4,6-ДИ(3,12-ДИАЗА-6,9-ДИАЗОНИАДИСПИРО[5.2.5.2]ГЕКСАДЕКАН-1-ИЛ)-2-МЕТИЛ-5-НИТРОПИРИМИДИН ТЕТРАХЛОРИД ДИГИДРОХЛОРИД ГЕКСАГИДРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A61K9/10 A61K31/499 A61K31/505 A61P31/22 

Изобретение относится к применению 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропириллидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, обладающего активностью в отношении вируса герпеса, для предупреждения и лечения герпетической инфекции человека и животных с использованием местного способа применения.

Несмотря на многочисленные исследования в области вирусологии проблемы герпес-вирусных инфекций (ГВИ), в особенности ассоциированных с вирусом простого герпеса (Herpes simplex) 1 и 2 типа (ВПГ-1 и ВПГ-2), не теряют своей актуальности и медико-социальной значимости. В структуре инфекционно-вирусных поражений человека ГВИ занимают 2-е место, уступая лишь гриппу. ГВИ способны поражать практически все органы и системы макроорганизама, вызывая латентную, острую и хроническую инфекции.

Данные о распространенности ГВИ, приводимые в литературе, значительно варьируют, что по всей видимости связано с различиями в демографических и клинических характеристиках исследуемых групп больных, использованными методами диагностики. С одной стороны, по данным ряда исследователей, ГВИ клинически проявляется у 20-25% инфицированных, с другой стороны, результаты научных работ показывают, что клинические симптомы ГВИ проявляются в 60-70% случаев. В Российской Федерации широкомасштабных эпидемиологических исследований распространенности ГВИ не проводилось. Однако данные выборочного эпидемиологического исследования среди лиц в возрастной группе от 14 до 64 лет свидетельствуют о том, что частота распространения ВПГ 1 типа достигает 99,4% [Хрянин А.А. с соавт. Многолетние тенденции в распространенности вируса простого герпеса в Сибири. В помощь практическому врачу. 2010. №5] Официальная статистика о распространенности ГВИ, вызванной ВПГ-2, регистрируется в России только с 1993 года. Результаты анализа данных ежегодного государственного статистического наблюдения свидетельствуют о том, что на фоне сокращения заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем (ИППП), наблюдается рост показателей заболеваемости ГВИ урогенитального тракта. Такая же ситуация, по данным ВОЗ, наблюдается и по причинам смертности от вирусных инфекций: 35,8% - вирус гриппа и 15,8% - ВПГ. По различным оценкам, в США ежегодно регистрируется до 98 млн случаев лабиального герпеса и 20 млн случаев рецидивирующего герпеса гениталий, 500 тыс. случаев офтальмогерпеса и более 5 тыс. случаев герпетического энцефалита, около 1 тыс. случаев герпеса новорожденных. По сравнению с 80-ми годами к концу тысячелетия число зарегистрированных больных герпесом возросло в США на 13-40%, странах Европы на 7-16%, а в Африке на 30-40%. Сравнительный анализ данных NHANES I и NHANES II показал, что заболеваемость выросла в равных пропорциях во всех возрастных группах.

В настоящее время известны следующие группы противогерпетических препаратов [De Clercq Е. The discovery of antiviral agents: Ten different compounds, ten different stories. Med Res Rev 2008; 28: 929-953; De Clercq E. Antiviral drug discovery: Ten more compounds, and ten more stories (part B). Med Res Rev 2009; 29: 571-610; De Clercq E. Another ten stories in antiviral drug discovery (part C): "Old" and "new" antivirals, strategies and perspectives. Med Res Rev 2009; 29: 611-645; De Clercq E. Yet another ten stories on antiviral drug discovery (part D): Paradigms, paradoxes and paraductions. Med Res Rev 2010; 30: 667-707; De Clercq E. The next ten stories on antiviral drug discovery (part E): Advents, advances andadventures. Med Res Rev 2011; 31: 118-160]: класс аномальных нуклеозидов, производные фосфонуксусной и фосфонформатной кислот, производные адамантана гидрохлорида, гетероциклические производные, препараты растительного происхождения, интерферон и его индукторы, вакцины.

Класс аномальных нуклеозидов - наиболее изученный и обширный класс противогерпетических соединений и включает в себя пиримидиновые аналоги нуклеозидов, к которым относится идоксуридин (ИДУ) для химиотерапии герпес-вирусных инфекций, вызванных ВПГ, в офтальмологии (для лечения и профилактики герпетического кератита); пуриновые аналоги нуклеозидов, с наиболее известным представителем Видарабином, который был рекомендован для системного назначения при герпетическом энцефалите, однако, утратил свое значение из-за высокой токсичности: в высоких дозах обладал канцерогенным, мутагенным и тератогенным действием; производные азотистых гетероциклов - к этой группе относится химиопрепарат виразол (рибавирин) [Smith DB, Martin JA, Klumpp K, Baker SJ, Blomgren PA, Devos R, Granycome C, Hang J, Hobbs CJ, Jiang WR, Laxton C, Le Pogam S, Leveque V, Ma H, Maile G, Merrett JH, Pichota A, Sarma K, Smith M, Swallow S, Symons J, Vesey D, Najera I, Cammack N. Design, synthesis, and antiviral properties of 4_-substituted ribonucleosides as inhibitors of hepatitis С virus replication: The discovery of R1479. Bioorg Med Chem Lett 2007; 17: 2570-2576] - активен в отношении ДНК и РНК-содержащих вирусов (вирусы гриппа A и B, парагриппа, кори, ВПГ I и II типов, варицелла зостер и др.). Обладает рядом серьезных токсических эффектов: оказывает отрицательное влияние на костный мозг.

