ШТАММ А/Salekhard/01/2009(H1N1)v ВИРУСА ГРИППА А СУБТИПА H1N1 ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЧЕБНОЙ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/00 A61K39/145 

Описание патента на изобретение RU2457242C1

Изобретение относится к получению нового штамма вируса гриппа А субтипа H1N1 для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против пандемического гриппа А(H1N1/2009) и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

С помощью реассортации, биохимических и молекулярно-биологических методов получены известные штаммы-аналоги вируса гриппа субтипа H1N1 (А/17/Новая Каледония/99/145; А/17/Пекин/95/25; А/47/Пекин/95/35; А/47/Иоганнесбург/96/7/7; А/17/Перт/95/29; А/17/Техас/91/1/3; А/Техас/36/91) и генетические конструкции, которые используются для создания вакцинных препаратов с целью профилактики гриппа (в том числе гриппа свиней) среди людей различных возрастных групп [Патент РФ 2144955, МПК C12N 7/00, опубл. 27.01.00; Патент РФ 215981, МПК C12N 7/00, опубл. 25.05.99; Патент РФ 2183672, МПК C12N 7/00, опубл. 20.06.02; Патент РФ 2159810, МПК C12N 7/00, опубл. 27.11.00; Патент РФ 2151185, МПК C12N 7/00, опубл. 20.06.00; Патент РФ 2084524, МПК C12N 7/00, 20.07.97; Патент РФ 2077581, МПК C12N 7/00, опубл. 20.04.07; Заявка на патент США 2008031115, 18.12.08; Заявка на патент США 20080299151, 04.12.08; Заявка на патент США 20030099670, 29.05.03; Патент США 6485729, 26.11.02; Патент США 5162112, 10.11.92]. Однако все эти штаммы предназначены и использовались для производства профилактических препаратов, а не для оценки эффективности действия существующих и разрабатываемых лечебно-профилактических препаратов против гриппа.

Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 субтип H5N1 вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток [Патент РФ 2309983, МПК C12N 7/00, опубл. 27.05.07].

Однако указанный штамм обладает следующими недостатками:

- предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о вирулентности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток;

- не может быть использован (учитывая его принадлежность к субтипу H5N1 вируса гриппа) для оценки эффективности разрабатываемых и существующих лечебно-профилактических препаратов против пандемического гриппа A(H1N1/2009).

В качестве еще одного аналога выступает штамм А/Бак/Россия/05 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц [Патент РФ 2300564, МПК C12N 7/00, опубл. 10.06.07]. Однако указанный штамм может быть использован только для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о вирулентных свойствах данного штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, нет. Кроме того, учитывая его принадлежность к субтипу H5N1, штамм не может быть использован для оценки эффективности разрабатываемых и существующих лечебно-профилактических препаратов против пандемического гриппа A(H1N1/2009).

Также известен аналог - штамм вируса гриппа A/Swine/1976/31(H1N1), адаптированный к мышам, выделенный от свиней [Грипп A/H1N1 как типичная эмерджентная инфекция (вирусологические, клинико-эпидемиологические особенности, вопросы терапии и профилактика): Пособие для врачей / Под ред. Киселева О.И., Ершова Ф.И., Малого В.П., Сологуб Т.В., Романцова М.Г. - С.Пб. - Харьк. - Ужгород. - 2009. - С.30-32].

Однако указанный штамм генетически и по антигенным свойствам значительно отличается от штаммов вируса гриппа А(H1N1/2009).

Кроме того, известен штамм A/California/04/2009 субтип H1N1 вируса гриппа (аналог), выделенный в США от ребенка с легким течением заболевания, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов в культуре клеток и на животных [Itoh Y., Shinya К., Kiso M. et al. In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses. // Nature. 2009, 460:1021-5].

