СПОСОБ БИОМОНИТОРИНГА ВОДОЕМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО СОСТАВА ПОПУЛЯЦИЙ ХИРОНОМИД Российский патент 2015 года по МПК G01N33/18 G01N1/30 

Изобретение относится к области биологии, а именно к области экологической оценки окружающей среды биологическими методами, и может быть использовано в определении состояния водоема как целостной экосистемы.

Известен (RU, патент 2213350, опубл. 2003) способ биоиндикации среды, включающий выбор группы индикаторов, формирование эталонной среды с разбивкой ее по классам качества, определение видов индикаторов, способных существовать в диапазоне классов качества эталонной среды, извлечение из среды всех возможных видов из группы индикаторов, установление по каждому классу качества среды видов индикаторов, способных существовать в диапазоне классов качества эталонной среды, и определение класса качества среды по максимальному значению суммарной классовой значимости индикаторов, причем осуществляют оценку возможности самоочищения среды путем дополнительных извлечений индикаторов из среды и определений суммарной классовой значимости индикаторов до момента расположения максимального значения суммарной классовой значимости и наибольшего после него значения в соседних областях классности качества среды, а о возможности самоочищения судят при расположении наибольшего значения относительно максимального в области понижения классности среды.

Недостатком известного способа следует признать невозможность применения его для оценки собственно экосистемы водоема.

Известен (RU, патент 2361207, опубл. 2009) способ биологического мониторинга водной среды на основе регистрации положения створок раковин двухстворчатых раковинных моллюсков, включающий закрепление на створках раковины каждого моллюска датчика положения створок, размещение моллюсков с датчиками положения створок в контролируемой воде, формирование датчиками электрических сигналов положения створок, преобразование их в цифровые коды, ввод цифровых кодов в компьютер, сравнение компьютером введенных цифровых кодов с пороговым значением, соответствующим значению электрического сигнала при закрытых створках раковины моллюска, определение количества моллюсков, закрывших створки раковин, по результатам сравнения цифровых кодов с пороговым значением и принятие решения о загрязнении контролируемой воды при превышении количеством моллюсков, закрывших створки раковин, порогового значения, причем для формирования электрического сигнала положения створок каждого моллюска формируют оптическое излучение, пропускают его по оптическому волокну линии передачи, один из участков которого выполнен в виде петли оптического волокна и установлен на закрепленном на одной створке раковины моллюска основании датчика с упором одной стороной петли оптического волокна в дно паза, выполненного в основании датчика, с возможностью механического взаимодействия другой стороны петли оптического волокна с элементом воздействия на чувствительный элемент, установленным на другой створке раковины моллюска, и с возможностью деформации формы петли оптического волокна в ее плоскости в результате механического взаимодействия петли оптического волокна с элементом воздействия на чувствительный элемент и дном паза основания датчика, преобразуют оптическое излучение, прошедшее по оптическому волокну линии передачи, в электрический сигнал положения створок с помощью приемника оптического излучения, установленного с возможностью оптического контакта с выходным торцом оптического волокна линии передачи, и определяют количество моллюсков, закрывших створки раковин, по количеству цифровых кодов, не превысивших пороговое значение.

Недостатком известного способа следует признать его сложность и малую пригодность для применения в условиях естественного водоема. Известный способ более применим для определения токсичности различных материалов в лаборатории.

Известен (Ильяшук Б.П., Ильяшук Е.А., Даувальтер В.А., Каган Л.Я. Закономерности развития экологического кризиса в гидроэкосистеме, подверженной многолетнему влиянию загрязняющих веществ горно-металлургического производства. - Институт проблем промышленной экологии Севера, Кольский НЦ РАН, г.Апатиты. http://www.kolasc.net.ru/mssian/innovation/ksc70.html) способ биомониторинга загрязнения природных водоемов веществами горно-металлургического производства путем регистрации морфологических изменений у хирономид. Способ основан на наблюдениях за хирономидами из природного водоема. Обнаружено, что при значительном загрязнении водоемов появляются хирономиды с морфологическими изменениями, выражающимися в деформации элементов ротового аппарата, в частности субментума.

Недостатком данного способа является отсутствие критериев оценки токсичности и мутагенности по анализируемым признакам.

