ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ, ПРИМЕНЯЕМЫЙ ПРИ ПНЕВМОФИБРОЗЕ Российский патент 2015 года по МПК A61K9/127 A61K31/7088 A61K45/00 A61K47/14 A61K48/00 A61P11/00 

Область техники

Изобретение относится к носителю для доставки вещества, нацеленному на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в легких, и терапевтическому агенту, применяемому при легочном фиброзе, и способу лечения легочного фиброза с применением носителя.

Уровень техники

Легочный фиброз представляет собой заболевание, характеризующееся диффузной фиброплазией альвеолярных стенок, и его основные симптомы включают сухой кашель и одышку при физическом напряжении. В узком смысле оно относится к конечной стадии заболевания интерстициальная пневмония; в то время как в широком смысле оно означает, что легочный фиброз сопутствует в узком смысле интерстициальной пневмонии. Любая интерстициальная пневмония может вызвать легочный фиброз. Интерстициальная пневмония - общий термин для болезней, которые вызывают воспаление интерстиция легочной ткани (включая альвеолярную перегородку в узком смысле и внутридольковый интерстиций и окружающее пространство плевральной мембраны в широком смысле); он включает заболевания, вызываемые специфической причиной, такой как инфекция, коллагеновая болезнь, облучение, лекарственное средство и пыль, и заболевания, возникающие без выявленной причины, т.е. идиопатическая интерстициальная пневмония. Идиопатическая интерстициальная пневмония подразделяется на следующие виды, основанные на результатах видеоассистированной торакоскопической хирургии (ВТХ) и компьютерной томографии высокого разрешения (КТВР): идиопатический легочный фиброз (ИЛФ), неспецифическая интерстициальная пневмония (НИП), острая интерстициальная пневмония (ОИП), криптогенная организующаяся пневмония (КОП), респираторная ассоциированная с бронхиолитом интерстициальная болезнь легких (РБ-ИБЛ), десквамативная интерстициальная пневмония (ДИП), лимфоидная интерстициальная пневмония (ЛИП) и др. Многие из интерстициальных пневмоний со специфическими причинами лечатся устранением этих причин и приемом противовоспалительных агентов, таких как стероидные лекарственные средства. Однако для идиопатической интерстициальной пневмонии до сих пор не существует никакого радикального способа лечения и проводится только такое лечение, как прием стероидных лекарственных средств, азатиоприна и циклофосфамида, во время обострения симптомов, кислородная терапия при развитии гипоксемии; соответственно, есть много случаев со смертельным исходом, когда идиопатическая интерстициальная пневмония переходит в легочный фиброз. Поэтому средний срок выживаемости после постановки диагноза идиопатическая интерстициальная пневмония составляет 2,5-5 лет, и эта болезнь называется одной из специфических болезней для Японии.

В связи с этим, много научно-исследовательских работ было сделано в области разработки терапевтических агентов, применяемых при легочном фиброзе. В результате появились сообщения о том, что фармацевтические агенты, такие как колхицин, D-пеницилламин, пирфенидон (5-метил-1-фенил-2-[1Н]-пиридон), интерферон-β1а, релаксин, ловастатин, берактант, N-ацетилцистеин, фактор роста кератиноцитов, каптоприл (Непатентная Литература 1), фактор роста гепатоцитов (Патентная Литература 1), ингибитор Rho-киназы (Патентная Литература 2), тромбомодулино-подобный белок (Патентная Литература 3), билирубин (Патентная Литература 4), PPARγ (рецептор γ, активирующий пролиферацию пероксисом) активатор (Патентная Литература 5), иматиниб (Патентная Литература 6), интерферон-γ (Патентная Литература 7), проявляют некоторую эффективность на животных моделях легочного фиброза или в клинических исследованиях. Однако ни один из этих агентов не удовлетворяет требованиям и предполагалась дальнейшая разработка терапевтических агентов, применяемых при легочном фиброзе.

Список цитируемой литературы

Патентная Литература 1: JP A No. 8-268906

Патентная Литература 2: WO 00/57913

Патентная Литература 3: JP A No. 2002-371006

Патентная Литература 4: JP A No. 2003-119138

Патентная Литература 5: JP A No. 2005-513031

Патентная Литература 6: JP A No. 2005-531628

Патентная Литература 7: JP A No. 2006-502153

Патентная Литература 8: WO 2006/068232

Непатентная Литература 1: Ann Intern Med. 2001; 134(2): 136-51

Сущность изобретения

Проблемы, которые будут решены с помощью изобретения

Задачей данного изобретения является обеспечение носителя, который может доставить вещество, такое как лекарственное средство, специфическим образом к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких, а также обеспечение терапевтического агента, применяемого при легочном фиброзе, и способа лечения легочного фиброза с применением указанного носителя.

Средства для решения проблем

Авторы данного изобретения исследовали новые терапевтические агенты, применяемые при легочном фиброзе, и обнаружили, что введение композиции, в которой носитель, содержащий ретиноид, несет ингибитор продуцирования внеклеточного матрикса, может эффективно лечить легочный фиброз; тогда авторы завершили работу над данным изобретением.

Несмотря на то что было известно, что носитель, содержащий витамин А, может доставлять лекарственное средство к звездчатым клеткам, которые хранят витамин А (относится к Патентной литературе 8), взаимосвязь с легочным фиброзом до сих пор была абсолютно неизвестна.

Конкретно, данное изобретение относится к следующему:

(1) Носитель для доставки вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента.

(2) Носитель согласно указанному выше пункту (1), где производное ретиноида содержит ретинол.

