СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 A61P31/12 

Изобретение относится к способу оценки противооспенной активности экстренно-профилактических препаратов с использованием высоковирулентного штамма Ind-3а вируса натуральной оспы (ВНО) и инбредных разнополых мышей иммунодефицитной линии SCID (мыши SCID) и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

Для оценки эффективности противооспенных лечебных и профилактических препаратов необходимо получение данных об их защитных свойствах в экспериментах на животных. При этом необходимо, чтобы течение заболевания, вызванного ВНО, у этих животных максимально близко воспроизводило таковое у человека. Но найти вид животного, который бы в полной мере отвечал данному требованию, крайне сложно, так как патогенный потенциал этого возбудителя заболевания в отличие от других патогенов бактериальной и вирусной природы направлен строго на человека.

Тем не менее, известна модель для НО (аналог) - это культуры клеток, чувствительные к этому возбудителю заболевания: первичные и перевиваемые клеточные культуры различного происхождения, полученные от человека (фибробласты эмбриона человека, почки, амниотическая ткань), обезьяны, свиньи и другие, которые используются для оценки эффективности лечебно-профилактических препаратов против этого заболевания.

Однако культуры клеток применяют только в качестве предварительного теста при оценке эффективности лечебно-профилактических препаратов, так как они не воспроизводят какие-либо существующие интегративные процессы (иммунологические, гемопоэтические, гормональные и др.), происходящие внутри макроорганизма, так или иначе связанные с течением инфекционного заболевания. Кроме того, использование первичных культур клеток, приготовленных из органов мишеней чувствительного к патогену животного, сопряжено с существенным ограничением, обусловленным короткой продолжительностью их жизни (до 3-7 сут) и неоднородностью (внутри каждого вида клеток) их функционального со временем увядающего состояния. В связи с чем соединения, отклоненные на основе результатов, полученных в опытах in vitro, могут быть эффективными при испытаниях in vivo и, таким образом, при использовании культуры клеток можно получить как ложноположительный результат (препарат показывает положительный эффект на культуре клеток, но не обладает лечебно-профилактической активностью в отношении человека), так и ложноотрицательный (препарат не обладает активностью на культуре клеток, но успешно защищает человека от заболевания). Вакцинные же препараты не могут быть адекватно оценены на культуре клеток, так как их основная задача - формирование иммунного ответа организма, который трудно (невозможно) воспроизвести на культурах клеток. В связи с этим в настоящее время существуют требования российского национального органа контроля (НЦ ЭСМП), а также Управления по лекарственным препаратам и продовольственным продуктам США (FDA) и Европейского агентства по контролю лекарственных средств (ЕМА) иметь не менее двух видов животных, моделирующих соответствующее инфекционное заболевание у человека, для осуществления оценки лечебно-профилактической эффективности разрабатываемых противовирусных препаратов.

Несмотря на большие сложности, которые возникли с подбором модельных животных для НО, подавляющее большинство ученых при проведении исследований в этом направлении приняло за основу только необходимость воспроизведения клинической картины заболевания у человека. Но больших успехов здесь также добиться не удалось, и вся широта такого поиска ограничилась лишь отрядом приматов.

Известной моделью животного применительно к НО (аналог) является макака циномолгус (М. fascicularis, синоним - М. irus), проявляющая при инфицировании клинические признаки заболевания, сходные с таковыми у человекам, и которая используется для оценки лечебной (терапевтической) эффективности противооспенных препаратов (Jahrling Р.В., Hensley L.E., Martinez M.J., Leduc J.W., Rubins K.H., Relman D.A., Huggins J.W. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a model for human smallpox // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 (42): 15196-200; Huggins J., Goff A., Hensley L., Mucker E., Shamblin J., Wlazlowski C., Johnson W., Chapman J., Larsen Т., Twenhafel N., Karem K., Damon I.K., Byrd С.М., Bolken T.C., Jordan R., and Hruby D. Nonhuman primates are protected from smallpox virus or monkeypox virus challenges by the antiviral drug ST-246. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2009; 53 (6): 2620-25).