Однако указанный штамм A/California/04/2009 (H1N1) выделен не на территории России от больного с легким течением заболевания в самом начале пандемии, когда еще не было летальных случаев, вследствие чего не может вызывать весь спектр симптомов заболевания, в том числе приводящих к летальному исходу. Перечисленные характеристики штамма A/California/04/2009 (H1N1) не позволяют наиболее полно оценивать эффективность противовирусных препаратов особенно в отношении штаммов, способных вызвать летальный исход.

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 субтипа H5N1 [Патент РФ 2361917, МПК C12N 7/00, опубл. 20.02.08].

Однако этот штамм (учитывая его принадлежность к вирусу гриппа птиц субтипа H5N1) не может быть использован для оценки эффективности разрабатываемых и существующих лечебно-профилактических препаратов против пандемического гриппа, вызванного вирусом гриппа А(H1N1/2009).

Поскольку штаммы пандемического вируса гриппа A(H1N1/2009) широко распространены во всем мире и будут продолжать циркулировать наряду с вирусами сезонного гриппа, они оказывают влияние при проведении эпидемиологических и клинических научно-практических исследований. В связи с этим для проверки эффективности противогриппозных препаратов необходимо использовать референс-штаммы пандемического вируса гриппа 2009 г. субтипа H1N1, проявляющие высокую инфекционность в модельных системах in vivo и in vitro.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение более продуктивного штамма вируса гриппа А субтипа H1N1 для более достоверного моделирования инфекции пандемического гриппа А(H1N1/2009) на культуре клеток и беспородных мышах на территории РФ с целью изучения эффективности вакцин и противовирусных препаратов.

Указанный технический результат достигается тем, что получен новый штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v пандемического вируса гриппа А субтипа H1N1, выделенного на территории РФ от умершего человека, для использования в экспериментах по изучению специфической активности противовирусных (противогриппозных) препаратов и эффективности вакцин в экспериментах in vivo на беспородных лабораторных мышах. В гене, кодирующем гемагглютинин штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v, присутствует генетическая мутация G155E, которая по данным литературы приводит к повышению репродуктивных свойств вируса при культивировании в куриных эмбрионах и сохраняется при дальнейшем пассировании [Chen Z., Wang W., Zhou H. et al. Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09 (H1N1) vaccines with high yield in embryonated chicken eggs // J. Virol., 2010, 84 (I): 44-51]. Ген нейраминидазы штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v не содержит мутаций E119G и H274Y, которые определяют устойчивость к действию препаратов озельтамивир и занамивира [Zürcher Т., Yates P.J., Daly J. et al. Mutations conferring zanamivir resistance in human influenza virus N2 neuraminidases compromise virus fitness and are not stably maintained in vitro //J. Antimicrobial Chemotherapy, 2006, 58(4):723-732], а также мутации Q136K, которая не влияет на чувствительность к озельтамивиру, однако приводит к повышению устойчивости мутантных изолятов к занамивиру и в меньшей степени к перамивиру [Hurt A.C., Holien J.K., Parker M. et al. Zanamivir-resistant influenza viruses with a novel neuraminidase mutation // J. Virol., 2009, 83 (20): 10366-73]. Как и все штаммы пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009) штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v устойчив к действию ремантадина. Других известных в литературе мутаций, влияющих на свойства вируса в геноме штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v, не обнаружено.

Штамм высокопродуктивен: при культивировании в куриных эмбрионах (КЭ) биоконцентрация вируса достигает 8,5±0,6 lg ЭИД50/мл (десятичный логарифм 50% эмбриональных инфицирующих доз), при культивировании в клетках MDCK -7,3±0,4 lg ТЦД50/мл (десятичный логарифм 50% тканевых цитопатических доз), титр в РГА составляет 1:128. Штамм не вызывает заболевания с летальным исходом у мышей при аэрозольном, интраназальном, внутримозговом, внутримышечном заражении. Штамм эффективно размножается в носовой полости, трахее, бронхах и легких мышей и вызывает у мышей заболевание, которое по патоморфологической картине и перечню основных органов-мишеней, где происходит размножение данного патогена, наиболее адекватно моделирует гриппозную инфекцию у человека.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v относится к вирусу гриппа род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от человека, умершего от гриппа в ноябре 2009 года. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под регистрационным номером №V-538 (дата регистрации - апрель 2011 г.).

