, например, любой радиоизотоп, магнитный материал, вещество, которое связывается с меченым веществом (например, антитело), флуоресцентное вещество, флуорофор, хемилюминесцентное вещество и фермент, и так далее.

В настоящем изобретении фраза "к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга" или "для доставки к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга" означает, что это подходит для применения по отношению к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам костного мозга как клетке-мишени, и это включает, например, возможность доставки вещества к этой клетке более быстро, эффективно и/или в большем количестве, чем к другим клеткам, например нормальным клеткам. Например, носитель по настоящему изобретению может доставлять вещество к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга со скоростью и/или эффективностью в 1,1 раза выше или более, 1,2 раза выше или более, 1,3 раза выше или более, 1,5 раза выше или более, 2 раза выше или более, и даже 3 раза выше или более, по сравнению с другими клетками.

Настоящее изобретение также относится к композиции для контроля активности или роста продуцирующей внеклеточный матрикс клетки костного мозга, или для лечения миелофиброза, композиции, содержащей лекарственное средство, которое контролирует активность или рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки костного мозга, и настоящее изобретение также относится к применению при получении указанных композиций лекарственного средства, которое контролирует активность или рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки костного мозга. Лекарственное средство может содержаться в композиции само по себе или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Композиция по настоящему изобретению может быть нацелена на продуцирующую внеклеточный матрикс клетку костного мозга, которая будет мишенью, с целью эффективной доставки к указанной клетке. Способ наведения на цель специальным образом не ограничен, за исключением того, что он должен содействовать доставке композиции по настоящему изобретению к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга, например фибробласту костного мозга, и примеры включают добавление ретиноида. Соответственно, предпочтительное воплощение данного изобретения включает ретиноид как направляющий агент, и более предпочтительно включает носитель, содержащий выше упомянутый ретиноид, в качестве направляющего агента.

По настоящему изобретению миелофиброз включает первичный миелофиброз, так же как и вторичный миелофиброз. Вторичный миелофиброз включает, без ограничения к этому, миелофиброз, который является вторичным по отношению к болезни, такой как острый миелолейкоз, острая лимфоидная лейкемия, хронический миелолейкоз, истинная полицитемия, первичная тромбоцитопения, миелодиспластический синдром, множественная миелома, злокачественная лимфома, карцинома, системная красная волчанка и прогрессирующий системный склероз или лучевая болезнь.

Миелофиброз по настоящему изобретению может быть диагностирован любыми способами, известными специалистам в данной области техники. Наиболее характерной патологией миелофиброза является фибриллизация костного мозга, и это может быть определено до некоторой степени неудачей в сборе аспирата костного мозга при аспирации костного мозга ("сухая пункция"). Окончательный диагноз может быть поставлен путем подтверждения фибриллизации костного мозга и/или увеличения трабекул с помощью биопсии костного мозга (см. Фиг.1). Дополнительно первичный миелофиброз может проявляться анемией, гепатоспленомегалией, появлением лейкоэритробластоза, пойкилоцитоз, таких как дакриоциты, бластных клеток, макротромбоцитов и мегакариоцитов в периферической крови, увеличением сывороточной ЛДГ (LDH), увеличением печеночно-селезеночного поглощения при сцинтиграфии костного мозга, тенденцией случайных кровотечений, вздутием живота, лихорадкой, общим недомоганием, потерей веса и т.д. При вторичном миелофиброзе симптомы основной болезни часто выходят на первый план. Симптомы, специфичные для основной болезни, хорошо известны специалистам в данной области.

В композиции по настоящему изобретению, если содержащийся в носителе ретиноид присутствует в такой форме, что действует как направляющий агент, носитель может содержать доставляемое вещество внутри себя, может быть прикреплен к внешней части транспортируемого вещества, или может быть смешан с транспортируемым веществом. Поэтому в зависимости от способа введения и способа высвобождения лекарственного вещества, и так далее, композиция может быть покрыта подходящим материалом, таким как, например, кишечнорастворимая оболочка или материал с регулируемым временем распада, или может быть включена в подходящую систему высвобождения лекарственного вещества.

Композиция по настоящему изобретению может быть введена различными путями, включая как пероральный, так и парентеральный пути, и примеры этого включают, но без ограничения к этому, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, внутри дыхательных путей, интратрахеальный, интрабронхиальный, назальный, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутримозговой, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный пути, и может быть выполнена в виде лекарственной формы, пригодной для каждого пути введения. Такая лекарственная форма и способ получения могут быть выбраны в качестве подходящих из любых известных лекарственных форм и способов (см., например, Hyojun Yakuzaigaku (Standard Pharmaceutics), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003).

