РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По этой заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/348978, зарегистрированной 27 мая 2010 года, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
ЗАЯВЛЕНИЕ ПРАВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СОЗДАННЫЕ В ХОДЕ СПОНСИРУЕМОГО ГОСУДАРСТВОМ ИССЛЕДОВАНИЯ
Это изобретение создали при поддержке грантов правительства R01 CA 107098 и R01 CA110246, присужденных Национальным Институтом Здоровья. Государство обладает некоторыми правами на изобретение.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании, главным образом, представлена серия новых макроциклических депсипептидных соединений с ингибиторными свойствами в отношении гистондеацетилаз (HDAC). В частности, в настоящем описании описаны соединения, пригодные для использования для селективной остановки роста клеток, стимуляции терминальной дифференцировки и/или инициации апоптоза опухолевых клеток, таким образом, ингибирования их пролиферации. В описании представлены способы получения этих новых макроциклических соединений, фармацевтических композиций и способов лечения, включающих селективное ингибирование изоформ HDAC, приводящее к направленной терапии злокачественного новообразования. Соединения по изобретению также можно применять в лечении заболеваний, запускаемых дисрегуляцией HDAC, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания и различные заболевания центральной нервной системы.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Показано, что ларгазол, циклический депсипептид, исходно выделенный из морской цианобактерии Symploca sp., является противоопухолевым средством (Taori et al., 2008). Ларгазол специфически воздействует на гистондеацетилазы, дисфункция которых часто ассоциирована с множеством опухолей человека. Показано, что ларгазол (i) демонстрирует значения GI50 по отношению к множеству клеточных линий в нМ (например, клетки карциномы молочной железы MDA-MB-231, GI50=7,7 нМ; фибробластные клетки остеосаркомы U2OS, GI50=55 нМ; клетки толстого кишечника HT29, GI50=12 нМ; клетки нейробластомы IMR-32 (Taori et al., 2008), GI50=16 нМ) (Taori et al., 2008), (ii) демонстрирует дифференциальную активность по отношению к трансформированным и нетрансформированные клеткам (Nasveschuk et al., 2008; Taori et al., 2008; Ungermannova 2010) и (iii) является структурно более простым и, вероятно, более легко получаемым синтетически, чем другие депсипептиды.
Хотя доказано, что молекула ларгазола является противоопухолевым средством, всегда существует потребность в улучшенных структурных аналогах, приводящих к улучшению ингибиторных свойств в отношении HDAC, токсичности и физико-химических профилей, что приводит к улучшению способов терапии злокачественных новообразований.
В течение многих лет было известно, что DMSO и бутират, два известных относительно неспецифичных ингибитора HDAC, могут индуцировать дифференцировку определенных лейкозных клеток и подавлять неопластический рост (Sato et al., 1971; Leder et al., 1975).
В последние годы HDAC и гистонацетилазы (HAT) общепринято считают ключевыми факторами в регуляции транскрипции (Minucci и Pelicci 2006). Ацетилирование лизинов в хвостах гистонов H3 и гистонов H4 четко коррелирует с состоянием хроматина, готового к транскрипции или являющегося частью активно транскрибируемых областей генома (Allfrey et al., 1964). Ацетилирование гистонов также коррелирует с другими важными функциями клетки, включая сборку хроматина, репарацию ДНК и рекомбинацию.
В геноме человека существуют гены 18 ферментов HDAC, которые можно разделять на четыре класса (Lane и Chabner 2009). Классы I, II и IV содержат молекулу цинка (Zn2+) в своем активном центре (таблица 1 из (Lane и Chabner 2009)).
По причине своей важной роли в регуляции транскрипции и нарушений их регуляции в опухолевых клетках предполагают, что ингибирование HDAC может являться эффективным способом терапии злокачественных новообразований. Таким образом, достигнут значительный прогресс в отношении ингибиторов ферментов HDAC (HDACi) в качестве потенциальных противоопухолевых лекарственных средств (Marks). Такое внимания к HDACi оправдано, и его клиническая значимость недавно была подтверждена внедрением в конце 2006 года вориностата (Zolinza™ Merck, также широко известного как SAHA = субероиланилид гидроксамовой кислоты) для лечения кожной T-клеточной лимфомы и, недавно, ромидепсина (FK228) (Marks).
Каталитическая активность HDAC включает свойства и сериновой протеазы, и металлопротеазы. На основе структуры кристалла HDAC8 и бактериального гистондеацетилаза-подобного белка (HDLP) были предложены механизмы реакции деацетилирования (Finnin et al., 1999; Somoza et al., 2004; Vannini et al., 2004). Существует глубокий трубчатый узкий карман, расширяющийся книзу, и внутренняя полость, граничащая с карманом (фигура 1.1). Внутренняя часть трубы состоит из гидрофобных и ароматических остатков. Ион цинка расположен в нижней части кармана, и Zn2+ и His142, действуя как общее основание, активируют молекулу воды для нуклеофильной атаки на карбонильную группу субстрата. Это будет приводить к образованию тетраэдрического углерода, стабилизируемого образованием водородной связи с Tyr306, а общая кислота His143 протонирует уходящую группу лизина, приводя к образованию продуктов - ацетата и лизина. И His142, и His143 входят в систему переноса заряда Asp 166-His 131, которая, как предполагают, модулирует основность остатков His (фигура 1.4) (Finnin et al., 1999).
Механизмом действия большинства ингибиторов HDAC является имитация взаимодействия субстрата с деацетилазой, таким образом предотвращающая вход ацетилированного остатка лизина, локализованного на хвосте гистонового белка. Все низкомолекулярные ингибиторы гистондеацетилаз обладают тремя структурными элементами, участвующими в ингибировании HDAC: (1) распознающий поверхность домен, заякоренный на краю трубчатого кармана HDAC, (2) участок связывания цинка, (3) линкерная область, связывающая распознающий поверхность домен с участком связывания цинка (Finnin et al., 1999). На фигуре 1.5 (из (Newkirk et al., 2009)) представлена общая фармакофорная модель нескольких известных ингибиторов HDAC.
Хотя SAHA проявляет свою противоопухолевую активность, по меньшей мере, частично модуляцией HDAC напрямую посредством координации иона Zn2+ в активном центре фермента через концевую гидроксамовую кислоту, он демонстрирует плохую селективность среди 3 классов HDAC частично по причине простоты своей структуры (Minucci и Pelicci 2006; Lane и Chabner 2009). Общепринято считают, что HDAC класса I более важны для терапии злокачественных новообразований, и плохая селективность ингибиторов HDAC ответственна за хроническую токсичность (Minucci и Pelicci 2006; Lane и Chabner 2009). Поиск более специфичных ингибиторов HDAC класса I привел к открытию ряда природных депсипептидов, включая FR901375 (Koho 1991), FK228 (Ueda et al., 1994a), спирухостатин A (Masuoka et al., 2001) и недавно выделенный ларгазол (Taori et al., 2008) (фигура 2). Эти природные продукты, известные как депсипептиды, обладают общим свойством - все они содержат боковую цепь (3S,4E)-3-гидрокси-7-меркапто-4-гептеновой кислоты (Newkirk et al., 2009). Свободный сульфгидрил (тиол) должен подвергаться воздействию этого класса соединений для осуществления ингибиторной активности в отношении HDAC, так как тиол координирует ион Zn2+ в активном центре для предотвращения катализа.
Zn2+-связывающая часть ларгазола неактивна до удаления тиоэфира гидролизом. Показано, что ларгазол-тиол является активным веществом, потенциально ингибирующим HDAC (Bowers et al., 2008; Ying et al., 2008b). Таким образом, наиболее вероятно, ларгазол является пролекарством, активируемым эстеразой/липазами после захвата клетками или конъюгированным с носителем/транспортным белком и восстанавливаемым до тиола внутриклеточно. Произошел значительный прогресс в дизайне пролекарств для улучшения физико-химических и фармакокинетических свойств биологически активных веществ-прототипов (Rautio et al., 2008). Однако эти стратегии не применяли к ларгазолу систематически.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области терапии злокачественных новообразований. В частности, изобретение относится к новым макроциклическим соединениям и содержащим их фармацевтическим композициям. Кроме того, изобретение относится к новому способу получения и применения этих соединений. Эти макроциклические соединения являются ингибиторами HDAC и применимы в качестве антипролиферативных средств для терапии рака. Способы, представленные в настоящем описании, позволяли устанавливать соединения, обладающие селективностью при воздействии на HDAC при противораковой терапии. Эти соединения воздействуют на HDAC, дисфункция которых часто ассоциирована с различными опухолями человека (Marks и Breslow 2007).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)
,
где
"A" представляет собой арил или гетероарил, необязательно, замещенный одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
Z представляет собой -(CH2)nSR12;
R1 и R2 независимо представляют собой H, галоген, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или R1 и R2 вместе,
или один из R1, R2 вместе с R9 образуют C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил и C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R3 и R4 независимо представляют собой H, галоген, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или R3 и R4 вместе,
или один из R3, R4 вместе с R10 образуют C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил и C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещают одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22, -S(O)mR20;
R5 и R6 независимо представляют собой H, галоген, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или R5 и R6 вместе,
или один из R5, R6 вместе с R11 образуют C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R7 и R8 независимо представляют собой H, галогеновую группу, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или R5 и R6 совместно образуют C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R9 независимо представляет собой H, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или вместе с одним из R1, R2 образует C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R10 независимо представляет собой H, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или вместе с одним из R3, R4 образует C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R11 независимо представляет собой H, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил,
или вместе с одним из R5, R6 образует C3-C8-циклоалкил, C3-C8-гетероциклоалкил,
где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C8-алкила, C3-C8-циклоалкила, C3-C8-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;
R12 независимо представляет собой H, C1-C10-алкил, -COR20, -CONR20R22, -OR20, -COOR20, -COCR20R22NR20R22, -SR20, -P(O)(OR24)2;
R20 и R22 независимо представляют собой H, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, арил или гетероарил;
R24 независимо представляет собой H, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, Na, K или Ca;
n=1-6
m=1 или 2;
или их фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям формулы (II)
,
где
L и Q независимо представляют собой S, O, N или CR26;
R26 независимо представляет собой H, галоген, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, арил, гетероарил, где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, арил и гетероарил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, - NCOR20R22, -CONR20R22;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 и Z являются такими, как описано выше;
или их фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединениям формулы (III)
,
где
L, Q и Y независимо представляют собой S, O, N, или CR26;
R26 независимо представляет собой H, галоген, C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, арил, гетероарил, где C1-C10-алкил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-гетероциклоалкил, арил и гетероарил, необязательно, замещен одной или несколькими группами, выбранными из C1-C10-алкила, C3-C10-циклоалкила, C3-C10-гетероциклоалкила, арила, гетероарила, галогена, гидроксила, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, - NCOR20R22, -CONR20R22;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 и Z являются такими, как описано выше;
или их фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (IV)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (V)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (VI)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (VII)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (VIII)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (IX)
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (X)
,
где A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 и n являются такими, как описано выше;
или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату, пролекарству или стереоизомеру.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям соединений или фармацевтически приемлемых солей одного или нескольких соединений, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемого носителя.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний, опосредуемых ферментами HDAC, включающим введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, представленных в настоящем описании. Другие способы включают способы комбинированной терапии посредством введения одного или нескольких соединений по настоящему изобретению с другими противораковыми средствами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 изображена потенциальная роль HAT и HDAC в регуляции транскрипции.