Источник получения. Штамм выделен от жителя Салехарда, умершего от гриппа в ноябре 2009 г. Вирус был получен в высоких титрах при заражении гомогенатом легочной ткани (изолированный образец) 9-дневных КЭ после первого пассажа. Штамм агглютинировал эритроциты человека, цыпленка и морской свинки: показатели титров в РГА составляли 1:128-1:256. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 7,3±0,4 lg ТЦД50/мл в культуре клеток MDCK и 8,5±0,6 lg ЭИД50/мл в КЭ.

Подлинность штамма. Вирусная РНК была выделена из аллантоисной жидкости РКЭ с помощью набора «РИБО-сорб» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР проводили с использованием набора реагентов «АмплиСенс Influenza virus A/H1-swine-FL» (Интерлабсервис, г. Москва). Определение нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов проводили на приборе Beckman Coulter CEQ2000XL DNA Analysis System ("Beckman Coulter, Inc.") с использованием наборов "Beckman sequencing Kit". Полученные нуклеотидные последовательности и филогенетический анализ проводился с использованием прикладных программ VECTOR NTI 8.0 («InforMax») и Mega 2.1. Матрицу расстояний вычисляли по алгоритму Р-дистанции. Филогенетическое дерево строили с использованием метода «ближайшего соседа» (neighbor-joining). Достоверность проверялась методом «бутстреп» (bootstrap) с 500 репликациями. Достоверным считали «бутстреп» индекс >75. Для построения филогенетических деревьев использовали нуклеотидные последовательности генов вируса гриппа, депонированных в международной базе данных GenBank.

Все полученные первичные последовательности были депонированы в базу GenBank. Номера депонирования генов штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v представлены в таблице 1.

Таблица 1 Номера депонирования генов штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v в международной базе данных GenBank Штамм вируса гриппа Ген вируса гриппа и номер депонирования в GenBank НА NA РВ2 PB1 PA NP MP NS A/Salekhard/01/ GU GU GU GU GU GU GU GU 2009(H1N1)v 367327 367329 367334 367333 367332 367330 367328 367331

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v к субтипу H1N1. Штамм генетически близок к референс-штамму A/California/07/2009(H1N1) пандемического H1N1 (2009) вируса гриппа.

Культуральные свойства. Штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v при культивировании при 36,0°С в аллантоисной жидкости КЭ достигает высоких концентраций 8,5±0,6 lg ЭИД50/мл через 2 суток после инфицирования в аллантоисную полость. Штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v при культивировании в монослое клеток MDCK вызывает цитопатическое действие (ЦПД) через 2-4 суток после заражения (температура культивирования 37°С в атмосфере 5% СО2). Максимальную концентрацию вируса регистрировали через 4-6 суток после заражения монослоя клеток MDCK, и ее величина составляла 7,3±0,4 lg ТЦД50/мл.

Патогенность для человека. Штаммы пандемического вируса гриппа A(H1N1/2009) являются вирулентными для человека: летальность для людей составляет около 0,5% (от 0,02% до 4,6%).

Патогенность для свиней. Штаммы пандемического вируса гриппа A(H1N1/2009) являются высоковирулентными для свиней, вызывая, кроме респираторной симптоматики, нарушения функции воспроизводства у 10 - 30% заболевших животных.

Для длительного хранения. Штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 2 и более лет при температуре хранения минус 70°С.

Среды культивирования. Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, StemAlpha-MDCK, MegaVir-MDCK, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Пример 1. Изучение репродуктивных свойств штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v

Выделенные на территории России штаммы пандемического вируса гриппа A(H1N1/2009) культивировали в куриных эмбрионах (КЭ) и в клетках MDCK.

