КОМПОЗИЦИЯ С ПОВЫШЕННОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ ГИНОСТЕММЫ ПЯТИЛИСТНОЙ Российский патент 2015 года по МПК A61K36/424 A61K31/715 A61P1/16 A61P3/00 A61P9/02 

Изобретение относится к фармацевтике и может быть использовано при производстве биологически активных добавок и лекарственных препаратов на основе Гиностеммы пятилистной.

Известны экстракты Гиностеммы пятилистной (см. патент CN №102451215, МПК А61К 36/424, опубликовано 16.05.2012 г.; заявку на патент US №20080260877, МПК А61К 36/424, опубликовано 23.10.2008 г.).

Основным недостатком данных экстрактов является низкая водорастворимость (около 0,8 г/л) содержащихся в Гиностемме пятилистной сложных гипенозидов и, как следствие, невысокая их экстрактивность из растительного материала, что приводит к необходимости использования для достижения лечебных результатов высоких терапевтических доз (100-300 мг/кг массы тела).

Известен этанольный экстракт Гиностеммы пятилистной с повышенным содержанием гипенозидов дамулина А и В (см. заявку на патент US №20110015142, МПК А61К 31/58, опубликовано 20.01.2011 г.). Несмотря на повышенное содержание в данном экстракте гипенозидов он имеет недостатки, аналогичные другим экстрактам Гиностеммы пятилистной: низкую водорастворимость действующих веществ и соответственно слабый терапевтический эффект.

Задачами заявляемого изобретения являются: улучшение растворимости/экстрактивность компонентов Гиностеммы пятилистной, повышение ее фармакологического (гиполипидемического, гепатопротекторного, гипотензивного и гипогликемического) действия, возможность снижения применяемых доз с сохранением базового терапевтического эффекта.

Техническим результатом изобретения является создание композиции на основе Гиностеммы пятилистной, обладающей высокой растворимостью/экстрагируемостью биологически активных компонентов Гиностеммы пятилистной в водной среде и повышенным фармакологическим действием.

Технический результат достигается за счет того, что состав композиции с повышенной фармакологической активностью на основе Гиностеммы пятилистной (Gynostemma pentaph yllum) (далее композиция) со стоит из сухого сырья (высушенных стеблей, листьев, побегов и усиков) Гиностеммы пятилистной (далее Гиностемма) и полисахарида арабиногалактана из лиственницы Сибирской или Гмелина (далее арабиногалактан) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Гиностемма пятилистная 16,7-50 Арабиногалактан 83,3-50

Частицы компонентов композиции могут иметь размеры менее 20 мкм, а также образовывать агломераты размерами 30-100 мкм.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется нижеследующими электронными микрофотографиями: на фиг.1 изображена субстанция арабиногалактана; на фиг.2 - порошок сухого сырья Гиностеммы; на фиг.3 - композиция состава Гиностемма:арабиногалактан в массовых соотношениях 1: 2, полученная при обработке смесей исходных компонентов на мельнице ВМ-1 в течение 2 часов.

В основу выбора состава композиции положено обнаруженное нами явление повышения экстрактивности сапонинов (гипенозидов) в смесях Гиностеммы с арабиногалактаном, вероятно, за счет образования их водорастворимых межмолекулярных комплексов и способ получения твердых композиций Гиностеммы и арабиногалактана путем механической обработки их смесей интенсивными механическими воздействиями. Арабиногалактан (Е.Н. Медведева, В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы развития (обзор), Химия растительного сырья, 1 (2003), с.27-37) является полисахаридным метаболитом эндемиков сибирской лесной флоры лиственницы сибирской (Larix sibirica), лиственницы Гмелина (Larix Gmelinii), лиственницы американской (Larix laricind), лиственницы западной (Larix occidentalis) и легко выделяется из древесины указанных деревьев. Содержание арабиногалактана составляет до 15% от веса сухой древесины. Химически арабиногалактан представляет собой полисахарид гребенчатого строения с м.м. ~18 кДа. Главная цепь состоит из звеньев галактозы, боковые цепи - из звеньев арабинозы и галактозы. Эта особенность строения способствует образованию прочных межмолекулярных комплексов лекарственных препаратов, молекулы которых вероятнее всего связываются межмолекулярными водородными вандерваальсовыми связями в пространстве, образованном боковыми цепями.

