СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИГОДНОСТИ МОРСКОЙ ВОДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПРОМЫСЛОВЫХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к аквакультуре, а точнее к конхиокультуре и предназначено для определения биокачества морской воды, подходящей для выращивания личинок промысловых двустворчатых моллюсков, как в питомнике, так и при выборе акватории для марихозяйств.

Аварийные сбросы в море хозяйственно-бытовых сточных вод загрязняют прибрежную акваторию. Их многократное повторение в течение многих лет нарушает экологическое равновесие и может привести к необратимым изменениям [1,2]. Загрязняющие вещества или поллютанты (минеральные или органические) могут находиться в растворенном, либо взвешенном состоянии, а иногда в виде эмульсий. Поллютанты характеризуются токсичностью, стойкостью к разрушению. Вещество считается токсичным, если, попадая в воду, оно вызывает гибель организмов. Но имеется обширный класс загрязняющих отравляющих веществ, которые не являются остротоксичными. К ним относятся соли тяжелых металлов и синтетические органические вещества: например поверхностно-активные вещества (ПАВ). Они могут сорбироваться на поверхности микроводорослей, затем концентрироваться в поедающих их моллюсках [9].

В синтетических моющих средствах находятся полифосфаты [3, 5]. Попадая в морскую воду с аварийными сбросами неочищенных бытовых стоков, они образуют продукты гидролиза, которые являются опасными для водных экосистем. Избыток фосфора инициирует следующую цепочку: бурный рост растений, отмирание растений, их гниение, обеднение водоемов кислородом, ухудшение жизни организмов. Они опасны для всего живого в воде даже в очень малых концентрациях. Загрязнение вод моющими средствами осложняется еще и тем, что даже их биологическое разрушение не является решением проблемы, так как и продукты разрушения являются токсичными в некоторых случаях. Микроорганизмы, процеживая через себя воду, вместе с питательными веществами получают и дозу загрязнителя. Загрязнение распространяется по пищевой цепи, концентрация такого вещества на единицу веса каждого последующего консумента возрастает.

Наиболее близок к направлению исследований Метод использования ранних эмбрионов черноморской мидии для биотестирования при мониторинге прибрежных зон северо-западного шельфа [8], где в качестве тест-объекта оценки качества воды используют эмбрионы иглокожих и двустворчатых моллюсков. В способе осемененные яйцеклетки помещают в тестируемую среду. Критерием воздействия тестируемой среды на развитие эмбрионов является достоверное отличие между распределениями эмбрионов по стадиям дробления в контроле и тестируемой среде, для чего используют показатель соответствия хи-квадрат. В способе принято, что относительная синхронность ниже 1 свидетельствует об угнетении тестируемой средой процесса дробления у эмбрионов; превышающая 1 - о стимулирующем воздействии. Расчет показателей относительной синхронности производят с использованием процентного содержания эмбрионов на стадиях зиготы, двух и восьми бластомеров.

Применение известного способа затруднено из-за ряда недостатков, снижающих достоверность результатов:

1. отсутствует информация о гидрохимических характеристиках морской воды, используемой в качестве контроля;

2. не описана методика проведения оплодотворения без полиспермии;

3. не приведены данные о плотности посадки оплодотворенных яйцеклеток (тыс. кл./л) в контроле и опытах;

4. не указаны причины отставания развития эмбрионов в опытах по сравнению с контролем;

5. подсчет достоверности различий между контролем и опытом, проведенный методом хи-квадрат без каких-либо модификаций и без другого исправляющего контекста, обычно дает посредственные результаты. Такие критерии редко применяются на практике, поскольку величина дисперсии распределения обычно неизвестна.

Задача изобретения состоит в обеспечении исследователей качественным и достоверным методом оценки пригодности воды для выращивания личинок промысловых двустворчатых моллюсков.

Техническим результатом изобретения является достоверная оценка биокачества морской воды для выращивания личинок промысловых моллюсков в питомнике и при выборе участков акватории моря для марихозяйств. Техническим результатом является также точность в определении качества морской воды, т.к. в способе реализуется комплексный подход, в исследования включены гидрохимические и биологические показатели. Техническим результатом является возможность использования способа в качестве экспресс-метода определения пригодности морской воды.