Результаты изучения эффективности репродуцирования в указанных системах после пассирования в КЭ приведены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v был получен в высоких титрах после 1-го пассажа на КЭ, тогда как для выделения других штаммов потребовалось не менее 2 пассажей в КЭ. При этом штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v обладает высокими репродуктивными свойствами не только в КЭ, но и в культуре клеток MDCK, что является основанием для его использования при исследовании противовирусной эффективности лекарственных препаратов и иммуногенности вакцин.

Все исследуемые штаммы репродуцировались в культуре клеток MDCK и в КЭ. В то же время для проведения дальнейших исследований нами был выбран штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v. Это обусловлено тем, что данный штамм обладал более высокой репродуктивной активностью по сравнению с другими испытанными штаммами (поскольку в его геноме присутствует мутация G155E), которая способствует появлению более высоких репродуктивных свойств вируса при культивировании в куриных эмбрионах (КЭ) и сохраняется при дальнейшем пассировании.

Пример 2. Использование штаммов пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009) для проверки противовирусной активности препаратов in vitro

Далее было проведено исследование чувствительности полученных штаммов пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009) к противогриппозным препаратам Тамифлю (табл.3), Ингавирин (табл.4), Реаферон (табл.5) и Ремантадин (табл.6) in vitro.

Как видно из таблиц 3, 4 и 5, штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v, полученный после 1-го пассажа в КЭ, обладает чувствительностью к Тамифлю, Ингавирину и Реаферону, сопоставимой с чувствительностью референс-штамма A/California/07/2009(H1N1)v, полученного из CDC (США). Об этом свидетельствует достоверное уменьшение его инфекционности (ИД50 in vitro) при инкубировании с данными противовирусными препаратами в культуре клеток MDCK. При этом другие штаммы пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009), которые нам удалось получить в относительно высоких титрах только после 2-го пассажа в КЭ, проявляли или пониженную, или повышенную чувствительность к исследованным препаратам. В связи с этим неясно, было ли это обстоятельство связано с пассированием вируса в КЭ или исходный изолят действительно был нечувствительным к данным противогриппозным препаратам. Показано также, что штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v, также как и другие изученные штаммы вируса гриппа A(H1N1/2009), нечувствителен к Ремантадину (табл.6).

Полученные результаты показывают, что штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v имеет ряд преимуществ при оценке эффективности противогриппозных препаратов. Это обусловлено тем, что он был выделен сразу после 1-го пассажа в КЭ и имеет мутацию G155E, способствующую появлению его более высоких репродуктивных свойств не только при культивировании в КЭ, но и в культуре клеток MDCK, и сохраняющуюся при дальнейшем пассировании в чувствительных системах [Chen Z., Wang W., Zhou H. et al. Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09 (H1N1) vaccines with high yield in embryonated chicken eggs // J. Virol., 2010, 84(1):44-51].

Пример 3. Изучение инфекционных свойств штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v в экспериментах in vivo на разных линиях мышей

После 1-го или 2-го пассажа в КЭ были сформированы стоки штаммов пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009), выделенных на территории России, и изучена их патогенность (инфекционность) для мышей разных линий (ICR, BALB/c, C57/black, CBA) при интраназальном заражении.

Результаты экспериментов приведены в таблице 7. Было отмечено, что более высокой инфекционной активностью по сравнению с референс-штаммом и другими российскими штаммами обладал штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v. В течение всего срока наблюдения (12 суток) за животными указанных линий, инфицированными разведениями вируса 0, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 гибели не наблюдалось. Через 4-7 суток после заражения в разведениях 0-10-5 у части животных всех линий регистрировали некоторые клинические признаки заболевания (взъерошенность, сниженная двигательная активность, конъюнктивит).