(3) Носитель согласно указанным выше пунктам (1) или (2), где содержание ретиноида составляет 0,2-20 мас.% от полной массы носителя.

(4) Носитель согласно любому из указанных выше пунктов (1)-(3), где носитель имеет форму липосомы и молярное отношение ретиноида к липиду, содержащемуся в липосоме, составляет 8:1-1:4.

(5) Композиция для лечения легочного фиброза, содержащая носитель согласно любому из указанных выше пунктов (1)-(4), и лекарственное средство, которое контролирует активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких.

(6) Композиция согласно указанному выше пункту (5), где лекарственное средство, которое контролирует активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, выбирается из группы, состоящей из агента для ингибирования активности или продуцирования биоактивного вещества, выбранного из группы, состоящей из желатиназы А, желатиназы В и ангиотензиногена, ингибитора клеточной активности, ингибитора роста, индуцирующего апоптоз агента, так же как миРНК (малая интерферирующая РНК), рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты, ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на, по меньшей мере, одну из молекул, составляющих внеклеточный матрикс, или молекул, вовлеченных в продуцирование или секрецию указанных молекул, составляющих внеклеточный матрикс, и вектора, который экспрессирует указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и ДНК/РНК химерный полинуклеотид.

(7) Композиция согласно указанному выше пункту (6), где молекулой, вовлеченной в продуцирование или секрецию составляющих внеклеточный матрикс молекул, является HSP (белок теплового шока) 47.

(8) Композиция согласно любому из указанных выше пунктов (5)-(7), где лекарство и носитель смешиваются на месте терапевтического лечения или в непосредственной близости от него.

(9) Набор для приготовления композиции согласно любому из указанных выше пунктов (5)-(8), где набор содержит один или более контейнеров, содержащих по отдельности или в комбинации лекарственное средство для ингибирования активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, ретиноид и, при необходимости, образующее носитель вещество, отличное от ретиноида.

Эффекты настоящего изобретения

Пока точный механизм действия композиции для лечения легочного фиброза по настоящему изобретению до конца не ясен, предполагают, что он выглядит следующим образом: в композиции ретиноид действует в качестве направляющего агента к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких, таким как фибробласты и миофибробласты, и ретиноид доставляет активный ингредиент, такой как фармацевтические агенты, которые контролируют активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, к таким клеткам, тем самым проявляя эффект против легочного фиброза.

Соответственно, поскольку активные ингредиенты могут быть эффективно доставлены к местам действия и далее к клеткам-мишеням с использованием носителя по настоящему изобретению, теперь стало возможным лечение, предотвращение развития или предотвращение легочного фиброза, особенно идиопатической интерстициальной пневмонии, лечение которой было затруднительным до сих пор; таким образом, носитель по изобретению является значительным вкладом в медицину и ветеринарию.

Более того, носитель по настоящему изобретению может быть объединен с любыми фармацевтическими лекарственными средствами (например, существующими терапевтическими агентами для легочного фиброза), увеличивая эффективность их действия; следовательно, его преимущества заключаются еще и в том, что у него широкий диапазон применения с точки зрения состава, что ускоряет производство эффективных терапевтических агентов.

Краткое описание чертежей:

Фиг.1 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую индукцию легочного фиброза в крысах и график введения лекарства.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий полное количество клеток в жидкости, взятой с помощью бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), на 21-й день после введения блеомицина. «Контролем» являются нормальные крысы, которым не вводился блеомицин.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий количество гидроксипролина (ГП) в легких на 21-й день после введения блеомицина. «Контролем» являются нормальные крысы, которым не вводился блеомицин.

На Фиг.4 показаны фотографии легочных тканей, окрашенных гематоксилин-эозином, на 21-й день после введения блеомицина.

На Фиг.5 показаны фотографии легочных тканей, окрашенных азаном, на 21-й день после введения блеомицина.

На Фиг.6 показаны фотографии, показывающие распределение αSMA-положительных клеток в легочных тканях на 21-й день после введения блеомицина.

Описание вариантов осуществления изобретения

В настоящем изобретении для продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких не существует особых ограничений, поскольку они являются клетками, присутствующими в легких и обладающими способностью продуцирования внеклеточного матрикса, и включают, например, фибробласты и миофибробласты, присутствующие в легких. Фибробласты, присутствующие в легких, включают, например, васкулярные адвентициальные фибробласты и бронхиальные адвентициальные фибробласты и т.д. Миофибробласты, присутствующие в легких, могут включать не только те, которые образованы из фибробластов, присутствующих в клетках, но также те, которые образованы из фибробластов в циркулирующей крови, и те, которые трансформированы из эндотелиальных клеток путем эндотелиально-мезенхимальной трансдифференциации. Миофибробласты характеризуются экспрессией α-гладкомышечного актина (α-ГМА). Миофибробластами в настоящем изобретении являются те, которые идентифицируются, например, иммунным окрашиванием с использованием анти-α-ГМА антител, помеченных для дальнейшего обнаружения. Вдобавок, пока фибробласты экспрессируют виментин, что характерно для мезенхимальных клеток, они не экспрессируют α-ГМА; следовательно, фибробласты могут идентифицироваться двойным окрашиванием с виментином и α-ГМА.

Для ретиноида по настоящему изобретению не существует особых ограничений, поскольку он ускоряет доставку вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких, и примеры ретиноидов включают их производные, такие как ретинол (витамин А), этретинат, третиноин, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен и ретинол пальмитат, так же как аналоги витамина А, такие как фенретинид (4-ГФР, 4-гидроксифенилретинамид) и бексаротен.