Ациклические аналоги пуриновых нуклеозидов - наиболее ярким представителем является ацикловир и его производные валацикловир, пенцикловир, фамцикловир, ганцикловир, цидофовир. Это класс соединений, аналогов гуанозина и аденозина, в которых сохранен фрагмент нуклеинового основания. Противогерпетические препараты этого класса (для местного и системного действия) высокоспецифичны и малотоксичны. В инфицированной клетке в процессе копирования материнской вирусной ДНК ацикловир после трехшагового фосфорилирования, выполненного на первом этапе вирусной тимидинкиназой (монофосфорилирование), а на втором и третьем этапе клеточной тимидинкиназой, подхватывается вирусной ДНК-полимеразой и встраивается в цепи строящихся ДНК для дочерних вирионов. В связи с тем, что ацикловир лишен, в отличие от природного гуанозина, 3-гидроксильной группы, необходимой для присоединения к нему следующего нуклеозида из состава цепи, при его раннем включении в синтез ДНК, этот процесс обрывается в самом начале, сборка дочерних вирусных ДНК останавливается и новые вирусные частицы просто не формируются. Очень важно, что, будучи включенным в какой-либо участок новой ДНК, ацикловир никогда не заменяется естественным гуанозином. Применение нуклеозидов обрывает процесс репликации герпес-вирусов на любой стадии, новые генерации вирусов не образуются, и собственно распространение инфекции приостанавливается. Оставшееся в организме ограниченное количество антигенов герпес-вирусов позволяет иммунной системе без помех разобраться в их типах и репертуаре, что приводит к формированию полноценного иммунитета у всех людей с нормально функционирующей иммунной системой. Другие ациклические нуклеозиды [Sofia MJ, Bao D, Chang W, Du J, Nagarathnam D, Rachakonda S, Reddy PG, Ross BS, Wang P, Zhang HR, Bansal S, Espiritu C, Keilman M, Lam AM, Steuer HM, Niu C, Otto MJ, Furman PA. Discovery of a-d-2-deoxy-2-fluoro-2-C-methyluridine nucleotide prodrug (PSI-7977) for the treatment of hepatitis С virus. J Med Chem 2010; 53: 7202-7218; Furman PA, Murakami E, Niu C, Lam AM, Espiritu C, Bansal S, Bao H, Tolstykh T, Micolochick Steuer H, Keilman M, Zennou V, Bourne N, Veselenak RL, Chang W, Ross BS, Du J, Otto MJ, Sofia MJ. Activity and themetabolic activation pathway of the potent and selective hepatitis С virus pronucleotide inhibitor PSI-353661. Antiviral Res 2011; 91: 120-132; Reddy PG, Chun BK, Zhang HR, Rachakonda S, Ross BS, Sofia MJ. Stereoselective synthesis of PSI-352938: A.-D-2-deoxy-2-fluoro-2-C-methyl-3,5-cyclic phosphate nucleotide prodrug for the treatment of HCV. J Org Chem 2011; 76: 3782-3790; Lam AM, Espiritu C, Murakami E, Zennou V, Bansal S, Micolochick Steuer HM, Niu C, Keilman M, Bao H, Bourne N, Veselenak RL, Reddy PG, Chang W, Du J, Nagarathnam D, Sofia MJ, Otto MJ, Furman PA. Inhibition of hepatitis С virus replicon RNA synthesis by PSI-352938, a cyclic phosphate prodrug of D-2-deoxy-2-fluoro-2-C-methylguanosine. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55: 2566-2575] используют тот же принцип действия, но ориентированы на другие ферментные группы герпес-вирусов. Однако оказалось, что некоторые химиотерапевтические препараты обладают сильными побочными действиями и неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами, что ограничивает показания и/или возможность их применения либо по возрастным, либо по клиническим критериям.

Производные пиримидиндиспиротрипиперазиния (4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат), обнаруженные в результате работ по мишень-направленному поиску новых лекарственных препаратов, обладают способностью специфически блокировать гепарансульфат (HS) содержащие рецепторы на клеточной стенке и таким образом предотвращать адсорбцию вирусов к клеткам хозяина. Наиболее известными патогенными вирусами, использующими такой механизм адсорбции к клеточной стенке, являются вирусы герпеса 1 и 2 типа, папилломы вируса, цитомегаловируса, некоторые разновидности ВИЧ, респираторный синцитиальный вирус и другие.

Механизм действия производных диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадеканов был изучен на примере вируса герпеса 1-го типа (HSV-1) и клеток почек зеленых обезьян, и доказано, что он связан со специфическим свойством соединений связываться с HS, что приводит к драматическому уменьшению числа репликаций вируса. Показано, что присоединение исследуемых веществ антагонизируется гепарином. Мишенью диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадеканов являются две сульфатные группы, расположенные в соседних сахаридных остатках, так, например, для GlcA2S-GlcNS6S, GlcA2S-GlcNS3S, IdoA2S-GIcNAc6S, IdoA2S-GlcNH23SS6S, IdoA2S-GlcNS6S и IdoA2SGlcNS3S наблюдается хорошее электростатическое взаимодействие между отрицательным зарядом на сульфатной группе и положительно заряженными атомами азота 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат. Также показано, что аналогичного рода взаимодействие может происходить и с карбонильной группой октасахарида ΔUA-GlcNSldoUA2S-GlcNAc-UA2S-GlcNS-IdoUA2S-GlcNH23S, являющейся необходимым участком HS для проникновения HSV-1 в клетку хозяина. Таким образом, диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадеканы блокируют ключевые функциональные группы HS, предотвращая репликацию вируса, обеспечивая высокую противовирусную активность [Schmidtke М., Riabova О., Dahse Н.-М., Stelzner A., Makarov V., Synthesis, Cytotoxicity and Antiviral Activity of N,N′-bis-5-nitropyrimidyl Derivatives of Dispirotripiperazine, Antiviral Research, 2002, 55, 117-127; Schmidtke M., Karger A., Meerbach A., Egerer R., Stelzner A., Makarov V., Binding of a N,N′-bisheteryl derivative of dispirotripiperazine to heparan sulfate residues on the cell surface specifically prevents infection of viruses from different families, Virology, 2003, V. 311, p. 134-143; Schmidtke, M., Wutzler, P., Makarov, V. Novel opportunities to study and block interactions between viruses and cell surface heparan sulfates, Lett. Drug Design Discov., 2004, 1, p. 293-300].