Каждый из штаммов вируса гриппа проявлял сходную инфекционную активность для всех исследованных линий мышей. В то же время инфекционность штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v была выше, чем у референс-штамма и других российских штаммов пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009). В связи с этим для проведения дальнейших исследований нами был выбран штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v. Это было обусловлено следующими обстоятельствами:

- штамм был выделен из изолированного образца после 1-го пассажа в КЭ;

- наличием мутации, обеспечивающей более высокую продуктивность штамма в КЭ;

- его более высокой продуктивной активностью по сравнению с другими испытанными штаммами в КЭ и клетках MDCK;

- его более высокой инфекционностью: чувствительностью к нему лабораторных мышей (легких);

- более высокой актуальностью для населения нашей страны, поскольку был выделен на территории РФ.

С точки зрения последнего обстоятельства, наиболее адекватную для населения России оценку эффективности существующих и разрабатываемых лечебно-профилактических противовирусных препаратов может дать использование вирусных штаммов, выделенных прежде всего на территории России, по причине генетических различий между штаммами, изолированными в разных регионах мира. Использование российского штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v также позволит более корректно установить степень готовности учреждений Минздравсоцразвития к локализации и ликвидации в России вспышек заболеваний среди людей, вызванных пандемическим вирусом гриппа А(H1N1/2009), потенциально способным привести к летальному исходу.

Учитывая эти обстоятельства и отсутствие достоверных различий между всеми линиями мышей по инфекционной активности для данного российского штамма, а также существенно более низкую стоимость беспородных белых мышей (линия ICR), в дальнейшей работе были использованы следующие биоматериалы: штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v и беспородные белые мыши ICR.

Пример 4. Использование штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v и беспородных лабораторных мышей для проверки противовирусной активности препаратов по индексу нейтрализации in vivo

Из литературных данных известно, что использование мышей в качестве модельного животного для проверки противовирусной активности препаратов при гриппозной инфекции широко распространено в научной практике [Droebner К., Ehrhardt С., Poetter A., Ludwig S. and Planz O. CYSTUS052, a polyphenol-rich plant extract, exerts anti-influenza virus activity in mice // Antiviral Research. 2007, 76 (I. LP): 1-10]. При этом исследователи использовали штаммы вируса гриппа, не имеющие отношение к субтипу H1N1. В этой связи, основываясь на ранее приведенных примерах (1 и 2), нами была подобрана адекватная биосистема [российский штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v и беспородные белые мыши], позволяющая моделировать течение инфекционного заболевания у человека, вызванного пандемическим вирусом гриппа A(H1N1/2009). Используя данную модельную систему, были проведены исследования по оценке противовирусной активности лекарственных препаратов, разрешенных к применению на территории России.

Для определения 50%-ной инфицирующей дозы (ИД50) штамма вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v беспородных белых мышей массой 15-17 г инфицировали интраназально 5 разведениями ВАЖ: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 и 10-7 в объеме 40 мкл. Через 4 сут животных забивали, получали гомогенаты легких и определяли в них наличие или отсутствие вируса посредством инфицирования КЭ. При изучении лечебно-профилактического действия препараты Тамифлю, Ингавирин, Ремантадин, Реаферон-Липинт, Арбидол и Виразол вводили мышам перорально по 0,05 мг/г; 0,09 мг/г; 0,1 мг/г; 250 МЕ/г; 0,1 мг/г и 0,05 мг/г соответственно в дистиллированной воде по 0,2 мл ежедневно 1 раз в сутки (в день заражения через 1 час, а потом в течение 4 сут после заражения пандемическим вирусом гриппа). При расчете эквивалентных для мышей доз препаратов были использованы ранее опубликованные сведения [Kleiber M. The Fire of Life // New York - London, John Wiley and Sons. - 1961], где научно обосновано применение повышенных величин таких доз в пересчете на единицу массы мелких лабораторных животных. Контрольной группе мышей по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду. Результаты исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8 Лечебно-профилактическая активность препаратов Тамифлю, Ингавирин, Ремантадин, Реаферон-Липинт, Арбидол и Виразол на модели гриппозной инфекции, вызванной штаммом A/Salekhard/01/2009(H1N1)v у мышей по индексу нейтрализации in vivo Препарат для лечения штаммов в lgЭИД50/гол.
(М±I95) для белых мышей
Индекс нейтрализации# (lg)
Тамифлю 1,6±0,4* 1,0 Ингавирин 1,4±0,4* 0,8 Ремантадин 0,9±0,4 0,3 Реаферон-Липинт 1,4±0,4 0,8 Арбидол 1,4±0,4* 0,8 Виразол 1,6±0,4* 1,0 Контроль 0,6±0,4 - Примечание: & - величина получена путем оценки наличия вируса в гомогенатах легких (при инфицировании КЭ) через 5 сут после заражения мышей разными дозами вируса гриппа; * - величина с вероятностью 95% отличается от контроля; # - показатель определяется как разница между ИД50 (в lgЭИД50/гол.) между опытной и контрольной группами животных.

