ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, ТАКОГО КАК ЛЕЙШМАНИОЗ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКСТРАКТА РИБОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ (RPE) Российский патент 2015 года по МПК C07K14/44 G01N33/569 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способу диагностики паразитарного заболевания, такого как лейшманиоз, с использованием RPE.

Предшествующий уровень техники

Висцеральный лейшманиоз собак (CVL) представляет собой значимый острый зооноз в странах средиземноморского бассейна, на Ближнем Востоке и в Латинской Америке (20). Это тяжелое заболевание вызывается Leishmania infantum в средиземноморском регионе, на Ближнем Востоке и азиатских странах и L. chagasi в Латинской Америке (20, 21). Оба вида, вызывающих CVL на различных континентах, можно считать идентичными из-за их генетического родства (26).

При заражении у собак могут развиваться различные формы заболевания: бессимптомная, малосимптомная или симптоматическая (4). Симптоматическая инфекция приводит к смерти, и ее клинические проявления включают кожные изменения, такие как алопеция, дерматит, онихогрифоз (3, 11), а также висцеральные проявления с изменениями почек, печени и головного мозга (18, 28). Некоторые из зараженных собак остаются бессимптомными или обнаруживают несколько слабых симптомов и классифицируются как малосимптомные (4). CVL не может рассматриваться только в качестве ветеринарного заболевания, поскольку зараженные собаки (даже без симптомов) являются основным внутренним резервуаром паразита для заражения человека (1). Таким образом, для того чтобы снизить передачу лейшманий от собак к людям, необходимо диагностировать лейшманиоз собак как можно раньше.

Наличие специфических антител против лейшманий у бессимптомных, малосимптомных и симптоматических зараженных собак (4, 9, 34) позволило разработать серологические тесты, включая иммунофлуоресцентный анализ антител (IFAT), вестерн-блоттинг, иммунохроматографический тест и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) (рассмотрены в (23)). Диагностика CVL с использованием тестов ELISA, основанных на неочищенных растворимых антигенах лейшманий (SLA), демонстрирует высокую чувствительность, но низкую специфичность из-за родства между антигенами лейшманий и другими патогенными простейшими (16). В качестве стратегии для разработки специфических тестов для серодиагностики CVL различные паразитарные антигены получали в виде рекомбинантных белков (5, 10, 24). Однако из-за высокой вариабельности наблюдаемого гуморального ответа по отношению к различным паразитарным антигенам у отдельных зараженных собак (19, 31) для эффективной диагностики, основанной на рекомбинантных белках, может потребоваться смесь рекомбинантных белков или использование химерных белков, содержащих отдельные неродственные паразитарные антигены (6, 31, 36). Специфическая диагностика CVL может быть также разработана с использованием неочищенных фракций паразита, исследованных посредством вестерн-блоттинга, или очищенных препаратов из паразита (8, 17). Например, уже разработан анализ ELISA, основанный на растворимом антигене лейшманий (SLA) (27, 31). Однако этот анализ, основанный на SLA, недостаточно специфичен для диагностики бессимптомного лейшманиоза. Кроме того, сыворотка от индивидуумов с другими паразитарными заболеваниями, отличными от лейшманиоза, будет давать ложноположительную реакцию в анализе, основанном на SLA.

Таким образом, все еще существует необходимость в улучшенном способе диагностики паразитарного заболевания, такого как лейшманиоз, у которого отсутствуют недостатки существующих способов.

Описание изобретения

В этой работе авторы показывают, что RPE, в частности RPE лейшманий (LRPE), может быть с успехом использован для диагностики паразитарного заболевания, такого как лейшманиоз; этот новый способ диагностики является более специфическим, чем известные способы диагностики, такие как способ, основанный на SLA, как показано в примере. Этот новый способ дает возможность проводить досимптоматическую диагностику лейшманиоза, которая имеет решающее значение для предупреждения или снижения передачи лейшманий от собак к людям.

Изобретение далее описано ниже.

Применение

В первом аспекте предлагается применение экстракта рибосомального белка (RPE) для диагностики паразитарного заболевания у индивидуума.

Как определено в настоящем описании, экстракт рибосомального белка можно получить путем выполнения следующих стадий с использованием клетки паразита, вызывающего паразитарное заболевание, когда он присутствует у индивидуума:

a. смешивание клетки паразита с лизирующим буфером,

b. центрифугирование полученной смеси для получения цитоплазматического экстракта,

c. приготовление экстракта рибосомального белка из полученного цитоплазматического экстракта.

На стадии a паразит предпочтительно означает простейшее. Предпочтительные паразиты будут определены позднее в настоящем описании. Более предпочтительно, простейшее находится на стадии промастиготы. Специалисту в данной области известно количество клеток паразита, приблизительно необходимое для получения желаемого количества RPE. Как правило, для получения 500 микрограмм RPE используют 3×10⁹ клеток паразита. Лизирующий буфер представляет собой буфер, который разрушает, по меньшей мере, некоторые из клеток паразита. По меньшей мере, часть предпочтительно означает, по меньшей мере, 50% клеток или, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Предпочтительный лизирующий буфер содержит неионное поверхностно-активное вещество. Хорошие результаты получали при использовании в качестве неионного поверхностно-активного вещества Нонидет P40 (NP40). Однако можно использовать другие неионные поверхностно-активные вещества. Предпочтительным для использования лизирующим буфером является следующий (буфер A): 10 мМ Трис HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 0,5% NP40 (Roche) и, предпочтительно, дополненный ингибиторами протеаз, такими как 1 мМ PMSF, 8 мкг/мл леупептина, 4 мкг/мл апротинина и 8 мкг/мл пентатина. Подходящее количество клеток паразита (10⁹ клеток/мл буфера A), как правило, осторожно смешивают с лизирующим буфером при помощи пипетки Эппендорфа.

На стадии b смесь, полученную на стадии a, по меньшей мере, один раз центрифугируют при 4°C; как правило, первую стадию центрифугирования проводят при 3000 g в течение 2 минут. Полученный супернатант предпочтительно центрифугируют снова один или два раза при 13000 g в течение 15 минут при 4°C.

На стадии c полученный супернатант используют для приготовления RPE, как описано в (45). В кратком изложении, полученный супернатант подвергают высокоскоростному центрифугированию при 90000 об/мин в течение 30 мин при 4°C. Предпочтительно используют ротор Beckman TL100.3. Полученный осадок представляет собой неочищенный рибосомальный осадок, который ресуспендируют в подходящем буфере, таком как буфер B (20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 500 мМ AcNH₄, 100 мм MgCL₂, 5 мМ β-меркаптоэтанол) и центрифугируют при ступенчатом градиенте сахарозы (20/40%) в подходящем буфере, таком как буфер A, при 90000 об/мин при 4°C. Здесь снова предпочтительным ротором является ротор TL100.3. Полученный осадок содержит рибосомы. Этот осадок предпочтительно растворяют в PBS (забуференный фосфатом солевой раствор), обрабатывают ультразвуком и хранят при -70°C.