Примеры лекарственных форм, пригодных для перорального способа введения, включают, но без ограничения к этому, порошок, гранулы, таблетка, капсула, жидкость, суспензию, эмульсию, гель и сироп, и примеры лекарственных форм, пригодных для парентерального способа введения, включают инъекции, такие как раствор для инъекций, суспензия для инъекций, эмульсия для инъекций, и инъекционная форма, приготавливаемая непосредственно перед введением. Составы для парентерального введения могут быть в такой форме, как водный или неводный стерильный изотонический раствор или суспензия.

Композиция по настоящему изобретению может содержать одно или более из любых других лекарственных средств, которые могут лечить миелофиброз или облегчать его начало, прогрессирование и/или рецидив, и/или симптомы, или может применяться в комбинации с такими лекарственными средствами. Примеры таких лекарственных средств включают, без ограничения, например, анаболические гормоны, такие как даназол и примоболан, ингибитор ангиогенеза, такой как талидомид и леналидомид, противоопухолевое лекарственное средство, такое как гидроксикарбамид, анагрелид, иматиниб, 2-хлордеоксиаденозин, мелфалан, бусульфан и этопозид, эритропоэтин, ингибиторы тирозинкиназы JAK2V617F, ингибиторы TGF-β, как, например, растворимый рецептор TGF-β, ингибиторы NFκB, такие как бортезомиб, ингибиторы ДНК метилтрансферазы, такие как децитабин, ингибиторы гистондеацетилазы, такие как трихостатин А, ингибиторы VEGF, такие как PTK787/ZK222584 и бевасизумаб, и противоопухолевые лимфоцитарные антитела, описанные в Патентной литературе 1, приведенной выше. При применении в комбинации композиция по настоящему изобретению может быть введена одновременно, до или после другого лекарственного средства. Способ введения может быть тем же или другим. Например, композиция по настоящему изобретению может быть введена парентерально, тогда как другое лекарственное вещество может быть введено перорально, и так далее.

Носитель или композиция по настоящему изобретению могут предоставляться в любой форме, но с точки зрения сохранения стабильности предпочтительно представление в такой форме, которая может быть приготовлена на месте медицинского лечения или рядом с ним, врачом и/или фармацевтом, медсестрой или другим медицинским работником. В этом случае носитель или композиция по настоящему изобретению предоставляется в виде одного или более контейнеров, содержащих, по меньшей мере, одну составляющую, необходимую для приготовления, и приготовление осуществляется перед использованием, например, в пределах 24 часов перед использованием, предпочтительно в пределах 3 часов перед использованием и более предпочтительно непосредственно перед использованием. Во время приготовления обычно на месте приготовления доступны реагент, растворитель, оборудование для приготовления и т.д., которые могут применяться соответствующим образом.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к набору для приготовления носителя или композиции, причем набор содержит один или более контейнеров, которые содержат или отдельный, или в комбинации ретиноид, и/или доставляемое вещество, и/или вещество, являющееся составляющей частью носителя, отличное от ретиноида, так же как и к составляющей, необходимой для носителя или для композиции, представленного в форме такого набора. Набор по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к выше указанному, инструкции, электронный носитель, такой как CD или DVD, относящиеся к способам приготовления и введения носителя и композиции по настоящему изобретению. Более того набор по настоящему изобретению может содержать все компоненты для конечного получения носителя или композиции по настоящему изобретению, но необязательно, чтобы он содержал все компоненты. Таким образом, в наборе по настоящему изобретению не требуется содержания реагента или растворителя, которые обычно доступны на месте проведения медицинского лечения или в экспериментальном помещении, и так далее, таких как, например, стерильная вода, физиологический раствор или раствор глюкозы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу контроля активности или роста продуцирующей внеклеточный матрикс клетки костного мозга, или к способу лечения миелофиброза, где способ содержит введение эффективного количества вышеупомянутой композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Эффективное количество согласно настоящему изобретению, в способе лечения миелофиброза, представляет собой, например, количество, которое подавляет начало или рецидив миелофиброза, облегчает его симптомы, или задерживает или останавливает его прогрессирование, и предпочтительно является количеством, которое предотвращает начало или рецидив миелофиброза или излечивает его. Также предпочтительно количество, которое не вызывает побочного эффекта, превышающего пользу от введения. Такое количество может быть должным образом определено с помощью теста in vitro, с применением культуры клеток или с помощью теста на животной модели, такой как мышь, крыса, собака или свинья, и такие способы тестирования хорошо известны специалистам в области техники. Более того, доза ретиноида, содержащаяся в носителе, и доза лекарственного средства, применяемого в способе по настоящему изобретению, известны специалистам в данной области техники, или могут быть должным образом определены с помощью вышеупомянутых тестов, и так далее.