Результаты представленных исследований свидетельствуют о наличии достоверного лечебно-профилактического эффекта у препаратов Тамифлю, Ингавирина, Арбидола, Реаферона-Липинта и Виразола при инфекции у мышей, вызванной пандемическим вирусом гриппа А(H1N1/2009). В то же время Ремантадин не проявлял лечебно-профилактического эффекта в экспериментах на животных.

Таким образом, предлагаемый штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v может быть успешно использован в экспериментах на беспородных белых мышах для изучения лечебно-профилактической активности препаратов против пандемического гриппа А(H1N1/2009) путем оценки индекса нейтрализации in vivo.

Пример 5. Использование штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1)v и беспородных лабораторных мышей для проверки противовирусной активности препаратов по результатам накопления вируса в легких

Основываясь на ранее приведенных примерах (1 и 2), нами была подобрана адекватная биосистема [российский штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v и беспородные белые мыши], позволяющая моделировать течение инфекционного заболевания у человека, вызванного пандемическим вирусом гриппа A(H1N1/2009). В связи с успешной регистрацией лечебно-профилактического эффекта по ИН in vivo, используя данную модельную систему, были проведены исследования по оценке противовирусной активности тех же препаратов (Тамифлю, Ингавирин, Ремантадин, Реаферон-Липинт, Арбидол, Виразол) в экспериментах, связанных со сравнительным определением уровня накопления вируса в легких контрольных и опытных групп беспородных белых мышей.

Беспородных белых мышей массой 15-17 г инфицировали интраназально штаммом вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v в дозе 10-30 ИД50/мышь. При изучении лечебно-профилактического действия препараты Тамифлю, Ингавирин, Ремантадин, Реаферон-Липинт, Арбидол и Виразол вводили мышам перорально по 0,05 мг/г; 0,09 мг/г; 0,1 мг/г; 250 МЕ/г; 0,1 мг/г и 0,05 мг/г соответственно в дистиллированной воде по 0,2 мл ежедневно 1 раз в сутки (в день заражения через 1 час, а потом в течение 4 дней после заражения вирусом гриппа). При расчете эквивалентных для мышей доз препаратов были использованы ранее опубликованные сведения [Schmid R.F. and Thews G. Физиология человека. // М.: Мир, 1986, С.19], где научно обосновано применение повышенных величин таких доз в пересчете на единицу массы мелких лабораторных животных. Контрольной группе мышей по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду. Результаты исследований представлены в таблице 9.