Однако данное модельное животное является крайне дорогостоящим и применение его в вирусологических экспериментах сопряжено с большой трудоемкостью, что существенно затрудняет его использование в крупномасштабных статистически значимых экспериментах по оценке эффективности разрабатываемых препаратов. Кроме того, несмотря на относительно близкую к человеку клиническую картину заболевания, вызванного ВНО у этих приматов, они от 100000 до 1000000 раз менее чувствительны к данному вирусу, чем человек. При этом инфицирование приматов часто осуществляется внутривенным методом, тогда как основные пути заражения человека ВНО реализуются через первичное попадание патогена в органы респираторного тракта. Все это в совокупности не позволяет считать обезьян полностью подходящей моделью для НО для изучения эффективности лечебно-профилактических противооспенных препаратов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ оценки эффективности лекарственных средств против ВНО, в котором в качестве модели животных для изучения натуральной оспы является модель животного беспородная белая мышь популяции ICR (массой 7-9 г), которая используется для оценки профилактической (экстренно-профилактической) эффективности препаратов против натуральной оспы (Патент RU №2522483, МПК A61K 35/76, опубл. 20.07.2014).

Однако при использовании данного модельного животного результаты исследований профилактической (экстренно-профилактической) активности препаратов против НО могут быть применены только для людей с нормальным состоянием иммунной системы. В то же время некоторые существующие и разрабатываемые противооспенные препараты, например, из числа живых оспенных вакцин (Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. - Москва: КМК Scientific Press Ltd.; 1998. 386 с.) могут создавать определенную угрозу для жизни человека, имеющего патологические изменения в органах, формирующих иммунитет, и проявлять при этом эффективность, отличающуюся от таковой у людей, не имеющих данной патологии. Причем с каждым годом число людей с подавленной функцией иммунной системы под влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды только растет.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение более адекватной оценки активности экстренно-профилактических препаратов против натуральной оспы, предназначенных для людей с подавленной функцией иммунной системы.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки активности экстренно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы, включающем введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензию исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса натуральной оспы Индия-3а, депонированным в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-45, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких, по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм животных за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса, согласно изобретения, в качестве модели животных используют инбредных разнополых 18-21-суточных мышей иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г, а интраназальное заражение штаммом вируса натуральной оспы Индия-3а указанных инбредных мышей линии SCID осуществляют в дозе 4,5-5,5 lg БОЕ.

Применение инбредных разнополых мышей иммунодефицитной линии SCID обусловлено тем, что они обладают тяжелым комбинированным иммунодефицитом (дефицитом Т- и В-лимфоцитов и иммуноглобулинов), который в той или иной степени выраженности может наблюдаться у некоторых групп людей. При этом у мышей SCID отсутствуют какие-либо изменения в клетках системы мононуклеарных фагоцитов (макрофагах), что крайне важно при проведении исследований с ортопоксвирусами (включая ВНО), для которых основной клеткой мишенью является макрофаг.

У интраназально (и/н) зараженных в дозе 4,5-5,5 lg БОЕ (10-100 ИД₅₀) штаммом Ind-3а ВНО мышей SCID опытных (обработанных исследуемым препаратом) и контрольной группы определяют наличие и/или концентрацию вируса в легких (первичный орган мишень) через 4 сут п.з. с целью определения следующих показателей, по которым может оцениваться эффективность исследуемых препаратов:

- коэффициент защиты от инфицирования (КЗИ), который вычисляли по формуле: КЗИ=% неинфицированных животных в опыте - % неинфицированных животных в контроле;

- индекс подавления продукции вируса (ИППВ) в легких, который вычисляли по формуле: ИППВ=lg количества вируса в легких контрольной группы животных - lg количества вируса в легких опытной группы животных.

Для суждения о значимости вычисляемых показателей (КЗИ и ИППВ) на 5% уровне надежности, предварительно проводили статистическое сравнение данных, полученных в ходе экспериментов, с использованием следующих статистических методов (Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976. 598 с.):

- показатели долей инфицированных животных в контрольной и опытной группах сравнивали с использованием точного теста Фишера и χ² критерия;

- сравнение уровней накопления вируса в легких у и/н инфицированных мышей проводили при использовании непараметрического метода Манна Уитни.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм Ind-3а ВНО выделен от человека в 1967 году. Штамм прошел 2 пассажа на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», регистрационный номер №V-45 (справка о депонировании штамма ВНО прилагается).