При системном, в основном пероральном введении противогерпетического агента для лечения требуется продолжительное лечение, а также введение высоких доз (до 1000 мг/сут) противовирусного агента. Недостаток местных лекарственных форм, таких как гели, кремы, растворы, лосьоны, лаки и т.п., заключается в том, что фармацевтически активный агент находится в недостаточно близком контакте с пораженном участком. Правильное проведение комплексного лечения с применением противовирусных препаратов, различающихся по механизму и спектру действия, является одной из важнейших задач, связанной с герпетической патологией человека.

Задача настоящего изобретения состояла в изыскании лекарственной формы, содержащей 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро-[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, которая бы обладала высокой активностью в отношении герпетической инфекции, в том числе к штаммам, резистентным к существующим в настоящее время лекарственным препаратам. Результатом решения данной задачи явилась разработка крема, содержащего 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, обладающего противогерптической активностью.

Указанная задача и результат достигаются за счет использования фармацевтической композиции для лечения герпес-вирусной инфекции в виде крема, содержащей в качестве активного вещества 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата от 0,5 до 10,0%. Другой вариант предусматривает, что заявлена фармацевтическая композиция для лечения герпес-вирусной инфекции в виде геля, содержащая в качестве активного вещества 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата от 0,5 до 10,0%. Также заявлено применение фармацевтической композиции в виде вышеуказанного крема, согласно которому крем обладает противогерпесной активностью в отношении штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2, в том числе резистентных к существующим в настоящее время лекарственным препаратам.

Также заявлен способ лечения или предупреждения герпетической инфекции у человека или животного, включающий местное введение пациенту фармацевтической композиции по п. 1 и/или п. 2 в эффективном количестве.

Введение 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата в виде фармацевтической композиции или лекарственного средства на его основе при лечении или профилактике людей или животных может осуществляться обычными методами в виде форм, пригодных для наружного применения, например в форме мазей, кремов, паст, лосьонов и линиментов, помещенных в упаковку, или пластырей.

В качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ в составе фармацевтической композиции согласно изобретению могут быть использованы любые фармацевтически приемлемые компоненты, которые совместимы с активным ингредиентом, не наносят вреда пациентам и традиционно используются для приготовления лекарственных форм. К ним относятся, например, наполнители, связующие агенты, пластифицирующие агенты, такие как камфора, трифенилфосфат или пентанил диизобутират, диизобутилфталат и др., пигменты, солюбилизирующие агенты, стабилизаторы, разбавители, адъюванты, консерванты, компоненты буферных систем, растворители, диспергирующие агенты, консерванты, загустители, пищевые красители, эмульгаторы, пленкообразующие вещества, такие как гидроксиэтил или пропилцеллюлоза, гидроксипропилхитозан, пролонгаторы, вещества, способствующие улучшению проникновения лекарственного средства, например бензиловый спирт, и др. Фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами являются, например, гуммиарабик, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, альгиновая кислота, альгинат натрия, безводная кремниевая кислота, стеарат магния, тальк, карбоксивиниловый полимер, оксид титана, эфир жирной кислоты и сорбита, натрия лаурилсульфат, глицерин, глицериновый эфир жирной кислоты, ланолин, глицерожелатин, полисорбат, макрогол, растительное масло, воск, парафины, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вода, этанол, полиспирты, полиоксиэтиленгидрированное касторовое масло, хлорид натрия, гидроксид натрия, соляная кислота, двухосновный фосфат натрия, моноосновный фосфат натрия, лимонная кислота, глутаминовая кислота, бензиловый спирт, метил п-оксибензоат, этил п-оксибензоат и др.

Композиция для местного применения может также содержать в качестве вспомогательного вещества растительное масло, такое как масло жожоба, оливковое масло, подсолнечное масло, соевое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, миндальное масло, пальмовое масло, кокосовое масло или косточковое пальмовое масло. Композиция может содержать в качестве эмульгаторов, например, глицерин, возможно, в смеси в смеси с лауратами сахарозы или сорбитол, эмульгатор М/В (масло/вода), например гидролизат растительного белка.

Композиция может быть использована также в форме линимента (лат. linimentum) - густой или студнеобразной лекарственной формы для наружного применения, которая втирается в кожу. В качестве вспомогательных веществ линимент может содержать, например, пропиленгликоли, бензалкония хлорид. Эмульсионные жирные линименты могут иметь структуру эмульсий типа "масло в воде" или "вода в масле". Эмульсионные линименты, так же как суспензионные, нуждаются в стабилизации, которую можно повысить с помощью эмульгатора, например эмульгатора Т-2 (эмульгатор Т-2 представляет собой сложные эфиры жирной кислоты и полимера глицерина), Твина 80 и других ПАВ. В некоторых случаях эмульгаторы могут образовываться в результате взаимодействия ингредиентов, входящих в состав линимента.

Фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами при получении фармацевтической композиции для наружного применения являются, например, природные или отверженные масла, например масло какао, воска, жиры, эфир глицерина и насыщенной жирной кислоты, глицерожелатин, макрогол, полужидкие или жидкие полиолы, триглицериды и др. Основа фармацевтической композиции для наружного применения может включать также поверхностно-активное вещество или стабилизатор.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показано течение экспериментальной герпес-вирусной инфекции у морских свинок на фоне лечения кремом при местном применении.

На Фиг. 2 показано течение экспериментальной герпес-вирусной инфекции у морских свинок на фоне лечения препаратом в виде геля при местном применении.

Осуществление изобретения

Соединение 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат может быть получено в соответствии со следующим протоколом синтеза.