Таблица 9 Исследование лечебно-профилактической активности препаратов на модели гриппозной инфекции, вызванной штаммом A/Salekhard/01/2009(H1N1)v у мышей по индексу подавления продукции вируса в легких Препарат для лечения Титры вируса& в легких мышей lg ТЦД50/мл (M±I95) Индекс подавления продукции вируса # Тамифлю 1,80±0,62* 2,20* Ингавирин 2,83±0,74* 1,17* Ремантадин 3,70±0,50 0,30 Реаферон-Липинт 1,83±0,72* 2,17* Арбидол 3,00±0,53* 1,00* Виразол 3,00±0,57* 1,00* Контроль 4,00±0,44 - Примечание: & - величина определялась путем титрования на клетках MDCK гомогенатов легких через 5 суток после заражения мышей; * - величина с вероятностью 95% отличается от контроля; # - показатель определялся как разница между концентрациями вируса гриппа в легких (в lgТЦД50/мл) контрольной и опытной групп животных через 5 сут после их заражения.

Результаты представленных исследований свидетельствуют о наличии достоверного лечебно-профилактического эффекта у препаратов Тамифлю, Ингавирина, Реаферона-Липинта, Арбидола и Виразола при инфекции у мышей, вызванной пандемическим вирусом гриппа А(H1N1/2009). В то же время Ремантадин не проявлял какого-либо лечебно-профилактического эффекта в экспериментах на животных.

Таким образом, предлагаемый штамм вируса гриппа A/Salekhard/01/2009 (H1N1)v может быть успешно использован в экспериментах на беспородных белых мышах для изучения лечебно-профилактической эффективности препаратов против пандемического вируса гриппа А(H1N1/2009) путем сравнительной оценки уровня накопления вируса в легких в контрольной и опытных группах животных.

Похожие патенты RU2457242C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ШТАММАМИ СУБТИПА H1N1 ВИРУСА ГРИППА А ПРЕПАРАТОМ НА ОСНОВЕ АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА 2013
  • Агафонов Александр Петрович
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Сергеев Артемий Александрович
  • Скарновича Максим Олегович
  • Кабанов Алексей Сергеевич
  • Сергеев Александр Николаевич
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Войтенко Александр Васильевич
  • Смолина Марагарита Петровна
  • Усова Светлана Владимировна
RU2523554C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09, АДАПТИРОВАННЫЙ К ТКАНЯМ ЛЕГКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ 2012
  • Львов Дмитрий Константинович
  • Щелканов Михаил Юрьевич
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Дерябин Пётр Григорьевич
  • Прошина Елена Сазоновна
  • Пономаренко Роман Александрович
RU2487936C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО ВИРУСОМ ГРИППА ПТИЦ А/Н5N1 2008
  • Агафонов Александр Петрович
  • Сергеев Александр Николаевич
  • Дроздов Илья Геннадиевич
  • Бажутин Николай Борисович
  • Таргонский Сергей Николаевич
RU2395295C2
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/Russia/01/2009-ma СУБТИПА H1N1 ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЧЕБНОЙ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ in vitro И in vivo 2010
  • Романовская Алеся Александровна
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Зайковская Анна Владимировна
  • Дурыманов Александр Гаврилович
  • Шестопалов Александр Михайлович
RU2451072C1
ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Laetiporus sulphureus 2011
  • Теплякова Тамара Владимировна
  • Косогова Татьяна Алексеевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Кабанов Алексей Сергеевич
  • Пучкова Лариса Ивановна
  • Сергеев Александр Николаевич
RU2475530C2
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/CHICKEN/KURGAN/05/2005 СУБТИП H5N1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА 2008
  • Агафонов Александр Петрович
  • Терновой Владимир Александрович
  • Писарева Мария Михайловна
  • Сергеев Артемий Александрович
  • Демина Ольга Константиновна
  • Дутов Василий Николаевич
  • Шиков Андрей Николаевич
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Рябчикова Елена Ивановна
  • Грудинин Михаил Павлович
  • Сергеев Александр Николаевич
  • Киселев Олег Иванович
  • Дроздов Илья Геннадиевич
RU2361917C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ 2009
  • Львов Дмитрий Константинович
  • Бурцева Елена Ивановна
  • Прилипов Алексей Геннадьевич
  • Дерябин Петр Григорьевич
  • Малышев Николай Александрович
  • Базарова Марина Викторовна
  • Колобухина Людмила Васильевна
  • Меркулова Лилия Николаевна
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Садыкова Галина Кадымовна
  • Усачев Евгений Валерьевич
  • Щелканов Михаил Юрьевич
  • Шевченко Елена Сергеевна
  • Трушакова Светлана Викторовна
  • Иванова Валерия Тимофеевна
  • Белякова Наталья Владимировна
  • Оскерко Татьяна Александровна
RU2412244C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ A/SWINE/SIBERIA/1SW/2016 H1N1-СУБТИПА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДАМИ РТГА И ПЦР И ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VITRO И IN VIVO 2016
  • Курская Ольга Григорьевна
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Алексеев Александр Юрьевич
  • Соболев Иван Андреевич
  • Леонов Сергей Владимирович
  • Юшков Юрий Георгиевич
  • Шестопалов Александр Михайлович
RU2631938C1
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГРИППА ПТИЦ 2012
  • Ямковая Татьяна Витальевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Загребельный Станислав Николаевич
  • Панин Лев Евгеньевич
  • Ямковой Виталий Иванович
RU2502512C2
Композиция на основе пептида, подавляющего репликацию вируса гриппа А 2018
  • Егоров Владимир Валерьевич
  • Забродская Яна Александровна
  • Шалджян Арам Арутюнович
  • Матусевич Олег Владимирович
  • Васин Андрей Владимирович
  • Штро Анна Андреевна
  • Сергеева Мария Валерьевна
  • Никонов Борис Алексеевич
  • Гаршинина Анжелика Валерьевна
  • Федорова Виктория Александровна
  • Горшков Андрей Николаевич
  • Зарубаев Владимир Викторович
  • Гюлиханданова Наталия Евгеньевна
RU2695336C1