Подлинность штамма. Подлинность штамма была подтверждена ПЦР и секвенированием. Эпидемиологический тип штамм - variola major.

Культуральные свойства. Штамм Ind-3а ВНО при культивировании на монослое клеток Vero вызывает цитопатическое действие (ЦПД) через 2 сут п.з. (температура культивирования 34,5°C, в атмосфере 5% CO₂). Максимальную концентрацию вируса регистрировали на 3-й сут п.з. монослоя клеток при 80-90%-м ЦПД, ее величина составляла 6,9 lg БОЕ/мл.

Патогенность для человека. ВНО (штамм Ind-3а) относится к 1-й группе патогенности по классификации МЗ РФ, летальность для человека при классической оспе (variola major) составляет от 5 до 40%.

Условия для длительного хранения. Для длительного хранения штамм Ind-3а ВНО лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 10 и более лет при температуре хранения минус 70°C.

Применение после хранения. Для подготовки штамма Ind-3а ВНО к культивированию используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Пример 1. Определение 50%-й инфицирующей дозы вируса натуральной оспы (штамм Ind-3а) для мышей SCID

В связи с тем, что одним из наиболее достоверных показателей инфицированности животных является размножение вируса в клетках органов мишеней, была проведена серия экспериментов по определению у этих животных ИД₅₀ (50%-я инфицирующая доза) ВНО, рассчитанная с учетом регистрации наличия вируса в одном из таких органов: легких. Для определения величины данного показателя необходимо было сначала изучить динамику накопления вируса в легких мышей с целью выбора временной точки, когда концентрация вируса в этом органе достигает максимальных значений. При этом группу мышей SCID (18 особей) и/н инфицировали высокой дозой ВНО (5,2 lg БОЕ), а через 1, 2, 3, 4, 5, 7 сут после заражения (п.з.) брали у них (после проведения процедуры эвтаназии методом цервикальной дислокации) целиком легкие, объединяя их в одну пробу от 3 животных, с целью приготовления 10%-х (по объему) гомогенатов путем механической дезинтеграции с помощью пестика в ступке с речным песком и раствором Хенкса.

Перед проведением процедуры и/н инфицирования животных подвергали наркозу с помощью диэтилового эфира или хлороформа. Для этого мышь помещали в перевернутую горлом к поверхности стола банку с ваткой, смоченной наркотическим средством. К заражению мыши приступали сразу после того, как животное достигнет состояния рауш наркоза (резкое снижение двигательной активности). Вируссодержащий материал в объеме 30 мкл вводили небольшими каплями на обе ноздри с помощью автоматической пипетки с пластиковым носиком.

Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях (Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с английского. Washington, D.C.: National Akademy Press; 1996. 138 р.).

Статистическую обработку результатов осуществляли стандартными методами (Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976. 598 с.). ИД₅₀ рассчитывали с использованием формулы Спирмена-Кербера.

В результате этих исследований была представлена динамика накопления вируса в легких этих животных: через 1 сут п.з. - 3,7±0,1 БОЕ/мл; через 2 сут п.з. - 4,0±0,1 БОЕ/мл; через 3 сут п.з. - 3,8±0,1 БОЕ/мл; через 4 сут п.з. - 3,9±0,2 БОЕ/мл; через 5 сут п.з. - 3,7±0,1 БОЕ/мл; через 7 сут п.з. - 2,9±0,2 БОЕ/мл.

Основываясь на результатах изучения данной динамики, с целью определения величин ИД₅₀ вируса для мышей SCID были выбраны (для регистрации наличия вируса в легких) 4-е сут после и/н заражения. При этом животных инфицировали, используя по 6 особей на дозу вируса (1,2-5,2 lg БОЕ), разведенного с 10-кратным шагом, и через 3 и 4 сут п.з. (после проведения процедуры эвтаназии методом цервикальной дислокации) брали целиком легкие от каждого животного отдельно с целью приготовления 10%-х (по объему) гомогенатов и последующего титрования.

