СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ C1 ИНГИБИТОРА, ПРОЯВЛЯЕМОЙ В ОБОИХ ПУТЯХ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 G01N33/535 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

С1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, C1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - XIa, XIIa, XIIf и плазмина (фибринолизина) [1]. Была также обнаружена его способность ингибировать сериновые протеиназы лектинового пути комплемента [2]. Однако недавно была открыта новая функция С1 ингибитора - его способность регулировать альтернативный путь комплемента путем взаимодействия с компонентом C3b комплемента и ингибирования связывания фактора В комплемента с C3b [3]. Эта функция химически отлична от уже известной, так как при ее осуществлении С1 ингибитор не блокирует ковалентно-активный центр сериновых протеиназ, как это было во всех описанных выше случаях, а связывается нековалентно с компонентом C3b, ингибируя образование или дестабилизируя комплекс последнего с фактором В [3].

Дефицит этого ингибитора в крови больного приводит к периодическим отекам, затрагивающим главным образом конечности, лицо, гортань и слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

Наследственный дефицит С1 ингибитора бывает двух типов. Тип I обусловлен низкими концентрациями С1 ингибитора. При типе II продуцируется С1 ингибитор с пониженной или отсутствующей функциональной активностью, но в нормальной или повышенной концентрации [4]. Поскольку тип II обусловлен мутациями гена С1 ингибитора, такие мутации на обеих функциональных активностях С1 ингибитора могут сказываться по-разному. Таким образом, в настоящее время известно, что С1 ингибитор может связываться с сериновыми протеиназами ковалентно (например, с компонентами C1s и C1r комплемента или с фибринолизином [5], образуя сложноэфирную связь карбоксильной группы ингибитора с гидроксильной группой серина активного центра протеиназы и ингибируя классический путь активации комплемента. Кроме того, известно, что С1 ингибитор может связываться нековалентно с компонентом C3b комплемента, блокируя его взаимодействие с фактором В и ингибируя альтернативный путь активации комплемента. Находятся ли эти два участка взаимодействия С1 ингибитора с комплементом в одном месте молекулы ингибитора или пространственно разнесены и могут взаимодействовать независимо, в литературе неизвестно. При существовании независимых участков взаимодействия С1 ингибитора с компонентами комплемента C1s и C3b возможно создание способа определения активности С1 ингибитора, при котором С1 ингибитор будет одновременно связан с обоими компонентами или с веществами, их имитирующими.

Задачей заявленного изобретения является создание способа и набора для иммуноферментного определения минимальной из активностей С1 ингибитора по классическому и альтернативному путям с использованием простых и доступных средств без специфических антител.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения С1 ингибитора, который предусматривает связывание в лунках микропанели компонента C3b, инкубацию в лунках образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор человека, и определение связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата сериновой протеиназы с ферментом и субстрата для этого фермента.

Для фиксации в лунках микропанели C3b проводят сорбцию аптечного препарата КИП (комплексный иммуноглобулиновый препарат, состоящий из иммуноглобулинов G, А и М человека). Было показано (см. табл.1), что в образцах коммерческого препарата КИП содержится компонент С3 комплемента человека в следовых количествах, которые оказались достаточными для специфического связывания С1 ингибитора.

Таблица 1 Содержание компонента С3 в различных сериях коммерческого препарата комплексного иммуноглобулинового препарата Образец Белок, мг/мл С3, мкг/мг белка 1 56,6 3,83 2 63,4 2,52 3 35,1 2,27 4 54,3 0,09 5 26,0 6,10 6 61,6 3,89

Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным C3b в виде препарата КИП, конъюгат фермента с сериновой протеиназой, субстратный буфер и стандарт для активного С1 ингибитора.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения С1 ингибитора, обладающего одновременно обеими комплементингибирующими активностями с использованием в качестве источника компонента C3b комплемента аптечного препарата КИП (комплексный иммуноглобулиновый препарат, состоящий из иммуноглобулинов G, А и М человека), который, как было обнаружено, содержит компонент C3b комплемента человека, а для определения связавшегося С1 ингибитора используют конъюгат аптечного препарата фибринолизина с пероксидазой хрена. Таким образом, при реализации этого способа нет необходимости в получении специфических антител, можно использовать доступные аптечные препараты, а сам способ дает ответ на вопрос о наличии дефицита активности С1 ингибитора, независимо от того, обусловлен ли этот дефицит активностью С1 ингибитора в классическом или альтернативном путях комплемента.

Пример 1. Определение активности С1 ингибитора, проявляемой в обоих путях активации комплемента. Растворяют фармакопейный препарат КИП в концентрации 40 мкг/мл в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят анализируемые пробы, содержащие С1 ингибитор с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером (ЗФР), рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с фармакопейным препаратом фибринолизина в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (чертеж).

На чертеже изображено определение активности С1 ингибитора, проявляемой в обоих путях активации комплемента.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения активности С1 ингибитора, проявляемой в обоих путях активации комплемента.

Набор для определения минимальной из комплемент ингибирующих активностей С1 ингибитора. Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным компонентом C3b, конъюгат фермента с сериновой протеиназой, субстратный буфер и стандарт с известной активностью С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,99, что позволяет достоверно определять активность С1 ингибитора, проявляемую в обоих путях активации комплемента в концентрациях от 1,5 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. 3rd. С1 inhibitor and hereditary angioneurotic edema. Ann. Rev. Immunol. 1988. V.66. P.595-628.

2. Matsushita M., Thiel S., Jensenius J.C., Terai I., Fujita T. Proteolytic activities of two types of mannosebinding lectin-associated serine protease. J. Immunol. 2000. V.165. P.2637-2642.

3. Jiang H., Wagner E., Zhang H., Frank M.M. Complement 1 inhibitor is a regulator of the alternative complement pathway. J Exp Med. 2001. V.194. P.1609-1616.

4. Андина С.С., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества С1 ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков. Биомедицинская химия. 2004. Т.50. №1. С.86-91.

5. Козлов Л.В., Андина С.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н. Способ определение функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека. Патент РФ №2195662. Бюл. №36. 27.12.2002.

Способ по изобретению предусматривает сорбцию в лунках микропанели для иммуноферментного анализа аптечного препарата КИП, содержащего компонент С3b комплемента. Затем в лунки вносят раствор анализируемой пробы, содержащей С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной активностью. Проводят инкубацию, затем сушат и отмывают планшет, в лунки вносят конъюгат фермента с сериновой протеиназой в виде аптечного препарата фибринолизина и субстрат этого фермента. По количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции рассчитывают содержание активного С1 ингибитора. Набор для осуществления способа содержит плоскодонную микропанель со связанным С3b, конъюгат фермента с сериновой протеиназой, субстратный буфер этого фермента и стандарт для активного С1 ингибитора. Использование способа по изобретению позволит определять активность С1 ингибитора, одновременно связанного как с ингибированием сериновых протеиназ, так и ингибированием связывания фактора В комплемента с компонентом С3b комплемента. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ иммуноферментного определения активности С1 ингибитора, проявляемой в обоих путях активации комплемента, отличающийся тем, что в лунках микропанели для иммуноферментного анализа сорбируют С3b в виде аптечного препарата КИП, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с сериновой протеиназой в виде аптечного препарата фибринолизина и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет содержания активного С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения активности С1 ингибитора, проявляемой в обоих путях активации комплемента, отличающийся тем, что набор содержит плоскодонную микропанель со связанным компонентом комплемента С3b, конъюгат фермента с сериновой протеиназой, субстратный буфер и стандарт для активного С1 ингибитора.