СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЦЕРЕБРАЛЬНОГО СОСУДИСТОГО СПАЗМА ПРИ НЕТРАВМАТИЧЕСКОМ СУБАРАХНОИДАЛЬНОМ КРОВОИЗЛИЯНИИ IN VIVO Российский патент 2016 года по МПК G09B23/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно нейрохирургии, патологической анатомии, и может быть использовано для изучения сосудистого спазма при нетравматических субарахноидальных кровоизлияниях в эксперименте и проведения исследований терапевтической эффективности препаратов для профилактики и лечения сосудистого спазма.

Уровень техники

Из уровня техники известен способ моделирования нетравматического субарахноидального кровоизлияния у крыс (Solomon R.A., Antunes J.L., Chen R.Y., Bland L., Chien S.: Decrease in cerebral blood flow in rat after experimental subarachnoid hemorrhage: a new animal model. Stroke 16:58-64, 1985). При данной методике авторы производили однократное пункционное введение свежей артериальной аутокрови в затылочную цистерну крысы и проводили последующую оценку церебральной перфузии в сроки до 2 часов.

Однако в известном способе производится однократное введение крови в затылочную цистерну, что позволяет наблюдать изменение церебрального кровотока в острую фазу спазма. В то же время при однократном способе введения изменения в отсроченном периоде эксперимента практически отсутствуют. Указанная модель не позволяет изучать терапевтическую эффективность препаратов, специфичных к белкам крови человека.

Из уровня техники известен также способ моделирования нетравматического субарахноидального кровоизлияния у крыс (Bederson J.B., Germano I.M., Guarino L.: Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke 26:1086-1092, 1995). При данной методике авторы осуществляли эндоваскулярную перфорацию внутренней сонной артерии у крысы и оценивали изменения церебрального кровотока в первые 24 часа от эксперимента.

Однако известный способ также не позволяет наблюдать отсроченные изменения сосудистого спазма и изучать терапевтическую эффективность препаратов, специфичных к белкам крови человека.

Одним из наиболее близких способов моделирования нетравматического субарахноидального кровоизлияния у крыс является метод двухкратного введения крови (Meguro Т., Clower B.R., Carpenter R., Parent A.D., Zhang J.H. Improved rat model for cerebral vasospasm studies. Neurol Res Oct 2001; 23(7):761-6). При данной методике авторы выполняли двухкратное введение свежей артериальной аутокрови в затылочную цистерну крысы с интервалом 48 часов между введениями и оценивали морфологические изменения интракраниальных сосудов в сроки до 7 суток.

Однако при всех перечисленных методиках невозможно апробировать профилактическое и лечебное воздействие препаратов, имеющих сродство к белкам крови человека, например, фибринолитическим препаратам группы рекомбинантной стафилокиназы, которые эффективны только у некоторых видов животных и человека, но неэффективны у крыс (Species Reactivity to Staphylokinase. Exp Biol Med (Maywood) June 1949 71:261-263, Lijnen H.R., De Cock F., Matsuo O. & Collen D. Comparative fibrinolytic and fibrinogenolytic properties of staphylokinase and streptokinase in plasma of different species in vitro. Fibrinolysis 6, 33-37 (1992)).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание удобной, доступной биологической модели для изучения способов профилактики и лечения церебрального сосудистого спазма при нетравматических субарахноидальных кровоизлияниях с использованием препаратов, специфичных к белкам крови человека (например, препараты группы рекомбинантной стафилокиназы).

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является воспроизведение морфологических изменений интракраниальных сосудов при сосудистом спазме у лабораторных белых крыс, наиболее близких к таковым у человека, обеспечивающих адекватное изучение терапевтической эффективности препаратов, специфичных к белкам крови человека.

Поставленная задача решается тем, что способ моделирования церебрального сосудистого спазма при нетравматическом субарахноидальном кровоизлиянии в эксперименте включает введение в затылочную цистерну крысы крови, при этом вводят свежую человеческую венозную кровь, причем перед введением выполняют пункцию или дренирование затылочной цистерны с выведением спинномозговой жидкости.

Пункцию и введение крови выполняют под контролем частоты и глубины дыхания животного. Выведение спинномозговой жидкости из субарахноидального пространства крысы осуществляют в объеме от 0,05 до 0,2 мл в течение 3-7 мин. Введение человеческой крови в затылочную цистерну осуществляют в объеме от 0,05 до 0,25 мл в течение 5-10 мин.