Получение гидрохлорида N-бензоилпиперазина

К 10 г (0,116 моль) безводного пиперазина добавляют 45 мл уксусной кислоты при охлаждении и интенсивном перемешивании. Затем добавляют 20 мл ацетона и 20 мл воды. Через 20 мин перемешивания добавляют 6,7 мл (0,058 моль) хлористого бензоила. Раствор перемешивают 3 ч. Затем реакционную массу упаривают на половину. Добавляют 450 мл 40% раствора NaOH. Выпавший осадок отфильтровывают, водный маточный раствор экстрагируют хлороформом 3 раза по 100 мл. Высушивают. Упаривают досуха. Получают 13,4 г желтого масла, содержащего около 60% основного вещества.

Полученное масло растворяют в 5 мл воды, раствор нагревают до 45°C и при перемешивании добавляют 0,78 мл формалина порциями по 0,25 мл через каждые 10 мин. После прибавления формалина перемешивают 40 мин при 55°C. Охлаждают до 7°C и выдерживают при этой температуре 1,5 часа. Осадок отфильтровывают и промывают водой 3 раза. Сушат при 80°C 15 часов. Получают 6,7 г метилен-бис-4(1-бензоилпиперазина). Перед следующей стадией продукт измельчают. Т_пл=125-127°C.

К суспензии 6,6 г измельченного метилен-бис-4(1-бензоилпиперазина) в 35 мл этилового спирта при интенсивном перемешивании и охлаждении до 10-15°C прикапывают 12% спиртовой раствор хлористого водорода до рН=1-2. Далее выдерживают реакционную массу 3 часа при 10°C. Осадок отфильтровывают и промывают этиловым спиртом по 50 мл 4 раза. Сушат при 80°C 10 часов. Получают 5,9 г продукта. Т_пл=274°C с разложением. Получение гидрохлорида N-бензоил-N′-(2-оксиэтил)пиперазина.

К раствору КОН (0,024 моль) в 14 мл этилового спирта добавляют при перемешивании гидрохлорид N-бензоилпиперазина (0,02 моль) и перемешивают 1 час. В полученную суспензию прибавляют этиленхлоргидрин (0,05 моль) и начинают прикапывать раствор КОН (0,052 моль) в 25 мл этилового спирта. При этом температуру в реакционной массе поддерживают не более 20°C. После прибавления раствора КОН реакционную массу перемешивают 20 часов. Отфильтровывают KCl, к маточному раствору добавляют 12% спиртовой раствор хлористого водорода до рН=1-2 и охлаждают при -5°C в течение 5 часов. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом. Сушат при 50°C 5 часов. Выход продукта составляет 70%. Т_пл=207-210°C.

Получение гидрохлорида N-бензоил-N′-(2-хлорэтил)пиперазина

К суспензии гидрохлорида N-бензоил-N′-(2-оксиэтил)пиперазина (0,013 моль) в 22 мл хлороформа при перемешивании прикапывают тионилхлорид (0,028 моль) и медленно нагревают. Выдерживают 30 мин при 45°C, 30 мин при 45°C и 3 часа при 70°C. При этом выпадает осадок сначала в виде масла, а затем затвердевает в кристаллическую массу. Реакционную массу охлаждают до 6-8°C и перемешивают при этой температуре 1 час. Осадок отфильтровывают, промывают хлороформом 3 раза по 10 мл. Сушат при 70°C 10 часов. Выход продукта 72%. Т_пл=226-227°C.

Получение дигидрохлорида N,N-дибензоила-N′,N′′-диспиротрипиперазиния

К раствору NaOH (0,017 моль) в 25 мл этилового спирта прибавляют гидрохлорид N-бензоил-N′-(2-оксиэтил)пиперазина (0,0156 моль). Перемешивают суспензию 1,5 часа. NaCl отфильтровывают. Маточный спиртовой раствор кипятят 1 час. Затем упаривают и сухой остаток нагревают на масляной бане 10 часов. Температура бани 120°C. Охлаждают до комнатной температуры, добавляют этиловый спирт и осадок отфильтровывают. Промывают этиловым спиртом. Сушат при 100°C 3 часа. Выход продукта 60%. Т_пл более 300°C с разложением.

Получение 3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекана дихлорида дигидрохлорида

Смесь дигидрохлорида N,N′′′-дибензоила-N′,N′′-диспиротрипиперазиния (0,002 моль) и 7 мл 10% соляной кислоты кипятят 4 часа. Охлаждают до 15°C и отфильтровывают бензойную кислоту, промывают водой. Маточный раствор упаривают досуха, добавляют метиловый спирт. Осадок отфильтровывают и промывают метанолом. Сушат при 90°C 5 часов. Выход продукта 85%. Т_пл более 300°C с разложением.

Получение 3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекана дихлорида

К суспензии 3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекана дихлорида дигидрохлорида (0,0017 моль) в 3 мл воды добавляют LiOH (0,0033 моль). При этом контролируют рН=8,5-9. Через 30 мин в реакционную массу добавляют активированный уголь, перемешивают 20 мин. Отфильтровывают уголь, к фильтрату добавляют 25 мл метилового спирта и оставляют на 16 часов при 5-10°C. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают метанолом и сушат при 90°C 3 часа. Выход составляет 90%. Т_пл более 320°C с разложением.

Получение 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорида

К раствору 4,6-дихлоро-2-метил-5-нитропиримидина (0,12 моль) в 940 мл этилового спирта добавляют раствор 3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекана дихлорида (0,24 моль) в 220 мл воды при интенсивном перемешивании. Суспензию нагревают 4 часа при 70°C. Охлаждают до комнатной температуры, осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом. Сушат при 110°C 18 часов и затем на воздухе 4 суток. Выход 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорида 87%.

Т_пл=216-220°C с разложением.