Известен (RU, патент 2491546, опубл. 2013) способ оценки генотоксической активности водных сред, включающий приготовление опытных проб, получение синхронизированной культуры дафний от одного наиболее плодовитого клона из популяции дафнии, за исключением лабораторной популяции, экспонирование одновозрастных, партеногенетических дафний из синхронизированной культуры параллельно в исследуемом растворе (опыт), в воде (К - контроль), в растворе эталонного токсиканта (К_т ⁺), в растворе и эталонного мутагена (К_м ⁺), регистрацию физиологического состояния у особей исходного поколения (F₀), определение коэффициентов токсичности, а именно коэффициента гибели (L₀) и коэффициента плодовитости (Р₀), регистрацию физиологического состояния дафний второго поколения (F₂), определение суммарной мутагенной активности расчетным путем, сравнение ее значения с изоэффективными концентрациями эталонных мутагенов и токсикантов, выделение лимитирующего показателя вредности, установление уровня генотоксической активности на основании полученных результатов.

Недостатком известного способа следует признать его сложность и длительность.

Известен (RU, патент 2357243, опубл. 2009) способ биологического мониторинга на основе биоиндикации, предусматривающий отбор проб водных животных, установление их численности, биомассы, видового разнообразия, границ распределения и регистрацию функциональных параметров организма, а также основных гидрологических и гидрохимических показателей, определение на их основе пространственных и временных трендов изменения индикаторных биологических параметров в градиенте экологических факторов, причем биомониторинг осуществляют непрерывно посредством многоуровневой биоиндикации с использованием нескольких уровней организации биологических систем и измерением индикаторных параметров с различной дискретностью, при этом результаты оперативной биоиндикации по физиологическим и поведенческим реакциям организма в природных условиях характеризуют изменения состояния среды в интервале от 1 ч до 6 месяцев, краткосрочной биоиндикации - по параметрам популяций отдельных видов - характеризуют диапазон от 0,5 года до 3 лет, многолетней биоиндикации на уровне сообществ оценивают изменения с интервалом 3 и более лет, оценка изменений среды осуществляется путем сравнения с фоновыми и референтными трендами индикаторных параметров, причем обнаружение достоверных различий индикаторных параметров более чем на 30% относительно референтных трендов свидетельствует об устойчивом изменении состояния среды.

Недостатком известного способа следует признать его длительность.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать способ биомониторинга водоема (автореферат диссертации Даниловой М.В. Значение кариотипов хирономид (Chironomus plumosus L и Camptochironomus tentans F) для оценки состояния водной среды. Калининград, 2011).

Указанный источник содержит следующие общие с заявленным техническим решением признаки: способ биомониторинга водоема с использованием генетического состава популяций хирономид, включающий отбор проб обитающих в водоеме хирономид, определение уровня загрязнения окружающей среды путем анализа отобранных организмов и оценки результатов анализа, причем при реализации способа в водоеме отлавливают личинки хирономид с последующей их фиксацией и приготовлением временных цитологических препаратов политенных хромосом слюнных желез личинок по ацето-орсеиновой методике, при этом о состоянии водоема судят по состоянию политенных хромосом с последующим вынесением суждения о состоянии загрязнения водоема по хромосомным индексам.

Недостатком известного способа можно признать невысокую точность.

Техническая задача, решаемая посредством использования разработанного способа, состоит в обеспечении достоверного мониторинга водоемов.

Технический результат, достигаемый при реализации способа, состоит в его упрощении при одновременном повышении точности за счет повышения точности определения показателей полиморфизма популяции хирономид в водных экосистемах.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ биомониторинга водоема с использованием генетического состава популяций хирономид. При реализации способа проводят отбор проб обитающих в водоеме хирономид, определение уровня загрязнения окружающей среды путем анализа отобранных организмов и оценку результатов анализа, причем в водоеме отлавливают личинки хирономид IV стадии развития, а анализ проводят путем фиксации пойманных личинок с последующим приготовлением временных цитологических препаратов политенных хромосом слюнных желез личинок по ацето-орсеиновой методике с последующим вынесением суждения о степени загрязнения водоема по хромосомным индексам. В качестве хромосомных индексов, предпочтительно, использовали среднее число гетерозиготных инверсий на особь, общее количество последовательностей дисков, количество геномных комбинаций, отношение числа последовательностей дисков к числу геномных комбинаций.