Для достижения поставленной задачи, а также для устранения недостатков в прототипе в заявляемом способе, включающем использование в качестве тест-объекта оплодотворенных яйцеклеток двустворчатых моллюсков Mytilus galloprovincialis, развитие которых осуществляют в тестируемой воде и в контроле, после чего сравнивают воздействие тестируемой среды и контроля на развитие эмбрионов, предусмотрены ряд изменений. Яйцеклетки промывают профильтрованной морской водой через 12 мин после оплодотворения, затем разделяют на равные части и выдерживают 2 часа 36 мин в тестируемой среде и в контроле при оптимальной плотности посадки оплодотворенных яйцеклеток 50 тыс. кл./л, температуре морской воды 14,7°С. Под критериями воздействия понимают уровень эмбрионального развития личинок, наличие или отсутствие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, а также значение содержания минеральных и органических фосфатов в тестируемой морской воде, не превышающее 12 мкг⋅л^-1. Кроме того, уровень эмбрионального развития оценивают путем сравнения процентного соотношения эмбрионов мидии с двумя и четырьмя бластомерами, развитие которых происходило в контроле и в тестируемой воде. Кроме того, под хромосомными аномалиями в эмбриональных клетках мидии понимают полиплоидию (нерасхождение хромосом); лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза и метафазе митоза, фрагментацию хромосом в метафазе митоза выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом, образование «мостов», многополярность веретена деления хромосом; блокировку цитокинеза.

Заявляемый способ поясняется иллюстрациями.

Фиг. 1 - Триплоидные эмбрионы мидии: а - метафаза митоза; б - анафаза митоза.

Фиг. 2 - Лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза (а) и в метафазе митоза (б), фрагментация хромосом в метафазе митоза (в).

Фиг. 3 - Выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом (а); мосты и не расхождение хромосом (б); многополярность веретена деления хромосом (в).

Фиг. 4 - Блокировка цитокинеза на анафазе митоза (а); на профазе митоза (б).

Фиг. 5 - Аномальное эмбриональное деление: хромосомы остались в одном из бластомеров.

Фиг. 6 - Отделение от бластомеров части хромосом с цитоплазмой.

Фиг. 7 - Тетраплоидные эмбриональные клетка (а), блокировка деления центромер (б); множественные мосты и не расхождение хромосом в анафазе митоза (в); фрагментация хромосом (г).

Степень воздействия загрязняющих веществ на гидробионтов зависит от их типа, концентрации, физиологического состояния, стадии онтогенеза и многих внешних факторов. Наиболее чувствительные - стадии эмбрионального и личиночного развития.

Авторами проводились исследования уровня эмбрионального развития и наличие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии Mytilus galloprovincialis, возникающих в результате воздействия на оплодотворенные яйцеклетки мидии раствором порошка «Ушастый нянь - автомат» концентрации 0,001% и 0,005% в течение 5 и 15 мин.

Работу проводили в питомнике ИМБИ РАН в марте-апреле 2017 г. Мидий отбирали на мидийно-устричной ферме (внешний рейд, бухта Севастопольская). Нерест половозрелых особей (L=79 мм) вызывали методом температурной стимуляции. Для проведения группового скрещивания были отобраны и мидий. Морская вода подавалась со скважины и была профильтрована через установку с набором фильтров диаметром ячеи: 20, 10, 5 и 1 мкм. Для исследования влияния ПАВ на эмбриональное развитие мидий был выбран популярный порошок - «Ушастый нянь - автомат», применяемый для стирки детской одежды. В состав стирального порошка «Ушастый нянь» входят: сульфаты - 15-30%; фосфаты - 15-30%; кислородсодержащие отбеливающие вещества - 5-15%; анионные ПАВ - 5-15%; карбонаты - 5-15%; силикаты - 5-15%; неионогенные ПАВ (<5%); пеногаситель(<5%); энзимы, оптические отбеливатели, отдушки [https://roscontrol.com/product/ushastiy-nyan/].

Оплодотворенные яйцеклетки разделили на 4 части. Одну часть перенесли в профильтрованную морскую воду (контроль). Две другие - в раствор порошка «Ушастый нянь» на морской воде концентрации 0,001% на 5 и 15 мин соответственно (опыт 1 и опыт 2), а четвертую - в раствор порошка «Ушастый нянь» концентрации 0, 005% на 5 мин (опыт 3).

Затем оплодотворенные яйцеклетки, промытые в профильтрованной морской воде, перенесли в профильтрованную морскую воду температуры 14,7°С для дальнейшего развития. Через 2 часа 36 мин от момента оплодотворения, эмбрионы из контроля и трех опытов зафиксировали в 4% формалине и в этанол-уксусном фиксаторе (3:1) с двумя сменами фиксатора: через 1 час и одни сутки (для хромосомных препаратов).

