СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА Н КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК A61K35/00 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Фактор Н принадлежит к белкам системы комплемента с концентрацией в сыворотке крови 400-800 мкг/мл. Функция его состоит в регуляции активации альтернативного пути комплемента. Отсутствие в плазме крови достаточной активности этого фактора приводит к нерегулируемой спонтанной активации комплемента с развитием воспаления и поражения собственных тканей организма. Заболевания, связанные с дефицитом активного фактора Н, включают поражения почек: атипичный гемолитикоуремический синдром [1], мембранопролиферативный гломерулонефрит [2], а также глаз - возрастная макулярная дегенерация [3]. Дефицит активности фактора Н может быть обусловлен либо пониженной продукцией активного белка, либо продукцией его мутантных форм [1-3]. Мутации затрагивают, как правило, участки молекулы фактора H, ответственные за связывание фрагмента C3b третьего компонента комплемента. Важным функциональным свойством фактора H является способность связываться с этим фрагментом, поскольку фактор Н является кофактором протеолитического расщепления C3b фактором I, которое необходимо для регуляции образования С5-конвертазы - основного фермента, ответственного за воспаление и лизис клеток. Таким образом, определение активности фактора Н (в частности, по его способности связывать C3b) необходимо для диагностики ряда тяжелых заболеваний и выявления их причины.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови, а также их функциональной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Для количественного определения содержания фактора Н в сыворотке крови имеются коммерческие ИФА системы. Однако определение функциональной активности фактора Н в литературе не описано.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.

Поставленная задача достигается путем разработки иммуноферментного способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели IgG антител к фактору Н, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный фактор H, проведение инкубации, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок внесение в лунки микропанели препарата компонента С3 [4], неизбежно содержащего фрагмент C3b, а также «C3b-подобный» белок - С3(H₂O) [5, 6], образующиеся в результате спонтанной инактивации компонента С3, и после очередной промывки лунок определение количества связавшегося компонента C3b с активными молекулами фактора H на поверхности лунок с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Метод основан на способности функционально активного фактора Н связываться с C3b или С3(H₂O) [6].

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка иммуноферментного способа и набора для определения функциональной активности фактора Н, позволяющих при сравнении с результатами количественного определения содержания фактора Н в тех же образцах диагностировать наличие мутантных форм этого белка с измененной функциональной активностью.

Пример 1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.

IgG-антитела к фактору Н в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной концентрацией 15-50 мкг/мл, вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, (ЗФР) по 250 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый фактор Н в подходящем разведении в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл препарата компонента С3 человека, в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата антител против С3 с пероксидазой. По окончании инкубации в течение 1 ч при 37°С удаляют содержимое лунок и промывают пять раз по 200 мкл буфером ЗФР-Твин. Вносят в каждую лунку по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного фактора Н рассчитывают по стандартной кривой (рис. 1). На рис.1 представлено определение функциональной активности фактора H комплемента человека методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора H.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированными антителами к фактору Н, препарат компонента С3 комплемента человека, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора H человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора Н с коэффициентом корреляции R²=0,99, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора H заявленным способом в концентрациях от 5 нг/мл с использованием описанного набора.

Кроме того, для проверки адекватности метода было проведено сравнение активностей фактора Н в сыворотках крови 6 пациентов, у четырех из которых генетическими исследованиями были выявлены мутации фактора Н, и в пуле 10 сывороток здоровых доноров крови. Определение количественного содержания фактора Н во всех исследованных сыворотках было проведено с использованием коммерческой тест-системы («Фактор Н системы комплемента, кат. номер HK342-01» - Набор реагентов для количественного определения фактора Н системы комплемента методом иммуноферментного анализа, БИОХИММАК, Москва). Во всех сыворотках количество фактора Н было примерно одинаково и составляло 790±180 мкг/мл.

Результаты определений приведены в таблице 1. Как следует из данных таблицы, низкая активность фактора Н была обнаружена только в сыворотках крови, содержащих мутантный фактор Н.

Таблица 1. Определение активности фактора Н в сыворотках крови пациентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Westra D., Vernon K.A., Volokhina E.B., Pickering M.C., van de Kar N.C., van den Heuvel L.P. Atypical hemolytic uremic syndrome and genetic aberrations in the complement factor H-related 5 gene // J. Hum. Genet. 2012. V. 57. P. 459-464.

2. Wong E.K., Anderson H.E., Herbert A.P., Challis R.C., Brown P., Reis G.S., Tellez J.O., Strain L., Fluck N., Humphrey A., Macleod A., Richards A., Ahlert D., Santibanez-Koref M., Barlow P.N., Marchbank K.J., Harris C.L., Goodship Т.Н., Kavanagh D. Characterization of a Factor H Mutation That Perturbs the Alternative Pathway of Complement in a Family with Membranoproliferative GN // J. Am. Soc. Nephrol. 2014. Apr 10. [Epub ahead of print].

3. Hoffman J.D., Cooke Bailey J.N., D'Aoust L.N., Cade W., Ayala-Haedo J., Fuzzell M.D., Laux R.A., Adams L., Reinhart-Mercer L., Caywood L., Whitehead-Gay P., Agarwal A., Wang G., Scott W.K., Pericak-Vance M., Haines J.L. Rare Complement Factor H Variant Associated with Age-related Macular Degeneration in the Amish // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2014. Jun 6. pii: IOVS-13-13684. doi: 10.1167 / iovs. 13-13684. [Epub ahead of print].

4. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Мишин А.А., Гузова В.А., Баталова Т.Н., Лысакова С.В. Способ получения компонента С3 комплемента человека. Патент РФ №2144365. 20.01.2000. Бюл. №2.

5. Andersson J., Ekdahl K.N., Larsson R., Nilsson U.R., Nilsson В. С3 Adsorbed to a Polymer Surface Can Form an Initiating Alternative Pathway // J. Immunology. 2002. V. 168. P. 5786-5791.

6. Oran A.E., Isenman D.E. Identification of residues within the 727-767 segment of human complement component C3 important for its interaction with factor H and with complement receptor 1 (CR1, CD35) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5120-5130.

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах, а также набору для определения функциональной активности фактора Н комплемента человека. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют IgG антитела к фактору Н, затем вносят в лунки микропанели пробу, содержащую определяемый функционально активный фактор H, проводят инкубацию, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок вносят в лунки микропанели препарат компонента С3 и после очередной инкубации и промывки лунок определяют количество связавшегося компонента С3 с активными молекулами фактора Н с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Расчет активности фактора Н проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность фактора Н комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности фактора H комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели IgG-антитела к фактору Н, затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую фактор Н с неизвестной активностью, проводят инкубацию, в процессе которой фактор Н связывается с сорбированными в лунках микропанели IgG-антителами, выливают содержимое лунок, а затем вносят в них препарат компонента С3 человека и после инкубации и отмывки определяют количество связавшегося С3 с помощью конъюгата фермента с антителами к компоненту С3 и субстратного буфера для этого фермента, после чего проводят расчет активности фактора Н по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека, связанного с сорбированными в лунках микропанели антителами к нему, отличающийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированными антителами к фактору Н, препарат компонента С3 человека, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 человека, субстратный буфер и стандарт для расчета активности фактора Н.