В одном из вариантов выполнения изобретения возможно повторное введение крови в затылочную цистерну через время, обеспечивающее постоянное присутствие крови с момента первого введения, необходимое для развития церебрального сосудистого спазма. Указанное время составляет 24-48 ч.

После введения крови выполняют послойное ушивание раны, включающее ушивание затылочной мембраны.

В одном из вариантов исполнения при введении крови в затылочную цистерну выполняют одновременную сенсибилизацию животного путем внутривенного введения человеческой крови в объеме, не приводящем к нарушению витальных функций у крысы. Указанный объем составляет 0,5-2 мл.

Перед введением крови выполняют гепаринизацию средств введения.

Для исключения агглютинации человеческих эритроцитов агглютининами крыс перед экспериментом у 10 произвольных животных была проведена оценка групповой принадлежности по системе АВО и резус-фактор с использованием цоликлонов и проведением пробы на индивидуальную совместимость со всеми группами человеческой крови. Помимо этого, перед каждым введением человеческой крови проводили пробу на индивидуальную совместимость. Агглютинации между сывороткой крысы и эритроцитами человека не наблюдали ни в одном случае, что позволяет предположить, что человеческие эритроциты не агглютинируют под воздействием плазмы крови крыс.

При сравнительной эффективности интрацистернального введения препаратов рекомбинантной стафилокиназы с последующим наружным дренированием цереброспинальной жидкости на модели с использованием свежей аутокрови у крыс нами были получены данные, говорящие об отсутствии фибринолитической активности как местно (в затылочной цистерне), так и системно (влияние на параметры гемостаза).

По предварительным данным интрацистернальное применение препаратов рекомбинантной стафилокиназы на модели введения человеческой крови в затылочную цистерну на 3-4-е сутки эксперимента с последующим наружным дренирование цереброспинальной жидкости в объеме, не приводящем к нарушению витальных функций крысы (0,3-1,5 мл спинномозговой жидкости в сутки), снижает выраженность морфологических изменений при сосудистом спазме как в стенке интракраниальных сосудов, так и в ткани мозга.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется фотографиями изображения объекта исследования в эксперименте, где на фиг. 1 показана верификация САК: А - мозг интактного животного; Б - мозг изъят через 30 мин после введения 0,25 мл аутокрови в затылочную цистерну; на фиг. 2 - верхняя треть основной артерии (увеличение ×400), контроль, А - окраска гематоксилином и эозином, Б - окраска по Грамм-Вейгерту, на изображениях позициями обозначены: 1 - ядра эндотелиоцитов, 2 - ВЭМ, 3 - ГМК. Соответствует нормальному строению верхней трети основной артерии крысы; на фиг. 3 показана верхняя треть основной артерии на 5-е сутки после двухкратного введения крови (увеличение ×400), А - окраска гематоксилином и эозином, Б - окраска по Lie, на изображениях позициями обозначены: 1 - ядра эндотелиоцитов, 2 - ВЭМ, 3 - ГМК (имеются признаки вакуолизации цитоплазмы). Отмечается резкое сужение просвета сосуда, значительное утолщение стенки артерии, сближение ядер эндотелиоцитов. ВЭМ имеет выраженно извитые контуры, в цитоплазме ГМК - распространенная гидропическая дистрофия; на фиг. 4 представлено изображение верхних отделов моста крысы (окраска по Lie, увеличение ×1000), А - 3-и сутки после введения крови, Б - 7-е сутки после введения крови, на изображениях позициями обозначены: 4 - капилляры с сохраненным током крови (на фиг. А - полнокровные, на фиг. Б - со спавшимся просветом), 5 - зоны выраженного периваскулярного отека.

Осуществление изобретения

Ниже представлено подробное описание осуществления изобретения и результаты морфологических исследований полученной модели церебрального сосудистого спазма при двукратном введении в затылочную цистерну крысы свежей человеческой венозной крови. При этом данное подробное описание не ограничивает заявляемое изобретение, т.к. в эксперименте был получен заявленный результат и при однократном введении крови.

1. Анестезия

Обезболивание животных осуществляли по следующей методике.