В качестве объекта исследования использованы личинки хирономиды Chironomus plumosus IV стадии развития, отлов которых производили в обследуемом водоеме. Личинок вылавливали в местах наибольшей заиленности, так как этот вид предпочитает жить в иле. При исследовании использовали личинки IV стадии развития, т.к. в этой стадии они достигают максимального размера, что облегчает исследования. Все картирование хромосом выполнено именно на этой стадии развития. Гидрологическим сачком зачерпывали со дна грунт, который промывали через крупноячеистое сито. Личинок Glyptotendipes glaucus собирали с корней и погруженных в воду листьев растений, так как это фитофильный вид, предпочитающий селиться на прибрежных растениях. Пойманных личинок фиксировали на месте отлова в растворе 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1).

Временные цитологические препараты политенных хромосом слюнных желез личинок готовили по стандартной ацето-орсеиновой методике. Из 2-3 грудного сегмента фиксированной личинки в капле 40% молочной кислоты выделяли слюнные железы и окрашивали орсеином на предметном стекле в течение 30 минут. Затем железы переносили в каплю 50% молочной кислоты, где отделяли от секрета железы и разрушали, чтобы из них были извлечены хромосомы и отделены от цитоплазмы. Затем освобожденные хромосомы накрывали предметным стеклом, излишки молочной кислоты удаляли фильтровальной бумагой с легким надавливанием, чтобы при анализе получить отчетливый рисунок хромосомных дисков. По краю покровного стекла проводили прозрачным лаком, чтобы избежать высыхания препарата. Готовые временные препараты хранили в холодильнике.

Картирование хромосом Ch. plumosus проводили по системе Михайловой (плечо В), остальные плечи - по системе Кейла. Картирование G. glaucus осуществлялось по Беляниной, Дурновой, обозначения плеч использовались по Михайловой.

В качестве показателей генотипической структуры изучаемых природных популяций и экспериментальных личинок были использованы:

- - общее количество последовательностей дисков;

- - количество геномных комбинаций;

- - среднее число гетерозиготных инверсий на особь;

- - отношение числа последовательностей дисков к числу геномных комбинаций.

Была установлена зависимость состояния водоема от указанных характеристик.

Если общее количество последовательностей дисков в популяции превышает 12,4, то такой водоем считается загрязненным.

Если общее количество геномных комбинаций в популяции превышает 14,6, то такой водоем считается загрязненным.

Если число гетерозиготных инверсий на особь превышает 0,98, то такой водоем считается загрязненным.

Если отношение числа последовательностей дисков к числу геномных комбинаций ниже чем 0,85, то такой водоем считается загрязненным.

Изобретение относится к области биологии и предназначено для биомониторинга водоема с использованием генетического состава популяций хирономид. В водоеме осуществляют отбор личинок хирономид IV стадии развития с последующей их фиксацией и приготовлением временных цитологических препаратов политенных хромосом слюнных желез личинок по ацето-орсеиновой методике. О степени загрязнения водоема судят по состоянию политенных хромосом и хромосомным индексам. Достигается упрощение способа при одновременном повышении точности определения показателей полиморфизма популяции хирономид в водных экосистемах. 1 з. п. ф-лы.

1. Способ биомониторинга водоема с использованием генетического состава популяций хирономид, включающий отбор проб обитающих в водоеме хирономид, определение уровня загрязнения окружающей среды путем анализа отобранных организмов и оценку результатов анализа, отличающийся тем, что в водоеме отлавливают личинки хирономид IV стадии развития с последующей их фиксацией и приготовлением временных цитологических препаратов политенных хромосом слюнных желез личинок по ацето-орсеиновой методике, при этом о состоянии водоема судят по состоянию политенных хромосом с последующим вынесением суждения о степени загрязнения водоема по хромосомным индексам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве хромосомных индексов используют общее количество последовательностей дисков, количество геномных комбинаций, среднее число гетерозиготных инверсий на особь, а также отношение числа последовательностей дисков к числу геномных комбинаций.