Рибосомальные белки представляют собой высококонсервативные цитоплазматические белки. Таким образом, RPE, как определено в настоящем описании, могут быть получены из любого эукариотического организма, будь это растение или животное, млекопитающие, пресмыкающиеся, рыбы, насекомые или любой другой организм, содержащий хромосому, такой как простейшие. Предпочтительно RPE получают из организма, который на эволюционном древе близок к организму, вызывающему заболевание, предпочтительно паразитарное заболевание. Таким образом, особый интерес в качестве источника RPE для использования в лечении паразитарного заболевания представляют простейшие, такие как Plasmodium, и, в частности, члены семейства трипаносом, более конкретно, различные виды трипаносомных простейших Leishmania или Trypanosoma. Существует более 20 известных видов лейшманий, включая виды подрода Leishmania, содержащие комплекс L. major, в том числе L. major, комплекс L. Donovani, в том числе L. chagasi, L. donovani и L. infantum, комплекс L. Mexicana, в том числе L. amazonensis и L. mexicana, а также подвиды Viannia, содержащие комплекс L. braziliensis, в том числе L. braziliensis и L. Peruviana, и комплекс L. guyanensis, в том числе L. guyanensis и L. panamensis. Виды плазмодия, представляющие интерес, включают Plasmodium falciparum и Plasmodium vivax. В предпочтительном варианте осуществления RPE получают из видов Leishmania, предпочтительно Leishmania major и/или Leishmania infantum. В другом предпочтительном варианте осуществления RPE получают из видов Plasmodium. Специалисту в данной области будет понятно, что RPE можно также получить путем смешивания RPE от нескольких различных организмов, как определено в настоящем описании. Применение RPE в способе диагностики по изобретению вместо применения определенного белка является крайне привлекательным, поскольку RPE содержит большое количество различных антигенов. Каждый из этих антигенов потенциально может диагностировать наличие иммунного ответа у индивидуума. Кроме того, существуют индивидуумы, которые отвечают на антиген A и не отвечают на антиген B, и наоборот. Таким образом, RPE, как использовано в настоящем описании, предполагается применять для широких слоев населения, поскольку он содержит большое количество различных антигенов. В предпочтительном варианте осуществления RPE содержит, по меньшей мере, один рибосомальный белок, и/или, по меньшей мере, один антиген рибосомального белка, и/или, по меньшей мере, один белковый фрагмент рибосомального белка. В более предпочтительном варианте осуществления RPE содержит, по меньшей мере, два рибосомальных белка, и/или, по меньшей мере, два антигена рибосомального белка, и/или, по меньшей мере, два белковых фрагмента рибосомального белка. Белковый фрагмент, как определено в настоящем описании, представляет собой предпочтительно фрагмент, который содержит, по меньшей мере, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 или более смежных аминокислот соответствующего рибосомального белка. В одном варианте осуществления RPE, как определено в настоящем описании, не содержит или не состоит из кислого рибосомального белка P0 из Leishmania infantum и/или рибосомального антигена LbeF4A из Leishmania braziliensis. В другом варианте осуществления RPE, как определено в настоящем описании, не содержит или не состоит из эпитопа, полученного из кислого рибосомального антигена LcPo из Leishmania chagasi, как описано в EP 824699. Более предпочтительно, RPE не содержит или не состоит из 17 аминокислот, расположенных на C-конце LcPo: аминокислоты 306-322 LcPo, представленные SEQ ID NO:2 в EP 824699, который также определен как SEQ ID NO:1 в списке последовательностей.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что оно дает возможность проводить специфическую и раннюю диагностику широкого спектра паразитарных заболеваний. Одним из примеров паразитарного заболевания, при котором это имеет место, является лейшманиоз. В предпочтительном варианте осуществления паразитарное заболевание представляет собой лейшманиоз или малярию. Более предпочтительно, паразитарное заболевание вызвано видами Leishmania или Plasmodium. В дополнительном, предпочтительном варианте осуществления паразитарное заболевание вызвано видами, отличными от видов, из которых получен RPE. В частности, лейшманиоз, вызванный одним видом из рода Leishmania, может быть диагностирован при помощи композиции на основании RPE из других видов Leishmania. В одном из вариантов осуществления лейшманиоз, вызванный L. major, успешно диагностируется при помощи композиции, содержащей RPE из L. infantum. Альтернативно, другие паразитарные заболевания, такие как малярия, могут быть успешно диагностированы при помощи композиции на основании RPE из других видов, например на основании RPE из L. infantum.

В контексте изобретения индивидуум означает человека или животное. Животное, которое охватывается объемом изобретения, включает млекопитающее, предпочтительно человека или собаку. В принципе, любой индивидуум может быть диагностирован при помощи изобретения. Способ диагностики можно применять так часто, как это необходимо индивидууму. Предпочтительно, диагностируемый индивидуум представляет собой индивидуума с подозрением на риск заражения указанным паразитом, вызывающим указанное паразитарное заболевание. Индивидуум с подозрением на риск заражения указанным паразитом может проживать в эндемической области или посещать эндемическую область. Эндемическая область включает Северную Африку от Алжира до Саудовской Аравии, Кению, Судан, Эфиопию. Она далее включает Южную Европу: средиземноморские страны - Испанию, Францию, Грецию и т.д. Она также включает Центральную (все страны) и Южную Америку: Бразилию, Венесуэлу, Перу, Боливию, Колумбию, север Аргентины, Парагвай, Уругвай, область от Центральной до Юго-Восточной Азии: Индию, Иран, Ирак, Монголию, Непал, Бангладеш.

В контексте изобретения применение, как определено в настоящем описании, предпочтительно является применением in vitro или ex vivo. Предпочтительно означает, что указанное применение проводят на образце от указанного индивидуума. Предпочтительные образцы включают кровь, сыворотку, плазму, слюну, цереброспинальную жидкость или мочу. Более предпочтительно, образец представляет собой кровь или образец сыворотки, полученные от индивидуума.

В предпочтительном варианте осуществления диагностику проводят до появления симптома указанного паразитарного заболевания, так называемая досимптоматическая диагностика или диагностика у бессимптомного индивидуума. В данном контексте "досимптоматическая" предпочтительно означает, по меньшей мере, одни сутки, по меньшей мере, двое суток, по меньшей мере, трое суток, по меньшей мере, четверо суток, по меньшей мере, пять суток, по меньшей мере, шесть суток, по меньшей мере, семь суток, по меньшей мере, восемь суток, по меньшей мере, девять суток, по меньшей мере, десять суток, по меньшей мере, 15 суток, по меньшей мере, 20 суток, по меньшей мере, 25 суток, по меньшей мере, 30 суток или более до появления первого симптома. Первый симптом или первый клинический признак, связанный с паразитарным заболеванием, таким как лейшманиоз, можно выбрать из следующего списка: лихорадка, спленомегалия, гепатомегалия, лимфоаденопатия, конъюнктивит, дерматит, онихогрифоз, кератоконъюктивит, апатия и кахексия. Большинство из них можно просто обнаружить при внешнем медицинском обследовании. Конъюнктивит, дерматит, онихогрифоз, кератоконъюктивит представляют собой формы кожного поражения.

Предпочтительным первым симптомом, связанным с лейшманиозом, является лимфоаденопатия. Ее можно выявить при внешнем медицинском обследовании, таком как пальпация.

В другом предпочтительном варианте осуществления диагностику проводят до появления некоторых симптомов указанного паразитарного заболевания, так называемая диагностика у малосимптомного индивидуума. В этом контексте, "малосимптомный" предпочтительно означает индивидуума, у которого присутствуют максимум три из симптомов, как определено выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления диагностику проводят до появления всех симптомов указанного паразитарного заболевания, так называемая диагностика у симптоматического индивидуума. В этом контексте, "симптоматический" предпочтительно означает индивидуума, у которого присутствуют, по меньшей мере, четыре из симптомов, как определено выше, в том числе форма кожного поражения, как определено выше.

Специалисту будет понятно, что наиболее важным типом диагностики является диагностика бессимптомных индивидуумов, поскольку это помогает предотвращать дальнейшее распространение заболевания, и бессимптомным индивидуумам можно помочь и подвергнуть их лечению более эффективно, если они будут диагностированы на такой стадии.