Крысу помещали в замкнутую емкость, на дне которой уложена гигроскопичная вата, пропитанная диэтиловым эфиром. Через 1-2 мин крыса засыпала. После этого выполняли премедикацию для потенцирования основного наркоза: внутримышечно в область бедра инсулиновым шприцем вводили следующие препараты: дроперидол - 0,3 мг/кг массы тела (0,03 мл 0,25% раствора), димедрол 1,2 мг/кг массы тела (0,03 мл 1% раствора), атропин - 0,012 мг/кг массы тела (0,03 мл 0,1% раствора). Через 15 мин после премедикации в область бедра другой лапки крысы вводили следующие препараты: «золетил 100» - 24 мг/кг массы тела (0,06 мл раствора), ксилазин - 3,2 мг/кг массы тела (0,04 мл 2% раствора). Как правило, крыса засыпала в течение 5-15 мин. Оценку глубины анестезии проводили по выраженности корнеального рефлекса. При необходимости через 20 мин добавляли 0,02-0,04 мл «золетил 100».

2. Техника операции

Введение крови в затылочную цистерну (выполняли на 1-е и 2-е сутки эксперимента с интервалом между введениями 24 часа). Животное фиксировали на операционном столике и брили область операции. После обработки кожи растворами антисептиков выполняли срединный разрез от области затылочного возвышения до остистого отростка VI-VII шейного позвонков. Мышцы шеи для снижения кровоточивости и потенцирования наркоза инфильтрировали комбинированным местным анестетиком «Ультракаин ДС 1:200000» (артикаина гидрохлорид 40 мг/мл + эпинефрина гидрохлорид 6 мг/мл) в разведении с физиологическим раствором 1:5. Далее мышцы в месте их прикрепления к черепу отсекали и скелетировали чешую затылочной кости, атлантоокципитальную мембрану и дугу I шейного позвонка. Выполняли пункцию затылочной цистерны с выведением 0,05-0,2 мл спинномозговой жидкости в течение 3-7 мин под контролем частоты и глубины дыхания животного. После этого в затылочную цистерну в течение 5-10 мин вводили 0,05-0,2 мл свежей человеческой венозной крови под контролем частоты и глубины дыхания животного. Для того чтобы большая часть крови скапливалась в области базальных цистерн, животное оставляли на 20 мин с опущенным на 20°-30° головным концом. После этого рану послойно ушивали. При необходимости компенсации кровопотери подкожно вводили смесь 5% раствора глюкозы и 0,9% раствора хлорида натрия объемом до 5-10 мл.

3. Оценка неврологического статуса

Оценку неврологического статуса проводили 1 раз в сутки в течение 7 дней после введения крови по методике, предложенной J.B. Bederson с соавт. (1986) [Bederson J.B., Pitts L.H., Tsuji M., Nishimura M.C., Davis R.L., Bartkowski H.: Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 17:472-476, 1986] по 4-балльной шкале:

0 баллов - отсутствие неврологических нарушений

1 балл - крыса малоподвижна, вяло реагирует на прикосновение. Очаговая неврологическая симптоматика отсутствует

2 балла - имеется изолированный парез одной конечности (при приподнимании животного за хвост активность движений в одной из конечностей снижена)

3 балла - имеется односторонний гемипарез (при подталкивании животного в бок оно заваливается на пораженную сторону)

4 балла - имеется односторонняя гемиплегия (животное не может активно передвигаться, при движении вперед отмечается выраженное отклонение в пораженную сторону - движение по кругу).

По нашим данным изменения неврологического статуса наблюдались в течение первых суток после любого вмешательства под наркозом до 1 балла и не были связаны с проявлением сосудистого спазма

4. Морфологическое исследование

Перед изъятием головного мозга животное усыпляли смесью препаратов «золетил 100» (0,4 мл), ксилазина гидрохлорид (0,3 мл 2% р-ра) и рокурония бромида (0,1 мл 1% р-ра). По имевшемуся разрезу рану вскрывали. Выполняли декапитацию на уровне III-IV шейного позвонков, вскрывали черепную коробку и, по возможности не травмируя твердую и мягкую мозговую оболочки, извлекали препарат головного мозга вместе с верхнешейным отделом спинного мозга. Далее препарат помещали на 24 ч в 5% р-р формалина и заливали в парафин. Для морфологического исследования использовали срезы на уровне верхней трети базилярной артерии.

Окраску парафиновых срезов осуществляли следующими способами:

- Обзорная: гематоксилином и эозином,

- Для оценки состояния эластических волокон стенки артерии: по Грамм-Вейгерту (определение морфологического типа стенки базилярной артерии),

- Для оценки состояния сократительного аппарата гладкомышечных клеток (миофибрилл): по Lie.