В результате проведенных исследований было отмечено, что процент инфицированности мышей SCID, регистрируемый по наличию вируса в легких через 4 сут после и/н заражения, имел четкую зависимость «доза-эффект», что и позволило нам определить ИД₅₀ ВНО для этих животных, которая составила 3,5±0,7 lg БОЕ. Однако с учетом количество апплицированного в дыхательном тракте вируссодержащего материала, введенного и/н методом, ИД₅₀ ВНО для мышей SCID должна быть существенно ниже (на 1 lg, судя по нашим данным с использованием физической и биологической метки) и составить 2,5 lg БОЕ, что свидетельствует об относительно высокой чувствительности данных животных к ВНО, приближающейся к таковой у человека: до 1 lg жизнеспособных вирусных частиц (БОЕ) (Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях. М.: Медицина. 1987. 256 с.; Огарков В.И., Гапочко К.Г. Аэрогенная инфекция. М.: Медицина. 1975). Сравнивая показатель чувствительности к ВНО мышей SCID и двух известных видов модельных животных, необходимо отметить, что его величина (2,5±0,7 lg БОЕ) существенно ниже (в 100 и более раз), чем у обезьян (Jahrling Р.В., Hensley L.E., Martinez M.J., Leduc J.W., Rubins K.H., Relman D.A., Huggins J.W. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a model for human smallpox // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 (42): 15196-200) и достоверно не отличается от таковой у мышей популяции ICR, у которых она составляет 1,7±0,4 lg БОЕ (патент RU №2522483).

Пример 2. Изучение динамики накопления вируса натуральной оспы (штамм Ind-3а) в органах и тканях и/н зараженных мышей SCID

Учитывая то обстоятельство, что мыши SCID проявляли относительно высокую чувствительность к ВНО (штамм Ind-3а) при и/н заражении (см. пример 1), близкую к таковой у человека, в дальнейшей работе мы использовали именно этих животных для изучения динамики диссеминации ВНО в их организме после и/н заражения с целью последующего сравнения с таковой у человека или существующего модельного животного.

В экспериментах с использованием мышей SCID (24 особи) и/н их инфицирование проводили одной дозой: 5,2 lg БОЕ (50 ИД₅₀ для этих животных), осуществляя отбор биоматериалов через 1, 2, 3, 4, 5 и 7 сут п.з. и используя по 4 животных на каждую временную точку. При этом у мышей SCID забирали кровь из ретроорбитального венозного синуса, из которой путем центрифугирования получали сыворотку и сгусток форменных элементов для последующего приготовления гомогената. Кроме того, от инфицированных животных брали органы и ткани (носовая перегородка со слизистой, головной мозг, трахея, бифуркационные лимфоузлы, легкие, печень, селезенка, поджелудочная железа, двенадцатиперстная кишка и почки) и готовили 10%-е (по объему) гомогенаты, описанным ранее методом (см. пример 1). Перед приготовлением гомогенатов тот или иной вид органа и ткани по отдельности объединяли в одну пробу от 4 животных, взятых на соответствующую временную точку, проводя аналогичную процедуру и в отношении сывороток крови мышей.

До вирусологического исследования биоматериалы, полученные от инфицированных животных, хранили при температуре минус 70°C. Статистическую обработку результатов осуществляли стандартными методами (Zaks L. Statistical Estimation. М.: Statistics; 1976. 598 р). Нормальность распределения титров вируса в гомогенатах органов и тканей, а также сыворотке крови животных проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова для вероятности ошибки p>0,10. Сравнение концентраций ВНО в исследованных образцах проводили с использованием t-статистики.