Ретиноид по настоящему изобретению - это тот, который ускоряет специфическую доставку вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких. Механизм ускорения доставки вещества ретиноидом пока недостаточно ясен; однако предполагают, что он выглядит следующим образом: например, ретиноид, который образует специфическую связь с ретинол-связывающим белком (РСБ), вовлекается в продуцирующую внеклеточный матрикс клетку в легких через определенный рецептор, присутствующий на поверхности этой клетки.

Ретиноид является представителем класса соединений, обладающих скелетом, в котором четыре изопреноидных единицы связаны по типу «голова-к-хвосту» (см., например, G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992)). Витамин А является родовым дескриптором для ретиноидов, который качественно показывает биологическую активность ретинола. Для ретиноида, который может быть использован в настоящем изобретении, не существует особых ограничений, и примеры ретиноидов включают их производные, такие как ретинол, ретиналь, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты, сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты, этретинат, третиноин, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен и ретинол пальмитат и аналоги витамина А, такие как фенретиниды (4-ГФР) и бексаротен.

Среди них ретинол, ретиналь, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты (такой как ретинил ацетат, ретинил пальмитат, ретинил стеарат и ретинил лаурат) и сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты (такой как этил ретиноат) являются предпочтительными с точки зрения эффективности специфической доставки вещества к внутриклеточным матрикс-продуцирующим клеткам в легких.

Все изомеры ретиноидов, такие как цис-транс, включены в объем изобретения. Ретиноид может быть замещен одним или более заместителем. Ретиноид по настоящему изобретению включает ретиноид в изолированном состоянии, так же как в состоянии раствора или смеси со средой, которая может растворять или хранить ретиноид.

Носитель по настоящему изобретению может быть образован из ретиноида самого по себе или путем создания ретиноидной связи с или включения в составной компонент носителя, отличного от ретиноида. Следовательно, носитель по настоящему изобретению может содержать составной компонент носителя, отличный от ретиноида. Для такого компонента не существует особых ограничений, может быть использован любой компонент, известный в медицинской и фармацевтической областях, но предпочтительными являются те, которые могут включать ретиноид или связываться с ним.

Примеры таких компонентов включают липид, например фосфолипид, такой как глицерофосфолипид, сфинголипид, такой как сфингомиелин, стерол, такой как холестерин, растительное масло, такое как соевое или маковое масло, минеральное масло и лецитин, такой как лецитин яичного желтка, но примеры этим не ограничиваются. Среди них предпочтительны те, которые могут образовывать липосомы, например натуральный фосфолипид, такой как лецитин, полусинтетический фосфолипид, такой как димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) или дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) и диолеилфосфатидилхолин (DOPE), дилауроилфосфатидилхолин (DLPC) и холестерин.

Особенно предпочтительным является компонент, который может избежать захвата ретикулоэндотелиальной системой, и примеры таких компонентов включают катионные липиды, такие как N-(α-триметиламмоний-ацетил)-дидодецил-D-глютамат хлорид (TMAG), N,N',N",N"'-тетраметил-N,N',N",N"'-тетрапальмитилспермин (TMTPS), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминий трифторацетат (DOSPA), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), диоктадецилдиметиламмоний хлорид (DODAC), дидодециламмоний бромид (DDAB), 1,2-диолеилокси-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol), 1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE) и O,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмоний-ацетил)диэтаноламин хлорид (DC-6-14).

Связывание ретиноида с носителем по настоящему изобретению или включение в него также возможно посредством связывания или включения ретиноида с или в составной компонент носителя, отличный от ретиноида, с помощью химического и/или физического способа. С другой стороны, связывание ретиноида с носителем или включение в носитель по настоящему изобретению также можно провести посредством смешивания ретиноида и составного компонента носителя, отличного от ретиноида, при получении носителя. Количество ретиноида, связанного с или включенного в носитель по настоящему изобретению, в виде массовой доли в составных компонентах носителя, может составлять от 0,01 до 100%, предпочтительно, от 0,2% до 20% и, более предпочтительно, от 1% до 5%. Связывание ретиноида с или включение в носитель можно осуществить до того как лекарственное средство и т.п. объединяется с носителем, можно осуществить при помощи одновременного смешивания носителя, производного ретиноида и лекарственного средства и т.д. или при помощи смешивания производного ретиноида с носителем, на котором уже содержится лекарственное средство и т.п. Следовательно, настоящее изобретение также относится к процессу создания состава, специфического для продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, при этом процесс включает этап связывания ретиноида с любым существующим носителем, связывающим лекарственное средство, или носителем, инкапсулирующим лекарственное средство, например липосомный состав, такой как DaunoXome®, Doxil, Caelyx® или Myocet®.

Форма носителя по настоящему изобретению может быть любой, лишь бы желаемое вещество или объект могли транспортироваться к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам-мишеням в легких, и неограничивающие примеры носителей включают макромолекулярные мицеллы, липосомы, эмульсии, микросферы и наносферы. В настоящем изобретении, с точки зрения высокой эффективности доставки, широкого ассортимента веществ, которые будут доставляться, и простоты создания состава и т.д., липосомная форма является предпочтительной среди форм, и катионная липосома, которая включает катионный липид, является особенно предпочтительной. В случае когда носитель представляет собой липосомную форму, молярное отношение ретиноида к составным компонентам липосомы, отличным от ретиноида, составляет, учитывая эффективность связывания ретиноида с носителем или включения ретиноида в носитель, предпочтительно от 8:1 до 1:4, более предпочтительно от 4:1 до 1:2, еще более предпочтительно от 3:1 до 1:1 и особенно предпочтительно 2:1.