Специфичная доза композиции, вводимой в способе по настоящему изобретению, может быть определена с учетом разных состояний применительно к пациенту, нуждающемуся в лечении, таких как тяжесть симптомов, общее состояние здоровья пациента, возраст, масса тела, пол пациента, диета, время и частота введения, сопутствующее лекарственное средство, восприимчивость к терапии, и пригодность терапии для данного пациента, и так далее.

Способ введения включает различные способы, включая как пероральный, так и парентеральный пути, например, такие как пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, внутри дыхательных путей, интратрахеальный, интрабронхиальный, назальный, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутримозговой, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный пути.

Частота введения варьирует в зависимости от свойств применяемой композиции и вышеупомянутых состояний пациента, и может составлять, например, несколько раз в день (то есть 2, 3, 4, 5 и более раз в день), один раз в день, раз в несколько дней (то есть каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней и так далее), несколько раз в неделю (например, 2, 3, 4 раза и так далее в неделю), один раз в неделю, или каждые несколько недель (то есть каждые 2, 3, 4 недели и так далее).

В способе по настоящему изобретению термин "пациент" означает любой живой индивидуум, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее и еще более предпочтительно человека. В данном изобретении, пациент может быть здоров или болен некоторым расстройством, и если лечение миелофиброза назначено, это обычно означает, что пациент болен миелофиброзом или подвергнут риску заболеть миелофиброзом. Когда назначена профилактика первичного миелофиброза, например, типичные примеры включают, без ограничения, пациентов, имеющих мутацию в гене Jak2 и/или c-mpl. Когда назначена профилактика вторичного миелофиброза, типичные примеры включают, без ограничения, пациентов, больных такими заболеваниями, как острый миелолейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический миелолейкоз, истинная полицитемия, первичная тромбоцитопения, миелодиспластический синдром, множественная миелома, злокачественная лимфома, карцинома, системная красная волчанка и прогрессирующий системный склероз, или пациента, который был подвергнут облучению.

Более того, термин "лечение" включает все типы приемлемых с медицинской точки зрения профилактических и/или терапевтических вмешательств с целью лечения, временной ремиссии или профилактики расстройства. Например, термин "лечение" включает приемлемые с медицинской точки зрения вмешательства с различными целями, включая задержку или остановку прогрессирования миелофиброза, регрессию или исключение поражения, профилактику начала или профилактику рецидива миелофиброза.

Настоящее изобретение также относится к способу применения вышеуказанного носителя для доставки лекарственного средства к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке косного мозга. Этот способ включает, но без ограничения к этому, например, стадию добавления к носителю доставляемого вещества, стадию введения или добавления носителя, несущего доставляемое вещество в организм или среду, например культуральную среду, которая содержит продуцирующую внеклеточный матрикс клетку косного мозга. Эти стадии могут быть должным образом достигнуты в соответствии с любым известным способом или таким способом, как описан в данном описании изобретения. Способ доставки может быть объединен с другим способом доставки, например другой способ направленной доставки в костный мозг. Более того, способ включает вариант воплощения, выполненный in vitro, и вариант воплощения, в котором мишенью является продуцирующая внеклеточный матрикс клетка косного мозга внутри тела.

Настоящее изобретение также относится к новой миРНК (siRNA) против мышиного HSP47, предпочтительно такой, которая направлена к части, выбранной из участков от позиции 1130 до позиции 1145, от позиции 1485 до позиции 1500, от позиции 1501 до позиции 1516, от позиции 1654 до позиции 1678 и от позиции 1951 до позиции 1978 последовательности SEQ. ID NO:13. Хотя способы конструирования и получения миРНК против определенного участка гена, с целью подавления экспрессии указанного гена, известны в данной области техники, как правило, невозможно предсказать тот участок гена, который должен быть мишенью, и это может быть установлено только через эксперимент. В данном изобретении, благодаря сильному подавляющему эффекту на экспрессию HSP47, предпочтительной является миРНК, нацеленная на участок от позиции 1501 по позицию 1516, и миРНК, нацеленная на участок от позиции 1951 по позицию 1978 последовательности SEQ. ID NO:13. Некоторые предпочтительные примеры новых миРНК по настоящему изобретению состоят из следующих комбинаций смысловой цепи и антисмысловой цепи.