Результаты этих экспериментов представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что уже через 1 сут п.з. возбудитель заболевания был обнаружен только в легких мышей SCID, затем через 2 сут п.з. патоген был зарегистрирован в относительно высоких концентрациях в легких и трахее, а через 3 сут п.з. вирус появился и в носу (носовой перегородке со слизистой), исчезнув при этом в трахее. В течение 3 сут (с 3-х по 5-е сут п.з.) ВНО продолжал регистрироваться только в легких и носу (носовой перегородке со слизистой), перестав выявляться в последнем органе через 7 сут п.з., тогда как в легких он вытитровался в это время в низкой концентрации по сравнению с таковой через 2-5 сут п.з. Самые высокие значения концентраций ВНО из трех продуцирующих вирус органов имели легкие через 2-5 сут. п.з., когда их величины находились в диапазоне от 3,6 до 4,0 lg БОЕ. Во все сроки исследования от 1 до 7-х сут п.з. вирус вообще не был обнаружен с помощью использованного метода титрования в других биоматериалах (клетки крови, сыворотка крови, головной мозг, пищевод, печень, селезенка, почки, двенадцатиперстная кишка), что свидетельствует об отсутствии или крайне низкой чувствительности клеток данных органов и тканей к вирусу. Это обстоятельство привело к ограниченному развитию инфекционного процесса у мышей SCID, затронувшего лишь первичные органы мишени, расположенные в респираторном тракте.

Сам факт размножения вируса в органах системы дыхания этих мышей после респираторного заражения ВНО полностью согласуется с таковым у человека и существующих модельных животных для НО (Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М.: КМК Scientific Press Ltd.; 1998. 386 с.; Westwood J.C., Boulter E.A., Bowen E.T., Maber H.B.: Experimental respiratory infection with poxviruses: I. Clinical virological and epidemiological studies. Br. J. Exp. Pathol. 1966; 47: 453-65; Патент RU №2522483, опубл. 20.07.14).

Пример 3. Изучение патоморфологических изменений в органах и тканях мышей SCID, и/н зараженных вирусом натуральной оспы (штамм Ind-3а)

С целью выяснения степени сходства патоморфологических изменений в органах и тканях и/н инфицированных мышей SCID с таковыми у человека и существующего модельного животного были проведены эксперименты с использованием световой и электронной микроскопии.

Для этого у мышей SCID, и/н инфицированных ВНО в дозе 5,2 lg БОЕ (50 ИД₅₀), после проведенной эвтаназии (см. пример 1) осуществляли забор биоматериала (клетки крови, носовая перегородка со слизистой, головной мозг, трахея, бифуркационные лимфоузлы, легкие, печень, селезенка, поджелудочная железа, двенадцатиперстная кишка, брызжеечные лимфоузлы, почки, надпочечники, кусочки кожи) через 1, 2, 3, 4, 5 и 7 сут п.з., используя по 4 животных на каждую временную точку и контроль.

Для светооптического исследования образцы взятых биоматериалов фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида. Дальнейшую их обработку проводили по общепринятой методике: последовательное обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, пропитывание в смеси ксилол - парафин и заливка в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм готовили с помощью автоматического ротационного микротома НМ-360 (Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование и микрофотосъемка проводилась на микроскопе Imager Z1 (Zeiss, Германия), оснащенном камерой высокого разрешения HRc. При анализе снимков использовали программный пакет AxioVision Rel.4.8.2. Для электронно-микроскопического исследования образцы органов и тканей дофиксировали 1%-м раствором осмиевой кислоты, обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы органов готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония), фотосъемку проводили с помощью встроенной цифровой камеры Jeol и цифровой камеры бокового вывода Veleta (SIS, Германия). Снимки обрабатывали и анализировали с помощью программного пакета iTEM (SIS, Германия).

В результате этих исследований наиболее значимые изменения наблюдались у мышей SCID в основном в органах дыхательного тракта - легких, трахее и нос (носовая перегородка со слизистой) через 5 и 7 сут п.з., связанные с воспалительно-деструктивными процессами, соответствующими описанным другими авторами при респираторном инфицировании у существующих модельных животных для ВНО (Lancaster М.С., Boulter Е.А., Westwood J.C.N., Randies J. Experimental respiratory infection with poxviruses. II Pathological studies. Brit. J. Exp. Path., 1966; 47 (5): 466-71; Патент RU №2522483, опубл. 20.07.2014).

Пример 4. Патогенетическая картина течения инфекции у мышей SCID, интраназально зараженных вирусом натуральной оспы (штамм Ind-3а)

Основываясь на данных, представленных в примерах 1, 2 и 3, разработана патогенетическая схема течения заболевания у мышей SCID (рис.), и/н инфицированных штаммом Ind-3а ВНО дозой 5,2 lg БОЕ (50 ИД₅₀).