Способ

Во втором аспекте предлагается способ диагностики паразитарного заболевания у индивидуума с использованием RPE; способ, включающий определение того, присутствует ли распознавание RPE антителом в образце, полученном от индивидуума. Предпочтительный способ по изобретению, как и предпочтительное применение по изобретению, предпочтительно осуществляют in vitro или ex vivo. Определение было дано выше в настоящем описании.

В предпочтительном способе RPE присутствует в композиции. Определение RPE было дано выше в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления другое соединение присутствует в указанной композиции. Альтернативно, каких-либо других соединений в указанной композиции нет.

В предпочтительном варианте осуществления другие соединения применяют последовательно или одновременно с RPE для того, чтобы улучшить специфичность способа. Полезно, например, использовать другие соединения, которые способны различать бессимптомного, малосимптомного или симптоматического индивидуума и привитого индивидуума. Более предпочтительно, такие соединения не присутствуют в одной композиции вместе с RPE. Например, можно использовать другой неродственный антиген паразита, вызывающего указанное паразитарное заболевание (31), такое как лейшманиоз. Другим примером является использование полибелков, которые содержат несколько паразитарных антигенов (6, 36). Предпочтительные антигены включают гистоновый белок, или его фрагмент, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный гистон. Более предпочтительно, гистоновым белком является H2A, H2B, H3 и/или H4, как определено в EP 1687023. Гистоны H2A, H2B, H3 и H4 представляют собой высококонсервативные ядерные белки, и их последовательность хорошо известна в данной области, см., например, Requena et al., Trends in Parasitol. (2000) 16:246. Предпочтительно гистоны получают из организма, который на эволюционном древе близок к организму, вызывающему заболевание. Таким образом, особый интерес в качестве источника гистонов для применения в лечении паразитарных заболеваний, таких как лейшманиоз, представляют простейшие, и, в частности, члены семейства трипаносом, как, например, Plasmodium, более конкретно, различные виды трипаносомных простейших Leishmania.

В более предпочтительном способе диагностики паразитарное заболевание диагностируют, когда присутствует выявляемое количество антитела, распознающего RPE, и/или присутствует повышенное количество указанного антитела. У контрольного или здорового индивидуума указанное антитело, как правило, не выявляется.

Выявление наличия указанного антитела проводят при помощи способов, известных специалисту в данной области, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Предпочтительные способы детекции описаны в разделе, озаглавленном Анализ.

Антитело, распознающее RPE, предпочтительно означает, что, по меньшей мере, присутствует одно антитело, которое способно распознать, по меньшей мере, одно соединение, присутствующее в RPE. Указанное соединение может быть рибосомальным белком, или рибосомальным белковым фрагментом, или рибосомальным антигеном рибосомального белка.

Анализ

В третьем аспекте предлагается устройство для анализа или анализ для диагностики паразитарного заболевания у индивидуума, где устройство или анализ содержат RPE. Присутствие антитела, специфически распознающего RPE, может быть обнаружено любыми стандартными способами, известными специалистам в данной области (см., например, Harlow и Lane, Antybodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, включенный в настоящее описание посредством ссылки). Подходящие способы включают электрофорез, совмещенный с аффинной хроматографией (ACE) и (фермент-связанный иммуносорбентный анализ) ELISA. Предпочтительно, анализ включает ELISA. Некоторые виды анализа более подробно описаны ниже.

В предпочтительном варианте осуществления анализ включает использование RPE, иммобилизованного на твердой подложке, для связывания и удаления антитела из образца. Указанное связавшееся антитело можно затем обнаружить при помощи реагента для детекции, который связывается с комплексом антитело/RPE и содержит детектируемую репортерную группу. Подходящие реагенты для детекции включают антитела, которые связываются с комплексом антитело/RPE и свободный полипептид, меченный репортерной группой (например, в полуконкурентном анализе). Альтернативно, можно использовать конкурентный анализ, в котором антитело, связывающееся с RPE, мечено репортерной группой и связывается с иммобилизованным RPE после инкубации RPE с образцом. Степень, в которой компоненты образца ингибируют связывание меченого антитела с RPE, иммобилизованным на подложке, является показателем реактивности образца с иммобилизованным RPE.

Твердая подложка может быть из любого материала, известного специалистам в данной области, к которому можно присоединить RPE. Например, подложка может представлять собой тест-лунку в планшете для микротитрования или нитроцеллюлозную или другую подходящую мембрану. Альтернативно, подложка может представлять собой гранулу или диск из стекла, стекловолокна, латекса или из пластика, такого как полистирол или поливинилхлорид. Подложка может представлять собой магнитную частицу или оптико-волоконный сенсор, такой как раскрытые, например, в патенте США 5359681.

RPE можно связать с твердой подложкой при помощи ряда техник, известных специалистам в данной области. В контексте настоящего изобретения термин "связанный" относится как к нековалентной связи, такой как адсорбция, так и к ковалентному прикреплению (которое может представлять собой непосредственную связь антигена и функциональных групп на подложке или может представлять собой связь посредством перекрестно связывающего агента). Предпочтительным является связывание посредством адсорбции в лунке планшета для микротитрования или на мембране. В таких случаях, адсорбции можно достичь за счет контакта RPE в подходящем буфере с твердой подложкой в течение подходящего количества времени. Время контакта зависит от температуры, но, как правило, составляет от 1 часа до 1 суток. В основном, контакта лунки пластикового планшета для микротитрования (такого как полистирол или поливинилхлорид) с количеством RPE в диапазоне от 10 нг до 1 г, и предпочтительно 100 нг, достаточно для связывания необходимого количества RPE.

Ковалентного присоединения RPE к твердой подложке можно, как правило, достичь за счет начального взаимодействия подложки с бифункциональным реагентом, который реагирует как с подложкой, так и с функциональной группой на полипептиде, такой как гидроксильная или аминогруппа. Например, RPE может связываться с подложкой с подходящим полимерным покрытием при помощи бензохинона или за счет конденсации альдегидной группы на подложке с амином и активным водородом на полипептиде (см., например, Pierce Immunotechnology Catalog и Handbook (1991) at A12-A13).

В определенных вариантах осуществления анализ представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Данный анализ можно проводить путем начального контакта RPE, иммобилизованного на твердой подложке, обычно лунке планшета для микротитрования, с образцом таким образом, что антитела в образце, специфичные к RPE, могут связаться с иммобилизованным RPE. Несвязавшийся образец затем удаляют с иммобилизованного RPE и добавляют реагент для детекции, способный связываться с иммобилизованным комплексом антитело-RPE. Количество реагента для детекции, которое осталось связанным с твердой подложкой, затем определяют при помощи метода, подходящего для конкретного реагента для детекции.

Как только RPE иммобилизован на подложке, оставшиеся участки связывания белка на подложке, как правило, блокируют. Можно использовать любые подходящие блокирующие вещества, известные специалистам в данной области, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA) или Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Иммобилизованный RPE затем инкубируют с образцом, и антитело (если оно присутствует в образце) может связаться с RPE. Перед инкубацией образец можно развести подходящим разбавителем, таким как забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). Как правило, подходящее время контакта (т.е. время инкубации) представляет собой такой период времени, который достаточен для того, чтобы обнаружить присутствие антитела в образце. Предпочтительно, время контакта является достаточным для достижения уровня связывания, когда, по меньшей мере, 95% связывания достигается при равновесии между связавшимися и несвязавшимися антителами. Специалистам в данной области будет понятно, что время, необходимое для достижения равновесия, легко определить, анализируя уровень связывания, который происходит в течение периода времени. При комнатной температуре, как правило, достаточным является время инкубации приблизительно 30 минут.