MS (m/z): 694 (М+) C₂₉H₅₃Cl₃N₁₁O₂ (М+)

Микроэлементный анализ, %

Рассчитано: C₂₉H₆₇Cl₆N₁₁O₈: С, 38.25; Н, 7.42; Cl 23.36; N, 16.92

Найдено: С, 38.44; Н, 7.38; Cl 22.98; N, 16.78

Анализ воды по Фишеру

Рассчитано: 11.86%

Найдено: 11.72%

Примеры получения фармацевтических композиций в виде различных форм, пригодных для использования в качестве наружного лекарственного средства и содержащих 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]-гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид

Пример 1. Приготовление фармацевтической композиции в форме крема

Активное вещество 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат 10,0 г Вазелин 10,0 г Полоксамер (Эмуксол 268) 8,0 г Воск эмульсионный 3,0 г Сорбитан моностеарат (Спан-60) 0,5 г Сорбиновая кислота 0,125 г Вода очищенная до 100,0 мл

Растворяют активное вещество, полоксамер и сорбиновую кислоту в 50 мл воды, при энергичном перемешивании добавляют воск эмульсионный и сорбитан моностеарат, затем выдерживают. Получают крем, который далее может быть использован в качестве противовирусного средства.

Пример 2. Фармацевтическая композиция в виде геля

Соединение 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат 10,0 г Метилцеллюлоза-35 7,5 г Сорбиновая кислота 0,150 г Вода до 100,0 г

В 50 мл воды растворяют действующее вещество, добавляют метилцеллулозу-35 и сорбиновую кислоту и при энергичном перемешивании добавляют оставшуюся воду и затем выдерживают для разбухания. Получают гель, который далее может быть использован в качестве противовирусного средства.

Пример 3. Приготовление фармацевтической композиции в форме мази

Мазь может быть изготовлена следующим образом: 0,5-3% вес. от общей массы активного вещества расплавляют в небольшом количестве мазевой, кремовой или свечной основе. Получившийся расплав тщательно перемешивают с необходимым количеством основы, разогретой до (35-80)°C. Полученную смесь гомогенизируют. Готовую смесь в растопленном состоянии разливают в тубы.

Пример 4. Приготовление фармацевтической композиции в форме линимента

Линимент получают в виде 5% прозрачной жидкости желтого цвета, со слабым специфическим запахом, содержащей: 1-2 мг активного соединении формулы (I), 50 мг бензалкония хлорида и 1,2-пропиленгликоля. Пропиленгликоль используется в качестве увлажнителя.

Пример 5. Фармацевтическая композиция в виде жирного эмульсионного линимента

3 г активного вещества, кремния диоксид коллоидный (аэросил) 5 г, касторовое масло 89 г. Возможно добавление эмульгатора, например эмульгатора Т-2 или Твина 80.

Описание противовирусной активности крема по изобретению

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучаемые препараты

В исследованиях использованы 10% крем (Пример А) и 10% гель (Пример Б), приготовленные на основе субстанции соединения 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, далее субстанции.

В качестве препарата сравнения использовали ацикловир (9-(2-гидроксиэтоксиметил) гуанин) - препарат в форме крема для наружного применения Зовиракс, содержащий 5% ацикловира (GlaxoSmithKline, «ГлаксоСмитКляйн Консьюмер Хелскер», Великобритания). В качестве плацебо в опытах с морскими свинками использовали крем и гель такого же состава без субстанции активного вещества.

Животные

Самцов морских свинок массой 250-300 г получали из питомника РАМН «Андреевка» (Московская обл.). Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Кормили животных брикетированными кормами в соответствии с утвержденными нормами. Маркировка животных по группам производилась с помощью окраски красителями (эозин) поверхности тела. Исследования были проведены в соответствии с этическими нормативными документами, действующими на территории РФ, после утверждения Этического Комитета ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова, а также принимая во внимание рекомендации международных разрешительных органов (1-4).

Вирусы и клетки

Культура клеток. В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек зеленых мартышек Vero, полученную из АТТС (Американская коллекция клеточных культур и вирусов). Клетки культивировали в среде роста, представляющей собой среду ДМЕМ (Минимальная среда ИГЛА, «ПанЭко, Россия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «ПанЭко, Россия), 2 мМ L-глутамина (Sigma, USA) и антибиотиков (100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Среда поддержки содержала все указанные выше ингредиенты и 2% ЭТС. Клетки инкубировали в термостате в атмосфере 5% CO₂ при +37°C.

Вирусы. В опытах использовали вирус простого герпеса ВПГ-2-го антигенного типа, штамм ВН, полученный из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Вирус поддерживали в серийных пассажах и титровали на перевиваемой культуре клеток почек зеленых мартышек VERO. Титры вируса оценивали по стандартной методике (по Риду и Менчу) микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах с использованием культуры клеток и выражали в Ig ТЦД₅₀/мл. За ТЦД₅₀ вируса принимали минимальное разведение вируса, вызывающее 50% поражение клеточного монослоя при отсутствии дегенерации клеточного монослоя в контроле без инфицирования (50% тканевая цитопатическая доза вируса ТЦД₅₀). В экспериментах использовали вирус в виде вируссодержащей взвеси с инфекционным титром 6,0 Ig ТЦД₅₀/мл. Полученные вирусы хранились в аликвотах замороженными.

Оценка эффективности препаратов на модели генитального герпеса морских свинок

Самцов морских свинок заражали культуральной, вируссодержащей жидкостью (ВПГ-2, "ВН"). Вируссодержащую жидкость (в дозе 100 ТЦД₅₀) наносили с помощью пипетки (с последующим втиранием) на предварительно скарифицированную кожу пениса. Скарифицирование проводили с помощью хирургического ланцета, после того как животные были анестезированы анестетиком - лидокаином (1%). Размер площади скарификации составлял 4-7 мм². Каждая группа содержала 4-5 животных.