На фиг. 1 представлена патогенетическая схема течения заболевания у мышей линии SCID, интраназально (и/н) инфицированных штаммом Ind-3а вируса натуральной оспы (ВНО) дозой 5,2 lg БОЕ (50 ИД₅₀ ^€).

Примечание к таблице на фиг. 1 * - величина соответствует вводимой и/н дозе ВНО: 5,2 lg БОЕ; ^# - величина соответствует количеству апплицированного ВНО в респираторном тракте мышей сразу после и/н заражения; ^& - величина получена путем экстраполяции данных по мышам линии ICR в отношении доли апплицированного ВНО в респираторном тракте сразу после и/н заражения (см. пример 1); Н.п. - показатель не проявился на данную временную точку; ^€ - величина определена для мышей по результатам регистрации наличия вируса в легких через 3 сут после заражения.

Обращает на себя внимание тот факт, что экспериментальные данные, на базе которых была построена схема, во многом совпадают с таковыми, описанными в научной литературе для человека и существующего модельного животного к ВНО в части, касающейся инфекционного процесса в первичных органах мишенях, расположенных в респираторном тракте.

В этом смысле практически все показатели взаимодействия мышей SCID с ВНО в рамках критериев, направленных на поиск модельных животных с целью использования для оценки только профилактической (экстренно-профилактической) эффективности препаратов против НО, соответствуют или близки к таковым у человека и известного модельного животного: обезьяна (табл. 2).

Примечание. * - величина получена путем теоретических исследований (см. п.3.1.1); ^# - величина рассчитана на реально апплицированную долю вируса (10%) в респираторном тракте мышей при интраназальном заражении (см. пример 1); ^€ - приведена обобщенная информация из литературных источников по известным модельным животным (макака циномолгус и мышь популяции ICR) для НО в отношении вида клеток мишеней в респираторных органах и в отношении наличия после респираторного заражения вирусом максимального уровня его накопления в этих органах, превышающего 3 lg БОЕ/мл (Westwood J.C., Boulter Е.А., Bowen Е.Т., Maber H.B.: Experimental respiratory infection with poxviruses: I. Clinical virological and epidemiological studies. Br. J. Exp.Pathol. 1966; 47: 453-65; Lancaster M.C., Boulter E.A., Westwood J.C.N., Randles J. Experimental respiratory infection with poxviruses. II Pathological studies. Brit. J. Exp.Path., 1966; 47 (5): 466-71; Jahrling P.B., Hensley L.E., Martinez M.J., LeDuc J.W., Rubins K.H., Relman D.A., Huggins J.W. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a model for human smallpox. Proc. Natl. Acad. Sci. 2004; 101 (42): 15197-200; Патент RU №2522483, опубл. 20.07.2014), так как подобные сведения, касающиеся людей, в доступной научной литературе отсутствуют.

Однако если учесть то, что в настоящее время практически нет животных, которые могли бы быть использованы в качестве модельных к ВНО, за исключением обезьян макака циномолгус (М. fascicularis, синоним - М. irus), которые обладают существенно более низкой чувствительностью к этому возбудителю заболевания при респираторном инфицировании (6 lg ООЕ и более) (Jahrling Р.В., Hensley L.E., Martinez M.J., LeDuc J.W., Rubins K.H., Relman D.A., Huggins J.W. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a mo del for human smallpox. Proc. Natl. Acad. Sci. 2004; 101 (42): 15197-200; Huggins J., Goff A., Hensley L., Mucker E., Shamblin J., Wlazlowski C, Johnson W., Chapman J., Larsen Т., Twenhafel N., Karem K., Damon I.K., Byrd СМ., Bolken T.C., Jordan R., and Hruby D. Nonhuman primates are protected from smallpox virus or monkeypox virus challenges by the antiviral drug ST-246. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2009; 53 (6): 2620-25), и мышей ICR, использование которых для определения профилактической (экстренно-профилактической) эффективности препаратов против ВНО сориентировано только на людей с нормальным состоянием иммунной системы (Патент RU №2522483, опубл. 20.07.2014), то мыши SCID выглядят в этом направлении более предпочтительно, так как эти животные, проявляя относительно высокую восприимчивость к ВНО, могли бы быть применены для изучения профилактической (экстренно-профилактической) эффективности противооспенных препаратов, моделируя начальную стадию течения инфекционного процесса, захватывающую только органы респираторного тракта, у людей, в том числе и с подавленной функцией иммунной системы. Мыши SCID, не имея изменений в клетках системы мононуклеарных фагоцитов (макрофагах), обладают тяжелым комбинированным иммунодефицитом (дефицитом Т- и В-лимфоцитов и иммуноглобулинов).