Несвязавшийся образец можно затем удалить промыванием твердой подложки подходящим буфером, таким как PBS, содержащим 0,1% Tween 20. Затем к твердой подложке можно добавлять реагент для детекции. Подходящий реагент для детекции представляет собой любое соединение, которое связывается с иммобилизованным комплексом антитело-RPE и затем может быть обнаружено при помощи ряда способов, известных специалистам в данной области. Предпочтительно, реагент для детекции содержит связующее вещество (такое как, например, белок A, белок G, иммуноглобулин, лектин или свободный антиген), конъюгированное с репортерной группой. Предпочтительные репортерные группы включают ферменты (такие как пероксидаза хрена), субстраты, кофакторы, ингибиторы, красители, радионуклиды, люминисцентные группы, флуоресцентные группы и биотин. Конъюгацию связующего агента с репортерной группой можно осуществить при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области. Распространенные связующие агенты также могут быть приобретены конъгированными с рядом репортерных групп у многих поставщиков (например, Zymed Laboratories, San Francisco, CA и Pierce, Rockford, IL).

Реагент для детекции затем инкубируют вместе с иммобилизованным комплексом антитело-RPE в течение времени, достаточного для выявления связавшегося антитела. Подходящий период времени можно, как правило, определить по инструкции производителя или анализируя уровень связывания, которое происходит за период времени. Несвязавшийся реагент для детекции затем удаляют, и связавшийся реагент для детекции определяют с помощью репортерной группы.

Способ, который используется для выявления репортерной группы, зависит от природы репортерной группы. Для радиоактивных групп подходит, как правило, измерение активности сцинтилляционным методом или авторадиографические способы. Для выявления красителей, люминисцентных групп и флуоресцентных групп можно использовать спектроскопические методы. Биотин можно обнаружить при помощи авидина, связанного с другой репортерной группой (обычно радиоактивная или флуоресцентная группа или фермент). Ферментные репортерные группы, как правило, выявляют путем добавления субстрата (как правило, в течение конкретного периода времени) с последующим спектроскопическим или другим анализом продуктов реакции.

Для того чтобы определить наличие или отсутствие в образце антитела, специфичного для паразитарного заболевания, такого как лейшманиоз, сигнал, полученный от репортерной группы, которая осталась связанной с твердой подложкой, как правило, сравнивают с сигналом, который соответствует предопределенному пороговому значению. В одном из предпочтительных вариантов осуществления пороговое значение предпочтительно представляет собой среднее значение сигнала, полученного при инкубировании иммобилизованного RPE с образцом от неинфицированного индивидуума. Как правило, образец считается положительным, если он генерирует сигнал, который составляет три стандартных отклонения выше предопределенного порогового значения (т.е. реагирует с RPE). В альтернативном, предпочтительном варианте осуществления пороговое значение определяют при помощи ROC-кривой, согласно способу Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7 (Little Brown and Co., 1985). В кратком изложении, в данном варианте осуществления пороговое значение можно определять из графика с парами положительных уровней (т.е. чувствительность) и ложноположительных уровней (100% специфичность), которые соответствуют каждому возможному пороговому значению для результата диагностического теста.

Пороговое значение на графике, ближайшее к верхнему левому углу (т.е. значение, которое охватывает самую большую площадь), является наиболее точным пороговым значением, и образец, генерирующий сигнал выше, чем пороговое значение, определенное данным способом, может считаться положительным. Альтернативно, пороговое значение можно сдвигать вдоль графика влево, чтобы минимизировать ложноположительный уровень, или вправо, чтобы минимизировать ложноотрицательный уровень.

В связанном варианте осуществления анализ проводят в проточном формате или формате теста-полоски, где RPE иммобилизован на мембране, такой как нитроцеллюлоза. В проточном тесте антитела в образце связываются с иммобилизованным RPE, в то время как образец проходит через мембрану. Затем реагент для детекции (например, белок A с коллоидным золотом) связывается с комплексом антитело-RPE, в то время как раствор, содержащий реагент для детекции, протекает через мембрану. После этого можно проводить выявление связавшегося реагента для детекции, как описано выше. В формате теста-полоски один конец мембраны, с которой связан RPE, смачивают раствором, содержащим образец. Образец мигрирует по мембране через область, содержащую реагент для детекции, к области с иммобилизованным полипептидом. Концентрация реагента для детекции на RPE указывает на присутствие в образце антитела, специфичного к антигену паразита, вызывающего паразитарное заболевание, такое как лейшманиоз. Как правило, концентрация реагента для детекции в этом месте создает картину в виде линии, которую можно увидеть визуально. Отсутствие такой картины указывает на отрицательный результат. Как правило, количество RPE, иммобилизованного на мембране, выбирают для того, чтобы создавать визуально различимую картину, когда образец содержит уровень антитела, достаточный для создания положительного сигнала на ELISA, как указано выше. Предпочтительно, количество RPE, иммобилизованного на мембране, находится в диапазоне от 25 нг до 500 нг. Такие тесты, как правило, можно проводить с очень небольшим количеством сыворотки или крови индивидуума (например, одна капля).

Любой индивидуум или терапевт может использовать это устройство в офисе/дома, используя такое устройство или анализ повторно по мере необходимости.

Как правило, дополнительные молекулы применяют в анализе в качестве положительного или отрицательного контроля. Обычный положительный контроль может представлять собой антитело, распознающее молекулу, которая, как известно, присутствует в исследуемом образце. Обычный отрицательный контроль может представлять собой антитело, распознающее молекулу, которая, как известно, отсутствует в исследуемом образце.

В настоящем описании и формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения применяют в неограничивающем смысле, подразумевая, что пункты, следующие за словом, включены в состав, но не исключая пунктов, не приведенных отдельно. Кроме того, глагол "состоять" может быть заменен на "по существу состоять из", означая, что продукт, устройство для анализа, соответственно способ или применение, как определено в настоящем описании, могут содержать дополнительный компонент(ы), соответственно дополнительную стадию(и), кроме тех, которые конкретно определены; указанный дополнительный компонент(ы), соответственно стадию(и) не изменяют уникальные характеристики изобретения.

Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности, что присутствует более чем один элемент, за исключением случаев, когда контекст ясно указывает на наличие одного и только одного элемента. Единственное число, таким образом, как правило, означает "по меньшей мере, один".

Все патенты и ссылки на литературу, процитированные в настоящем описании, таким образом, включены посредством ссылки во всей их полноте.

Изобретение далее иллюстрируется следующим примером, который не должен рассматриваться как ограничивающий объем настоящего изобретения.

Описание фигур

Фиг.1. (A) Рибосомальные белки L. infantum подвергали электрофорезу на линейном 10-14% градиенте SDS-PAGE геля, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с сывороткой здоровых собак (дорожки 1-3) и сывороткой собак, инфицированных естественным путем L. infantum, с симптоматическим CVL (дорожки 4-13). Использовали отдельные сыворотки в разведении 1:200. (B) Двумерный электрофорез на полиакриламидном геле (2D-PAGE) рибосомальных белков L. infantum. Левая панель показывает репрезентативный гель, окрашенный серебром. Такой же гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с совокупностью сывороток с CVL (1:200), использованных в (A). В качестве вторичного реагента использовали антитело против IgG собак, конъюгированное с пероксидазой хрена.

Фиг.2. Сравнительная оценка диагностической чувствительности LRP и SLA. (A) Данные ELISA по реактивности сыворотки собак с симптоматическим CVL и контрольной сыворотки с LRP и SLA. (B) Данные ELISA по реактивности сыворотки собак с малосимптомным и бессимптомным CVL с LRP и SLA. Показано среднее значение сыворотки с CVL.

Прерывистые полосы показывают пороговое значение, которое определяли как среднюю оптическую плотность плюс три стандартных отклонения от величин, полученных на сыворотке от здоровых контролей.