Носитель по настоящему изобретению может содержать вещество, которое будет транспортироваться внутри его внутреннего пространства, может быть прикреплен к внешней части вещества, которое будет транспортироваться или может быть смешан с веществом, которое будет транспортироваться, лишь бы ретиноид, содержащийся в нем, присутствовал в такой форме, чтобы мог функционировать в качестве направляющего агента. Фраза «функционировать в качестве направляющего агента», упоминаемая здесь, означает, что носитель, содержащий ретиноид, достигает и/или поглощается клеткой-мишенью, т.е. продуцирующими внеклеточный матрикс клетками в легких, более быстро и/или в большем количестве, чем с носителем, не содержащим ретиноид, и это можно легко подтвердить, например, путем добавления меченого или содержащего метку носителя к культуре клеток-мишеней и анализируя сайты, где после заданного периода времени присутствует метка. В конструктивном отношении данное требование может быть удовлетворено, например, если ретиноид, по меньшей мере, частично экспонирован на внешней части состава, содержащего носитель, не позднее того момента, когда он достигает клетки-мишени. Экспонирован или нет ретиноид на внешней части состава, можно оценить посредством контактирования состава с веществом, которое специфически связывает ретиноид, таким как ретинол-связывающий белок (РСБ), и оценки связывания с составом.

Для вещества или объекта, которые доставляются данным носителем, не существует особых ограничений, и они предпочтительно имеют такой размер, что могут физически передвигаться внутри тела живого существа с места введения до места патологического изменения, где присутствует клетка-мишень. Следовательно, носитель по настоящему изобретению может транспортировать не только вещество, такое как атом, молекула, соединение, белок или нуклеиновая кислота, но также объект, такой как вектор, вирусная частица, клетка, высвобождающая лекарственное средство система, сформированная из одного или нескольких элементов, или микромашина. Упомянутые выше вещество или объект предпочтительно имеют свойство некоторого влияния на клетку-мишень, и примеры таких веществ или объектов включают такие, которые метят клетку-мишень, и такие, которые контролируют (например, увеличивают или подавляют) активность или рост клетки-мишени.

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, вещество, которое доставляется носителем, является «лекарством, контролирующим активность или рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки в легких». Активность продуцирующей внеклеточный матрикс клетки в легких, на которую здесь сделана ссылка, подразумевает различные активности, такие как секреция, поглощение, миграция и т.д., проявляемые продуцирующей внеклеточный матрикс клеткой в легких, и в настоящем изобретении активность обычно подразумевает, в частности, активности, участвующие в начале, прогрессировании и/или рецидиве легочного фиброза. Примеры таких активностей включают, но не ограничиваются, продуцирование/секрецию биоактивного вещества, такого как желатиназа А и желатиназа В (ММР (матриксная металлопротеиназа) 2 и ММР 9, соответственно) и ангиотензиноген и т.д., и компонента внеклеточного матрикса, такого как коллаген, протеогликан, тенасцин, фибронектин, тромбоспондин, остеопонтин, остеонектин и эластин.

Следовательно, лекарственное средство, контролирующее активность или рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки в легких, может быть любым лекарственным средством, которое прямо или косвенно подавляет физические, химические и/или физиологические и др. действия указанной клетки, связанные с началом, прогрессированием и/или рецидивом легочного фиброза, при этом эти лекарственные средства включают, но без ограничения: лекарственные средства, ингибирующие активность или продуцирование вышеупомянутых биоактивных веществ, ингибиторы ММП (матриксной металлопротеиназы), такие как батимастат, и антитела и фрагменты антител, которые нейтрализуют вышеупомянутые биоактивные вещества, и вещества, которые подавляют экспрессию вышеупомянутых биоактивных веществ, такие как миРНК, рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК (пептидная нуклеиновая кислота) или их композит), и вещества, которые имеют доминантный негативный эффект, такие как доминантный негативный мутант, или вектор, экспрессирующий эти вещества, лекарственные средства, подавляющие продуцирование и секрецию вышеупомянутого компонента внеклеточного матрикса, и т.д., например вещества, которые подавляют экспрессию компонента внеклеточного матрикса, такие как миРНК, рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК или их композит), и вещества, которые имеют доминантный негативный эффект, такие как доминантный негативный мутант, или вектор, экспрессирующий эти вещества, ингибиторы клеточной активности, такие как блокатор натриевых каналов, ингибиторы клеточного роста, например алкилирующие агенты (такие как фосфамид, нимустин, циклофосфамид, дакарбазин, мелфалан и ранимустин), противоопухолевые антибиотики (такие как идарубицин, эпирубицин, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митоксантрон и митомицин С), антиметаболиты (такие как гемцитабин, эноцитабин, цитарабин, тегафур/урацил, тегафур/гимерацил/отерацил натрия смесь, доксифторидин, гидроксикарбамид, фторурацил, метотрексат и меркаптопурин), алкалоиды, такие как этопозид, иринотекан, винорелбин, доцетаксел гидрат, паклитаксел, винкристин, виндезин и винбластин, и комплексы платины, такие как карбоплатин, цисплатин, недаплатин, и индукторы апоптоза, такие как соединение 861, глиотоксин, ловастатин и берактант. Более того, «лекарственное средство, контролирующее активность или рост продуцирующей внеклеточный матрикс клетки в легких» в настоящем изобретении может быть любым лекарственным средством, которое прямо или косвенно способствует физическим, химическим и/или физиологическим и др. действиям клетки, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, прямо или косвенно связанным с подавлением начала, прогрессирования и/или рецидива легочного фиброза.