Целесообразность использования массовых соотношенияй Гиностеммы и арабиногалактана от 1:1 до 1:5 обусловлена следующим:

- при увеличении относительного содержания Гиностеммы (>1:1) в композиции достигаемое увеличение растворимости за счет образования водорастворимых комплексов недостаточно для усиления биологической активности;

- при понижении относительного содержания Гиностеммы (<1:5) - композиция оказывается «перегружена» вспомогательным веществом (арабиногалактаном), что приводит к нежелательному увеличению общей дозы препарата, а также к увеличению его себестоимости.

Для получения композиции используют механохимический подход, заключающийся в обработке смеси твердых компонентов интенсивными механическими воздействиями - давлением и сдвиговыми деформациями, реализуемыми преимущественно в мельницах различного типа, осуществляющих ударно-истирающие воздействия на вещества. Смесь Гиностеммы и арабиногалактана подвергается механической обработке в шаровых мельницах. При этом параллельно происходят два процесса, обеспечивающие повышение экстрактивности сапонинов/гипенозидов.

1. Разрушение структуры растительных клеток Гиностеммы, что увеличивает доступность сапонинов/гипенозидов к прямому контакту с растворителем/водой - при водной экстракции. Учитывая, что размеры растительных клеток преимущественно находятся в интервале 15-60 мкм, желательно, чтобы частицы растительного сырья измельчались преимущественно до размеров менее 20 мкм.

2. Образование частиц - агрегатов разрушенных клеток Гиностеммы и частиц арабиногалактана, что, благодаря образованию контактов остатков клеточных структур, содержащих экстрактивные компоненты и арабиногалактана, способствует более эффективному образованию водорастворимых комплексов гипенозидов и арабиногалактана при гидратации получаемой композиции.

Полученная композиция имеет более высокие водорастворимость и экстрагируемость гипенозидов по сравнению с исходным сырьем Гиностеммы (см. пример 1) и, как следствие, более высокую биологическую активность - гиполипидемическое действие (см. примеры 2, 3) и гипогликемическое действие (см. примеры 4, 5).

Настоящее изобретение подтверждается следующими экпериментами (примерами).

1. Исследование экстрактивности сапонинов/гипенозидов из композиций сухого сырья Гиностеммы и арабиногалактана.

Пример 1.

Смеси Гиностеммы с арабиногалактаном, взятые в весовых соотношениях 1:1, 1:2 и 1:5, были подвергнуты обработке ударно-истирающими воздействиями в шаровой ротационной/валковой мельнице ВМ-1 в течение 2 часов (механическая активация). Затем была определена экстрактивность сапонинов (гипенозидов), для чего 0,6 г навески исследуемого материала суспендировали в 5 мл 20%-ного спирта при +37°С на магнитной мешалке (400 об/мин) в течение 20 минут. Концентрация сапонинов в растворе определялась с помощью фотометрической методики: сначала экстракт (0,5 мл) смешивали с 1 мл 5%-ного ванилина в уксусной кислоте и 4 мл 70%-ной хлорной кислоты, затем смесь выдерживали в термостате при температуре 60°С в течение 15 минут. Полученные образцы сканировали на спектрофотометре «СПЕКС ССП-700» в диапазоне длин волн 350-600 нм. В качестве калибровочных образцов использовали растворы растительного сапонина - глицирризиновой кислоты в различных концентрациях (см. Xie Z., Liu W., Huang H. Chemical composition of five commercial gynostemma pentaphyllum samples and their radical scavenging, antiproliferative, and anti-inflammatory properties // J. Agric. Food Chem. - 2010. - Vol.58. - P.11243-11249). Полученные данные экстрактивности приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Экстрактивность сапонинов из материалов, содержащих сырье Гиностеммы. Вещество/Композиция Количество экстрагированных сапонинов в исходных веществах и м/а композициях мг/г Гиностеммы∗ Увеличение экстрактивности относительно сырья Гиностеммы в разы Гиностемма (Г) 144,2 - Гиностемма (Г) м/а^∗∗ 290,4 2,0 Г+АГ(1:1) м/а 493,0 3,4 Г+АГ(1:2) м/а 541 3,7 Г+АГ(1:5) м/а 678 4,7 ^∗ - в пересчете на глицирризиновую кислоту
^∗∗м/а - механически активированная

Во всех случаях имеет место повышение экстрактивности сапонинов Гиностеммы до 3,4-4,7 раз. При этом по мнению авторов, за счет комплексообразования с арабиногалактаном возможна преимущественная экстракция малорастворимых фракций гипенозидов, обладающих наибольшей фармакологической активностью. Это предположение подтверждают проведенные биологические испытания (см. примеры реализации 2, 3).