Фиг.3. Сравнительная оценка диагностической специфичности LRP и SLA. (A) Данные ELISA по реактивности сыворотки собак, инфицированных T. gondii или T. Cruzi, с LRP и SLA. (B) Данные ELISA по реактивности сыворотки собак, вакцинированных Leishmune^® или Leishtec^®, с LRP и SLA. Показано среднее значение сыворотки CVL. Прерывистые полосы показывают пороговое значение, которое определяли как среднюю оптическую плотность плюс три стандартных отклонения от величин, полученных на сыворотке от здоровых контролей.

Примеры

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Паразиты. Leishmania chagasi (MOM/BR/1970/BH46) и L. infantum (MCAN/ES/1996/BCN/150, MON-1) выращивали при 24°C в среде Шнайдера (Sigma, St. Louis, MO, USA), дополненной 20% фетальной телячьей сывороткой, инактивированной нагреванием (Sigma, St. Louis, MO, USA), 20 мМ L-глутамином, 200 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл гентамицина при pH 7,4.

Получение антигена. SLA получали из промастигот L. chagasi и L. infantum в неподвижной фазе после нескольких пересевов в жидкой культуре, как описано ранее (12). В кратком изложении, 2×10⁸ промастигот на мл, в объеме 5 мл, промывали 3 раза в стерильном забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). После шести циклов заморозки-оттаивания и последующей обработки ультразвуком (Ultrasonic processor, GEX600) в течение 5 циклов по 30 сек при 38 МГц суспензию центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин при 4°C и собирали супернатант, содержащий SLA. Концентрацию белка определяли по способу Брэдфорда (7) и хранили аликвоты по 500 мкл при -70°C.

LRP получали из логарифмической фазы промастигот L. Infantum, как описано ранее (22). В кратком изложении, собирали 1×10⁹ промастигот, промывали дважды охлажденным PBS, ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфера NP40 (10 мМ Трис HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 0,5% NP40) и пипетировали 10 раз. После лизиса образцы центрифугировали при 3000×g в течение 2 мин при 4°C для осаждения ядер. Супернатант центрифугировали дважды при 13000×g в течение 15 мин при 4°C. Очищенный цитоплазматический супернатант подвергали высокоскоростному центрифугированию 90000 об/мин в течение 30 мин при 4°C на роторе Beckman TL100.3. Неочищенный рибосомальный осадок ресуспендировали в буфере A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 500 мМ AcNH₄, 100 мМ MgCl₂, 5 мМ β-меркаптоэтанол) и центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы (20/40%) в буфере A при 90000 об/мин при 4°C на роторе TL 100.3.

Образцы сыворотки. Образцы сыворотки собирали в Испании и Бразилии. Образцы сыворотки с CVL из Испании собирали у 28 собак с клиническими симптомами в регионе Эстремадура. Животных, инфицированных L. infantum, оценивали клинически и с помощью лабораторных методов в Департаменте Паразитологии Ветеринарной школы Университета Эстремадуры, Касерес, Испания. Животных считали симптоматическими при наличии трех и более следующих симптомов: потеря массы, алопеция, аденопатия, онихогрифоз, гепатомегалия, конъюнктивит и эксфолиативный дерматит на носу, хвосте и кончиках ушей. Все сыворотки были положительными при исследовании посредством непрямой иммунофлуоресценции, и наличие амастиготных форм паразита в подколенном и надлопаточном лимфатических узлах подтверждали посредством прямого наблюдения. Контрольную сыворотку получали от 8 здоровых животных (отделение паразитологии, университет Эстремадуры).

Использовали образцы сыворотки от 58 собак, инфицированных L. chagasi (44 клинически симптоматических, 7 малосимптомных и 7 бессимптомных), из области Бело Оризонте, Минас Жерайс, Бразилия. Как описано выше, животных считали симптоматическими при наличии трех или более клинических симптомов, малосимптомными, при наличии только одного или двух симптомов, и бессимптомными, когда у собаки не было клинических симптомов. Как и выше, диагноз VL устанавливали, когда наблюдали амастиготы в мазках из аспиратов костного мозга, окрашенных по Гимзе, или когда в культуре периферической крови или аспиратах костного мозга были обнаружены промастиготы. Сыворотка от бразильских собак была предоставлена Evaldo Nascimento и Maria Norma Melo (Департамент Паразитологии, Государственный Университет Минас Жерайс, Бело Оризонте, Минас Жерайс, Бразилия). Контрольную группу составляли сыворотки от 47 собак, живущих в эндемических областях VL, но без клинических признаков или подозрения на лейшманиоз собак, отрицательные после паразитологических и серологических тестов. Следующие четырнадцать образцов сывороток от собак с другими паразитарными инфекциями использовали для анализа перекрестного реагирования: Toxoplasma gondii (n=5) и Trypanosoma cruzi (n=9). В экспериментах использовали образцы сыворотки от здоровых собак и собак, привитых вакцинами Leishmune^® (n=18) или Leishtec^® (n=23).

ELISA. Микротитровальные планшеты для иммунологического анализа (Falcon) покрывали SLA из L. infantum или L. chagasi, или LRP из L. infantum (0,5 мкг/лунка каждого), в 100 мкл покрывающего буфера с pH 9,6, 18 часов при 4°C. Строили кривую титрования для определения наилучших для использования концентраций белка и разведений антитела. Свободные участки связывания блокировали 0,05% PBS-Tween 20 (PBST) и 3% раствором казеина в течение 2 часов при 37°C. После трех промываний PBST планшеты инкубировали со 100 мкл сыворотки собак в течение 1 часа при 37°C. Образцы сыворотки разводили 1:200 в PBST и 0,3% казеине. Планшеты промывали семь раз и инкубировали с антителами против IgG собак, конъюгированными с пероксидазой хрена и разведенными 1:10000 (Sigma, St. Louis, USA). Реакцию проявляли путем инкубирования с H₂O₂, орто-фенилендиамином и цитрат-фосфатным буфером (pH 5,0) в течение 30 мин в темноте и останавливали добавлением 20 мкл 2н. H₂O₂. Оптические плотности измеряли при 492 нм в микропланшетном спектрофотометре для ELISA (Molecular Devices, Spectra Max Plus. Concord, ON, Canada).

Вестерн-блоттинг. Для SDS-PAGE LRP из L. infantum (15 мкг) ресуспендировали в буфере Лэммли и анализировали в 10-14% градиентных SDS-PAGE гелях с препаративной гребенкой с использованием системы BioRad для белкового электрофореза минигелей (Hercules, CA, USA). Для 2D-PAGE LRP из L. infantum растворяли в 200 мкл лизирующего буфера (0,5% Nonidet P40, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 мМ PMSF, 10 мМ Трис HCl, pH 7,4, и 1 мМ DTT) и экстрагировали равным объемом фенола. Белки, присутствующие в органической фазе, осаждали пятью объемами буфера с ацетатом аммония (0,1M ацетат аммония, растворенный в метаноле) и промывали три раза 80% ацетоном. Высушенный осадок ресуспендировали в регидратирующем буфере (7M мочевина, 2M тиомочевина, 0,5% буфер IPG (3-10), 4% CHAPS, 40 мМ Трис HCl, pH 8,8 и 0,002% бромофеноловый синий) и центрифугировали для удаления нерастворимого материала. Белки адсорбировали на 11 см Immobiline™ DryStrip, pH3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Рeгидратацию и изоэлектрофокусирование (IEF) проводили с использованием системы IPGphor (GE Healthcare) согласно инструкциям производителя. После IEF полоски IPG уравновешивали в уравновешивающем буфере (6M мочевина, 2% SDS, 0,375M ТрисHCl, pH 8,8, 20% глицерин, 0,002% бромофеноловый синий) плюс 20 мг/мл DTT в течение 15 мин, и затем с уравновешивающим буфером плюс 25 мг/мл йодацетамида еще 15 мин Уравновешенные полоски IPG помещали на 12% SDS-PAGE минигели (BioRad). 2D-PAGE гель окрашивали нитратом серебра при помощи набора для окраски серебром (GE Healthcare).