A) Модификация гистонов HAT и HDAC.
B) Регуляция экспрессии генов переключается комплексом коактиватора или корепрессора. Фигура и описание взяты из (Kim et al., 2003).
На фигуре 2 представлено несколько вариантов комплексов HDLP-TSA.
A) Представление заполнения пространства TSA в кармане активного центра. Группа гидроксамовой кислоты, большая часть алифатической цепи и часть диметиламинофенильной группы TSA находятся в глубине (60% площади поверхности TSA).
B) Схематичное представление взаимодействий HDLP-TSA. оба изображения и часть описания взяты из (Finnin et al., 1999).
На фигуре 3 представлен предполагаемый механизм действия цинк-зависимых HDAC.
На фигуре 4 представлен один из вариантов осуществления фармакофора HDACi. Область кэпа сверху; линкер внизу с цинк-связывающей частью. Фигура и описание взяты из (Newkirk et al., 2009).
Фигура 5. Природные депсипептидные ингибиторы HDAC. Представлен ключевой тиолсодержащий домен.
На фигуре 6 изображена возможная активация ларгазола и FK228 для осуществления ингибирования HDAC. Ларгазол является пролекарством, превращающимся после гидролиза в соответствующий тиол, инактивирующий HDAC посредством выведения цинка из активного центра фермента путем образования хелатного комплекса. Аналогично, восстановление дисульфидной связи в FK228 высвобождает тиол, потенциально ингибирующий HDAC.
На фигуре 7 представлены структуры ларгазола и нескольких структурных аналогов ларгазола. Пример 1 также обозначают как CGN 552.
На фигуре 8 представлены примерные данные, показывающие, что ларгазол, его селективные аналоги и SAHA стимулируют гиперацетилирование H3 в линии злокачественных клеток HCT 116.
a) Ларгазол (L) и SAHA ингибируют деацетилирование H3 в зависимости от времени. Клетки HCT 116 обрабатывали 10 нМ ларгазолом или 200 нМ SAHA в течение времени, указанного на фигуре. Экстракты клеток разделяли электрофорезом в ПААГ в присутствие SDS и определяли получаемые полосы с использованием антител против ацетил-H3. Обработанные DMSO клетки служили отрицательным контролем, в то время как экспрессию GAPDH использовали в качестве контроля для демонстрации стабильной экспрессии.
b) Клетки HCT 116 отвечали на ларгазол, его селективные аналоги и SAHA доза-зависимым образом. Клетки обрабатывали указанным соединением в течение 8 часов с концентрациями в диапазоне от 1/мкМ до 100 нМ и подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против ацетилгистона H3. CGN-722, CGN-552 и CGN-596 являются немного более активными ингибиторами деацетилаз, чем ларгазол (L) и SAHA. Превращение сложного тиоэфира в кетон (CGN-363) делает соединение неактивным в отношении ингибирования HDAC.
На фигуре 9 представлены данные анализа с использованием ДНК-микрочипа, показывающие, что SAHA, ларгазол и его выбранный аналог по примеру 1 вызывают четкие изменения в профилях экспрессии генов в линии раковых клеток HCT116, a) иерархическая кластеризация и тепловые карты изменений профилей экспрессии генов в клетках HCT116 с указанной обработкой, b) диаграммы Венна, на которых показаны наборы уникальных и общих генов, уровни экспрессии которых изменялись более чем в 2 раза после подвергания указанной обработке через 6 часов и 24 часа.
В таблице 1 представлена классификация изоформ HDAC. Класс I состоит из HDAC 1, 2, 3 и 8. Класс II состоит из HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10.
В таблице 2 представлены примерные данные, показывающие эффект ларгазола, аналогов ларгазола вместе с примерами соединений по настоящему изобретению на ингибирование роста раковых клеток.
Сравнительный анализ цитотоксического эффекта ларгазола на линии раковых клеток человека HCT116, SW480 и MDA-MB231. HME использовали в качестве контроля. 8000 клеток помещали в 96-луночные планшеты, где ряды 1 и 10 обрабатывали DMSO, ряд 2 не содержал клеток для определения фоновых уровней, ряды 3-9 содержали повышенные концентрации соединения. Клетки инкубировали с ларгазолом в течение 48 часов с последующим окрашиванием красителем кристалл-виолет. Поглощение при 588 нМ измеряли с использованием спектрофотометра Tecan Safire II для чтения планшетов. Эксперименты осуществляли в шести повторениях и получали кривые концентрация-ответ с помощью анализа данных нелинейной регрессией методом наименьших квадратов с использованием GraphPad Prism (San Diego, CA). Ингибирование роста (GI50) для каждого соединения определяли как концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50% снижению A588 по сравнению с контролями.
В таблице 3 представленная сумма количеств генов, уровни экспрессии которых изменялись в 2 раза после обработки указанными химическими веществами по сравнению с DMSO. Файлы с величинами экспрессии для каждого образца получали с использованием алгоритма Robust Multichip Average (RMA). Дифференциальную экспрессию определяли с использованием пакета программ R limma для получения линейных моделей и эмпирической байесовой статистики. Гены считали дифференциально экспрессирующимися, если значение P, скорректированное для многократного тестирования с использованием метода Бенджамини-Хохберга, составляло <5%, и log 2-кратного изменения составлял ≤1 или ≥-1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Следующее ниже описание является исключительно иллюстративным и не предназначено для ограничения настоящего описания, заявки или применения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Как применяют в настоящем описании, термин "замена для" относится к смене введения субъекту первого соединения или лекарственного средства на введение субъекту второго соединения или лекарственного средства. Например, экстракт кратома может являться заменой соединению, вызывающему привыкание, таким образом, что субъекту будут вводить экстракт кратома вместо соединения, вызывающего зависимость.
Как применяют в настоящем описании, термин "с риском" относится к медицинскому состоянию или набору медицинских состояний, развившихся у пациента, которые могут предрасполагать пациента к конкретному заболеванию или нарушению. Например, эти состояния могут возникать по причине факторов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, поведенческие, эмоциональные, химические, биохимические или воздействия окружающей среды.
Как применяют в настоящем описании, термин "эффективное количество" относится к конкретному количеству фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое средство, помогающее достигать клинически благоприятного эффекта (т.е., например, снижения симптомов). Токсичность и терапевтическую эффективность таких композиций можно определять стандартными фармацевтическими способами на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение доз между токсическими и терапевтическими эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как отношение LD50/ED50. Предпочтительны соединения, проявляющие большие терапевтические индексы. Данные, полученные при анализах этих культур клеток и дополнительных исследованиях на животных, можно использовать при составлении диапазона дозировок для применения у человека. Дозы таких соединений предпочтительно лежат в диапазоне концентраций в кровотоке, включающем ED50 с небольшой токсичностью или без нее. Дозы варьируются в этом диапазоне в зависимости от используемой лекарственной формы, чувствительности пациента и пути введения.
Как применяют в настоящем описании, термин "симптом" относится к любому субъективному или объективному доказательству заболевания или физического нарушения, наблюдаемого пациентом. Например, субъективное доказательство, как правило, зависит от самообследования пациента и может включать, в качестве неограничивающих примеров, боль, головную боль, зрительные нарушения, тошноту и/или рвоту. Альтернативно, объективное доказательство, как правило, является результатом медицинского тестирования, включая, в качестве неограничивающих примеров, температуру тела, клинический анализ крови, липидный спектр, исследование гормональной активности щитовидной железы, артериальное давление, частоту сердечных сокращений, электрокардиограмму, визуализацию тканей тела и результаты других медицинских тестов.
Как применяют в настоящем описании, термин "заболевание" относится к любому нарушению нормального состояния живого животного, в целом или одной из его частей, нарушающему или модифицирующему осуществление жизнедеятельности. Обычно проявляющееся отличительными признаками и симптомами, оно, как правило, является ответом на i) факторы внешней среды (например, неправильное питание, промышленное загрязнение или климат); ii) конкретные инфекционные агенты (например, червей, бактерий или вирусы); iii) наследственные дефекты организма (например, генетические аномалии); и/или iv) комбинации этих факторов.
Термины "уменьшать", "ингибировать", "ослаблять", "подавлять", "снижать", "предотвращать" и грамматические эквиваленты (включая "ниже", "меньше" и т.д.) по отношению к проявлению любого симптома у не подвергнутого лечению субъекта относительно подвергнутого лечению субъекта означает, что количество и/или сила симптомов у подвергнутого лечению субъекта ниже, чем у не подвергнутого лечению субъекта на любое количество, признанное клинически значимым любым медицинским персоналом. В одном из вариантов осуществления количество и/или сила симптомов у подвергнутого лечению субъекта составляет по меньшей мере на 10% ниже, по меньшей мере на 25% ниже, по меньшей мере на 50% ниже, по меньшей мере на 75% ниже и/или по меньшей мере на 90% ниже, чем количество и/или сила симптомов у не подвергнутого лечению субъекта.