Последовательности А: комбинация:

5'-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:1) и

3'-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:2).

Последовательности В: комбинация:

5'-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:3) и

3'-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:4).

Последовательности С: комбинация:

5'-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:5) и

3'-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:6).

Последовательности D: комбинация:

5'-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:7) и

3'-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:8).

Последовательности Е: комбинация:

5'-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:9) и

3'-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:10).

Среди них последовательности С и D особенно предпочтительны благодаря их сильному подавляющему эффекту в отношении экспрессию HSP47.

миРНК по настоящему изобретению может иметь естественную структуру РНК, или может также иметь различные модификации, направленные на улучшение стабильности in vivo или сродство к последовательности-мишени. Такая модификация включает, без ограничений к этому, модификацию посредством концевой аминогруппы, тиоловой группы, холестерола, длинноцепочечного алкила, сахарной цепи или пептида, и так далее, образование АР-сайта, введение модифицированной нуклеиновой кислоты такой как блокированная нуклеиновай кислота (LNA), пептидо-нуклеиновая кислота (ПНК), нуклеотид, модифицированный в 2' позиции сахара, например 2'-O-алкил-, 2'-O-алкил-O-алкил- или 2'-фтор-модифицированный нуклеотид.

миРНК по настоящему изобретению является чрезвычайно полезной для подавления экспрессии HSP47 в мышах и для подавления продукции коллагена, связанной с экспрессией HSP47, и может быть особенно пригодной для применения в исследованиях, экспериментах и тестах на мышах.

Примеры

Пример 1: Подтверждение патологии в мышиной модели миелофиброза.

Тромбопоэтин А (ТРО) трансгенная мышь, полученная Dr. Kazuya Shimoda и Dr. Mine Harada (ниже может также называться как ТРО мышь; см. Leukemia Research 29:761-769, 2005), применялась в качестве мышиной модели миелофиброза. В этой мыши ТРО избыточно производится в клетке, трансфицированной ТРО геном, что приводит к распространению мегакариоцитов в костном мозге. Распространившиеся мегакариоциты производят в избытке трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), который стимулирует фибробласты косного мозга, что способствует секреции коллагена фибробластами и приводит к фибриллизации костного мозга (см. Фиг.2)

ТРО мыши (предоставленные Kyushu University Animal Center) были выведены в нормальных условиях разведения, затем были подвергнуты эвтаназии в возрасте 4, 7, 9 или 12 месяце, их косный мозг был собран для приготовления образцов ткани, которые были окрашены с помощью окрашивания гематоксилин-эозином (ГЭ), окрашивания по Гиттеру или окрашивания по Азану соответственно, и изображения костного мозга были получены с помощью оптического микроскопа. Результаты показаны на Фиг.3 по 5.

Фибриллизация не была видна в возрасте 4 месяцев (4М). Однако в возрасте 7 месяцев (7М), хотя утолщение трабекулы не видны (ГЭ), гиперплазия ретикулярного волокна (Гиттер) и отложение коллагена (Азан) наблюдались (смотри Фиг.3).

В возрасте 9 месяцев (9М) и 12 месяцев (12М) было заметно утолщение трабекулы (ГЭ), также наблюдались гиперплазия ретикулярного волокна (Гиттер) и отложение коллагена (Азан). Более того, фибриллизация костного мозга и утолщение трабекулы прогрессировали (усилились) в 12М по сравнению с 9М (смотри Фиг.4).

В ГЭ образцах костного мозга ТРО мыши трабекулярное утолщение началось с возраста 9 месяцев (9М), и далее усилилось в возрасте 12 месяцев (смотри Фиг.5).

Соответственно, развитие симптомов миелофиброза было подтверждено у ТРО мышей.

Пример 2: Производство миРНК.

миРНК, нацеленные на мышиный HSP47 (миРНК HSP47), были получены в виде лекарственных средств, которые подавляют активность клеток костного мозга, продуцирующих внеклеточный матрикс. Более конкретно, пять миРНК HSP47 (миРНК HSP47 от А до Е), имеющих нижеприведенные последовательности, и случайная миРНК были синтезированы и применялись в экспериментах, далее приведенных в настоящем документе. миРНК HSP47 были приобретены у iGENE Therapeutics, Inc. (Tokyo), и целевые последовательности миРНК HSP47 были сконструированы на основе базы данных Refseq (GenBank Accession No. NM_009825), зарегистрированной в ноябре 2006. Случайная миРНК также была приобретена у iGENE Therapeutics, Inc. (название продукта: dsRNA scramble).