2. Сравнительное исследование биологической активности (гиполипидемическое и гипогликемическое действия) механически активированных композиций на основе Гиностеммы.

Образцы Гиностеммы пятилистной тестировали в дозах 60 мг сухого порошка травы на 25 г веса животного. Дозировка подбиралась из расчета количества экстрагируемых веществ Гиностеммы пятилистной. Тестированию подвергались субстанция Гиностеммы пятилистной, а также ее композиции с арабиногалактаном в различных весовых соотношениях (от 1:1 до 1:5), содержащих одинаковые дозы Гиностеммы. Для сравнения биологической активности с прототипом получали этанольный экстракт Гиностеммы в соответствии с заявкой на патент US №20110015142.

В исследованиях использовали 6-недельных мышей-самцов инбредной линии С57/В1, 6-месячных крыс-самцов линии Wistar и крыс гипертензивной линии НИСАГ (виварий Института цитологии и генетики СО РАН).

Пример 2.

Для исследования гиполипидемического действия образцов на основе Гиностеммы использовали экспериментальную модель гиперлипидемии у мышей при однократном внутрибрюшинном введении Полоксамера-407. Животных рандомизировали на 6 групп, в каждой группе - 10 мышей. 1-й (контрольной) группе внутрижелудочно вводили 0,5 мл дистиллированной воды в течение 4 дней и внутрибрюшинно - 0,2 мл физиологического раствора. Образцы композиций Гиностеммы суспендировали в воде и вводили животным с помощью металлического зонда для кормления мышей ежедневно в течение 4 дней.

Полоксамер-407, растворенный в физиологическом растворе, вводили однократно на 3-е сутки эксперимента. На 5-е сутки животных декапитировали и получали плазму крови центрифугированием (3000 g, 15 мин). В плазме крови определяли содержание общего холестерина и триглицеридов энзиматическим микрометодом (в объеме 200 мкл) с помощью наборов «Biocon» (Германия). Содержание липидов выражали в ммоль/л крови. Результаты исследований приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Гиполипидемический эффект композиций на основе Гиностеммы пятилистной.

  Композиции на основе Гиностеммы пятилистной Контроль Этанольный экстракт (прототип) Гиностемма пятилистная с арабиногалактаном Гиностемма пятилистная после механохимической активации Интактная группа (1:2 m/m) (1:4 m/m) Триглицериды, ммоль/л 30,37±2,2 21,68±1,9 11,38±1,6 17,58±2,0 17,06±2,1 0,71±0,2 Общий холестерин, ммоль/л 5,87±0,3 4,52±0,28 2,58±0,29 3,39±0,31 3,86±0,28 1,35±0,1

Примечание: Достоверность различий между группами p<0,05.

При развитии гиперлипидемии, индуцированной Полоксамером-407, ланильный экстракт Гиностеммы (прототип) снижал содержание триглицеридов и общего холестерина на 29 и 23% соответственно, в то время как композиции Гиностеммы с арабиногалактаном оказывали более сильное гиполипидемическое действие. Максимальный эффект наблюдался при использовании образца Гиностемма пятилистная:арабиногалактан 1:2. Композиция в данном соотношении вызывала снижение уровня холестерина и триглицеридов на 56 и 63% соответственно.

Пример 3.