Как применяют в настоящем описании, термин "ингибирующее соединение" относится к любому соединению, способному взаимодействовать (т.е., например, прикрепляться, связываться и т.д.) с партнером по связыванию в таких условиях, что партнер по связыванию перестает отвечать на свои природные лиганды. Ингибирующие соединения могут включать в качестве неограничивающих примеров небольшие органические молекулы, антитела и белки/пептиды.
Как применяют в настоящем описании, термин "прикрепленный" относится к любому взаимодействию между средой (или носителем) и лекарственным средством. Прикрепление может являться обратимым или необратимым. Такое прикрепление включает, в качестве неограничивающих примеров, ковалентную связь, ионную связь, ван-дер-ваальсовы силы или силы трения и т.п. Лекарственное средство прикрепляют к среде (или носителю), если оно вкраплено, включено, покрыто, находится в суспензии, в растворе, смешано и т.д.
Как применяют в настоящем описании, термин "лекарственное средство" или "соединение" относится к любому фармакологически активному веществу, которое можно вводить и достигать желаемого эффекта. Лекарственные средства или соединения могут являться синтетическими или природными, непептидными, белками или пептидами, олигонуклеотидами или нуклеотидами, полисахаридами или сахарами.
Как применяют в настоящем описании, термин "вводимый" или "введение" относится к любому способу предоставления композиции пациенту таким образом, что композиция оказывает свой предполагаемый эффект на пациента. Примером способа введения является прямой механизм, такой как, местное введение в ткань (т.е., например, внесосудистое введение), пероральное введение, трансдермальный пластырь, местное введение, ингаляция, использование суппозиториев и т.д.
Как применяют в настоящем описании, термин "пациент" означает человека или животное, не нуждающихся в госпитализации. Например, амбулаторные пациенты, субъекты в домах престарелых или инвалиды с медицинским обслуживанием являются "пациентами". Пациент может представлять собой человека или не являющееся человеком животное любого возраста и, таким образом, включает и взрослые, и молодые особи (т.е. детей). Не следует понимать, что термин "пациент" имеет дополнительно значение, относящееся к потребности в медицинской помощи, таким образом, пациент может вольно или невольно являться частью экспериментальных работ, клинических или в поддержку исследований в области фундаментальных наук.
Как применяют в настоящем описании, термин "субъект" относится к позвоночному, предпочтительно - млекопитающему, более предпочтительно - примату, еще более предпочтительно - человеку. Млекопитающие включают, в качестве неограничивающих примеров, людей, приматов, диких животных, одичавших животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных.
Как применяют в настоящем описании, термин "сродство", относится к любой силе притяжения между веществами или частицами, заставляющей их вступать в химическую комбинацию и оставаться в ней. Например, соединение-ингибитор, обладающее высоким сродством к рецептору, будет обеспечивать большую эффективность в предотвращении взаимодействия рецептора с его природными лигандами, чем ингибитор с низким сродством.
Как применяют в настоящем описании, термин "полученный из" относится к источнику соединения или последовательности. С одной стороны, соединение или последовательность можно получать из организма или конкретных видов. С другой стороны, соединение или последовательность можно получать из большего комплекса или последовательности.
Как применяют в настоящем описании, термин "тестируемое соединение" относится к любому соединению или молекуле, признанным кандидатом для ингибирующего соединения.
Как применяют в настоящем описании, термин "белок" относится к любому из многочисленных природных крайне сложных веществ (например, ферменту или антителу), состоящему из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, содержащими элементы углерод, водород, азот, кислород, как правило, серу. В основном, белок содержит аминокислоты в количестве порядка сотен.
Как применяют в настоящем описании, термин "пептид" относится к любому из многочисленных амидов, получаемых из двух или более аминокислот комбинацией аминогруппы одной кислоты с карбоксильной группой другой и, как правило, получаемых частичным гидролизом белков. В основном, пептид содержит аминокислоты в количестве порядка десятков.
Как применяют в настоящем описании, термин "фармацевтически" или "фармакологически приемлемый" относится к молекулам и композициям, не вызывающим побочные, аллергические или другие неблагоприятные реакции при введении животному или человеку.
Как применяют в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой растворитель и все растворители или дисперсионную среду, включая, в качестве неограничивающих примеров, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси, и растительные масла, покрытия, изотоничные и замедляющие всасывание средства, липосомы, коммерчески доступные очищающие средства и т.п. В такие носители также можно включать дополнительные биоактивные ингредиенты.
Как применяют в настоящем описании, термин "очищенный" или "выделенный" может относится к композиции пептидов, подвергнутой обработке (т.е., например, фракционированию) для удаления различных других компонентов и, по существу, сохраняющей свою выраженную биологическую активность.
Как применяют в настоящем описании, термин "образец" используют в его широчайшем смысле, и он включает природные и биологические образцы. Природные образцы включают материал из окружающей среды, такой как грунт и вода. Биологические образцы могут являться животным, включая человека, жидкостью (например, кровью, плазмой и сывороткой), твердым веществом (например, фекалиями), тканью, жидкой пищей (например, молоком) и твердой пищей (например, овощами). Например, с помощью бронхоальвеолярного лаважа (BAL) можно получать образец из легкого, содержащий жидкость и клетки, происходящие из ткани легкого. Биологический образец может содержать клетки, экстракт ткани, биологическую жидкость, хромосомы или внехромосомные элементы, выделенные из клетки, геномную ДНК (в растворе или связанную с твердой подложкой, такой как подложка для анализа Саузерн-блоттингом), РНК (в растворе или связанную с твердой подложкой, такой как подложка для анализа нозерн-блоттингом), кДНК (в растворе или связанную с твердой подложкой) и т.п.
Термин "биологически активный" относится к любой молекуле, имеющей структурные, регуляторные или биохимические функции. Например, биологическую активность можно определять, например, восстановлением роста, характерного для дикого типа, в клетках с недостаточной активностью белка. Клетки с недостаточной активностью белка можно получать многими способами (т.е., например, точковой мутацией и мутацией со сдвигом рамки считывания). Комплементации достигают трансфекцией клеток с недостаточной активностью белка с использованием экспрессирующего вектора, с которого экспрессируется белок, его производное или его часть.
В настоящем описании термин "метка" или "детектируемая метка" используют в отношении любой композиции, детектируемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. Такие метки включают биотин для окрашивания меченым конъюгатом стрептавидина, магнитные бусы (например, Dynabeads®), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и т.п.), радиоактивные метки (например, 3H, 125I, 35S, 14C или 32P), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие общеупотребительные в ELISA ферменты) и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластиковые бусы (например, из полистирола, полипропилена, латекса и т.д.). Патенты, в которых описывают применение таких меток, включают, в качестве неограничивающих примеров, патенты США № 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241 (все включены в настоящий документ в качестве ссылки). Метки, предусмотренные в настоящем изобретении, можно определять многочисленными способами. Например, радиоактивные метки можно определять с использованием фотопленки или сцинтилляционных счетчиков, флуоресцентные маркеры можно определять с использованием фотоэлемента для определения излучаемого света. Ферментные метки, как правило, определяют добавлением к ферменту субстрата и определение продуктов реакции, получаемых при воздействии фермента на субстрат, и калориметрические метки определяют, просто визуализируя цветную метку.
Как применяют в настоящем описании, термин "конъюгат", относится к любому соединению, образованному при соединении двух или более веществ.
"Группировка" или "группа" представляет собой любой тип молекулярной группировки, обозначенной формулой, химическим названием или структурой. В контексте конкретных вариантов осуществления конъюгат, как указано, содержит одну или несколько группировок или химических групп. Это означает, что формулу группировки в некотором месте заменяют, чтобы связать, и быть частью молекулярной группировки конъюгата. Хотя группировки можно ковалентно соединять напрямую, не следует понимать, что соединение двух или более группировок друг с другом должно являться прямым. Линкерная группа, группа для перекрестной сшивки или соединяющая группа относится к любой молекулярной группировке, которая будет соединять группировки ковалентными связями, например, в качестве неограничивающих примеров, одна или несколько амидных групп может соединять группировки. Кроме того, хотя он может являться незамещенным, конъюгат может иметь множество дополнительных заместителей, соединенных с линкерной группой и/или соединенных с группировками.
"Полимер" или "полимерная группа означает химические вещества или группу, полученную из повторяющихся соединенных группировок. В определенных вариантах осуществления предпочтительно, чтобы количество повторяющихся группировок составляло три или более или больше 10. Соединенные остатки могут являться идентичными по структуре или могут иметь изменения в структуре группировки. "Мономерный полимер" или "гомополимер" является полимером, содержащим одинаковые повторяющиеся асимметричные субъединицы. "Сополимер" является полимером, получаемым из двух или более типов мономерных веществ, т.е. двух или более отличающихся химических асимметричных субъединиц. "Блок-сополимеры" являются полимерами, состоящими из полимерных субъединиц двух или более веществ, соединенных ковалентными связями.
Как применяют в настоящем описании, термин "замещенный" означает, что по меньшей мере один атом водорода в молекулярной группировке заменяют заместителем. В случае заместителя оксо ("=O") заменяют два атома водорода. При замещении одна или несколько указанных групп являются "заместителями". Заместители включают, в качестве неограничивающих примеров, галоген, гидрокси-, оксо-, циано-, нитро-, амино-, алкиламино-, диалкиламиногруппу, алкильную, алкоксигруппу, алкилтиольную, галогеналкильную, арильную, арилалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, гетероциклическую и гетероциклалкильную группу, а также, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -NRaC(=O)NRaNRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaSO2Rb, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -OR, -SR, -SORo, -S(=O)aR, -OS(=O)2Ra и -S(=O)ORa. Кроме того, указанные выше заместители можно дополнительно замещать одним или несколькими из указанных выше заместителей таким образом, что заместитель содержит замещенный алкил, замещенный арил, замещенный арилалкил, замещенный гетероцикл или замещенный гетероциклоалкил. В этом контексте Ra и Rb могут являться одинаковыми или отличаться и независимо представлять собой водород, алкил, галогеналкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, арилалкил, замещенный арилалкил, гетероцикл, замещенный гетероцикл, гетероциклоалкил или замещенный гетероциклоалкил.