Ранее [7] авторами было показано, что в воде, отобранной на расстоянии 100 м от городского коллектора бухты Севастопольской, содержание фосфатов составило 126 мкг⋅л^-1, что соответственно в 18 раз выше, чем в двухмильной зоне (7 мкг⋅л^-1) и 11 раз выше, чем в открытой части бухты (11,45 мкг⋅л^-1). Высокое содержание фосфатов указывает на свежее загрязнение [1].

Концентрация фосфатов в морской воде из скважины составила 10 мкг⋅л^-1 (табл. 1). Суммарное содержание фосфора в растворах стирального порошка на морской воде зависело от концентрации: от 73,4 мкг⋅л^-1 - в растворе концентрации 0,001%, до 367,0 мкг⋅л^-1 - в 0,005%-ном растворе. По мере увеличения концентрации раствора увеличивался рН: от 8,03 до 8,08 соответственно при 0,001% и 0,005%, тогда как рН морской воды составил 8,01 (см. табл. 1). Незначительное изменение рН морской воды может быть причиной растворения раковин личинок двустворчатых моллюсков и их гибели [10].

Эмбрионы в контроле и опытах были зафиксированы через 2 часа 36 мин после оплодотворения, когда в контроле началось второе митотическое деление оплодотворенных яйцеклеток и образование эмбрионов с четырьмя бластомерами. Сравнение доли эмбрионов мидии с разным количеством бластомеров в опытах и контроле представлено в табл. 2.

Суммарное содержание минерального и органического фосфора в растворе ПАВ концентрации 0,001% составило 73,4 мкг⋅л^-1, что в 1,7 раза ниже, чем вблизи городского коллектора. Таким образом, даже кратковременное воздействие (в течение 5 мин) раствора порошка «Ушастый нянь - автомат» низкой концентрации 0,001% (опыт 1) на оплодотворенные яйцеклетки мидии приводит к торможению деления эмбриональных клеток.

Раствор ПАВ концентрации 0,001%, независимо от продолжительности воздействия (5 или 15 мин), проникая через поры клеточной оболочки яйцеклетки, остается в цитоплазме, вызывая хромосомные аномалии в 25-30% эмбрионов: полиплоидию (нерасхождение хромосом) (Фиг. 1); лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза и метафазе митоза, фрагментацию хромосом в метафазе митоза (Фиг. 2); выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом, образование «мостов», многополярность веретена деления хромосом (Фиг. 3.); блокировку цитокинеза (Фиг. 4). Все эти аномалии являются следствием разрушения белковых структур: ахроматинового веретена и гистонов - белков, входящих в структуру хромосом и, возможно, белкового слоя оболочки клетки, вызывая нарушение цитокинеза.

При высокой концентрации - 0,005% и кратковременном воздействии в течение 5 мин на оплодотворенные яйцеклетки мидии, раствор ПАВ нарушает целостность клеточной оболочки. Клетки вытягиваются, эмбрионы приобретают уродливую форму, хромосомы остаются в одном из бластомеров (Фиг. 5). Кроме вышеназванных хромосомных аномалий были отмечены следующие: часть цитоплазмы и хромосом отделяется от бластомеров (Фиг. 6). При норме - 28 хромосом, наблюдались тетраплоидные эмбриональные клетки и фрагментация хромосом; образуются множественные «мосты» и хромосомы не расходятся в анафазе митоза; часто блокируется деление центромер (Фиг. 7).

Оценку достоверности различий в уровне развития эмбрионов мидии в контроле и опытах проводили по критерию Стьюдента для долей. Так, между контролем и опытом №1 воздействие ПАВ концентрации 0,001% в течение 5 мин на оплодотворенные яйцеклетки статистически достоверно с вероятностью 0,999:

t_ф=8,055>t_st=3,29.

Достоверной разницы в уровне развития эмбрионов мидии в опытах №1 и №2 (концентрация ПАВ - 0,001%, продолжительность воздействия 5 и 15 мин соответственно) не обнаружено:

t_ф=1,471<t_st=1,96 при Р=0,05.

При сравнении уровня развития эмбрионов мидии в опытах №1 и №3 показано, что воздействие ПАВ концентрации 0,005% в течение 5 мин на оплодотворенные яйцеклетки по сравнению с концентрацией ПАВ 0,001% в течение 5 мин с высокой степенью вероятности (0,999) статистически достоверно:

t_ф=5,45>t_st=3,29.

Установлено также достоверное различие уровня эмбрионального развития мидии при воздействии на оплодотворенные яйцеклетки раствора порошка концентрации 0,005% в течение 5 мин по сравнению с раствором 0,001% концентрации в течение 15 мин (опыт 3 и 2):

t_ф=2,04>t_st=1,96 при Р=0,05.