Вещества, доставляемые носителем изобретения, включают без ограничений лекарственные средства, отличные от упомянутых выше, которые подавляют начало, прогрессирование и/или рецидив легочного фиброза, и примеры таких веществ включают, но не ограничиваются, колхицин, D-пеницилламин, пирфенидон (5-метил-1-фенил-2-[1Н]-пиридон), интерферон-β1а, релаксин, N-ацетилцистеин, фактор роста кератиноцитов, каптоприл, фактор роста гепатоцитов, ингибитор Rho-киназы, тромбомодулиноподобный белок, билирубин, активатор PPARγ, иматиниб, γ-интерферон и ингибитор рецепторной TGFβ-киназы.

Вещество или материя, доставляемые носителем по настоящему изобретению, может быть или не быть меченым. Мечение позволяет проводить мониторинг удачной или неудачной доставки, большая или меньшая часть вводимого вещества достигла клеткок-мишеней и т.д., и является особенно полезным на стадии тестирования/исследований. Метка может быть выбрана из любой известной специалисту в данной области, такой как, например, любой радиоизотоп, магнитный материал, вещество, которое связывается с веществом-меткой (например, антитело), флуоресцентное вещество, флюорофор, хемилюминесцентное вещество и фермент и т.д.

В настоящем изобретении выражение «для клетки, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких» или «для доставки к клетке, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких» означает, что указанное подходит для применения в качестве мишени к клеткам, продуцирующим внеклеточный матрикс, и также означает, что указанное способно доставить вещество к такой клетке более быстро, эффективно и/или в большем количестве, чем к другим клеткам, например нормальным клеткам. Например, носитель по настоящему изобретению может доставлять вещество к клетке, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, со скоростью и/или эффективностью, в 1,1 раза или более, 1,2 раза или более, 1,3 раза или более, 1,5 раз или более, 2 раза или более, или даже 3 раза или более большей, чем к другим клеткам.

Настоящее изобретение также относится к композиции для контроля активности или роста клетки, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, или для лечения легочного фиброза, причем композиция содержит носитель и лекарственное средство, контролирующее активность или рост клетки, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, и также относится к применению носителя для получения таких композиций.

В настоящем изобретении легочный фиброз включает не только легочный фиброз в узком смысле, но также легочный фиброз в широком смысле, который включает сопутствующую интерстициальную пневмонию. Легочный фиброз по настоящему изобретению может быть вызван любой интерстициальной пневмонией, например инфекционной интерстициальной пневмонией, ассоциированной с вирусной пневмонией, грибковой пневмонией, микоплазменной пневмонией и т.д., интерстициальной пневмонией, ассоциированной с коллагеновой болезнью, такой как ревматоидный артрит, системная склеродермия, дерматомиозит, полимиозит, смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ) и т.д., интерстициальной пневмонией, ассоциированной с радиационным облучением, лекарственно-индуцированной интерстициальной пневмонией, вызванной противоопухолевыми агентами, такими как блеомицин, растительными лекарственными препаратами, такими как Sho-sai-ko-to, интерфероном, антибиотиками, паракватом и т.д., и идиопатической интерстициальной пневмонией, такой как идиопатический легочный фиброз, неспецифической интерстициальной пневмонией, острой интерстициальной пневмонией, криптогенной организующейся пневмонией, респираторной ассоциированной с бронхиолитом интерстициальной болезнью легких, десквамативной интерстициальной пневмонией, лимфоидной интерстициальной пневмонией и т.д., и соответственно, легочный фиброз также может быть вызван хроническими состояниями таких интерстициальных пневмоний. Легочный фиброз по настоящему изобретению предпочтительно охватывает хронические состояния лекарственно-индуцированной интерстициальной пневмонии и идиопатической интерстициальной пневмонии.

В композиции по настоящему изобретению, пока ретиноид, содержащийся в носителе, присутствует в форме, которая функционирует в качестве направляющего агента, носитель может содержать вещество, которое будет доставляться, внутри его внутреннего пространства, может быть прикреплен к внешней поверхности вещества, которое будет доставляться, или может быть смешан с веществом, которое будет доставляться. Следовательно, в зависимости от пути введения и способа, которым высвобождается лекарственное средство, и т.д., композиция может быть покрыта подходящим материалом, таким как, например, кишечнорастворимая оболочка или материал, который со временем распадается, или может быть включена в состав подходящей системы высвобождения лекарственного средства.

Композиция по настоящему изобретению может быть введена различными путями, включая как пероральные, так и парентеральные пути, и примеры этих путей включают, но не ограничиваются ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, через дыхательные пути, внутритрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, ректальный, внутриартериальный, через воротную вену, внутрижелудочковый, интрамедуллярный, через лимфатические узлы, внутрилимфатический, внутримозговой, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, подкожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный путь, и композиция может быть заключена в лекарственную форму, подходящую для каждого пути введения. Подходящая лекарственная форма и способ составления композиции могут быть выбраны из любых известных лекарственных форм и способов (см., например, Hyojun Yakuzaigaku (Standard Pharmaceutics), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003).

Примеры лекарственных форм, подходящих для перорального введения, включают, но не ограничиваются ими, порошок, гранулу, таблетку, капсулу, жидкость, суспензию, эмульсию, гель и сироп, и примеры лекарственных дозированных форм, подходящих для парентерального введения, включают инъекции, такие как впрыскиваемый раствор, впрыскиваемая суспензия, впрыскиваемая эмульсия и инъекция, которую получают непосредственно перед применением. Составы для парентерального введения могут быть формами, такими как водный и неводный изотонический стерильный раствор или суспензия.

