Нуклеозидные производные 1,3-диаза-2-оксофеноксазина в качестве ингибиторов репликации герпесвирусов. Российский патент 2020 года по МПК A61K31/7042 C07H19/24 C07H19/02 C07D498/12 A61K31/5383 A61P31/22 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии, микробиологии и медицины, а именно к производным 1,3-диаза-2-оксофеноксазина, их получению и применению в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов.

Вирусные заболевания являются наиболее частой причиной смерти человека от инфекционных заболеваний. Герпесвирусы (Herpesviridae) - это большое семейство вирусов, которые широко распространены в природе и способны поражать человека и других млекопитающихся. На сегодняшний день известно 8 типов герпесвирусов человека, которые разделены на три группы. Вирусы простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1, ВПГ-2) и вирус ветряной оспы - опоясывающего герпеса (варицелла-зостер, ВЗВ) - это α-герпесвирусы. Первичное инфицирование ВПГ-1 и ВПГ-2 приводит к поражению кожи чаще около рта и в области гениталей, соответственно. Вирус варицелла-зостера первично вызывает ветряную оспу, в основном у детей, и характеризуется высыпаниями по всему телу. После первичного инфицирования герпесвирусы переходят в латентное состояние, при котором не происходит репликации вируса и экспрессии вирусных белков. Реактивация из латентной формы приводит к более тяжелому и затяжному течению заболевания. Рецидивам наиболее подвержены люди с ослабленным иммунитетом при наличии иммунодефицитных состояний и после иммуносупрессивной терапии. Цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) и ВГЧ-7 относятся к β-герпесвирусам. Цитомегаловирус особенно опасен для беременных женщин. Различные врожденные патологии диагностируют у 10-15% детей, инфицированных во время внутриутробного развития. У иммунокомпетентных людей ЦМВ приводит к серьезным заболеваниям, в том числе ретиниту, тяжелой пневмонии или энцефалиту. ВГЧ-6 первично вызывает внезапную экзантему у младенцев, известную также как детская розеола. Наиболее часто ВГЧ-6 и ВГЧ-7 реактивируются у пациентов, перенесших операции по трансплантаций, и могут приводить к осложнениям, таким как энцефалит и интерстициальный пневмонит. К γ-герпесвирусам пренадлежат вирус Эпштейна - Барра (ВЭБ) и ВГЧ-8. Вирус Эпштейна - Барра вызывает инфекционный мононуклеоз и зачастую тесно связан с развитием различных злокачественных новообразований [H.J. Field, R.A. Vere Hodge. Recent developments in anti-herpesvirus drugs. British Medical Bulletin 2013, 106: 213-249]. Герпесвирусные инфекции - одни из самых распространенных заболеваний человека, и по данным ВОЗ, 60-90% населения земли инфицированы одним или несколькими видами герпесвирусов [Y.C. Jiang, Н. Feng, Y.C. Lin, X.R. Guo. New strategies against drug resistance to herpes simplex virus. International Journal of Oral Science 2016, 8:1-6].

Несмотря на то, что противовирусная терапия позволяет справляться с первичными и повторными инфекциями, вызванными герпесвирусами, резистентность к применяемым препаратам и токсичность требуют изыскания и изучение новых высокоактивных противовирусных соединений.

Уровень техники

На сегодняшний день существует три класса препаратов, одобренных для лечения герпесвирусных инфекций: ациклические аналоги нуклеозидов (ацикловир, пенцикловир, ганцикловир), ациклические нуклеотидные аналоги (цидофовир, адефовир дипивоксил) и аналоги пирофосфата (фоскарнет) [Y.C. Jiang, Н. Feng, Y.C. Lin, X.R. Guo. New strategies against drug resistance to herpes simplex virus. International Journal of Oral Science 2016, 8:1-6].

Открытие противовирусного препарата нуклеозидной природы - ацикловира в 1977 году можно считать отправной точной в терапии герпесвирусов [G.B. Elion, Р.А. Furman, J.A. Fyfe et al. Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine. Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5716-20; H.J. Field, R.A. Vere Hodge. Recent developments in anti-herpesvirus drugs. British Medical Bulletin 2013, 106: 213-249]. Мишенью противовирусного действия ацикловира и других нуклеозидных аналогов является герпесная ДНК полимераза, и механизм заключается в постадийном фосфорилировании препарата и ингибировании синтеза вирусной ДНК.