Как применяют в настоящем описании, термин "незамещенный" относится к любому соединению, не содержащему дополнительных заместителей, присоединенных к соединению. Незамещенное соединение относится к химическому составу соединения без дополнительных заместителей, например, соединение не содержит защитные группы. Например, незамещенным пролином является аминокислота пролин, даже если аминогруппу пролина можно считать дизамещенной алкильными группами.
Как применяют в настоящем описании, термин "алкил" означает любой неразветвленный или разветвленный, нециклический или циклический, ненасыщенный или насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, в то время как термин "низший алкил" обладает тем же значением, что и алкил, но низший алкил содержит от 1 до 6 атомов углерода. Термин "высший алкил" обладает тем же значением, что и алкил, но высший алкил содержит от 2 до 10 атомов углерода. Типичные насыщенные неразветвленные алкилы включают, в качестве неограничивающих примеров, метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил и т.п.; в то время как насыщенные разветвленные алкилы включают, в качестве неограничивающих примеров, изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Циклические алкилы можно получать соединением двух алкильных групп, соединенных с одним атомом, или соединением двух алкильных групп, каждая из которых соединена с примыкающими атомами. Типичные насыщенные циклические алкилы включают, в качестве неограничивающих примеров, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; в то время как ненасыщенные циклические алкилы включают, в качестве неограничивающих примеров, циклопентенил и циклогексенил и т.п. В настоящем описании циклические алкилы обозначают как "гомоциклы" или "гомоциклические кольца". Ненасыщенные алкилы содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь между смежными атомами углерода (обозначают как "алкенил" или "алкинил", соответственно). Типичные неразветвленные и разветвленные алкенилы включают, в качестве неограничивающих примеров, этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и т.п.; в то время как типичные неразветвленные и разветвленные алкинилы включают, в качестве неограничивающих примеров, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил, и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "арил" означает любой ароматический карбоциклический фрагмент, в качестве неограничивающих примеров, такой как, фенил или нафтил.
Как применяют в настоящем описании, термин "арилалкил" или "аралкил" означает любой алкил, у которого по меньшей мере один атом водорода в алкиле заменен арильной группой, такой как бензил, в качестве неограничивающих примеров, -(CH2)2-фенил, -(CH2)3-фенил, -CH(фенил)2 и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "галогеновая группа" относится к любой из групп фтора, хлора, брома или йода.
Как применяют в настоящем описании, термин "галогеналкил" относится к любому алкилу, у которого по меньшей мере один атом водорода заменен галогеновой группой, такой как трифторметил и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "гетероарил" относится к любому ароматическому гетероциклическому кольцу из 5-10 членов, имеющему по меньшей мере один гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы, и содержащий по меньшей мере 1 атом углерода, включая, в качестве неограничивающих примеров, моно- и бициклическические системы ядер. Типичные гетероарилы включают, в качестве неограничивающих примеров, фурил, бензофуранил, тиофенил, бензотиофенил, пирролил, индолил, изоиндолил, азаиндолил, пиридил, хинолинил, изохинолинил, оксазолил, изоксазолил, бензоксазолил, пиразолил, имидазолил, бензимидазолил, тиазолил, бензотиазолил, изотиазолил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, циннолинил, фталазинил или хиназолинил.
Как применяют в настоящем описании, термин "гетероарилалкил" означает любой алкил, в котором по меньшей мере один атом водорода в алкиле заменен гетероарильной группой, такой как -CH-пиридинил, CH2-пиримидинил и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "гетероцикл" или "гетероциклическое кольцо" означает любое 4-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, являющееся насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, и содержащее от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы, необязательно, могут являться окисленными, и гетероатом азота, необязательно, может являться четвертичным, включая бициклические кольца, в которых любой из указанных выше гетероциклов конденсирован с бензольным кольцом. Гетероцикл можно присоединять через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы могут включать гетероарилы, примеры которых представлены выше. Таким образом, в дополнение к указанным выше гетероарилам, гетероциклы также могут включать, в качестве неограничивающих примеров, морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "гетероциклоалкил" означает любой алкил, в котором по меньшей мере один атом водорода в алкиле заменен гетероциклом, таким как -CH2-морфолинил и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "гомоцикл" или "циклоалкил" означает любое насыщенное или ненасыщенное (но не ароматическое) карбоциклическое кольцо, содержащее 3-7 атомов углерода, в качестве неограничивающих примеров, такой как, циклопропан, циклобутан, циклопентан, циклогексан, циклогептан, циклогексен и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "алкиламино" означает по меньшей мере одну алкильную группу, присоединенную через азотный мостик (т.е. -N-(алкил)N, такой как диалкиламиногруппа)), включая, в качестве неограничивающих примеров, метиламино-, этиламино-, диметиламино-, диэтиламиногруппу и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "алкилокси" или "алкокси" означает любую алкильную группу, присоединенную через кислородный мостик (т.е. -O-алкил), в качестве неограничивающих примеров, такую как, метокси, этоксигруппу и т.п.
Как применяют в настоящем описании, термин "алкилтио", означает любую алкильную группу, прикрепленную через серный мостик (т.е. -S-алкил), в качестве неограничивающих примеров, такую как, метилтио-, этилтиогруппу и т.п.
Термин "алкенил" означает неразветвленную или разветвленную углеводную цепь, содержащую одну или несколько двойных связей. Двойная связь алкенильной группы может являться неконъюгированной или конъюгированной с другой ненасыщенной группой. Подходящие алкенильные группы включают, в качестве неограничивающих примеров винил, аллил, бутенил, пентенил, гексенил, бутадиенил, пентадиенил, гексадиенил, 2-этилгексенил, 2-пропил-2-бутенил, 4-(2-метил-3-бутен)-пентенил. Алкенильная группа может являться незамещенной или замещенной одним или двумя подходящими заместителями.
Термин "алкинил" означает неразветвленную или разветвленную углеводную цепь, содержащую одну или несколько тройных связей. Тройная связь в алкинильной группе может являться неконъюгированной или конъюгированной с другой ненасыщенной группой. Подходящие алкинильные группы включают, в качестве неограничивающих примеров этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, метилпропинил, 4-метил-1-бутинил, 4-пропил-2-пентинил- и 4-бутил-2-гексинил. Алкинильная группа может являться незамещенной или замещенной одним или двумя подходящими заместителями.
Как применяют в настоящем описании, термин "соли" относится к любой соли, образующей комплексы с определенными соединениями, представленными в настоящем описании. Примеры таких солей включают, в качестве неограничивающих примеров, кислые соли присоединения, образованные с неорганическими кислотами (например, соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п.), и соли, образованные с органическими кислотами, в качестве неограничивающих примеров, такими как, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, таниновая кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота и полигалактуроновая кислота. Солевые соединения также можно вводить как фармацевтически приемлемые четвертичные соли, известные специалисту в этой области, конкретно, включающие четвертичные соли аммония формулы -NR,R',R"+Z-, где R, R', R", независимо, представляют собой водород, алкил или бензил, и Z представляет собой противоион, включая, в качестве неограничивающих примеров, хлорид, бромид, йодид, алкоксид, толуолсульфонат, метилсульфонат, сульфонат, фосфат или карбоксилат (такой как бензоат, сукцинат, ацетат, гликолят, малеат, малат, фумарат, цитрат, тартрат, аскорбат, циннамат, манделат и дифенилацетат). Солевые соединения также можно вводить как фармацевтически приемлемые соли пиридиния, имеющие замещенную или незамещенную частичную формулу: где Z представляет собой противоион, включая, в качестве неограничивающих примеров, хлорид, бромид, йодид, алкоксид, толуолсульфонат, метилсульфонат, сульфонат, фосфат, или карбоксилат (такой как бензоат, сукцинат, ацетат, гликолят, малеат, малат, фумарат, цитрат, тартрат, аскорбат, циннамат, манделат и дифенилацетат).
Как применяют в настоящем описании, термин "пролекарство" относится к производному соединения, которое может подвергаться гидролизу, окисляться или иным способом реагировать в биологических условиях (in vitro или in vivo) для получения соединения по изобретению. Пролекарства могут становиться активными только после некоторой реакции в биологических условиях, но они могут обладать активностью в своих непрореагировавших формах. Примеры пролекарств, приведенные в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, аналоги или производные соединений по изобретению и/или их соли, если возможно образование соли, а в частности, производные цинк-связывающей тиольной группировки. Примеры фрагментов пролекарств включают замещенные и незамещенные, разветвленные или неразветвленные группировки сложных эфиров низших алкилов (например, сложных эфиров пропионовой кислоты), сложных эфиров низших алкенилов, сложных эфиров динизших алкиламино-низших алкилов (например, диметиламиноэтиловый сложный эфир), сложных эфиров ациламино-низших алкилов (например, ацетилоксиметиловый сложный эфир), сложных эфиров ацилокси-низших алкилов (например, пивалоилоксиметиловый сложный эфир), арильных сложных эфиров (фениловый сложный эфир), сложных эфиров арил-низших алкилов (например, бензиловый сложный эфир), гетероарильных сложных эфиров (никотинатный сложный эфир), замещенных (например, метилом, галогеновой группой или метоксизаместителями) арильных сложных эфиров и сложных эфиров арил-низших алкилов, амиды, амиды низших алкилов, амиды динизших алкилов и гидроксиамиды, природные сложные эфиры аминокислот или их энантиомеры, дипептидные сложные эфиры, фосфоэфиры, метоксифосфоэфиры, дисульфиды и дисульфидные димеры. Пролекарства и их применение хорошо известны в этой области (см., например, Berge et al., 1977). Как правило, пролекарства можно получать с использованием хорошо известных способов, таких как описываемые в Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (Manfred E. Wolff ed.1995) и (Rautio, 2008).