Носитель или композиция по настоящему изобретению могут быть представлены в любой форме, но с точки зрения устойчивости при хранении, предпочтительно, чтобы они были в форме, которую получают непосредственно перед применением, например в форме, которая позволит доктору и/или фармацевту, медсестре, другому медицинскому персоналу и др. приготовить их на месте лечения или в непосредственной близости от него. В этом случае, носитель или композиция по настоящему изобретению предоставлены в виде одного или более контейнеров, содержащих, по меньшей мере, один существенный составной компонент, и он готовится до использования, например в течение 24 часов до использования, предпочтительно в течение 3 часов до использования и более предпочтительно непосредственно перед использованием. При приготовлении могут быть использованы подходящие реагент, растворитель, средства приготовления и т.д., которые обычно доступны на месте приготовления.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к набору для приготовления носителя или композиции, причем набор включает один или более контейнеров, содержащих раздельно или в комбинации ретиноид и/или вещество, которое будет доставляться, и/или вещество, составляющее носитель, отличное от ретиноида, и также к составному элементу, необходимому для представления носителя или композиции в форме такого набора. Дополнительно к этому, набор по настоящему изобретению может содержать инструкции, цифровые носители информации, такие как CD или DVD, относящиеся к процессу приготовления носителя и композиции по настоящему изобретению или способу введения и т.д. Более того, набор по настоящему изобретению может включать все составные элементы для создания носителя композиции по настоящему изобретению, но не обязательно всегда включает все составные элементы. Следовательно, набор по настоящему изобретению не обязательно включает реагент или растворитель, которые обычно доступны на месте терапевтического применения или экспериментальной установки, такие как, например, стерильная вода, физиологической солевой или глюкозный раствор.

Далее, настоящее изобретение относится к способу контролирования активности или роста клетки, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, или способу лечения легочного фиброза, причем способ включает введение эффективного количества композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Упомянутое эффективное количество в способе лечения легочного фиброза представляет собой, например, количество, которое подавляет начало или рецидив легочного фиброза, частично снимает симптомы, отсрочивает или останавливает его прогрессирование, и предпочтительно является количеством, которое препятствует началу или рецидиву легочного фиброза или лечит его. Также предпочтительно, что это количество не вызывает отрицательного действия, превышающего пользу от введения. Подходящее количество можно определить с помощью теста in vitro, используя культуральные клетки, или с помощью испытания на модельном животном, таком как мышь, крыса, собака или свинья, и такие способы испытаний хорошо известны специалисту в данной области. Более того, доза ретиноида, содержащегося в носителе, и доза лекарственного средства, используемого в способе по настоящему изобретению, известны специалисту в данной области или из них можно выбрать подходящие при помощи вышеупомянутого теста и т.д.

В способе по настоящему изобретению специфическую дозу введенной композиции можно определить с учетом разных условий у каждого субъекта, нуждающегося в лечении, таких как степень тяжести симптомов, общее состояние здоровья субъекта, возраст, вес, пол субъекта, диета, время и частота введения, используемое в комбинации лекарственное средство, ответная реакция на лечение, соблюдение режима лечения и т.д.

В качестве пути введения могут использоваться различные пути, включая как пероральные, так и парентеральные пути, и примеры этих путей включают, но не ограничиваются ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, через дыхательные пути, внутритрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, ректальный, внутриартериальный, через воротную вену, внутрижелудочковый, интрамедуллярный, через лимфатические узлы, внутрилимфатический, внутримозговой, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, подкожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный путь.

Частота введения зависит от свойств используемой композиции и вышеупомянутых условий субъекта, и введение может быть многократным в день (то есть 2, 3, 4, 5 или более раз в день), однократным в день, каждые несколько дней (то есть каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней и т.д.), несколько раз в неделю (например, 2, 3, 4 и т.д. раз в неделю), через неделю или каждые несколько недель (то есть каждые 2, 3, 4 недели и т.д.).

В способе по настоящему изобретению термин «субъект» означает любой живой организм, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее и еще более предпочтительно человеческий индивид. В настоящем изобретении субъект может быть здоровым или страдающим каким-либо заболеванием, и когда предполагается лечение легочного фиброза, под субъектом обычно подразумевается субъект, страдающий интерстициальной пневмонией или легочным фиброзом, или тот, у кого есть риск заболеть ими. Например, когда предполагается профилактика легочного фиброза, типичные примеры включают, но без ограничения к этому, субъекта, страдающий интерстициальной пневмонией, в частности идиопатической интерстициальной пневмонией.

Более того, термин «лечение» включает все типы профилактического и/или терапевтического воздействия, приемлемого для медицинского использования, с целью лечения, временной ремиссии или профилактики заболевания и т.д. Например, термин «лечение» включает приемлемое для медицинского использования воздействие для разных целей, включая отсрочивание или остановку прогрессирования легочного фиброза, регрессию или исчезновение очагов поражения, профилактику начала и рецидива легочного фиброза.