В опытах также использовали плацебо, представляющие крем и гель такого же состава, только без добавления субстанции PDSTP. Кроме того, в качестве контрольного препарата была использована лекарственная форма в виде 5% мази препарата Зовиракс (ацикловир). Лечение проводилось местно по лечебной схеме: через 3 или 48 часов после инфицирования (при выраженных проявлениях болезни). Препараты наносили методом аппликации тонким слоем на очаги поражения 2 раза в сутки, ежедневно, в течение 5 дней. Площадь нанесения препарата составляла 1,3 см².

Тяжесть инфекционного процесса оценивали ежедневно перед проведением лечения и прослеживали в течение всего периода болезни по следующим параметрам: наличие и степень специфических поражений (везикулы, пустулы, изъязвления, эрозии, корочки); отека, гиперемии, орхита. Максимальная выраженность каждого признака составляла 4 балла. Общая продолжительность наблюдения за животными составила 21 день.

Эффективность препаратов оценивали на пике выраженности патологического процесса по стандартной методике. Критериями оценки лечебного действия препаратов являлись: снижение интенсивности клинических проявлений, индекс лечебного действия (ИЛД), сокращение длительности заболевания в опытных группах по сравнению с контрольной.

ИЛД (в %) = (сумма баллов в контрольной группе - сумма баллов в группе животных, леченных препаратом) × 100/сумма баллов в контрольной группе

У морских свинок на 5 день после заражения получали смывы со слизистой урогенитального тракта в стерильные пробирки с 1,8 мл культуральной среды ДМЕМ.

Определение титра вируса, выделенного из урогенитальных смывов морских свинок

Титрование вируса из содержимого смывов со слизистой урогенитального тракта у морских свинок проводили in vitro на культуре клеток VERO с использованием стандартных вирусологических методов исследования.

Образцы в эксперименте после взятия до исследования хранили при 70°C.

Клетки VERO выращивали в 96-луночных планшетах для культивирования клеток фирмы «Costar». Клетки в полной культуральной среде вносили по 100 мкл в каждую лунку планшета в концентрации 10⁴ кл./мл, инкубировали в термостате при 37°C в атмосфере 5% CO₂. После образования полного монослоя (через 24 часа) среду удаляли, трижды промывали питательной средой без сыворотки и использовали в дальнейших экспериментах.

Перед внесением образцов во все лунки планшета вносили по 90 мкл питательной среды без сыворотки (в полной культуральной среде DMEM (ПанЭко, РФ) с добавлением антибиотиков, 0,008% раствора гентамицина сульфата (ФЕРЕЙН, РФ), 300 мг глутамина (ГУ ПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, РФ) на 500 мл среды). Исследуемые образцы вносили по 10 мкл/лунку (разведение 1:100). Далее путем серийных разведений в планшетах проводили титрование в диапазоне 10¹-10⁵ ТИЦД₅₀/мл. Параллельно титровали вирус в диапазоне 10³-10⁹ ТИЦД₅₀/мл.

В качестве контроля служила интактная культура клеток (негативный контроль). Далее клетки инкубировали в термостате при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 5 суток. Клеточный монослой ежедневно просматривали под световым микроскопом с целью оценки степени его интактности и обнаружения специфического цитопатического действия вируса (ЦПД). Учет результатов оценивали визуально, используя инвертированный микроскоп LABOVERT FS (фирмы "Leitz"). Цитопатические изменения, которые выражались в виде сгруппированных, увеличенных в размере округлых клеток, оценивали по следующей шкале:

+ - незначительные изменения в монослое (25%);

++ - наличие небольших разрывов в монослое (50);

+++ - разрушение около 50% монослоя (75%);

++++ - практически полное разрушение монослоя (100%).

Для количественного определения цитопатического действия образцов использовали модифицированный метод подсчета живых и мертвых клеток с использованием красителя Neutral Red (NR). После промывки (3 раза) раствор NR (концентрация 1,11 мкг/мл) вносили по 50 мкл в каждую лунку планшета, после инкубации в течение 2 часов при 37°C в атмосфере 5% CO₂ планшет трижды промывали и вносили по 100 мкл раствора 50% EtOH/ 50% 0,1 М NH₄H₂PO₄ (pH 3,5). Через 30 мин инкубации подсчет проводили на спектрофотометре при длине волны 490 нм.

Каждый исследуемый образец испытан в 4-х точках (лунках), а каждое значение представляет среднее арифметическое.

Статистическая обработка полученных данных проводилась общепринятыми методами вариационной статистики с использованием прикладных программ "Ecxell-5.0", оценивая доверительный интервал для 95% вероятности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Дизайн исследования

Лечение с использованием препаратов для наружного применения - крем, гель, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, и референс-препарата Зовиракс - крем проводили по лечебной схеме в двух вариантах: а) через 3 часа после инфицирования; б) через 48 часов после инфицирования (при выраженных проявлениях болезни). Препараты для наружного применения наносили (методом аппликации) тонким слоем на очаги поражения 2 раза в сутки, ежедневно, в течение 5 дней.

Описание исследуемых групп

С учетом цели эксперимента все животные были разделены на 7 групп, по 4 свинки в каждой, восьмая группа содержала 6 животных.

Первая группа содержала животных, инфицированных ВПГ-2 и леченных кремом для наружного применения по лечебной схеме через 3 ч после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Вторая группа содержала животных, инфицированных ВПГ-2 и леченных кремом для наружного применения по лечебной схеме через 48 ч после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Третья группа содержала инфицированных животных, обработанных гелем для наружного применения по лечебной схеме через 3 часа после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Четвертая группа содержала инфицированных животных, обработанных гелем для наружного применения по лечебной схеме через 48 часов после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Пятая группа содержала инфицированных животных, обработанных препаратом «Зовиракс» в виде крема для наружного применения по лечебной схеме через 3 часа после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Шестая группа содержала инфицированных животных, обработанных препаратом «Зовиракс» по лечебной схеме через 48 часов после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней.

Седьмая группа (позитивный контроль) содержала только инфицированных ВПГ-2 животных, не получавших лечения.