Как применяют в настоящем описании, "реакционноспособные группы" относятся к нуклеофилам, электрофилам или радикально-активным группам, т.е. группам, реагирующим в присутствии радикалов. Нуклеофил является группировкой, образующей химическую связь со своим партнером по реакции (электрофилом), выступая в качестве донора обоих электронов связи. Электрофилы принимают эти электроны. Нуклеофилы могут участвовать в нуклеофильной замене, в результате чего нуклеофил привлекается полным или частичным положительным зарядом на элементе и замещает группу, с которой он связан. Альтернативно, нуклеофилы могут участвовать в замещении карбонильной группы. Карбоновые кислоты часто делают электрофильными, получая сукцинильные сложные эфиры и проводя реакцию этих сложных эфиров с аминоалкилами для образования амидов. Другими общепринятыми нуклеофильными группами являются тиолалкилы, гидроксилалкилы, первичные и вторичные амины и углеродные нуклеофилы, такие как енолы и алкильные комплексные соединения с металлами. Другие предпочтительные способы лигандирования белков, олигосахаридов и клеток с использованием реакционноспособных групп описаны в (Lemieux и Bertozzi 1998), включенном в настоящий документ в качестве ссылки. В другом предпочтительном способе используют реакционноспособные группы для реакции Штаудингера, т.е. "клик-химии" с азидсодержащей группировкой и алкинильными реакционноспособными группами для образования триазолов. Также можно использовать реакцию Майкла между углеродным нуклеофилом енолятом с электрофильным карбонилом или образование оснований Шиффа нуклеофильного первичного или вторичного амина с альдегидом или кетоном. Другие способы биоконъюгации представлены в (Hang и Bertozzi 2001) и (Kiick et al., 2002), включенных в качестве ссылки.
Как применяют в настоящем описании, термин "биосовместимый" относится к любому материалу, не вызывающему значительный неблагоприятный ответ у хозяина. Всегда существуют опасения, что, когда объект попадает в живой организм, он будет вызывать реакцию иммунной системы, такую как воспалительный ответ, который будет оказывать отрицательные эффекты на хозяина. В контексте настоящего изобретения биосовместимость оценивают в соответствии с применением, для которого его осуществляют: например, бандаж должен являться биосовместимым с кожей, в то время как имплантируемое медицинское устройство должно являться биосовместимым с внутренними тканями организма. Предпочтительно биосовместимый материалы включают, в качестве неограничивающих примеров, биодеградируемые и биостабильные материалы. Значительный неблагоприятный ответ не возникает, если имплант, содержащий материал, находится рядом с участком имплантации в животном-хозяине, и ответ лучше, чем ответ ткани, понимаемый и считающийся подходящим ответом на материалы, одобренные ASTM. Подкомитет ASTM F04.16 по способам тестирования биосовместимости разработал стандарты биосовместимости для медицинских и хирургических материалов и устройств. Например, материалы для использования в контакте с кровеносной системой должны состоять из материалов, соответствующих стандартам гемосовместимости. Один из этих тестов является тестом на повреждение эритроцитов, что может приводить к гемолизу, т.е. повреждению клеток, как описано в F 756 Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials, включенном в настоящий документ в качестве ссылки.
Как применяют в настоящем описании, "биоактивное вещество" относится к любому из множества химических веществ, связывающихся с биомолекулой, в качестве неограничивающих примеров, такой как пептиды, белки, ферменты, рецепторы, субстраты, липиды, антитела, антигены и нуклеиновые кислоты. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления биоактивное вещество является биомолекулой, но биоактивное вещество не ограничено биомолекулами. В других предпочтительных вариантах осуществления биоактивные вещества обеспечивают гидрофобные, гидрофильные или электростатические взаимодействия, например, поликарбоновые кислоты, являющиеся анионными при физиологическом pH. В другом предпочтительном варианте осуществления щелочные факторы роста (с изоэлектрической точкой выше 7) удерживаются поликарбоксилатами посредством соответствующих электростатических взаимодействий и затем контролируемо и медленно высвобождаются.
"Рак" представляет собой термин, используемый для заболеваний, при которых аномальные клетки бесконтрольно делятся и способны осуществлять инвазию в другие ткани. Существует более 100 различных типов рака. Большинство видов рака называют по органу или типу клеток, в котором оно начинается, например, рак, начинающийся в толстом кишечнике, называют раком толстого кишечника; рак, начинающийся в базальных клетках кожи, называют базальноклеточной карциномой. Основные категории видов рака включают карциномы, саркомы, лейкозы, лимфомы и миеломы и виды рака центральной нервной системы. Некоторые общепринятые типы рака включают, в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстого и прямого кишечника, рак эндометрия, рак почек (почечноклеточный), лейкоз, рак легких, меланому, неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи (не меланома) и рак щитовидной железы. В одном из вариантов осуществления виды рака, предлагаемые для лечения по настоящему описанию, включают рак толстого кишечника и рак молочной железы.
Термины "содержит", "содержащий" предназначены, чтобы иметь широкий смысл, закрепленный за ними в патентном праве США, и могут означать "включает", "включающий" и т.п.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приблизительно в январе 2008 года ларгазол выделили из цианобактерии рода Symploca, и назвали в честь их местонахождения Key Largo (Luesch et al., University of Florida). Соединение проявляет антипролиферативную активность в трансформированных клетках эпителия молочной железы линии MDA-MB231 с GI50 7,7 нМ (Taori et al., 2008). Кроме того, ларгазол преимущественно действует на злокачественное новообразование по сравнению с нормальными клетками, что делает это "морское" вещество важной целью синтеза, а также потенциально значимым хемотерапевтическим средством против рака (Taori et al., 2008). Первое сообщение о синтезе ларгазола сделали Luesch с соавторами (Ying et al., 2008b), а затем группа Phillips (Nasveschuk et al., 2008), группа Cramer (Seiser et al., 2008), группа Williams (Bowers et al., 2008) и группа Ghosh (Ghosh и Kulkarni, 2008). Предполагают, что молекулярной основой его противоопухолевой активности является ингибирование гистондеацетилаз (HDAC) (Ying et al., 2008b).
Предполагают, что ингибиторы HDAC являются новым классом активных противоопухолевых средств для лечения солидных опухолей и гемобластозов. Существующие в настоящее время ингибиторы HDAC, такие как бутират натрия, трихостатин A (TSA), субероиланилид-гидроксамовая кислота (SAHA), FK228 и другие, могут проявлять свой противоопухолевый эффект, регулируя гены и их белковые продукты, необходимые для остановки клеточного цикла, репарации повреждений ДНК, удаления свободных радикалов и апоптоза (Marks, 2010). Например, SAHA одобрен для лечения кожной T-клеточной лимфомы на поздней стадии (Marks, 2007). Несколько других ингибиторов HDAC в настоящее время находятся на клинических испытаниях для лечения злокачественных опухолей (Marks, 2010).
Структура ларгазола содержит 16-членный макроцикл, содержащий 4-метилтиазолин, конденсированный с тиазольным кольцом, и октановую тиоэфирную боковую цепь, элемент, редко обнаруживаемый в природных продуктах (Taori et al., 2008; Newkirk et al., 2009). Высказывалось предположение, что он является макроциклической частью соединения, взаимодействующего с поверхностью белка HDAC, в то время как боковая цепь входит в активный центр HDAC и хелатирует цинк, что приводит к терминации деацетилирования субстрата (Newkirk et al., 2009) (фигура 4).
Для дополнительного определения фармакофора ларгазола, очевидно, что после его входа в цитоплазму клетки, тиоэфирная группировка быстро гидролизуется для получения свободной тиольной группы, которая теперь может взаимодействовать с ионом цинка внизу кармана HDAC и активно ингибировать ферментативную активность (фигура 6).
Для подтверждения того, что ларгазол-тиол является реакционноспособной молекулой, несколько групп синтезировало тиольное производное и оценивало биохимическую активность по ингибированию роста опухолевых клеток и в клеточном анализе ингибирования HDAC или анализе ингибирования HDAC in vitro. Эти данные свидетельствуют о том, что тиольный аналог вызывает аналогичное ингибирование HDAC при использовании обработанных соединением клеточных экстрактов (Bowers et al., 2008; Ying et al., 2008a; Ying et al., 2008b). В экспериментах in vivo, когда клетки обрабатывали ларгазолом или ларгазол-тиолом, родительская молекула обладала большей активностью в отношении ингибирования HDAC (IC50 51 нМ по сравнению с 209 нМ для тиольного метаболита) (Ying et al., 2008a).
Что касается антипролиферативной активности, две группы представили противоречащие наборы данных: Ying et al. показали, что ларгазол и тиольный аналог проявляют аналогичную активность по подавлению роста в клетках HCT 116 со значениями GI50 44 и 38 нМ, соответственно (Ying et al., 2008b). Группа Williams использовала серию клеточных линий меланомы для демонстрации того, что ларгазол обладает стабильно лучшей активностью (IC50 45-315 нМ) по сравнению со своим тиольным метаболитом (IC50 380-2600 нМ). Они объясняли различие цитотоксичности лучшей проникающей способностью тиоэфира ларгазола (Bowers et al., 2008). Для измерения активности деацетилазы in vitro очищенные полноразмерные белки HDAC класса I и класса II инкубировали с субстратом, конъюгированным с флуорофором, и ларгазолом или ларгазол-тиолом. Результаты не только показали, что ларгазол сам по себе является гораздо более слабым ингибитором HDAC по сравнению с восстановленным вариантом, но также свидетельствуют о четко выраженном предпочтении ларгазола для HDAC 1, 2 и 3 по сравнению с HDAC6 (Bowers et al., 2008). В качестве объяснения отсутствия различий в анализах с использованием клеток можно предполагать, что тиоэфир расщепляется в экспериментальных условиях.