Настоящее изобретение также относится к способу доставки лекарственного средства к клетке, продуцирующей внеклеточный матрикс в легких, с использованием вышеупомянутого носителя. Этот способ включает, но не ограничивается, например, стадию загрузки на носитель вещества, которое будет доставляться, и стадию введения или добавления носителя с переносимым веществом, которое будет доставляться, живому существу или среде, например культуральной среде, содержащей клетку, продуцирующую внеклеточный матрикс в легких. Эти стадии могут считаться подходящими в соответствии с любым известным способом или способом, описанным в настоящем описании, и т.д. Вышеупомянутый способ доставки можно объединить с другим способом доставки, например другим способом доставки, нацеленным на легкие. Более того, вышеупомянутый способ включает вариант, осуществляемый in vitro, и вариант, в котором клетка, продуцирующая внеклеточный матрикс в легких, внутри тела является мишенью.

Примеры

Настоящее изобретение подробно поясняется с помощью конкретных примеров, но эти примеры приведены в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Приготовление миРНК

Три типа миРНК, нацеленных на белок gp46 (GenBank Accession No. М69246), который является крысиным гомологом человеческого HSP47, и случайный контроль миРНК были приобретены в Hokkaido System Science Co., Ltd. Каждая миРНК состоит из 27 оснований с выступающим 3'-концом, и последовательности являются следующими.

Последовательность A: 5'-GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:1)

5'-GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU-3' (антисмысловая, SEQ ID NO:2)

Последовательность В: 5'-CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGCAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:3)

5'-GCUAGAUUGGAUAUAAAACUUGUGGAU-3' (антисмысловая, SEQ ID NO:4)

Последовательность С: 5'-CUAGAGCCAUUACAUUACAUUGACAAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:5)

5'-UGUCAAUGUAAUGUAAUGGCUCUAGAU-3' (антисмысловая, SEQ ID NO:6)

Случайная миРНК: 5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3' (смысловая, SEQ ID NO:7)

5'-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3' (антисмысловая, SEQ ID NO:8)

Более того, была также приготовлена миРНК, помеченная на 5'-конце флуоресцентным красителем 6'-карбоксифлуоресцеин (6'-FAM).

Пример 2. Приготовление ми-РНК-содержащей липосомы, связанной с ВА

В качестве липосомы была использована катионная липосома, содержащая DC-6-14, холестерин и DOPE (диолеилфосфатидилэтаноламин) в молярном соотношении 4:3:3 (Lipotrust, Hokkaido System Science Co., Ltd.). 10 нмоль липосомы и 20 нмоль витамина А (ВА: транс-ретинол по всем положениям, Sigma) смешивали в ДМСО, используя пробирку на 1,5 мл, затем растворяли в хлороформе, выпаривали однократно и затем суспендировали в ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор). Затем миРНК (10 мкг/мл), полученную в Примере 1, и липосомальную суспензию смешивали в соотношении 1:1 (мас./мас.). Свободный ВА и миРНК, содержащиеся в полученной липосомальной суспензии, были удалены с помощью системы микроразделения (Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES), при этом образовалась ми-РНК-содержащая липосома, связанная с ВА (ВА-лип-миРНК). Количество добавленного ВА и количество ВА, содержащегося в очищенной липосоме, измеряли в помощью ВЭЖХ и измеряли долю ВА, связанного с липосомой; в результате было обнаружено, что большинство ВА (95,6±0,42%) было связано с липосомой. Более того, эффективность поглощения миРНК в липосому измерялась с помощью анализа RiboGreen (Molecular Probes), и она достигала 94,4±3,0%. Здесь, в этом составе, ВА был, по меньшей мере, частично экспонирован на поверхности состава.

Пример 3. Активность против легочного фиброза in vivo ми-РНК-содержащей липосомы, связанной с ВА

(1) Индукция легочного фиброза и введение лекарственного средства

Крысам S-D мужского пола (6 крыс в группе, возраст 4 недели, Charles River Laboratories Japan, Inc.) были однократно введены в легкие, интратрахеально, с помощью катетеризации трахеи, под анестезией, 0,5 мг блеомицина (БЛМ), растворенного в 0,5 см³ физиологического раствора, для того чтобы получить модель блеомицинового легочного фиброза. При использовании этого способа, выраженный фиброз легких в основном возникает после приблизительно 3-х недель. ВА-лип-миРНК, приготовленная в Примере 2 (0,75 мг/кг - количество миРНК, или в объемных единицах - 1 мл/кг, т.е. 200 мкл на крысу весом 200 г), или ФСБР (1 мл/кг в объеме) вводились крысам через хвостовую вену, начиная со дня введения блеомицина, с частотой 3 раза в неделю. Крыс умерщвляли на 21 день после введения блеомицина и анализировали жидкость, взятую с помощью бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), далее определяли количество гидроксипролина в легких и проводили гистологическое исследование легочной ткани (См. Фиг.1). Для оценки статистически-значимых различий был использован критерий Стьюдента.

(2) Анализ БАЛ жидкости

Анализ БАЛ проводился следующим образом. Крысам внутрибрюшинно вводили летальную дозу пентобарбитала натрия, вскрывали их грудную клетку и освобождали трахею, в которую вставляли трубку. Затем 7 мл физиологического раствора впрыскивали в легкие через трубку в трахее и собирали лаважную жидкость. Этот процесс впрыскивания и сбора повторяли 5 раз, собранную лаважную жидкость объединяли и центрифугировали при 250×g в течение 10 мин. Полное количество клеток считали на цитометре, подсчет клеточных фракций осуществляли с использованием препарата-мазка, окрашенного по способу Мая-Гимзы на цитоцентрифуге. По меньшей мере, 200 клеток были подсчитаны и расклассифицированы на макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы и лимфоциты в соответствии с общими морфологическими критериями. Результаты подсчета полного числа клеток показаны на Фиг.2. На этой фигуре видно, что число клеток в БАЛ жидкости, полученной в случае введения группы ВА-лип-миРНК (БЛМ миРНК), значительно снижалось до уровня, схожего с уровнем нормальных контрольных крыс, которым вводился ФСБР вместо блеомицина, по сравнению с результатами для группы ФСБР (только БЛМ); при этом полагают, что воспаление снизилось.