В обоих случаях после электрофореза гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare). Исследовали пятна с отдельными сыворотками (1:200) от собак, инфицированных L. infantum (SDS-PAGE), или с пулом сывороток (2D-PAGE). В качестве вторичного антитела использовали антитела против IgG собак, конъюгированные с пероксидазой хрена (1:2000), приобретенные у Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, The Netherlands).

Статистический анализ. Все данные сравнения тестировали на значимость при помощи непарного t-теста Стьюдента; значения P<0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Антигенность LRP из L. infantum в течение инфекции у собак. Для того чтобы исследовать антигенность LRP в течение инфекции у собак, сыворотку от 10 собак, инфицированных L. Infantum естественным путем, инкубировали с нитроцеллюлозной мембраной, содержащей экстракты LRP из этого паразита. Сыворотка всех инфицированных животных распознавала очищенную фракцию белка этого паразита (фиг.1A, дорожки 4-13). Сыворотки от здоровых собак были отрицательными или слабо окрашивали некоторые полипептиды из неочищенного рибосомального препарата (фиг.1A, дорожки 1-3). Большинство сывороток с CVL распознавали большое количество полос белка, хотя сложность и интенсивность картины распознавания были различными у отдельных сывороток собак. Несмотря на установленную вариабельность, на вестерн-блоттинге наблюдали две иммунодоминантных области: полипептиды 45-36 кДа и 25-22 кДа, соответственно.

Для того чтобы более подробно проанализировать картину распознавания белков, экстракт LRP разделяли посредством 2D-PAGE с высоким разрешением. Как показано на фиг.1B, правая панель, гели, приготовленные с нанесениями препаративного белка (20 мкг), показывают хорошее разрешение только с минимальными полосами для большинства основных белков (фиг.1, левая панель). Наличие 20 пятен антигенов выявили, когда 2D-PAGE гель инкубировали с пулом таких же сывороток, как использовано выше (фиг.1B, правая панель).

Сравнение LRP и SLA для серодиагностики CVL. Для того чтобы определить, может ли экстракт LRP рассматриваться как полезный инструмент для серодиагностики CVL, авторы исследовали реактивность в отношении LRP и SLA на 127 образцах сывороток собак. Первую группу составили 72 образца сывороток, полученных от симтоматических собак, инфицированных L. infantum (n=28) или L. chagasi (n=44). Вторая группа была сформирована из сывороток от 55 здоровых собак. Фиг.2A показывает значения оптической плотности сывороток от симптоматического CVL и контроля. Для обоих препаратов белка различия между сыворотками с CVL и контрольными сыворотками были статистически значимыми (P<0,001). Спектр значений оптической плотности был различным для LRP и SLA, реактивность сыворотки с CVL в отношении SLA была выше (среднее=1,79±0,64), чем реактивность, полученная для LRP (среднее=0,90±0,63). Высокую вариабельность значений оптической плотности для отдельных образцов сыворотки наблюдали для обоих антигенных препаратов, на что указывает стандартное отклонение (SD), хотя SD было больше, когда в качестве антигена использовали SLA. Реактивность здоровой сыворотки также была выше в отношении SLA (среднее=0,38±0,13), чем в отношении LRP (среднее=0,0954±0,047). В условиях ELISA, указанных в материалах и способах, пороговое значение для обоих антигенов (определяется как среднее значение реактивности здоровой сыворотки плюс 3 SD) было 0,237 для LRP и 0,774 для SLA. Эти пороговые значения позволили авторам идентифицировать положительные и отрицательные сыворотки и, таким образом, оценить рабочие параметры ELISA (таблица 1). Поскольку LRP показывает параметры (высокие значения чувствительности и специфичности), сходные с SLA в анализах ELISA, можно заключить, что рибосомальные белки лейшманий являются подходящими антигенами для диагностики симптоматического CVL.

Затем исследовали сыворотки от малосимптомных (n=7) и бессимптомных (n=7) собак (фиг.2B). Обнаружили, что реактивность в отношении LRP и SLA из сывороток от обеих групп и здорового контроля была статистически значимой (P<0,001). Хотя использовали ограниченное число сывороток, полученные данные указывают на то, что в то время как сыворотка от малосимптомных собак распознавала препараты LRP и SLA (100% чувствительность), сыворотка от 30% бессимптомных собак (3/7) демонстрировала значения оптической плотности по отношению к SLA выше порогового значения (фиг.2B). С другой стороны, исследованная сыворотка от всех бессимптомных собак показала значения оптической плотности по отношению к LRP выше порогового значения. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что использование LRP можно рассматривать как хороший инструмент для серодиагностики CVL.

Перекрестная реактивность LRP и SLA. Поскольку LRP состоит из эволюционно консервативных белков, авторы анализировали возможную перекрестную реактивность экстрактов LRP с сыворотками от собак, инфицированных другими одноклеточными простейшими: Toxoplasma gondii (n=5) и Trypanosoma cruzi (n=9). На фиг.3 показаны значения реактивности отдельных сывороток из каждой группы в отношении LRP. Ни одна сыворотка от собак, инфицированных T. gondii (среднее=0,1012±0,056) или T. cruzi (среднее=0,101±0,06), не показала реактивности выше порогового значения, определенного по здоровой сыворотке (см. выше). В качестве контроля анализировали реактивность тех же самых сывороток в отношении SLA. Средняя реактивность этих сывороток в отношении SLA (0,629±0,21 для собак, зараженных T. Gondii, и 0,99±0,29 для собак, зараженных T. cruzi) была выше, чем средняя реактивность, которую наблюдали в отношении LRP. Реактивность некоторых сывороток была выше порогового значения (1/5 для собак, зараженных T. Gondii, и 7/9 для собак, зараженных T. cruzi).

Также анализировали реактивность сыворотки от собак, привитых двумя лицензированными в Бразилии профилактическими вакцинами против лейшманий: Leishmune^® (29) и Leishtec^® (15), в отношении экстрактов LRP и SLA. Авторы обнаружили, что 22,2% (4/18) сывороток от здоровых собак, привитых Leishmune^®, показали значения оптической плотности (OD) выше порогового значения, когда в анализе ELISA были использованы экстракты LRP (фиг.3B). Когда те же сыворотки исследовали в анализах ELISA на основе SLA, 16,6% (3/18) сывороток были также выше порога (фиг.3B). Ни одна из 23 сывороток, полученных от собак, привитых вакциной Leishtec^®, не показала реактивность в отношении SLA. Только одна из этих сывороток показала реактивность в отношении LRP с величиной OD, близкой к пороговому значению, определенному по отрицательной сыворотке здорового контроля, которая исследована на фиг.2A.

ОБСУЖДЕНИЕ

Множество внутриклеточных цитоплазматических или ядерных белков лейшманий, таких как гистоны, цистеинпротеиназы или кинезин, было идентифицировано в качестве антигенов при висцеральном лейшманиозе человека (VL) или собак (2, 13, 14, 30, 32, 35). В этой работе авторы показывали, что паразитарные рибосомальные белки также могут являться антигенными в течение заболевания CVL. Хотя наблюдали межиндивидуальную вариабельность между отдельными собаками, все сыворотки от симптоматических собак продемонстрировали реактивность в отношении некоторых составляющих рибосом паразита.

Поскольку антигенность паразитарных рибосомальных белков была также продемонстрирована на двух различных мышиных моделях кожного лейшманиоза (22), полученные результаты указывают на то, что рибосомы паразита взаимодействуют с иммунной системой позвоночных хозяев в течение экспериментального заражения лейшманиями и заражения естественным путем.