миРНК-А HSP47:

5'-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:1)

3'-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:2)

миРНК-В HSP47:

5'-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:3)

3'-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:4)

миРНК-С HSP47:

5'-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:5)

3'-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:6)

миРНК-D HSP47:

5'-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:7)

3'-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:8)

миРНК-Е HSP47:

5'-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:9)

3'-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:10)

Случайная миРНК:

5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:11)

3'-UAGCUAAGCGAUCUGGCCGAAGUAACG-5' (антисмысловая, SEQ ID NO:12)

Также были получены миРНК, меченные на 5'конце флуоресцентным красителем 6'-карбоксифлюоресцеином.

Пример 3: Свойства первично культивированных фибробластов костного мозга ТРО мышей.

Первичная культура фибробластов костного мозга была получена путем культивирования клеток костного мозга из ТРО мышей в возрасте от 4 до 6 недель в MEM (минимальная питательная среда Игла, Sigma) с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (FCS) в течение 4 недель. На Фиг.6 показана морфология клеток, полученная под инвертированным микроскопом. Клетки имеют веретенообразную форму, типичную для фибробластов. На Фиг.7 показаны результаты проточно-цитометрических анализов с использованием антител к маркерам мезенхимной клетки Виментину и α-SMA соответственно (анти-Виментин антитело (Santa Cruz Biotechnology) и анти-α-SMA антитело (Santa Cruz Biotechnology)). Наблюдали экспрессию обоих маркеров, демонстрирующую, что клетки, полученные из культуры, были типичными фибробластами костного мозга. В анализах использовали проточный цитометр FACS calibur (Becton Dickinson), и данные измерений анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson).

Пример 4: Влияние миРНК HSP47 на NIH3T3 клетку (линия клеток мышиных фибробластов).

1×10⁵ клеток NIH3T3 суспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Life Technologies) с добавлением 10% телячьей сыворотки (CS) и высеяли на 6-луночные культуральные плашки. Через 24 часа клетки NIH3T3 при 50-60% конфлюентности были трансфицированы миРНК HSP47, с применением Lipotrust (Hokkaido System Science Co., Ltd.). Конкретно, 20нМ Lipotrust и 50нМ случайной миРНК или миРНК HSP47 смешали на вортексе и применяли для трансфекции. Трансфицированные клетки NIH3T3 культивировали 4 часа в среде OPTI-MEM без сыворотки (GIBCO). Затем клетки NIH3T3 отмыли DMEM, и далее культивировали в течение 24 часов в DMEM с 10% CS, и экстрагировали белок. Затем экспрессию HSP47 анализировали с помощью вестерн-блота. А именно белок, экстрагированный из NIH3T3 клеток, фракционировали с использованием 4/20 SDS-полиакриламидного гельэлектрофореза (SDS-PAGE) и затем перенесли на нитроцеллюлозную мембрану. Сначала ее обработали либо первыми антителами против HSP47 (Stressgen) или первыми антителами против β-актина (Cell Signaling Technology), затем обработали вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой (Oncogene Research Product), и наконец проявили с помощью ECL (Amersham Life Science).

Результат показал, что через 24 часа после переноса миРНК HSP47 в NIH3T3 клетки миРНК-С и -D HSP47 имели более сильный эффект по сравнению с А, В и Е (см. Фиг.8А). Соответственно, мы применяли HSP47 миРНК-С и -D в качестве миРНК HSP47 в дальнейших экспериментах.

Пример 5: Влияние миРНК HSP47 на первично культивированные фибробласты косного мозга, полученные из ТРО мышей.

5×10⁵ первично культивированных фибробластов костного мозга, полученных из ТРО мышей, суспендировали в MEM с добавлением 15% FCS, и высеяли на 6-луночные культуральные плашки. Через 24 часа фибробласты костного мозга при 50-60% конфлюентности были трансфицированы миРНК HSP47, с применением Lipotrust Конкретно, 20 нМ Lipotrust и 50 нМ случайной миРНК или 5-50нМ миРНК-С или -D HSP47 смешали на вортексе и применяли для трансфекции, или они далее были смешаны с 40 нМ витамина А (ретинол, Sigma) на вортексе, через 5 минут, и использованы для трасфекции. Фибробласты косного мозга, трасфицированные либо витамин А-конъюгированными, либо витамин А-неконъюгированными липосомами с HSP47 миРНК, культивировали 4 часа в OPTI-MEM без сыворотки. Затем эти фибробласты костного мозга отмыли с MEM, далее культивировали 48 часов в MEM с добавлением 15% FCS, и экстрагировали белок. В различных экспериментах фибробласты косного мозга, трансфицированные 50 нМ витамин А-конъюгированными липосомами с миРНК-D HSP47 (VA-Lip-HSP47 миРНК-D; здесь далее "витамин А-конъюгированные" и "липосомы" могут быть сокращены как "VA" и "Lip" соответственно), культивировали 4 часа в OPTI-MEM без сыворотки и отмыли с MEM, затем далее культивировали от 24 до 96 часов в MEM с добавлением 15% FCS перед экстракцией белка. Затем экстрагированный белок анализировали на экспрессию HSP47 с помощью Вестерн-блота. Конкретно, экстрагированный из фибробластов костного мозга белок фракционировали с использованием 4/20 SDS-полиакриламидного гельэлектрофореза (SDS-PAGE) и затем перенесли на нитроцеллюлозную мембрану. Затем, подобно Примеру 4, мембрану обработали первыми антителами против HSP47 или β-актина, затем обработали вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой, и наконец проявили с помощью ECL. Результаты показаны на Фиг.8В и 8С.