Исследования проводили на крысах (Wistar), содержащихся на жировой диете в течение 10 недель. Крыс рандомизировали на 5 групп (в каждой группе - 6 животных). 1-я группа включала интактных крыс, содержащихся на стандартной диете (322 ккал/100 г: белки 19%, углеводы 60% и жиры 6%); брикетированный корм 120-1 «Лабораторснаб» Москва); 2-я контрольная группа крыс получала жировую диету (443 ккал/100 г, белки 17%, углеводы 60% и жиры 16%) в течение 10 недель и ежедневные внутрижелудочные введения воды (0,5 мл) в течение последних 5 недель (placebo); третья группа получала жировую диету (10 недель) и в течение последних 5 недель ежедневные внутрижелудочные введения прототипа (этанольного экстракта Гиностеммы), суспендированного в 0,5 мл воды; 4-я группа - жировую диету (10 недель) и в течение последних 5 недель ежедневные внутрижелудочные введения композиции Гиностеммы и арабиногалактана (1:2). После 10 недельного эксперимента животных декапитировали, центрифугированием получали сыворотку крови. В сыворотке крови определяли содержание общего холестерина и триглицеридов энзиматическим методом, как было описано выше (пример 1). Печень очищали от крови перфузированием раствором Хенкса. Взвешивали кусочки правой доли, обрабатывали трипсином и ЭДТА в растворе Хенкса для получения суспензии гепатоцитов, фильтровали и клетки центрифугировали при 800 g 5 мин. Гомогенат печени (1:3 - вес:объем 0,2М трис-HCl буфера, pH 7,4) получали из кусочков левой доли печени. Клетки печени фиксировали 4% парафармарльдегидом и окрашивали 0,5% жировым красным (Sigma-Aldrich) в 60% изопропаноле. Затем образцы отмывали в течение 2 ч раствором фосфатного буфера на шейкере. После отмывки окрашенные Жировым красным клетки дважды центрифугировали при 800 g 10 мин и Жировой красный экстрагировали изопропанолом в течение 1 ч. Образцы экстрагированного из клеток Жирового красного переносили в 96-луиочный планшет и фотометрировали в ридере Titrotek (Англия) при длине волны 520 нм. Полученные результаты аккумуляции общих неполярных липидов в печени выражали в регистрируемой оптической плотности экстрагированного Жирового красного на г сырого веса печени. Для определения концентрации общего холестерина и триглицеридов в гомогенате печени экстрагировали липиды методом Фолча (хлороформ:метанол - 2:1, об/об), экстракт высушивали под вакуумом и в сухом остатке определяли концентрацию липидов в растворе изопропанола, содержащего 0,1% Nonidet (Sigma-Aldrich), энзиматическим методом, как было описано выше (пример 2). Результаты исследований приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Сравнительный эффект композиции Гиностеммы и арабиногалактана (1:2) и экстракта Гиностеммы (прототипа) на содержание липидов в крови и печени крыс, содержащихся в течение 10 недель на жировой диете (М±m, n=6). Группы животных Липиды крови, моль/л Содержание липидов в печени Триглицериды Холестерин Общие липиды, О.П./г веса печени Триглицериды, мг/г веса печени Холестерин, мг/г веса печени 1. Интактные 0,81±0,06 1,12±0,09 4,33±0,37 17,7±1,42 15,98±0,16 2. Жировая диета (контроль) 1,68±0,13 1,97±0,21 6,69±0,71 56,72±5,91 28,83±3,24 3. Жировая диета + экстракт Гиностеммы 1,26±0,19^∗ 1,76±0,32 5,6±0,42^∗ 40,23±4,6^∗ 24,81±2,96 4. Жировая диета
+ композиция Гиностеммы и арабиногалактана (1:2) 0,91±0,12^∗∗# 1,41±0,16^∗ 4,48±0,44^∗∗# 24,88±2,6^∗∗# 19,12±0,84^∗∗# Примечание. Достоверные различия между группой 2 и 3,4 - ^∗ (p<0,05) и ^∗∗ (p<0,01); достоверные различия между группами 3 и 4 # (p<0,05).

Данные, полученные в эксперименте, моделирующем развитие гиперлипидемии и жирового гепатоза у крыс при жировой диете, показывают, что под воздействием композиции Гиностеммы и арабиногалактана (1:2) происходит значительное снижение уровня общих липидов (на 33%), триглицеридов (на 56%) и холестерина (на 33%) в печени и уровня триглицеридов (на 56%) и холестерина (на 28,4%) в крови. Гиполипидемическое действие заявленной композиции значительно превышает действие прототипа (экстракта Гиностеммы). При действии прототипа снижение уровня общих липидов, триглицеридов и холестерина в печени и уровня триглицеридов и холестерина в крови составило 16,3; 29; 13,94; 25 и 11% соответственно.

Пример 4.