Восьмая группа содержала 6 животных, которые подвергались только скарифицированию, при этом 2 свинки далее не подвергались лечению, а по 2 свинки подвергались обработке плацебо, соответствующим кремом и гелем по схеме через 3 часа после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней. Эти животные рассматривались как негативный контроль, по отношению к которому сравнивали выраженность вирус-обусловленного патологического процесса и местное раздражающее действие препаратов.

Характеристика инфекционного процесса у инфицированных животных

В контрольной группе инфицированных животных (группа №7), не получавших лечения, типичные местные проявления генитального герпеса развивались через 24-48 часов после инфицирования. Вначале на слизистой оболочке полового члена и прилежащих участках кожи отмечали появление единичных везикулезных высыпаний на эритематозном фоне, затем при прогрессировании заболевания возникали сливные очаги с геморрагическим содержимым, кровоточащие эрозии, изъязвления, умеренно выраженный орхит. В последующие дни эрозии и язвы эпителизировались либо под коркой, либо без ее образования. Специфичность местных проявлений ГГ была подтверждена нами методом выделения вируса из содержимого везикул, смывов, взятых с урогенитальной области инфицированных животных.

Процесс отличало наличие выраженных отечно-воспалительных явлений, длительное сохранение гиперемии, «вялое» заживление эрозивно-язвенных элементов. Максимальное развитие симптоматики отмечали на 5-е сутки после инфицирования: суммарный индекс выраженности симптоматики (СИВС) в этой группе равен 34,74 балла, средняя продолжительность болезни (СПЗ) - 15,0±2,46 суток.

2. Результаты лечения экспериментального генитального герпеса у морских свинок с использованием крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат для местного применения

Результаты лечения экспериментального генитального герпеса у морских свинок с использованием крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, и референс-препарата Зовиракс для местного применения, представлены в таблице 1, на фиг.1 и 2.

Как следует из данных, представленных в таблице 1, на фиг.1 и 2, использование крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата для местного применения, оказывало на течение генитального герпеса у самцов морских свинок воздействие разной степени выраженности.

Наиболее значимые результаты лечения получены в группе инфицированных животных, получавших крем по лечебной схеме - через 3 часа после инфицирования.

Установлено, что применение препарата в виде крема на ранней стадии инфекционного процесса (через 3 часа после инфицирования) приводило к статистически достоверному терапевтическому эффекту, снижению в 1,5 раза выраженности симптоматики и значительному сокращению средней продолжительности заболевания по сравнению с аналогичными показателями в группе инфицированных животных, не получавших лечения (положительный контроль). ИЛД составил 32,64%, СПЗ - 9,0±1,0 суток (см. табл. 1, Фиг. 1). Животные, леченные кремом, выздоравливали в среднем на 6,0 суток ранее, чем те, которые не получали лечения. Инфекционный процесс характеризовался наличием умеренно выраженных экссудативно-воспалительных явлений, сокращением сроков экссудативно-воспалительных явлений и разрешения элементов. Проведенные исследования не выявили значимых различий между показателями эффективности крема и референс-препарата Зовиракс по всем изучаемым параметрам (по влиянию на показатели ИЛД, СИВС, СПЗ, на характер течения инфекционного процесса), (p>0,05). На фоне лечения референс-препаратом Зовиракс (шестая группа) СПЗ составила - 8,33±0,57 суток; ИЛД - 35,23%.

Применение крема у инфицированных животных на фоне выраженных проявлений патологического процесса (группа №2) приводило также к статистически достоверному лечебному эффекту и сокращению сроков продолжительности заболевания по сравнению с инфицированными животными, не получавшими лечения. В то же время препарат по показателю терапевтического действия (26,59%) уступал таковому как в группе животных, получавших крем в ранние сроки после инфицирования (32,64%), так и в группе животных, получавших референс-препарат Зовиракс (30,05%), однако был сопоставим с первой группой по показателю СПЗ. Так, СПЗ у животных во второй группе составила - 9,33±1,52 сут, у животных в первой группе - 9,0±1,0 суток, p>0,5. При сравнении СПЗ у животных второй группы и у животных, леченных референс препаратом, было установлено, что инфицированные животные, получавшие исследуемый крем, выздоравливали на 1,33 суток позже, p<0,5. Необходимо также отметить, что в группе позднего лечения кремом (начало через 48 часов) экссудативно-воспалительные явления были более выраженными и продолжительными, чем у животных как в первой группе, получавших раннее лечение этим же препаратом, так и у животных, получавших референс-препарат Зовиракс.

Анализ применения геля для наружного применения по лечебной схеме на модели экспериментального генитального герпеса у морских свинок показал, так же как и в случае с кремом, что данная форма препарата проявляла более выраженную активность при использовании в ранние сроки после инфицирования.

Так, применение геля через 3 часа после инфицирования (группа №3) приводило к достоверному ИЛД, равному 25,73%, и достоверному снижению СПЗ на 3,34 суток по сравнению с группой животных, не получавших лечения. По эффективности применения гель, используемый по схеме - через 3 часа после инфицирования, был сопоставим с эффективностью крема, используемого на фоне выраженных проявлений инфекционного процесса (группа №2, начало лечения через 48 часов после инфицирования), однако уступал в среднем на 2,4 суток по влиянию на продолжительность заболевания по сравнению как с действием крема, используемого по схеме через 3 после инфицирования, так и с действием референс-препарата (см. табл. 1).

Проведенные исследования показали, что применение у инфицированных животных геля через 48 часов после инфицирования в течение 5 дней (группа №4) приводило к терапевтическому эффекту, равному 22,01%, и сокращению СПЗ на 2,66 суток по сравнению с инфицированными животными, не получавшими лечения. Тем не менее, применение геля по схеме +48 ч было менее эффективным по всем оценочным параметрам по сравнению с использованием как крема в различные сроки инфекционного процесса, так и референс-препарата Зовиракс (группа №6). Наблюдение за животными из 8 группы показало, что у 2 животных, которые подвергались только скарифицированию, произошло быстрое (в течение 1-2 дней) заживление, после этого никаких выраженных явлений у свинок в этой группе не наблюдалось. Кроме того, у 4 свинок, подвергавшихся обработке плацебо, соответствующим крему и гелю по схеме через 3 часа после инфицирования ежедневно 2 раза в сутки в течение 5 дней, не было выявлено отечности, видимого местного раздражающего действия препаратов и общих побочных эффектов.