Когда были использованы первично культивированные фибробласты костного мозга, ни миРНК-С HSP47 (Фиг.8, A), ни HSP47 миРНК-D (Фиг.8, B) в одиночку не показали никакого эффекта. Однако, при конъюгировании с витамином А (VA), было подтверждено проявление эффекта миРНК-С HSP47 (VA-Lip-HSP47 миРНК-С) при концентрации 50 нМ или выше, в то время как VA-Lip-HSP47 миРНК-D показала эффект при концентрации 25 нМ или выше. Соответственно стало ясно, что необходимо применять VA-Lip-HSP47 миРНК для эффективного переноса HSP47 миРНК в первично культивированные фибробласты косного мозга, и что VA-Lip-HSP47 миРНК-D оказывает более сильный подавляющий эффект на HSP47 по сравнению с VA-Lip-HSP47 миРНК-С. Таким образом, было решено в дальнейшем применять в экспериментах VA-Lip-HSP47 миРНК-D.

Кроме того, стало ясно, что эффект VA-Lip-HSP47 миРНК-D (50 нМ) может храниться до 72 часов (см. Фиг.8С).

Пример 6: Эффект витамина A (VA) на введение заключенной в липосомы миРНК HSP47 (Lip-siRNA миРНК) в первично культивированные фибробласты костного мозга, полученные из ТРО мышей.

Первично культивированные фибробласты костного мозга, полученные из ТРО мышей, трансфицировали Lip-HSP47 миРНК или VA-Lip-HSP47 миРНК, конъюгированной с 50нМ карбоксифлуоресцеином (FAM) (Lip-HSP47 миРНК-FAM или VA-Lip-HSP47 миРНК-FAM) в ОРТ1-МЕМ культуральной среде, с добавлением 10% CS, в присутствии или отсутствие 10 мг/мл антиретинолсвязывающий белок антителом (anti-RBP-Ab, BD Pharmingen), и анализировали с помощью проточной цитометрии через 30 минут. Среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) трансфицированных клеток измеряли с помощью FACS calibur и анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson). 5×10⁵ первично культивированных фибробластов костного мозга, полученных из ТРО мышей, высеяли на 6-луночные культуральные плашки. Через 24 часа добавили 50нМ VA-Lip-HSP47 миРНК-FAM или Lip-HSP47 миРНК-FAM. Эти клетки культивировали 30 минут в ОРТ1-МЕМ с добавлением 10% FCS, и отмыли PBS и в дальнейшем зафиксировали 4% параформальдегидом (25°градусов С, 15 минут). После фиксации ядро этих клеток было окрашено с DAPI в течение 1 минуты. Внутриклеточная локализация FAM была оценена с помощью флуоресцентного микроскопа. Типичная картина проточной цитометрии и типичный результат внутриклеточной локализации FAM-меченной миРНК показана на Фиг.9А и 9В соответственно. СИФ, как показано на Фиг.9А. Становится ясно, что в сравнении с Lip-HSP47 миРНК VA-Lip-HSP47 миРНК показывает более высокую эффективность трансфекции в первично культивированные фибробласты костного мозга, полученные из ТРО мышей (А и В). Кроме того, так как введение VA-Lip-HSP47 миРНК было частично подавлено anti-RBP-Ab (А), было предположено, что частично захват VA-Lip-HSP47 миРНК может быть осуществлен через рецептор RBP (Ретинол Связывающий Белок) фибробластов костного мозга.

Пример 7: Эффект HSP47 миРНК на секрецию коллагена первично культивированными фибробластами костного мозга, полученными из ТРО мышей.