Реферат патента 2012 года ШТАММ А/Salekhard/01/2009(H1N1)v ВИРУСА ГРИППА А СУБТИПА H1N1 ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЧЕБНОЙ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА

Изобретение относится к области вирусологии. Получен новый штамм вируса гриппа А субтипа H1N1 A/Salekhard/01/2009(H1N1)v, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора под регистрационным номером V-538. Изобретение может быть использовано для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против пандемического гриппа в медицинской вирусологии и микробиологии. 9 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 457 242 C1

Штамм A/Salekhard/01/2009(H1N1)v вируса гриппа А субтипа H1N1 для исследования лечебной и профилактической эффективности препаратов против вируса гриппа, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-538.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2012 года RU2457242C1

INFLUENZA RESEARCH DATABASE
ПРИБОР ДЛЯ КОНТРОЛЯ СМЕЩЕНИЯ ИСХОДНОГО КОНТУРА 0
SU367334A1
Способ обработки медных солей нафтеновых кислот 1923
  • Потоловский М.С.
SU30A1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ 2009
  • Львов Дмитрий Константинович
  • Бурцева Елена Ивановна
  • Прилипов Алексей Геннадьевич
  • Дерябин Петр Григорьевич
  • Малышев Николай Александрович
  • Базарова Марина Викторовна
  • Колобухина Людмила Васильевна
  • Меркулова Лилия Николаевна
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Садыкова Галина Кадымовна
  • Усачев Евгений Валерьевич
  • Щелканов Михаил Юрьевич
  • Шевченко Елена Сергеевна
  • Трушакова Светлана Викторовна
  • Иванова Валерия Тимофеевна
  • Белякова Наталья Владимировна
  • Оскерко Татьяна Александровна
RU2412244C1

RU 2 457 242 C1

Авторы

Агафонов Александр Петрович

Терновой Владимир Александрович

Шишкина Лариса Николаевна

Булычев Леонид Егорович

Сергеев Артемий Александрович

Скарнович Максим Олегович

Демина Ольга Константиновна

Кабанов Алексей Сергеевич

Шиков Андрей Николаевич

Семенцова Александра Олеговна

Сергеев Александр Николаевич

Даты

2012-07-27Публикация

2011-06-16Подача