Описание микропрепаратов проводили на светооптическом микроскопе Leica DM 1000 при увеличении 400-1000 раз, микрофотосъемку выполняли на цифровой камере Leica ЕС 3.

Были получены прямые качественные признаки церебрального сосудистого спазма в виде характерных морфологических изменений интракраниальных сосудов и ишемических изменений ткани мозга.

При исследовании верхней трети базилярной артерии у крыс после двухкратного введения аутокрови в затылочную цистерну были выявлены следующие изменения:

4-е сутки - морфологически прослеживались признаки умеренного спадения просвета сосуда без значительного утолщения стенки основной артерии и изменений внутренней эластической мембраны (ВЭМ). При окрасках по Lie и MSB выявлялись признаки гиперконтрактурных изменений гладкомышечных клеток (ГМК).

5-е сутки - отмечали утолщение стенки сосуда, подчеркнутую извитость эластической мембраны с углублением ее складок, сужением межскладочных промежутков, сближением эндотелиоцитов с выступающими в просвет ядрами, ориентированными по верхушкам сладок ВЭМ. При гистохимической реакции (окраска по Lie) в цитоплазме ГМК появлялись признаки дистрофических изменений от очаговой до распространенной гидропической дистрофии цитоплазмы в виде перинуклеарной и внутриклеточной вакуолизации, а также признаки внутриклеточной фуксинофилии цитоплазмы, указывающие на гиперконтрактурные изменения сократительных миофибрилл.

6-е и 7-е сутки - отмечали умеренное спадение просвета сосуда с распространенными дистрофическими изменениями цитоплазмы ГМК, как проявления остаточных признаков нарушения сократительной способности миоцитов при разрешении спазма.

Помимо этого, были выявлены признаки нарушения капиллярного кровотока в ткани мозга крысы, что является прямым признаком ишемии мозга на микроциркуляторном уровне.

Предложенный способ может быть использован для апробации методов профилактики и лечения церебрального сосудистого спазма в эксперименте, в том числе при интратекальном введении препаратов и использовании препаратов, имеющих сродство к белкам крови человека.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно нейрохирургии, патологической анатомии, и может быть использовано для изучения сосудистого спазма при нетравматических субарахноидальных кровоизлияниях. Способ включает введение в затылочную цистерну крысы свежей человеческой венозной крови. Причем перед введением выполняют пункцию или дренирование затылочной цистерны с выведением спинномозговой жидкости. После первого введения крови осуществляют повторное введение крови в затылочную цистерну через время, обеспечивающее постоянное присутствие крови с момента первого введения, необходимое для развития церебрального сосудистого спазма. Способ обеспечивает воспроизведение морфологических изменений интракраниальных сосудов, наиболее близких к таковым у человека, и возможность изучения сосудистой активности препаратов, специфичных к белкам крови человека. 8 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ моделирования церебрального сосудистого спазма при нетравматическом субарахноидальном кровоизлиянии в эксперименте для изучения сосудистой активности препаратов, специфичных к белкам крови человека, включающий введение в затылочную цистерну крысы свежей крови, отличающийся тем, что вводят свежую человеческую венозную кровь, причем перед введением выполняют пункцию или дренирование затылочной цистерны с выведением спинномозговой жидкости, после первого введения крови осуществляют повторное введение крови в затылочную цистерну через время, обеспечивающее постоянное присутствие крови с момента первого введения, необходимое для развития церебрального сосудистого спазма.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пункцию или дренирование затылочной цистерны и введение крови выполняют под контролем частоты и глубины дыхания животного.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выведение спинномозговой жидкости из субарахноидального пространства крысы осуществляют в объеме от 0,05 до 0,2 мл в течение 3-7 мин.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение человеческой крови в затылочную цистерну осуществляют в объеме от 0,05 до 0,25 мл в течение 5-10 мин.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что повторное введение крови осуществляют через 24-48 ч после первого введения.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после введения крови выполняют послойное ушивание раны, включающее ушивание затылочной мембраны.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при введении крови в затылочную цистерну выполняют одновременную сенсибилизацию животного путем внутривенного введения человеческой крови в объеме, не приводящем к нарушению витальных функций у крысы.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанный объем составляет 0,5-2 мл.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед введением крови выполняют гепаринизацию средств введения.