Для исследования гипогликемического эффекта композиций Гиностеммы использовали мышей-самцов линии С57/В1, находящихся на стандартной диете. Животных рандомизировали на 3 группы, в каждой группе - по 5 мышей. В течение трех дней животным внутрижелудочно вводили образцы Гиностеммы, контрольной группе - дистиллированную воду. На 4-й день, предварительно оставив мышей без корма на 6 часов, измеряли уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра «One Touch Ultra» и отмечали полученное значение как «0» точку. Далее внутрибрюшинно вводили раствор глюкозы в количестве 0,5 г на 100 г веса и измеряли концентрацию последней через 3 часа. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4. Гипогликемический эффект композиции.   Концентрация глюкозы, ммоль/л Контроль Этанольный экстракт (прототип) Гиностемма пятилистная с арабиногалактаном (1:2 т/т) «0» 9,4±0,42 8,2±0,39 8,0±0,17 3 ч 9,5±0,48 8,3±0,41 6,9±0,21 Гипогликемический эффект Гиностеммы. Достоверность различий между группами (p<0,05).

Полученные данные показывают, что даже непродолжительный прием Гиностеммы способствует снижению уровня глюкозы в крови.

Пример 5.

Исследование гипотензивного действия образцов Гиностеммы проводили на крысах гипертензивной линии НИСАГ. Крысам через зонд внутрижелудочно однократно вводили образцы Гиностеммы в 1 мл воды, контрольным животным вводили тем же способом 1 мл воды. Через 2 ч после введения измеряли систолическое и диастолическое артериальное давление неинвазивным методом с помощью рекордера CODA 2 (Kent Scientific, Torrington, CT) без использования наркоза, помещая крыс в термостатированные камеры.

Результаты, выраженные в мм рт.ст, приведены в Таблице 5.

Таблица 5. Сравнительное влияние этанольного экстракта Гиностеммы пятилистной (прототип) и композиций Гиностеммы пятилистной и арабиногалактана на артериальное давление у крыс линии НИСАГ (М±m, n=6). Артериальное давление, мм рт.ст. Введение воды Введение прототипа Введение композиции Гиностемма:арабиногалактан (1:2) Введение композиции Гиностемма:арабиногалактан (1:4) Систолическое 179,5±12 160±15,4 131±12,5^∗# 146±11^∗ Диастолическое 118±11 99,8±8,1 81±7,4^∗# 92±8,9^∗ Примечание. ^∗ - достоверные отличия от контроля (p<0,05); # - достоверные отличия от прототипа (p<0,05).

Данные демонстрируют, что гипотензивное действие заявленной композиции превышает действие прототипа. Наибольшим эффектом обладала композиция Гиностеммы и арабиногалактана в соотношении 1:2 (снижение систолического и диастолического артериального давления на 26 и 31,5%). Экстракт Гиностеммы (прототип) снижал систолическое и диастолическое артериальное давление только на 11 и 16% соответственно.

Таким образом, проведение ряда испытаний заявляемой композиции подтверждает технические результаты, получаемые при ее использовании: повышение растворимости/экстрактивности Гиностеммы и ее фармакологического действия - гиполипидемического, гепатопротекторного, гипотензивного и гипогликемического эффектов.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции, обладающей гиполипидемическим, гипотензивным, гепатопротекторным и гипогликемическим действием. Композиция, обладающая гиполипидемическим, гипотензивным, гепатопротекторным и гипогликемическим действием, содержит высушенные стебли, листья, побеги, усики Гиностеммы пятилистной и арабиногалактан из лиственницы Сибирской или Гмелина при определенном соотношении компонентов. Вышеописанная композиция обладает выраженным гиполипидемическим, гипотензивным, гепатопротекторным и гипогликемическим действием. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 5 пр.

1. Композиция, обладающая гиполипидемическим, гипотензивным, гепатопротекторным и гипогликемическим действием, характеризующаяся тем, что содержит высушенные стебли, листья, побеги, усики Гиностеммы пятилистной и арабиногалактан из лиственницы Сибирской или Гмелина при следующем соотношении компонентов, мас.%:
- высушенные стебли, листья, побеги, усики Гиностеммы пятилистной - 16,7-50;
- арабиногалактан - 50-83,3,
при этом размер частиц компонентов композиции не превышает 20 мкм.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что частицы компонентов образуют агломераты размерами 30-100 мкм.