Таким образом, результаты сравнительной оценки показателей взаимодействия мышей SCID с ВНО с таковыми у людей и известными модельными животными (обезьяна, мышь ICR) свидетельствуют о возможности использования этих мышей для определения профилактической (экстренно-профилактической) эффективности разрабатываемых и существующих препаратов против ВНО, в том числе для людей с подавленной иммунной системой.

Пример 5. Использование мышей SCID для оценки эффективности лечебно-профилактических препаратов против натуральной оспы в экспериментах in vivo

В экспериментах, связанных с изучением эффективности противовирусных препаратов, мышей SCID (27 особей) заражали 5,2 lg БОЕ (50 ИД₅₀ для этих животных) ВНО (штамм Ind-3a).

Исследованию подвергали химическое соединение, синтезированное в Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, ранее проявивших противовирусную активность в отношении ортопоксвирусов in vitro: 7-[N′-(4-Трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0^2,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14) (Селиванов Б.А., Беланов Е.Ф., Бормотов Н.И., Балахнин СМ., Серова О.А., Святченко В.А., Киселев Н.Н., Казачинская Е.И., Локтев В.Б., Тихонов А.Я. Производные трицикло[3.2.2.02,4]нон_8_ен_6,7_дикарбоновой кислоты высоко эффективно ингибируют репликацию различных видов ортопоксвирусов. Доклады Академии наук, 2011; 441 (3): 414-18). В качестве положительного контроля использовали химическое соединение с установленной противооспенной активностью 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[f]изоиндол-2(1Н)-ил)-бензамид (ST-246), синтезированное в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН по описанной методике (Jordan R., Bailey T.R., Rippin S.R. Compounds, compositions and methods for treatment and prevention of orthopoxvirus infections and associated diseases. Patent WO 2004/112718 A3; 2005. International Patent Classification C07D 209/56). Все лабораторные образцы химических соединений были охарактеризованы и паспортизованы.

Препараты НИОХ-14 и ST-246 вводили мышам перорально в дозе 50 мкг/г массы ежедневно однократно за 1 сут до заражения и в течение 3 сут п.з. Контрольные группы животных обрабатывали раствор метилцеллюлозы с твином-80, который использовали для растворения препаратов НИОХ и ST-246, применяя аналогичные схемы и способ введения, что и для химически синтезированных соединений.

У мышей опытных и контрольных групп после проведения процедуры эвтаназии (см. пример 1) осуществляли забор легких через 4 сут п.з. ВНО. Из легких от каждого животного в отдельности были приготовлены 10%-е (по объему) гомогенаты (см. пример 1).

Вышедших из экспериментов мышей SCID подвергали эвтаназии (см. пример 1).

Определение концентрации жизнеспособных ВНО в используемой для заражения животных вируссодержащей суспензии и гомогенатах легких мышей (каждого животного) проводили традиционным методом (см. пример 1), при этом минимальное количество вируса, которое могло быть выявлено в применяемом нами методе титрования, составляло 0,4 lg БОЕ/легкие.

Статистическую обработку результатов осуществляли стандартными методами (Zaks L. Statistical Estimation. М.: Statistics; 1976. 598 р.). Нормальность распределения титров вируса в гомогенатах легких мышей проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова для вероятности ошибки p>0,10. Концентрации ВНО представлены как среднее значение ±95%-й доверительный интервал (М±195). Сравнение концентраций ВНО в исследованных образцах проводили с использованием t-статистики. Сравнение долей инфицированных и неинфицированных мышей в экспериментальных группах проводили по критерию χ² и точному тесту Фишера. Различия считали достоверными на 5%-м уровне значимости (при p<0,05).