Следовательно, пригодность морской воды для выращивания личинок промысловых двустворчатых моллюсков возможно определить как по: 1) - концентрации растворенных фосфатов; так и по 2) - уровню эмбрионального развития и 3) - наличию хромосомных аномалий в эмбрионах мидии Mytilus galloprovincialis.

Способ реализуется следующим образом.

Нерест мидий и оплодотворение проводится в морской воде из скважины проверенного биокачества, в которой эмбриональное развитие мидии проходит без нарушений. Чтобы исключить полиспермию через 12 мин после оплодотворения яйцеклетки промываются в профильтрованной морской воде и разделяются на равные части по объему, для соблюдения одинаковой плотности посадки эмбрионов в контроле и опытах. (Оптимальная плотность посадки оплодотворенных яйцеклеток - 50 тыс. кл./л). Часть оплодотворенных яйцеклеток переносится в морскую воду из скважины (контроль), остальные - в тестируемую воду, отобранную в месте предполагаемого забора морской воды для питомника или в районе планируемого марихозяйства. Температура морской воды в опыте и контроле поддерживается одинаковой - 14,7°С. Через 2 часа 36 мин после оплодотворения оценивается пригодность тестируемой воды: по уровню эмбрионального развития личинок, наличию или отсутствию хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, по содержанию фосфатов. Суммарное содержание минеральных и органических фосфатов в морской воде не должно превышать 12 мкг⋅л^-1. Уровень эмбрионального развития оценивается путем сравнения процентного соотношения эмбрионов мидии с двумя и четырьмя бластомерами, развитие которых происходило в контроле и в тестируемой воде. При достоверном превосходстве уровня развития эмбрионов в контроле тестируемая вода непригодна для выращивания личинок промысловых двустворчатых. Под хромосомными аномалиями в эмбриональных клетках мидии понимают полиплоидию (нерасхождение хромосом); лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза и метафазе митоза, фрагментацию хромосом в метафазе митоза выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом, образование «мостов», многополярность веретена деления хромосом; блокировку цитокинеза. Уровень эмбрионального развития, наличие или отсутствие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, а также суммарное содержание минеральных и органических фосфатов в морской воде, не превышающее 12 мкг⋅л^-1 , дают возможность оценивать пригодность морской воды для выращивания личинок мидий Mytilus galloprovincialis.

Пример 1.

Анализ морской воды, предназначенной для выращивания личинок промысловых двустворчатых моллюсков в питомнике.

Нерест мидий Mytilus galloprovincialis и оплодотворение яйцеклеток проводили в морской воде из скважины проверенного биокачества с параметрами рН=8,01; содержанием минерального фосфора - 10 мкг⋅л^-1 и отсутствием органических фосфатов, где эмбриональное развитие мидии проходило без нарушений. Через 12 мин после оплодотворения яйцеклетки промывали в профильтрованной морской воде при помощи газ-сита (56 мкм) и разделяли на равные части по объему, для соблюдения одинаковой плотности посадки эмбрионов в контроле и опытах. Соблюдали оптимальную плотность посадки оплодотворенных яйцеклеток - 50 тыс. кл./л. Затем при помощи газ-сита часть оплодотворенных яйцеклеток переносили в морскую воду из скважины (контроль), часть - в тестируемую воду, отобранную в месте предполагаемого забора морской воды для питомника. Температуру морской воды в опыте и контроле поддерживали одинаковой - 14,7°С. Через 2 часа 36 мин после оплодотворения изучали уровень эмбрионального развития, наличие или отсутствие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, развитие которых происходило в тестируемой воде. Определяли суммарное содержание минеральных и органических фосфатов в морской воде, которое составило 12 мкг⋅л^-1. При сравнении уровня эмбрионального развития мидии в контроле и в тестируемой воде достоверное различие не было отмечено.

Отсутствовали хромосомные аномалии: полиплоидия (нерасхождение хромосом); лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза и метафазе митоза, фрагментация хромосом в метафазе митоза, выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом, образование «мостов», многополярность веретена деления хромосом; блокировка цитокинеза. Следовательно, тестируемая морская вода пригодна для выращивания личинок промысловых двустворчатых моллюсков.

Источники информации

1. Алексин О.А. Основы гидрохимии [Текст]: монография. - Л.: Гидромет. Из-во, 1970. - 443 с.

2. Брагинский, Л.П. Биопродукционные аспекты водной токсикологии. [Текст]: / Л.П. Брагинский // Гидробиол. ж-л. - 1988. - 24, №3. - С. 74-83.