Тесты, основанные на серологических методах, являются наиболее распространенными способами диагностики висцерального лейшманиоза (VL) у человека и собак в связи с сильным гуморальным ответом, который сопровождает инфицирование висцеротропными видами лейшманий. Учитывая высокую реактивность, которая наблюдается в отношении экстракта рибосомных белков паразита из сыворотки собак, пораженных CVL, авторы проанализировали диагностические свойства экстрактов LRP. Рибосомальные белки паразита использовали в качестве источника антигена для анализа ELISA, поскольку этот способ считают точным и чувствительным методом скрининга большого числа образцов для диагностики VL (16, 33). Был проведен сравнительный анализ экстрактов LRP с общими белками паразита, полученными из лизатов промастигот, поскольку применение анализов ELISA на основе неочищенного SLA обычно показывает, что имеется высокая чувствительность для диагностики VL (5, 25, 33). Значения чувствительности и специфичности для экстрактов LRP были сходны со значениями для SLA, когда анализировали сыворотку от симптоматических и малосимптомных. Небольшое повышение чувствительности получили для LRP по сравнению с SLA (100% и 96%, соответственно) и только одна сыворотка, полученная от здоровых собак, показала значение оптической плотности по отношению к LRP выше порогового значения, которое определяется как реактивность контрольной сыворотки. Таким образом, можно заключить, что диагностические параметры тестов ELISA на основе LRP были сходными с параметрами, полученными для препаратов SLA, при диагностике симптоматического или малосимптомного CVL. Однако выявление заболевания у бессимптомных собак может иметь решающее значение в эпидемиологических исследованиях для контроля распространения заболевания среди собак и между собаками и людьми (3, 20). Поскольку ELISA на основе SLA не удалось обнаружить большой процент бессимптомных случаев CVL (27, 31), авторы проанализировали чувствительность экстрактов LRP в диагностике бессимптомного CVL. В то время как смесь антигенов LRP выявила все бессимптомные случаи (100%), анализ с использованием препарата SLA выявил только приблизительно 30% случаев. Хотя реактивность в отношении LRP требует дополнительного подтверждения с использованием большего числа малосимптомных и бессимптомных образцов, полученные данные указывают, что LRP может быть использован в качестве более чувствительного антигена, чем SLA, при диагностике всех форм CVL.

Специфичность тестов ELISA с использованием SLA в значительной степени зависит от препарата антигена, и было получено несколько ложноположительных результатов на сыворотках, полученных от пациентов или собак с ко-эндемическими заболеваниями, такими как болезнь Шагаса, малярия, лепра или токсоплазмоз (16, 23, 31). По этой причине отдельно используют некоторые паразитарные рекомбинантные белки в качестве антигена в анализах ELISA для разработки более специфических диагностических тестов (24). Сравнительные анализы ELISA, в основном, выявили более высокую специфичность, но более низкую чувствительность при использовании рекомбинантных антигенов по отдельности вместо SLA при диагностике висцерального лейшманиоза человека (25) или собак (31). Более низкие значения чувствительности могут быть связаны с вариабельностью, которая наблюдается при гетерогенном гуморальном ответе, вызванном против белков паразита, у каждого пациента или зараженной собаки. Комбинация неродственных антигенов (31) или создание полибелков, которые содержат несколько паразитарных антигенов (6, 36), может еще больше повысить производительность тестов ELISA. Альтернативно, можно использовать очищенные фракции паразита, содержащие различные паразитарные антигены. Полученные результаты демонстрируют, что экстракты LRP не распознаются сыворотками от собак, инфицированных T. cruzi или T. gondii, в то время как некоторые из этих сывороток показали высокую реактивность в отношении SLA.

Диагностическая специфичность теста должна также сохраняться, когда сыворотку получают от привитых собак. В связи с существованием лицензированных коммерческих вакцин (15, 29) будет желательно отличать инфицированных собак от привитых животных. Полученные результаты показывают, что, в то время как некоторые из животных, привитых Leishmune®, все же проявили некоторую реактивность в отношении LRP, никто из животных, привитых Leishtec®, этого не проявил. В совокупности представленные в настоящем описании результаты показывают, что экстракты LRP могут рассматриваться в качестве представляющей интерес альтернативы для применения в диагностическом анализе ELISA для CVL и, главным образом, у бессимптомных животных для эпидемиологических исследований в эндемических областях.

ТАБЛИЦА 1
Чувствительность и специфичность анализов ELISA с использованием LRP и SLA для серодиагностики симптоматического CVL   LRP SLA Чувствительность^a 100% (0/72) 96% (3/72) Специфичность^b 98,2% (1/56) 100% (0/56) PVP^c 98,6% 100% PVN^d 100% 94,9% ^a Чувствительность рассчитывали из уравнения
[(истинно положительные/(истинно положительные+ложноотрицательные)×100]. Указано число ложноотрицательных.
^b Специфичность рассчитывали из уравнения
[(истинно отрицательные/(истинно отрицательные+ложноположительные)×100]. Указано число ложноположительных.
^c PVP. Прогностическую ценность положительного результата рассчитывали из уравнения
[(истинно положительные/(истинно положительные+ложноположительные)×100].
^d Чувствительность рассчитывали из уравнения
[(истинно отрицательные/(истинно отрицательные+истинно отрицательные)×100].

Ссылки

1. Alvar, J., С. Canavate, R. Molina, J. Moreno, and J. Nieto. 2004. Canine leishmaniasis. Adv Parasitol 57:1-88.

2. Badaro, R., D. Benson, M.C. Eulalio, M. Freire, S. Cunha, E.M. Netto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J.M. Burns, R.L. Houghton, J.R. David, and S.G. Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. J Infect Dis 173:758-61.

3. Baneth, G., A.F. Koutinas, L. Solano-Gallego, P. Bourdeau, and L. Ferrer. 2008. Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends Parasitol 24:324-30.

4. Barbiéri, Ñ. L. 2006. Immunology of canine leishmaniasis. Parasite Immunol 15 28:329-37.

5. Barbosa-De-Deus, R., M.L. Dos Mares-Guia, A.Z. Nunes, K.M. Costa, R.G. Junqueira, W. Mayrink, O. Genaro, and C.A. Tavares. 2002. Leishmania major-like antigen for specific and sensitive serodiagnosis of human and canine visceral leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol 9:1361-6.

6. Boarino, A., A. Scalone, L. Gradoni, E. Ferroglio, F. Vitale, R. Zanatta, M.G. Giuffrida, and S. Rosati. 2005. Development of recombinant chimeric antigen expressing immunodominant В epitopes of Leishmania infantum for serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol 12:647-53.

7. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of 25 microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54.

8. Cabrera, G.P., V.O. Da Silva, R.T. Da Costa, A.B. Reis, W. Mayrink, O. Genaro, and Ñ.B. Palatnik-de-Sousa. 1999. The fucose-mannose ligand-ELISA in the diagnosis and prognosis of canine visceral leishmaniasis in Brazil. Am J Trop Med Hyg 61:296-301.

9. Cardoso, L., H.D. Schallig, F. Neto, N. Kroon, and M. Rodrigues. 2004. Serological survey of Leishmania infection in dogs from the municipality of Peso da Regua (Alto Douro, Portugal) using the direct agglutination test (DAT) and fast agglutination screening test (FAST). Acta Trop 91:95-100.

10. Carvalho, F.A., H. Charest, C.A. Tavares, G. Matlashewski, E.P. Valente, A. Rabello, R.T. Gazzinelli, and A.P. Fernandes. 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani A2 antigen. Diagn Microbiol Infect Dis 43:289-95.