5×10⁵ первично культивированных фибробластов костного мозга суспендировали в MEM с добавлением 15% FCS, и высевали на 6-луночные культуральные плашки. Через 24 часа ввели 50нМ либо Lip-миРНК случайной (миРНК слч), Lip-HSP47 миРНК-D (миРНК D), VA-Lip-миРНК случайной (VA-миРНК слч) или VA-Lip-HSP47 миРНК-D (VA-миРНК D). Через 4 часа культуральную среду заменили на MEM с добавлением 15% FCS, перед культивирование еще в течение 48 часов. Затем культуральную среду удалили и заменили на OPTI-MEM без сыворотки, перед культивирование еще в течение 4 часов. После этого, во-первых, измерили содержание коллагена в супернатанте культуры с помощью комплекта Sircol™ Collagen Assay (Biocolor). А именно супернатант культуры смешали с раствором красителя на 30 минут, затем раствор центрифугировали при 10,000 × g в течение 10 минут. После удаления несвязанного раствора красителя добавили 1 мл щелочного реагента к связанному красителю и перемешивали на вортексе в течение 10 минут, количественное определение сделали на основе коэффициента поглощения, измеренного с помощью абсорбционного спектрометра (540 нм). Во-вторых, количество коллагена, отложенного на фибробластах, прикрепленных к культуральной плашке, было определено количественно путем добавления красителя Сириуса красного и измерения коэффициента поглощения с помощью абсорбционного спектрометра (540 нм).

Результат показан на Фиг.10. Обратите внимание, что "Супернатант Культуры" на чертеже показывает содержание коллагена в супернатанте культуры фибробластов, в то время как "Чашка (супернатант культуры удален)" показывает количество коллагена, отложенного на фибробластах после удаления культуры супернатанта, и "Всего" показывает сумму "Супернатант Культуры" и "Чашка (супернатант культуры удален)" соответственно. Данные представлены как среднее для 3 культур ± SD (*Р<0.05).

В результате стало ясно, что количество секретированного в супернатант культуры коллагена первично культивированными фибробластами, трансфицированными VA-Lip-HSP47 миРНК-D, было значительно меньше, по сравнению с другими клетками; что в клетках, трансфицированных VA-Lip-HSP47 миРНК-D, количество отложения коллагена на культуральной плашке было меньше, но не значительно, по сравнению с другими клетками; и что в трансфицированных VA-Lip-HSP47 миРНК-D фибробластах, сумма количества коллагена, секретируемого в супернатант культуры фибробластами, и количества отложенного на фибробластах коллагена, после удаления культурального супернатанта, была существенно меньше по сравнению с другими клетками.

Пример 8: Эффект миРНК HSP47 на фибриллизацию костного мозга ТРО мышей in vivo.

Мы изучили эффект VA-Lip-HSP47 миРНК-D in vivo на улучшение фибриллизации костного мозга мышей в возрасте 7 месяцев. Внутривенно, через ретроорбитальное сплетение, вводили 12,5 мг миРНК-D HSP47 на мышь с помощью туберкулинового шприца, через день, всего 4 дозы инъекций. А именно к 12,5 мг/мышь миРНК (8 мкл) и 12,5 нМ Lipotrust (12,5 мкл) либо с либо без 25 нМ витамина А (2,5 мкл) далее добавили РНКаза чистый PBS до общего объема 100 мкл, которые вводили мыши как одну дозу. Мыши были умерщвлены через 8 дней после начала введения миРНК-D HSP47, и был собран костный мозг для приготовления образцов ткани, каждый из которых был окрашен гематоксилин-эозин (ГЭ) окрашиванием, окрашиванием по Гиттеру или по Азану, и изображения костного мозга рассматривали под оптическим микроскопом. Результаты показаны на Фиг.11-14.

Из окрашенных по Гиттеру образцов после лечения (Фиг.11) стало ясно, что гиперплазия ретикулярного волокна в косном мозге была существенно улучшена в двух мышах, которым вводили VA-Lip-миРНК HSP47 (VA-Lip-миРНК HSP47 (1) и (2)), по сравнению с мышами без лечения (Нет лечения), мыши которым вводили Lip-миРНК HSP47 (Lip-миРНК HSP47) и мыши которым вводили случайную VA-Lip-миРНК (VA-Lip-миРНК слч). Кроме того, уровень улучшения гиперплазии ретикулярного волокна с помощью миРНК HSP47 был измерен и подсчитан с помощью программного обеспечения KS-400 (Carl Zeiss). А именно было выбрано 10 оптических полей из образцов после лечения, окрашенных по Гиттеру, и было измерено соотношение точек ретикулярного волокна против всех точек в каждом поле (процент области ретикулинового фиброза) как индекс гиперплазии ретикулярного волокна. Было подтверждено, что гиперплазия ретикулярного волокна в костном мозге была существенно улучшена в мышах, которым вводили VA-Lip-миРНК HSP47-D (VA-миРНК D), по сравнению с мышами без лечения (Нет лечения), мышами, которым вводили Lip-миРНК HSP47 (миРНК D), и мышами, которым вводили случайную VA-Lip-миРНК (VA-миРНК слч) (см. Фиг.12).