3. Бухштаб З.И., Мельник Л.П., Ковалёв В.М. Технология синтетических моющих средств. [Текст]: / З.И. Бухштаб // М.: «Легкая промышленность», 1988. - 320 с.

4. Методы гидрохимических исследований основных биогенных элементов [Текст]: учеб-метод, пособие / В.В. Сапожников [и др.] - М.: ВНИРО, 1988. - 119 с.

5. Неволин Ф.В. Химия и технология синтетических моющих средств. [Текст]: / Ф.В. Неволин // М.: «Легкая промышленность», 1971. - 423 с.

6. Лакин, Г.П. Биометрия [Текст]: учебное пособие. - М.: «Высшая школа», 1973. - 342 с.

7. Пиркова А.В., Ладыгина Л.В. Личинки мидии Mytilus galloprovincialis Lam. и устрицы Crassostrea gigas Th. - индикаторы биокачества морской воды. // Наук зап. Терноп. нац. пед. ун-ту. . - 2005. - Спец. випуск. , №4 (27) - С. 182-184.

8. Ходаков И.В. Метод использования ранних эмбрионов черноморской мидии для биотестирования при мониторинге прибрежных зон северозападного шельфа // Тезисы всероссийской конференции "Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)", Астрахань, 20-22 сентября, 1994. - Астрахань, 1994. - С. 352-353.

9. Холодов В.И. Выращивание мидий и устриц в Черном море [Текст]: практическое руководство / В.И. Холодов, А.В. Пиркова, Л.В. Ладыгина. - Севастополь: "DigitPrint", 2010. - 422 с.

10. Томас-Бургнер М., Молло П. Планктон и аспекты морепользования [Текст]: монография / М. Томас-Бургнер, П. Молло. - Севастополь, 2011. - 279 с.

Изобретение относится к области биологии, аквакультуре и представляет собой способ оценки пригодности морской воды для выращивания промысловых двустворчатых моллюсков, заключающийся в том, что в качестве тест-объекта оценки качества воды используют оплодотворенные яйцеклетки двустворчатых моллюсков Mytilus galloprovincialis, развитие которых осуществляют в тестируемой воде и в контроле, после чего сравнивают воздействие тестируемой среды и контроля на развитие эмбрионов, отличающийся тем, что через 12 мин после оплодотворения яйцеклетки промывают профильтрованной морской водой, разделяют на равные части и выдерживают 2 часа 36 мин в тестируемой среде и в контроле при оптимальной плотности посадки оплодотворенных яйцеклеток 50 тыс. кл./л, температуре морской воды 14,7°С, а критериями воздействия считают уровень эмбрионального развития личинок, наличие или отсутствие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, а также значение содержания минеральных и органических фосфатов в тестируемой морской воде, не превышающее 12 мкг⋅л^-1. Изобретение обеспечивает достоверную оценку биокачества морской воды для выращивания личинок промысловых моллюсков в питомнике и при выборе участков акватории моря для марихозяйств. 2 з.п. ф-лы. 1 пр., 2 табл. 7 ил.

1. Способ оценки пригодности морской воды для выращивания промысловых двустворчатых моллюсков, заключающийся в том, что в качестве тест-объекта оценки качества воды используют оплодотворенные яйцеклетки двустворчатых моллюсков Mytilus galloprovincialis, развитие которых осуществляют в тестируемой воде и в контроле, после чего сравнивают воздействие тестируемой среды и контроля на развитие эмбрионов, отличающийся тем, что через 12 мин после оплодотворения яйцеклетки промывают профильтрованной морской водой, разделяют на равные части и выдерживают 2 часа 36 мин в тестируемой среде и в контроле при оптимальной плотности посадки оплодотворенных яйцеклеток 50 тыс. кл./л, температуре морской воды 14,7°С, а критериями воздействия считают уровень эмбрионального развития личинок, наличие или отсутствие хромосомных аномалий в эмбриональных клетках мидии, а также значение содержания минеральных и органических фосфатов в тестируемой морской воде, не превышающее 12 мкг⋅л^-1.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что уровень эмбрионального развития оценивают путем сравнения процентного соотношения эмбрионов мидии с двумя и четырьмя бластомерами, развитие которых происходило в контроле и в тестируемой воде.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что под хромосомными аномалиями в эмбриональных клетках мидии понимают полиплоидию (нерасхождение хромосом); лизис гистонов хромосом в метафазе II мейоза и метафазе митоза, фрагментацию хромосом в метафазе митоза, выпадение хромосом в анафазе митоза и неравномерное деление хромосом, образование «мостов», многополярность веретена деления хромосом; блокировку цитокинеза.