11. Ciaramella, P., G. Oliva, R.D. Luna, L. Gradoni, R. Ambrosio, L. Cortese, A. Scalone, and A. Persechino. 1997. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet Ree 141:539-43.

12. Coelho, E.A., C.A. Tavares, F.A. Carvalho, K.F. Chaves, K.N. Teixeira, R.C. Rodrigues, H. Charest, G. Matlashewski, R.T. Gazzinelli, and A.P. Fernandes. 2003. Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect Immun 71:3988-94.

13. Chang, K.P., and B.S. McGwire. 2002. Molecular determinants and regulation of Leishmania virulence. Kinetoplastid Biol Dis 1:1.

14. Chang, K.P., S.G. Reed, B.S. McGwire, and L. Soong. 2003. Leishmania 20 model for microbial virulence: the relevance of parasite multiplication and pathoantigenicity. Acta Trop 85:375-90.

15. Fernandes, A.P., M.M. Costa, E.A. Coelho, M.S. Michalick, E. de Freitas, M.N. Melo, W. Luiz Tafuri, M. Resende Dde, V. Hermont, F. Abrantes Cde, and R.T. Gazzinelli. 2008. Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein. Vaccine 26:5888-95.

16. Ferreira Ede, C., M. de Lana, M. Carneiro, A.B. Reis, D.V. Paes, E.S. da Silva, H. Schallig, and Ñ.M. Gontijo. 2007. Comparison of serological assays for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in animals presenting different clinical manifestations. Vet Parasitol 146:235-41.

17. Ferreira, W.A., W. Mayrink, M.L. dos Mares-Guia, and C.A. Tavares. 2003. Detection and characterization of leishmania antigens from an American cutaneous leishmaniasis vaccine for diagnosis of visceral leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis 45:35-43.

18. Garcia-Alonso, M., C.G. Nieto, A. Blanco, J.M. Requena, C. Alonso, and I. Navarrete. 1996. Presence of antibodies in the aqueous humour and cerebrospinal fluid during Leishmania infections in dogs. Pathological features at the central nervous system. Parasite Immunol 18:539-46.

19. Goto, Y., R.F. Howard, A. Bhatia, J. Trigo, M. Nakatani, E.M. Netto, and S.G. Reed. 2009. Distinct antigen recognition pattern during zoonotic visceral leishmaniasis in humans and dogs. Vet Parasitol 160:215-20.

20. Gramiccia, M., and L. Gradoni. 2005. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol 35:1169-80.

21. Herwaldt, B.L. 1999. Leishmaniasis. Lancet 354:1191-9.

22. Iborra, S., N. Parody, D.R. Abanades, P. Bonay, D. Prates, F.O. Novais, M. Barral-Netto, C. Alonso, and M. Soto. 2008. Vaccination with the Leishmania major ribosomal proteins plus CpG oligodeoxynucleotides induces protection against experimental cutaneous leishmaniasis in mice. Microbes Infect 10:1133-41.

23. Kar, Ê. 1995. Serodiagnosis of leishmaniasis. Crit Rev Microbiol 21:123-52.

24. Kubar, J., and K. Fragaki. 2005. Recombinant DNA-derived leishmania proteins: from the laboratory to the field. Lancet Infect Dis 5:107-14.

25. Maalej, I.A., M. Chenik, H. Louzir, A. Ben Salah, C. Bahloul, F. Amri, and K. Dellagi. 2003. Comparative evaluation of ELIS As based on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 68:312-20.

26. Mauricio, I.L., J.R. Stothard, and M. A. Miles. 2000. The strange case of Leishmania chagasi. Parasitol Today 16:188-9.

27. Miro, G., L. Cardoso, M.G. Pennisi, G. Oliva, and G. Baneth. 2008. Canine leishmaniosis-new concepts and insights on an expanding zoonosis: part two. Trends Parasitol 24:371-7.

28. Nieto, С.G., I. Navarrete, M.A. Habela, F. Serrano, and E. Redondo. 1992. Pathological changes in kidneys of dogs with natural Leishmania infection. Vet Parasitol 45:33-47.

29. Palatnik-de-Sousa, Ñ.Â. 2008. Vaccines for leishmaniasis in the fore coming 25 years. Vaccine 26:1709-24.

30. Pollock, K.G., K.S. McNeil, J.C. Mottram, R.E. Lyons, J.M. Brewer, P. Scott, G.H. Coombs, and J. Alexander. 2003. The Leishmania mexicana cysteine protease, CPB2.8, induces potent Th2 responses. J Immunol 170:1746-53.

31. Porrozzi, R., M.V. Santos da Costa, A. Teva, A. Falqueto, A.L. Ferreira, Ñ.D. dos Santos, A.P. Fernandes, R.T. Gazzinelli, A. Campos-Neto, and G. Grimaldi, Jr. 2007. Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clin Vaccine Immunol 14:544-8.

32. Rafati, S., A. Nakhaee, T. Taheri, A. Ghashghaii, A.H. Salmanian, M. Jimenez, M. Mohebali, S. Masina, and N. Fasel. 2003. Expression of cysteine proteinase type I and II of Leishmania infantum and their recognition by sera during canine and human visceral leishmaniasis. Exp Parasitol 103:143-51.

33. Reed, S.G., W.G. Shreffler, J.M. Burns, Jr., J.M. Scott, G. Orge Mda, H.W. Ghalib, M. Siddig, and R. Badaro. 1990. An improved sérodiagnostic procedure for visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 43:632-9.

34. Reis, А.В., A. Teixeira-Carvalho, A.M. Vale, M.J. Marques, R.C. Giunchetti, W. Mayrink, L.L. Guerra, R.A. Andrade, R. Correa-Oliveira, and O.A. Martins-Filho. 2006. Isotype patterns of immunoglobulins: hallmarks for clinical status and tissue parasite density in Brazilian dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi. Vet Immunol Immunopathol 112:102-16.

35. Requena, J.M., C. Alonso, and M. Soto. 2000. Evolutionarily conserved proteins as prominent immunogens during Leishmania infections. Parasitol Today 16:246-50.

36. Soto, M., J.M. Requena, L. Quijada, and C. Alonso. 1998. Multicomponent 30 chimeric antigen for serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol 36:58-63.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Применяют экстракт рибосомального белка (RPE) вида Leishmania для диагностики лейшманиоза у индивидуума, причем RPE содержит, по меньшей мере, два рибосомальных белка. Применение экстракта рибосомальных белков позволяет проводить досимптоматическую диагностику лейшманиоза. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Применение экстракта рибосомального белка (RPE) вида Leishmania для диагностики лейшманиоза у индивидуума, где RPE содержит, по меньшей мере, два рибосомальных белка и где экстракт рибосомального белка получают путем выполнения следующих стадий с использованием клетки паразита, вызывающего паразитарное заболевание, когда он присутствует у индивидуума:
a. смешивание клетки паразита с лизирующим буфером,
b. центрифугирование полученной смеси для получения цитоплазматического экстракта,
c. приготовление экстракта рибосомального белка из полученного цитоплазматического экстракта.

2. Применение по п. 1, где вид Leishmania представляет собой Leishmania major.

3. Применение по п. 1, где паразитарное заболевание вызывается видами, отличными от видов, из которых был получен экстракт рибосомального белка.

4. Способ диагностики лейшманиоза у индивидуума с использованием RPE, как определено по любому из пп. 1-3, где способ включает определение присутствия антитела, распознающего RPE, в образце, полученном от индивидуума.

5. Анализ для диагностики лейшманиоза у индивидуума, где анализ включает RPE, как определено по любому из пп. 1-3.

6. Анализ по п. 5, где анализ представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).