(3) Определение количества гидроксипролина в легочной ткани

Легкие извлекали из крыс после проведения БАЛ, затем одно целое легкое гомогенизировали, используя политронный гомогенизатор, и определяли количество гидроксипролина в легком, используя способ Kivirikko et al. (Kivirikko KI, et al. Analytical Biochemistry 1967; 19: 249-255). Конкретнее, ткань легких гомогенизировали в 6Н соляной кислоте при 110°С, в течение 18 часов, и аликвоту объемом 25 мкл сушили при 60°С. Затем ее растворяли в 1,2 мл 50% изопропанола, инкубировали с ацитат-цитратом, рН 6,0, и с 200 мл 0,56% раствора хлорамина-Т, при комнатной температуре в течение 10 мин, затем последовала инкубация при 50°С в течение 90 мин после добавления 1 мл раствора Эрлиха; после чего измеряли поглощение при 560 нм. Результаты, показанные на Фиг.3, демонстрируют, что количество гидроксипролина в легких (мкг) в случае введения группы ВА-лип-миРНК (БЛМ + миРНК) значительно уменьшалось, по сравнению с тем же показателем для группы ФСБР (только БЛМ), при этом полагают, что фиброз легких был значительно подавлен.

(4) Гистологическое исследование

Часть удаленного легкого фиксировалась в формалине обычным способом и подвергалась окрашиванию гематоксилином и эозином (ГЭ), окрашиванию азаном (азокармин, анилиновый синий/оранжевый G раствор) или иммуноокрашиванию с антителами анти-αSMA. Что касается иммуноокрашивания, то после депарафинизации образцы взаимодействовали с мышиными антителами анти-αSMA (Nichirei Corporation, clone 1A4) в качестве первичных антител, затем с мечеными пероксидазой антимышиными иммуноглобулинами IgG в качестве вторичных антител, с последующим проявлением с помощью диаминобензидина (ДАБ). Как показывают результаты ГЭ окрашивания на Фиг.4, в случае введения группы ФСБР (21-й день введения БЛМ), наблюдались показатели, характерные для легочного фиброза, такие как исчезновение альвеол легких, наличие кровотечений и интерстициальная гиперплазия, в то время как в случае введения группу ВА-лип-миРНК (БЛМ + миРНК) фиброзные очаги значительно нормализовались. Аналогично, как показывают результаты окрашивания азаном на Фиг.5, в случае введения группы ФСБР (только БЛМ), наблюдалось выраженная фиброзная картина, характеризуемая увеличением интерстиция из-за большого количества окрашенных в голубой цвет коллагеновых фибрилл, в то время как в случае введения группы ВА-лип-миРНК (БЛМ + миРНК) фиброз был несомненно подавлен. Более того, как показывают результаты aSMA-окрашивания на Фиг.6, в то время как в интерстиции при введении группы ФСБР (только БЛМ) наблюдалось большое количество aSMA-положительных клеток, имеющих коричневый цвет, число aSMA-положительных клеток при введении группы ВА-лип-миРНК (БЛМ + миРНК) было значительно снижено.

Учитывая, что миРНК в основном действует в цитоплазме, описанные выше результаты свидетельствуют о том, что ретиноид функционировал в качестве направляющего агента к клеткам, продуцирующим внеклеточный матрикс в легких, для того чтобы лекарственное средство эффективно доставлялось к этим клеткам, приводя к значительному улучшению течения легочного фиброза.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ уменьшения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких или подавления увеличения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, содержащий введение субъекту композиции, содержащей (i) носитель, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, и (ii) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из миРНК, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на HSP47, и векторов, экспрессирующих указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и/или ДНК/РНК химерный полинуклеотид. Изобретение обеспечивает использование ретиноевой кислоты в качестве нацеливающего агента для доставки лекарственного средства к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в легких. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ уменьшения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких или подавления увеличения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, содержащий введение субъекту композиции, содержащей (i) носитель, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, и (ii) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из миРНК, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на HSP47, и векторов, экспрессирующих указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и/или ДНК/РНК химерный полинуклеотид.

2. Способ по п. 1, где ретиноид содержит ретинол.

3. Способ по п. 1, где содержание ретиноида составляет 0,2-20 мас. % от всего носителя.

4. Способ по п. 1, где носитель имеет форму липосомы, и молярное отношение ретиноида к липиду, содержащемуся в липосоме, составляет 8:1-1:4.

5. Способ по п. 1, где лекарственное средство и носитель смешиваются на месте терапевтического лечения или в непосредственной близости от него.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где субъект страдает от легочного фиброза.

7. Способ уменьшения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких или подавления увеличения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, содержащий: (а) обеспечение набора, который содержит один или более контейнеров, содержащих по отдельности или в комбинации лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из миРНК, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на HSP47, и векторов, экспрессирующих указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и/или ДНК/РНК химерный полинуклеотид, ретиноид и, при необходимости, образующее носитель вещество, отличное от ретиноида, (b) получение композиции, которая содержит (i) носитель, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, и (ii) указанное лекарственное средство, и (с) введение композиции субъекту.

8. Способ по п. 7, где субъект страдает от легочного фиброза.