Таким образом, по степени снижения эффективности исследуемые модификации препаратов, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, для наружного применения можно расположить следующим образом: группа №1 (крем +3 ч после инфицирования) > группа №3 (гель +3 ч после инфицирования) / группа №2 (крем +48 ч после инфицирования) > группа №4 (гель +48 ч после инфицирования).

3. Изучение влияния крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, для наружного применения на частоту и уровень выделения вируса простого герпеса 2 типа у самцов морских свинок

Для определения влияния крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, на частоту выделения ВПГ-2 и уровень его репликации у инфицированных животных нами проведено исследование образцов смывов с очагов поражения, собранных у животных на 5-е сутки после инфицирования, с использованием стандартной методики выделения вируса на культуре клеток VERO.

Таблица 2

Влияние крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат, для наружного применения на частоту выделения и уровень репликации вируса из очагов поражения у самцов морских свинок, инфицированных ВПГ-2 (по данным вирусологического метода)

Как видно из данных таблицы 2, на 5-е сутки после инфицирования частота выделения вируса у инфицированных животных как в опытных группах, так и в группах контроля составила 100%. Полученные результаты, в свою очередь, подтвердили специфичность наблюдаемых нами симптомов генитального герпеса у экспериментально инфицированных животных.

Установлено, что применение крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, у инфицированных животных (группы №1-4) приводило к снижению уровня репликации и инфекционной активности вируса, изолированного из образцов смывов с пораженной области, по сравнению с инфекционной активностью вируса, выделенного у инфицированных животных, не получавших лечения (см. табл. 2). Так, титры вируса, выделенного у животных на фоне лечения кремом, составили 1,9±0,52 Ig ТЦД₅₀/мл и 2,41±0,4 Ig ТЦД₅₀/мл, соответственно; на фоне лечения гелем - 2,25±0,5 Ig ТЦД₅₀/мл и 3,0±0,11 Ig ТЦД₅₀/мл, соответственно.

Наиболее выраженное снижение инфекционной активности вируса - в 100 раз - отмечено при использовании крема на ранних этапах инфекционного процесса, в то время как использование крема на фоне выраженных проявлений герпес-вирусной инфекции приводило к снижению инфекционной активности вируса в 30 раз.

Применение геля, в зависимости от схемы применения, приводило к снижению инфекционной активности вируса в 50 и 10 раз.

Титры вируса у инфицированных животных под влиянием референс-препарата Зовиракс статистически значимо снижались более чем в 100 раз по сравнению с титрами вируса в контроле (p<0.05) и составили 1,66-1,75 Ig ТЦД₅₀/мл.

Таким образом, в опытах по изоляции и титрованию вируса из образцов биоматериала у инфицированных животных с ГГ в культуре клеток VERO нами получены данные, свидетельствующие о наличии селективной противовирусной активности у ионного крема и геля, содержащих субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, при местном применении. Данные, полученные с помощью вирусологического метода, коррелируют с данными по эффективности действия препаратов, полученными с использованием характеристик инфекционного процесса, вызванного ВПГ-2. Таким образом: крем и гель, содержащие субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, при местном применении по лечебной схеме (двухкратной аппликации в течение 5 дней) на модели генитального герпеса у морских свинок обладают достоверным лечебным эффектом, позволяющим подавлять развитие герпес-вирусной инфекции, обусловленной ВПГ-2. Наиболее эффективным было лечение кремом, содержащем субстанцию 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата, по лечебной схеме в ранние сроки (через 3 часа) после инфицирования (группа №1), который оказывал выраженное терапевтическое воздействие на течение инфекции у животных, способствуя достоверному снижению выраженности симптоматики, сокращению сроков разрешения элементов, средней продолжительности заболевания, инфекционной активности ВПГ-2. Эффект лечения кремом в ранние сроки (через 3 часа) после инфицирования подтверждается результатами вирусологического метода исследования, в котором выявлено достоверное снижение титра у леченных животных по сравнению с группой вирусного контроля. Эффективность крема при использовании по лечебной схеме в ранние сроки после инфицирования как по характеристикам инфекционного процесса, так и по снижению титра вируса у леченных животных по сравнению с группой вирусного контроля сопоставима с референс-препаратом Зовиракс, применяемым по аналогичной схеме.

Изобретение относится к медицине и представляет собой фармацевтическую композицию в виде крема или геля для лечения герпес-вирусной инфекции, включающую 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрат. Изобретение заключается также в способе лечения или предупреждения герпетической инфекции у человека или животного. Технический результат заключается в обеспечении фармацевтической композиции на основе 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата в виде лекарственной формы для местного применения, обладающей высоким уровнем терапевтической эффективности. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Фармацевтическая композиция в виде крема для лечения герпес-вирусной инфекции, содержащая в качестве активного вещества от 0,5 до 10,0% масс./об. 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2] гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата.

2. Фармацевтическая композиция в виде геля для лечения герпес-вирусной инфекции, содержащая в качестве активного вещества от 0,5 до 10,0% масс. 4,6-ди(3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5.2.5.2] гексадекан-1-ил)-2-метил-5-нитропиримидин тетрахлорид дигидрохлорид гексагидрата.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где крем обладает противогерпесной активностью в отношении штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2, в том числе резистентных к существующим в настоящее время лекарственным препаратам.

4. Способ лечения или предупреждения герпетической инфекции у человека или животного, включающий местное введение пациенту фармацевтической композиции по пп. 1 и 2 в эффективном количестве.