Результаты этих исследований представлены в таблице 3.

твином-80, который использовали для растворения препаратов НИОХ-14 и ST-246; <1,1 - величина ниже порога чувствительности (1,1 lg БОЕ/легкие) использованного метода титрования; ^€ - достоверное отличие от контроля (двусторонний Т-тест Стьюдента с одинаковыми дисперсиями); ^@ - величина разницы между lg количества вируса в легких контрольной группы животных и опытной; ^# - достоверное отличие от контроля (точный тест Фишера p одностороннее <0,05); ^£ - величина разницы между % неинфицированных животных в опыте и контроле; «-» - величина не определяется.

Из данных таблицы 3 видно, что количество обработанных препаратом НИОХ-14 мышей SCID с зарегистрированным содержанием ВНО в легких через 4 сут п.з. достоверно ниже, чем в контроле (при p≤0,05), чего нельзя сказать в отношении препарата ST-246. В то же время оба используемых препарата по сравнению с контролем вызывали эффект значимого снижения средних концентраций вируса в легких мышей через 4 сут п.з. При этом введение НИОХ-14 и ST-246 в одинаковых дозах не выявило существенных различий между этими препаратами по эффективности противооспенного действия.

Эксперименты по оценке эффективности противооспенного действия ST-246, НИОХ-14 и НИОХ-32 (см. п.4.1) ранее проводили мы и многие исследователи (Булычев Л.Е., Сергеев Ал.А., Кабанов А.С., Пьянков О.В., Сергеев Ар.А., Таранов О.С.и др. Изучение эффективности химических синтезированных соединений против ортопоксвирусов. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2012; 20: 102-5; Jordan R., Goff A., Frimm A., Corrado M.L., Hensley L.E., Byrd СМ., Mucker E., Shamblin J., Bolken T.C., Wlazlowski C, Johnson W., Chapman J., Twenhafel N., Tyavanagimatt S., Amantana A., Chinsangaram J., Hruby D.E., Huggins J. ST-246 antiviral efficacy in a nonhuman primate monkeypox model: determination of the minimal effective dose and human dose justification. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53 (5): 1817-22; Stabenow J., Buller R.M., Schriewer J., West C, Sagartz J.E., Parker S.A. A mouse model of lethal infection for evaluating prophylactics and therapeutics against monkeypox virus. J. Virol. 2010; 84 (8): 3909-20 и др.) с использованием различных видов ортопоксвирусов, культур клеток и соответствующих существующих модельных животных и результаты таких исследований коррелировали с нашими данными, полученными на иммунодефицитнх мышах SCID с использованием ВНО. Это свидетельствует об адекватности использованной нами модели для НО.

Таким образом, в рамках полученных результатов было показано, что разнополые 18-21-суточные мыши иммунодефицитной линии SCID (массой 12-14 г) могут быть успешно использованы в качестве модельных животных для НО с целью изучения профилактической (экстренно-профилактической) активности препаратов против этого заболевания, предназначенных для людей (в том числе с иммунодепрессивными состояниями), по показателям подавления продукции вируса в легких и защиты от инфицирования.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы. Способ включает введение в организм инбредных разнополых 18-21-суточных мышей иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата. Заражают интраназально мышей штаммом вируса натуральной оспы Индия-3а в дозе 4,5-5,5 lg БОЕ. Инкубируют вирус в организме мышей и определяют концентрацию вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких, по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм животных за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса. Предложенное изобретение позволяет обеспечить более адекватную оценку активности экстренно-профилактических препаратов против натуральной оспы, предназначенных для людей с подавленной функцией иммунной системы. 1 ил., 3 табл., 5 прим.

Способ оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы, включающий введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса натуральной оспы Индия-3а, депонированным в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-45, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких, по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм животных за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса, отличающийся тем, что в качестве модели животных используют инбредных разнополых 18-21-суточных мышей иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г, а интраназальное заражение штаммом вируса натуральной оспы Индия-3а указанных инбредных мышей линии SCID осуществляют в дозе 4,5-5,5 lg БОЕ.