Кроме того, на основании окрашенных по Азану образцов после лечения, как показано на Фиг.13, было получено, что гиперплазия коллагена в косном мозге была существенно улучшена в двух мышах, которым вводили VA-Lip-миРНК HSP47 (VA-Lip-миРНК HSP47 (1) и (2)), по сравнении с мышами без лечения (Нет лечения), мышами, которым вводили Lip-миРНК HSP47 (Lip-миРНК HSP47), и мышами, которым вводили случайную VA-Lip-миРНК (VA-Lip-миРНК слч).

Более того, на основании окрашенных ГЭ образцов после лечения, как показано на Фиг.14, было получено, что трабекулярное утолщение было существенно улучшено в двух мышах, которым вводили VA-Lip-миРНК HSP47 (VA-Lip-миРНК HSP47 (1) и (2)), по сравнению с мышами без лечения (Нет лечения), мышами, которым вводили Lip-миРНК HSP47 (Lip-миРНК HSP47), и мышами, которым вводили случайную VA-Lip-миРНК (VA-Lip-миРНК слч).

На основании этих результатов было высказано предположение, что может быть полезно лечение миелофиброза с помощью миРНК, нацеленных на HSP47. Также в связи с тем, что миРНК в основном действуют в цитоплазме, вышеприведенные результаты предполагают, что ретиноид действует как направляющий агент к продуцирующей внеклеточный матрикс клетке костного мозга и эффективно доставляет лекарственное средство к этой клетке, тем самым существенно улучшая патологию миелофиброза.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой доставляющий вещество носитель для доставки вещества к клетке костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, где веществом является лекарственное средство, которое подавляет начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза. Изобретение обеспечивает эффективное подавление начала, прогрессирования и/или рецидива миелофиброза. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 8 пр.

1. Доставляющий вещество носитель для доставки вещества к клетке костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, где веществом является лекарственное средство, которое подавляет начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза.

2. Носитель по п. 1, где ретиноид содержит ретинол.

3. Носитель по п. 1 или 2, где содержание ретиноида составляет 0,2-20 мас.% от общей массы носителя.

4. Носитель по п. 1 или 2, где носитель имеет форму липосомы, и молярное отношение ретиноида к липидам, содержащимся в липосоме, составляет 8:1-1:4.

5. Композиция для лечения миелофиброза, содержащая лекарственное средство, которое подавляет начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза, и носитель по любому из пп. 1-4.

6. Композиция по п. 5, где лекарственным средством, которое подавляет начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза, является лекарственное средство, которое ингибирует активность или рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс.

7. Композиция по п. 6, где лекарственное средство, которое ингибирует активность или рост клетки костного мозга, продуцирующей внеклеточный матрикс, выбирается из группы, состоящей из средства для ингибирования активности или продуцирования биоактивного вещества, выбранного из группы, состоящей из желатиназы А, желатиназы В и ангиотензиногена, ингибитора клеточной активности, ингибитора роста, апоптоз-индуцирующего средства, а также миРНК, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, которые нацелены на, по меньшей мере, одну из молекул, образующих внеклеточный матрикс, или молекул, вовлеченных в продукцию или секрецию указанных молекул, образующих внеклеточный матрикс, и вектора, который экспрессирует указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и ДНК/РНК химерный полинуклеотид.

8. Композиция по п. 7, где молекула, вовлеченная в продукцию или секрецию образующих внеклеточный матрикс молекул, представляет собой HSP47.

9. Композиция по любому из пп. 5-7, где лекарственное средство и носитель смешиваются на месте медикаментозного лечения или поблизости.

10. Набор для приготовления композиции по любому из пп. 5-9, содержащий один или более контейнеров, которые содержат либо отдельно, либо в комбинации лекарственное средство, которое подавляет начало, прогрессирование и/или рецидив миелофиброза, ретиноид и вещество, являющееся составляющей частью носителя, отличное от ретиноида.