Кроме того, так как гидроксилы не хелатируют цинк, замещение -SH на -OH мешает токсическому эффекту, а также ингибирующей активности при анализе HDAC (Bowers et al., 2008); (Ying et al., 2008a)). В совокупности, тиол необходим для обеих активностей; таким образом, можно предполагать, что ингибирование HDAC стимулирует его противоопухолевый эффект. С точки зрения биосинтеза, в природе ларгазол продуцируется в качестве пролекарства чаще, чем целевая реакционноспособная молекула, для повышения его стабильности и для его защиты от нежелательного окисления (Ying et al., 2008b). Что интересно, аналогичный механизм защиты-и-высвобождения наблюдали в природном веществе FK228 (Shigematsu et al., 1994), (Ueda et al., 1994a; Ueda et al., 1994b). Это типичное циклическое соединение содержит дисульфидную связь, которая после гидролиза глутатионредуктазой до бутенилтиола распространяется на остаток цинка для терминации активности HDAC (фигура 6; и (Furumai et al., 2002)).
Получали серию аналогов для тестирования оптимальной длины октаноиловой цепи, так как она представляет собой линкер, встраиваемый в карман HDAC для образования хелатного комплекса цинка, приводящего к ослаблению биологической активности HDAC. Полагают, что ларгазол, а также FK228, встраивают 4-атомный линкер между макроциклом и связывающей цинк группой. Макроцикл без целой октаноиловой цепи не может ни ингибировать HDAC, ни обладать какой-либо токсической активностью в клетках, что дополнительно подтверждает важность тиольной группы в роли ларгазола как ингибитора HDAC. Ни укорочение, ни удлинение алифатической цепи не является благоприятной структурной модификацией, что измеряют при анализах HDAC in vivo и in vitro, а также при анализе жизнеспособности клеток по сравнению с линией клеток рака толстого кишечника HCT116 (таблица 2). Эти результаты позволяют предполагать, что природная длина "хвоста" ларгазола является оптимальной (Ying et al., 2008a; Ying et al., 2008b; Newkirk et al., 2009). Кроме того, Leusch и соавторы исследовали и сообщили о двух изменениях в области кэпа: замене валина на аланин и эпимере ларгазола (17R) (Ying et al., 2008a). Соединение с заменой Val на Ala демонстрирует 2-кратное снижение всех ингибиторных активностей по сравнению с ларгазолом, что свидетельствует о том, что остаток валина легко можно заменять. Эпимерный аналог плохо действовал в качестве ингибитора HDAC, демонстрируя важность S-конфигурации в положении C17 (Ying et al., 2008a). В последнее время все больше исследований взаимосвязи структуры и активности ларгазола осуществляли Zeng et al. (Zeng et al., 2010), где они заменяли валин лейцином и фенилаланином и наблюдали, что ингибиторная активность против нескольких линий раковых клеток немного снижалась (например, в клетках HCT116 GI50 для ларгазола составляла 80 нМ, в то время как для Leu 1 и Phe 1 измеряли 560 нМ и 260 нМ, соответственно). Что интересно, когда валин заменяли тирозином, что приводило к снижению активности против злокачественных клеток, это значительно повышало GI50 для нормальных клеток, значительно улучшая терапевтическое окно (HCT-116: GI50 0,39 мкМ; A549: GI50 1,46 мкМ) по сравнению с линиями нормальных клеток (HEK293: GI50 100 мкМ; HLF: GI50 100 мкМ, в то время как GI50 ларгазола в HEK293 составляет 1,36 мкМ и 0,98 мкМ в клетках HLF). Таким образом, предполагали, что введение Tyr в ларгазол может заставить соединение предпочтительно действовать на HDAC в злокачественных новообразованиях, вместо нормальных клеток (Zeng et al., 2010).
Таким образом, макроциклические ингибиторы HDAC, такие как ларгазол, демонстрируют потенциал в качестве инструмента для изучения биологии HDAC, в то же время, благодаря предпочтительному действию ларгазола в отношении уничтожения раковых клеток по сравнению с нормальными клетками, он обладает значительным потенциалом в качестве терапевтического средства против рака (т.е. имеет большое терапевтическое окно). Привлекательность ларгазола также заключается в том, что он высоко селективен в отношении деацетилаз класса I, что является редкостью среди ингибиторов HDAC.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу улучшения отношения структура-активность для ларгазола посредством получения аналогов ларгазола и оценки их антипролиферативных эффектов в клеточных линиях рака толстого кишечника и молочной железы.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений по настоящему изобретению для определения их ингибиторного эффекта относительно роста раковых клеток.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения активности и селективности ларгазола посредством получения 16-членного макроциклического остова.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к новым аналогам ларгазола, получаемым посредством разрыва кольца 4-метилтиазолина, приводящего к улучшению специфичности противоопухолевых эффектов, например, противоопухолевый эффект новых аналогов in vivo реализуется в эффективности, сравнимой с соединениями, где 4-метилтиазолиновое кольцо не разорвано, в то же время количество генов, на которые влияет новый аналог, составляет только 1/3 от того, что изменяли лечением ларгазолом через 24 часа. Эти данные позволяют предполагать, что новые аналоги отличаются от ларгазола и, вероятно, оказывают меньше побочных эффектов.
В еще одном варианте осуществления валин в молекуле ларгазола заменяли макроциклом с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, аланина, лейцина и изолейцина.
В еще одном варианте осуществляют замену валина глицином, улучшающую эффективность соединения-производного в 3 раза.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в дополнение к одному или нескольким соединениям, описываемым в настоящем описании, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может находиться в любой подходящей форме для желаемого пути введения. Если композиция предназначена для перорального введения, можно использовать любую подходящую вводимую перорально лекарственную форму, включая, в качестве неограничивающих примеров, таблетки, капсулы (заполненные твердым или жидким веществом), порошки, гранулы, сиропы и другие жидкости, эликсиры, ингалянты, пастилки, пластинки и растворы. Инъецируемые композиции или композиции для внутривенных вливаний также предоставляют в форме растворов, суспензий и эмульсий.
В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать одно или несколько дополнительных терапевтических средств, например, для повышения эффективности или снижения побочных эффектов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или несколько дополнительных терапевтических средств, выбранных из активных ингредиентов, применимых для лечения или ингибирования заболевания, прямо или косвенно опосредуемого HDAC. Примерами таких активных ингредиентов являются, в качестве неограничивающих примеров, средства для лечения или ингибирования рака, болезни Хантингтона, кистозного фиброза, фиброза печени, фиброза почек, легочного фиброза, фиброза кожи, ревматоидного артрита, диабета или сердечной недостаточности.
В еще одном варианте осуществления дополнительное подлежащее включению терапевтическое средство является противоопухолевым средством. Примеры противоопухолевого средства включают, в качестве неограничивающих примеров, алкилирующие средства, такие как циклофосфамид, дакарбазин, и цисплатин; антиметаболиты, такие как метотрексат, меркаптопурин, тиогуанин, фторурацил и цитарабин; растительные алкалоиды, такие как винбластин и паклитаксел; противоопухолевые антибиотики, такие как доксорубицин, блеомицин и митомицин; гормоны/антигормоны, такие как преднизон, тамоксифен и флутамид; другие типы противоопухолевых средств, такие как аспарагиназа, ритуксимаб, трастузумаб, иматиниб, ретиноевая кислота и производные, колониестимулирующие факторы, амифостин, камптотецин, топотекан, аналоги талидомида, такие как леналидомид, ингибиторы CDK, ингибитор протеасомы, такой как Велкейд, и другие ингибиторы HDAC.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования или лечения заболевания, возникающего при аномальной пролиферации клеток и/или дифференцировке у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления способ ингибирования или лечения заболевания включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких соединений по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Предназначенная для введения композиция может дополнительно содержать терапевтическое средство, такое как противоопухолевое средство.
В то время как изобретение, в частности, было представлено и описано со ссылкой на ряд вариантов осуществления, специалистам в этой области будет понятно, что можно осуществлять изменения в форме и деталях различных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, без отступления от сущности и объема изобретения, и что различные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, не предназначены для ограничения объема изобретения. Все цитируемые в настоящем описании ссылки включены в полном объеме.
СОЕДИНЕНИЯ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
В настоящем описании соединения по изобретению определяют по их химическим структурам и/или химическим названиям. Как правило, соединения по изобретению называют согласно системам номенклатуры IUPAC или CAS. Можно использовать аббревиатуры, хорошо известные специалистам в этой области. Если соединение представлено и химической структурой, и химическим названием, и химическая структура и химическое название противоречат друг другу, химическая структура является определяющей в отношении определения соединения.
Соединения формулы I по настоящему изобретению синтезируют по общей схеме, схеме I:
СХЕМА I
Промежуточную арильную или гетероарильную кислоту по общей формуле 1 и промежуточный амин по общей формуле 2 можно синтезировать хорошо известными способами, доступными в этой области, или они могут являться коммерчески доступными (Sigma-Aldrich; Advanced Chem Tech; Pep tech; Synthatech). Присоединение кислот формулы 1 и аминов формулы 2 посредством известных способов присоединения с использованием подходящих реагентов, таких как EDCI (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) или HATU (2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат) приводит к образованию амидов формулы 3. Гидролиз сложных эфиров формулы 3 приводит к образованию кислот формулы 4, которые, в свою очередь, можно присоединять к аминам формулы 5 для получения соединений формулы 6. Примерами средств для присоединения являются EDCI (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) или HATU (2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат). Гидролиз и удаление защитной аминогруппы из соединений формулы 6 с последующей макроциклизацией приводит к образованию макролактамов по общей формуле 7. Макроциклизации можно достигать посредством реакции аминокислот соединений формулы 6 без защитных групп с диизопропилэтиламином, HATU (2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфатом) в растворителе, таком как тетрагидрофуран. Реакция перекрестного метатезиса с олефинами превращает соединения формулы 7 в соединения формулы I по настоящему изобретению.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры представлены исключительно в качестве иллюстраций и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Пример 1. S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоат
Стадия 1: Получение метил-2-(2-((трет-бутоксикарбониламино)метил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метилпропаноата: В круглодонную колбу с 50 мл метиленхлорида добавляли 2-((трет-бутоксикарбониламино)метил)тиазол-4-карбоновую кислоту (2,0 г, 7,74 ммоль) и метил-2-амино-2-метилпропаноат гидрохлорид (1,25 г, 8,13 ммоль). Затем в смесь добавляли триэтиламин (5,4 мл, 38,7 ммоль), а затем 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (2,97 г, 15,5 ммоль) и гидроксибензотриазол (2,09 г, 15,5 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем смесь разбавляли метиленхлоридом. Затем смесь промывали водой и экстрагировали водный слой метиленхлоридом. Затем комбинированный органический слой высушивали с использованием Na2SO4 и фильтровали. Фильтрат концентрировали и очищали хроматографией на силикагелевой колонке, элюируя 1:1 EtOAc/гексаном для получения желаемого продукта (2,40 г, выход 87%).
Стадия 2: Получение 2-(2-((трет-бутоксикарбониламино)метил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метилпропионовой кислоты: Метил-2-(2-((трет-бутоксикарбониламино)метил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метилпропаноат (2,4 г, 6,7 ммоль) растворяли в 10 мл метанола и 3 мл воды. Затем в смесь добавляли моногидрат гидроксида лития (0,56 г, 13,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, пока TLC не показала полный расход исходного материала. В смесь добавляли воду и EtOAc и водный слой подкисляли 2 Н HCl до приблизительно pH 7. Слои разделяли и водный слой экстрагировали с использованием EtOAc. Комбинированный органический слой высушивали с использованием Na2SO4 и концентрировали для получения желаемого продукта в виде белого твердого вещества (2,3 г, количественный выход).
Стадия 3: Получение трет-бутил (3S)-3-{[(2S)-2-(2-{[2-({ [(трет-бутокси)карбонил]амино}метил)-1,3-тиазол-4-ил]формамидо}-2-метилпропанамидо)-3-метилбутаноил]окси}пент-4-еноата: В раствор 2-(2-((трет-бутоксикарбониламино)метил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метилпропионовой кислоты (1,26 г, 3,67 ммоль) в 10 мл диметилформамида добавляли HBTU (O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметил-уроний-гексафтор-фосфат) (1,67 г, 4,40 ммоль) и диизопропилэтиламин (2,0 мл, 11,0 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавляли (S)-трет-бутил-3-((S)-2-амино-3-метилбутаноилокси)пент-4-еноат (1,0 г, 3,67 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли воду и EtOAc и разделяли слои. Водный слой экстрагировали с использованием EtOAc, комбинированный органический слой высушивали с использованием Na2SO4 и концентрировали. Его очищали хроматографией на колонке, элюировали 1:1 Hex/EtOAc для получения желаемого продукта (2,1 г, выход 96%).
Стадия 4: Получение (7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-10-винил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она: Раствор (7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-10-винил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она (200 мг, 0,33 ммоль) в 10 мл метиленхлорида охлаждали до 0°C. В смесь добавляли 10 мл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1,5 часов. Смесь концентрировали и три раза подвергали азеотропной перегонке с толуолом и один раз с тетрагидрофураном для получения аминокислоты. Во вторую круглодонную колбу помещали HATU (381 мг, 1,0 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,51 мл, 2,85 ммоль) в 70 мл тетрагидрофурана. Смесь охлаждали до 0°C. Затем раствор указанной выше неочищенной аминокислоты добавляли в 14 мл тетрагидрофурана через поршневой насос в течение 8 часов. Затем реакционную смесь перемешивали в течение ночи в холодной комнате при 4°C. Затем его нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 часов. Затем реакционную смесь охлаждали водой. Слои разделяли и водный слой экстрагировали с использованием EtOAc. Комбинированный органический слой высушивали с использованием Na2SO4 и концентрировали. Смесь очищали хроматографией в силикагеле, элюировали с использованием EtOAc для получения желаемого продукта. Его дополнительно очищали обратно-фазовой хроматографией, элюировали 0-100% водой/CH3CN для получения желаемого продукта (45 мг, 32% выход).
Стадия 5: Получение (7S,10S)-10-((E)-4-бромбут-1-енил)-7-изопропил-4,4-диметил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13,2,1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она: В смесь (7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-10-винил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она (20 мг, 0,047 ммоль) в 2 мл 1,2-дихлорэтана добавляли 4-бром-1-бутен (25,6 мг, 0,19 ммоль) и катализатор Zhan-1 (3,2 мг, 0,0047 ммоль). Смесь быстро дегазировали и затем нагревали в запаянной трубке до 85°C в течение ночи. Неочищенный продукт концентрировали и пропускали через силикагелевый заполнитель для получения смеси желаемого продукта и восстановленного исходного материала (отношение 2:1). Его дополнительно очищали обратно-фазовой хроматографией, элюировали 0-80% водой/CH3CN для получения желаемого продукта (8 мг, 32% выход).
Стадия 6: Получение S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоата: В смесь (7S,10S)-10-((E)-4-бромбут-1-енил)-7-изопропил-4,4-диметил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она (15 мг, 0,028 ммоль) в 1 мл ацетона при комнатной температуре добавляли K2CO3 (16 мг, 0,12 ммоль) и октантиоевая S-кислота (14 мг, 0,085 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение четырех часов. Выпаривали растворитель. Неочищенную смесь пропускали через силикагелевый заполнитель. Ее дополнительно очищали обратно-фазовой хроматографией, элюировали 0-90% водой/CH3CN для получения желаемого продукта (4 мг, 23% выход). 1H-ЯМР (300 МГц, CDC13) δ: 8,02 (с, 1H), 7,62 (с, 1H), 6,47 (д, J=10,85 Гц, 1H), 6,33 (дд, J=8,65, 4,50 Гц, 1H), 5,83-5,67 (м, 2H), 5,64-5,56 (м, 1H), 5,18 (дд, J=17,31, 8,22 Гц, 1H), 4,64 (дд, J=9,87, 3,97 Гц, 1H), 4,37 (дд, J=17,21, 4,01 Гц, 1H), 2,87 (т, J=7,2 Гц, 2H), 2,81-2,61 (м, 2H), 2,51 (т, J=7,5 Гц, 2H), 2,30 (м, 3H), 1,90 (с, 3H), 1,59 (м, 2H), 1,57 (с, 3H), 1,27 (м, 8H), 0,88 (м, 5H), 0,69 (д, J=6,82 Гц, 3H).
Альтернативный способ получения S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)-бут-3-енилоктантиоата: В смесь (7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-10-винил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она (32,5 мг, 0,077 ммоль, полученной на стадии 4) и S-бут-3-енилоктантиоата (33 мг, 0,15 ммоль) в 1 мл дихлорэтана добавляли катализатор Grela (5 мг, 0,077 ммоль). Смесь продували аргоном в течение нескольких минут и нагревали до 85°C в течение двух часов. Добавляли дополнительный октантиоат (16,5 мг, 0,077 ммоль) и катализатор Grela (5 мг, 0,077 ммоль). Их перемешивали в течение еще двух часов. Выпаривали растворитель и очищали смесь хроматографией в силикагеле для получения желаемого продукта (21,3 мг, 46%). MS (ESI) [M+Na+]+=631,3.
Пример 2: S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енилэтантиоата
.
В смесь (7S,10S)-10-((E)-4-бромбут-1-енил)-7-изопропил-4,4-диметил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-она (20 мг, 0,038 ммоль) (полученного так же, как и на стадии 5 примера 1) в 0,5 мл ацетона при комнатной температуре добавляли K2CO3 (10,5 мг, 0,08 ммоль) и тиоуксусную кислоту (6 мг, 0,08 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Растворитель выпаривали. Неочищенную смесь очищали хроматографией в силикагеле, элюировали с использованием EtOAc, затем 10% MeOH в EtOAc для получения желаемого продукта (19 мг, 96% выход). MS (ESI) [M+Na+]+=547,2.
Пример 3: S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазаспиро[бицикло[13.2.1]октадека-[1(17),15(18)]диен-4,1'-циклопропан]-10-ил)бут-3-енилоктантиоат
.
Это соединение получали способом из примера 1 с использованием соответствующих исходных материалов. MS (ESI) [M+Na+]+=629,2.
Пример 4: S-(E)-4-((7S,10S)-4,4,7-триметил-2,5,8,12-тетраоксо-9,16-диокса-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоат
.
Это соединение получали способом из примера 1 с использованием соответствующих исходных материалов. MS (ESI) [M+Na+]+=587,3.
Пример 5: (7S,10S)-4,4-диметил-10-[(1E)-4-(октаноилсульфанил)бут-1-ен-1-ил]-7-(пропан-2-ил)-9-окса-3,6,13,19-тетраазабицикло[13.3.1]нонадека-1(18),15(19),16-триен-2,5,8,12-тетра-он
.
Это соединение получали способом из примера 1 с использованием соответствующих исходных материалов. MS (ESI) [M+Na+]+=625,3.
Пример 6: Димер (7S,10S)-7-изопропил-10-((E)-4-(((E)-4-((7R,10R)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енил)дисульфанил)бут-1-енил)-4,4-диметил-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-2,5,8,12-тетра-он
.
В раствор S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека-1(17),15(18)-диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоата (10 мг, 0,016 ммоль) в 2 мл CH3CN добавляли водный раствор NH3 (28,9%, 0,2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем добавляли дополнительные 0,2 мл водного раствора аммиака и реакционную смесь перемешивали в течение суток. Добавляли дополнительные 0,2 мл водного раствора аммиака и полученную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли дополнительные 0,1 мл водного раствора NH3 и перемешивали в течение 6 часов. Его концентрировали и остаток очищали хроматографией на силикагелевой колонке, элюировали с использованием EtOAc/MeOH (10/1). Объединяли фракции, содержащие желаемый продукт. Их снова очищали с использованием обратно-фазовой хроматографии, градиентной элюции 0-80% CH3CN/водой для получения желаемого продукта (6,5 мг, 82%). MS (ESI) [M+Na+]+=985,3.
Далее представлены неограничивающие примеры соединений формулы 1 по схеме I:
.
Далее представлены неограничивающие примеры соединений формулы 2 по схеме I:
.
Пример 7: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
Клеточные линии SW480, HCT 116 и MDA-MB231 получали в American Tissue Culture Collection. Клетки SW480 и MDA-MB231 выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, при 37°C во влажной атмосфере 5% CO2. Клетки линии HCT116 культивировали в среде МакКоя 5a [ATCC; кат. № 30-2007] с 1,5 мМ L-глутамином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой [ATCC; кат. № 30-2020]. Клетки HME (Clonetics, San Diego, CA; донор 4144) культивировали без сыворотки в рекомендованной Clonetics среде и добавках (52 мкг/мл экстракта гипофиза быка, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 0,01 мкг/мл эпидермального фактора роста человека, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина и 50 нг/мл амфотерицина-B).
Пример 8: АНАЛИЗ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК
8000 клеток различных видов рака помещали в плоскодонные 96-луночные микропланшеты. (В каждый планшет для анализа включали лунки для контроля фона без клеток, но содержащие тот же объем среды). Через 24 часа после посева добавляли новую среду. Для оценки цитотоксичности in vitro каждое соединение растворяли в DMSO, получали непосредственно перед экспериментами и разбавляли полной средой перед добавлением к культурам клеток. Затем тестируемые соединения добавляли в среду для культивирования в определенных понижающихся концентрациях (от 600 нМ до 10 нМ). Через 48 часов определяли жизнеспособность клеток с использованием красителя кристалл-виолет (Sigma-Aldrich), солюбилизированного в этаноле, и измеряли поглощение при 588 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов Tecan Safire II. Эксперименты осуществляли в шести повторениях и получали кривые концентрация-ответ посредством анализа данных нелинейной регрессией методом наименьших квадратов с использованием GraphPad Prism (San Diego, CA). Ингибирование роста (GI50) для каждого соединения определяли как концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50% снижению A588 по сравнению с контролями.
Пример 9: ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ
Для анализа вестерн-блоттинга получали тотальные белковые экстракты посредством лизиса клеток в лизирующем буфере (50 мМ Трис-Cl [pH 8,0], 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид). 50 мкг тотальных растворимых белков разделяли электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и мембрану блокировали в течение 1 часа с использованием 4% обезжиренного молока с последующей инкубацией с первичными антителами против ацетилированного гистона H3 (1:1000, Upstate, #06-599), эзрина (1:10000, Sigma, E-8897), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH; 1:20000, Santa Cruz, sc-47724), гистона H3 (H3; 1:1000, Santa Cruz, sc-8654) в течение ночи при 4°C. Затем мембраны инкубировали с конъюгированными с пероксидазой вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. Определение осуществляли с использованием Super Signal WestDura. Экспрессию эзрина и GAPDH использовали в качестве референса для нормализации экспрессии.
Пример 10: АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТА ЛАРГАЗОЛА И ЕГО АНАЛОГОВ НА РОСТ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК
8000 клеток из различных видов рака или нетрансформированных клеток помещали в плоскодонные 96-луночные микропланшеты. (В каждый планшет для анализа включали лунки для контроля фона без клеток, но содержащие тот же объем среды). Через 24 часа после посева добавляли новую среду. Для оценки цитотоксичности in vitro каждое соединение растворяли в DMSO, получали непосредственно перед экспериментами и разбавляли полной средой перед добавлением в культуры клеток. Затем в среду для культивирования добавляли тестируемые соединения в определенных понижающихся концентрациях (от 600 нМ до 10 нМ). Жизнеспособность клеток определяли через 48 часов с использованием красителя кристалл-виолет (Sigma-Aldrich), солюбилизированного в этаноле и измеряли поглощение при 588 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов Tecan Safire II. Эксперименты осуществляли в шести повторениях и получали кривые концентрация-ответ посредством анализа данных нелинейной регрессией методом наименьших квадратов с использованием GraphPad Prism (San Diego, CA). Ингибирование роста (GI50) для каждого соединения определяли как концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50% снижению A588 по сравнению с контролями.
Пример 11: ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МИКРОЧИПОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТА SAHA, ЛАРГАЗОЛА И ЕГО АНАЛОГОВ НА ПРОФИЛИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТКАХ
Клетки HCT116 высевали в трех параллелях приблизительно с 60% конфлюентностью. Через восемь часов клетки обрабатывали контролем растворителя DMSO (0,01%), SAHA (200 мкМ), ларгазолом (20 нМ) или средством по примеру 1 (20 нМ). Клетки инкубировали в течение 6 или 24 часов с последующей промывкой фосфатно-солевым буфером. Тотальную РНК выделяли с использованием набора для выделения РНК RNeasy Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA) непосредственно после промывки. Концентрацию тотальной РНК определяли с использованием спектрометра Lambda 800 UV/VIS (PerkinElmer, Waltham, MA) и обрабатывали для мечения, гибридизации, промывки и сканирования в University of Colorado-Denver Health Sciences Center. Три чипа GeneChip® Human Gene 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) использовали для каждого из моментов времени, типа клеток и обработок, всего 24 чипа. Файлы с величинами экспрессии для каждого образца получали с использованием алгоритма Robust Multichip Average (RMA). Дифференциальную экспрессию определяли с использованием пакета программ R limma для получения линейных моделей и эмпирической байесовской статистики. Гены считали дифференциально экспрессирующимися, если значение P, скорректированное для многократного тестирования с использованием метода Бенджамини-Хохберга, составляло <5%, и log 2-кратного изменения составлял ≤1 или ≥-1. Программное обеспечение GeneSpring GX (Agilent, Santa Clara, CA) использовали для иерархической кластеризации и получения тепловых карт.
ССЫЛКИ
В то время как изобретение, в частности, было представлено и описано со ссылкой на ряд вариантов осуществления, специалистам в этой области будет понятно, что можно осуществлять изменения в форме и деталях различных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, без отступления от сущности и объема изобретения, и что различные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, не предназначены для ограничения объема изобретения. Все цитируемые в настоящем описании ссылки включены в полном объеме.
2-кратное изменение
Изобретение относится к новому макроциклическому соединению общей формулы (I), обладающему ингибиторной активностью в отношении гистондеацетилаз (HDAC), фармацевтической композиции, содержащей соединение, и способу, применимому для лечения заболеваний с использованием соединения. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 ил., 11 пр.
1. Соединение формулы (I)
А представляет собой гетероарил, представляющий собой ароматическое гетероциклическое кольцо из 5-10 членов, имеющий по меньшей мере один гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы;
Z представляет собой -(СН2)nSR12;
R1 и R2 независимо представляют собой Н, C1-C10-алкил;
R3 и R4 независимо представляют собой Н, C1-C10-алкил;
или R3 и R4 вместе образуют C3-C10-циклоалкил;
R5 и R6 независимо представляют собой Н;
R7 и R8 независимо представляют собой Н;
R9 независимо представляет собой Н;
R10 независимо представляет собой Н;
R11 независимо представляет собой Н;
R12 независимо представляет собой -COR20;
R20 представляет собой C1-C10-алкил; и
n=1-6;
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п. 1, где A представляет собой 5-членное гетероарильное кольцо, содержащее по меньшей мере один атом азота.
3. Соединение по п. 1, где A представляет собой 6-членное гетероарильное кольцо, содержащее по меньшей мере один атом азота.
4. Соединение по п. 2, представленное формулой (II)
где
R1-R12, R20, z и n являются такими, как указано в п. 1;
L и Q независимо представляют собой S, О, N или CR26; и
R26 независимо представляет собой Н;
или его фармацевтически приемлемая соль.
5. Соединение по п. 2, где А представляет собой оксазол или тиазол.
6. Соединение по п. 1, выбранное из
S-(Е)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-
тетраазабицикло[13.2.1]октадека1(17),15(18)диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоата;
S-(E)-4-((7S,10S)-7-изопропил-4,4-диметил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-16-тиа-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека1(17),15(18)диен-10-ил)бут-3-енилэтантиоата;
S-(Е)-4-((7S,10S)-7-изопропил-2,5,8,12-тетраоксо-9-окса-тиа-3,6,13,18-тетраазаспиро[бицикло[13.2.1]октадека[1(17),15(18)]диен-4,1′-циклопропан]-10-ил)бут-3-енилоктантиоата; и
S-(Е)-4-((7S,10S)-4,4,7-триметил-2,5,8,12-тетраоксо-9,16-диокса-3,6,13,18-тетраазабицикло[13.2.1]октадека1(17),15(18)диен-10-ил)бут-3-енилоктантиоата;
или его фармацевтически приемлемая соль.
7. Соединение по п. 3, представленное формулой (III)
где
R1-R12, R20, Z и n являются такими, как указано в п. 1;
L, Q и Y независимо представляют собой N или CR26; и
R26 независимо представляет собой Н;
или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Соединение по п. 1, являющееся
(7S,10S)-4,4-диметил-10-[(1Е)-4-(октаноилсульфанил)бут-1-ен-1-ил)]-7-(пропан-2-ил)-9-окса-3,6,13,19-тетраазабицикло[13.3.1]нонадека-1(18),15(19),16-триен-2,5,8,12-тетра-оном;
или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Соединение формулы (IV)
или его фармацевтически приемлемая соль.
10. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, опосредованного ферментом HDAC, содержащая соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
11. Способ лечения заболевания, опосредуемого ферментами HDAC, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества соединения по п. 1.
| ИНГИБИТОРЫ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ | 2003 |
|
RU2324483C2 |
| WO 2008062201 A1, 29.05.2008 | |||
| WO 2009022182 A1, 19.02.2009 | |||
| WO 2004020460 A1, 11.03.2004 | |||