Ациклический аналог гуанозина - ацикловир мало токсичен, хорошо переносится пациентами, однако имеет низкую биодоступность. Валацикловир, L-валиновый эфир ацикловира - это пролекарство, которое под действием фермента валацикловир-гидроксилазы превращается в организме в активное вещество - ацикловир. Валацикловир, в отличие от ацикловира, активен в отношении всех видов герпесвирусов, однако наиболее высокая чувствительность проявляется у представителей α-подсемейства. Недостатком валацикловира является отсутствие инфузионной формы препарата, что ограничивает его применение при тяжелых острых поражениях [L. Poole, S.H. James. Antiviral Therapies for Herpesviruses: Current Agents and New Directions. Clinical Therapeutics 2018, 40(8): 1282-1298].

Фамцикловир является пролекарством пенцикловира, а именно, его диацетататным эфиром. Пенцикловир примерно в 100 раз менее активен, чем ацикловир, но поскольку для препарата достигается высокая концентрация в клетках, и он обладает долгим временем полувыведения, его эффективно применяют в терапии [Y.C. Jiang, Н. Feng, Y.C. Lin, X.R. Guo. New strategies against drug resistance to herpes simplex virus. International Journal of Oral Science 2016. 8:1-6].

Ганцикловир - это синтетический нуклеозидный аналог гуанозина. Механизм действия аналогичен таковому у ацикловира, однако исключает активное участие вирусной тимидинкиназы, что позволяет использовать ганцикловир преимущественно при тех герпетических инфекциях, при которых ацикловир является недостаточно эффективным (ЦМВ, вирус Эпштейна-bappa, ВГЧ-6 и ВГЧ-7) [C.L. Poole, S.H. James. Antiviral Therapies for Herpesviruses: Current Agents and New Directions. Clinical Therapeutics 2018, 40(8): 1282-1298].

Фоскарнет является неорганическим аналогом пирофосфата, неконкурентным ингибитором вирусной ДНК полимеразы. Фоскарнет показал активность против всех известных герпесвирусов. Его применяют при резистентных формах ВПГ и ВЗВ, а также при ЦМВ, резистентном к ганцикловиру. Однако сравнительно высокая токсичность фоскарнета ограничивает его эффективное применение [Y.C. Jiang. Н. Feng, Y.C. Lin, X.R. Guo. New strategies against drug resistance to herpes simplex virus. International Journal of Oral Science 2016, 8:1-6].

Цидофовир - это ациклический фосфонатный нуклеотидный аналог.Наличие фосфонатной группы исключает первую стадию фосфорилирования вирусной киназой. Последующие фосфорилирование осуществляется клеточными киназами, и далее активная молекула включается в ДНК вируса. Цидофовир проявляет активность против всех герпесвирусов человека, ортопоксвирусов, аденовирусов и папиломовирусов. Цидофовир переносится хуже, чем ацикловир и ганцикловир, поэтому его используют в основном при тяжелых, угрожающих жизни формах герпесвирусных инфекций (Иммунокомпетентные пациенты с ВПГ и ЦМВ инфекциями, резистентными к ацикловиру, ганцикловиру и фоскарнету) [Е. De Clercq, A. . Acyclic nucleoside phosphonates: a key class of antiviral drugs. Nat Rev Drug Discov 2005. 4(11): 928-940 С.].

Таким образом, возникновение резистентности и недостатки существующих на данный момент одобренных препаратов обуславливают необходимость разработки новых производных, активных относительно представителей семейства герпесвирусов.

Раскрытие изобретения

Предлагаемое изобретение решает задачу расширения арсенала противовирусных лекарственных средств за счет производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина, обладающих активностью относительно герпесвирусов, а именно вируса варицелла-зостер и цитомегаловируса. В процессе создания настоящего изобретения были разработаны способы получения соединений, являющихся производными 1,3-диаза-2-оксофеноксазина, и обнаружено, что некоторые из них обладают способностью ингибировать репликацию вируса варицелла-зостер и цитомегаловируса.

Соединения 2а-с получают из соответствующих нуклеозидных производных 5-бромурацила 1а-с (фиг. 1): активацией С4 атома гетероциклического кольца производных 1a-с кипячением в смеси CH₂Cl₂/CCl₄ (v/v:5/1) в присутствии трифенилфосфина (PPh₃), с последующим его замещением 2-аминофенолом в присутствии DIPEA; затем, циклизацией при кипячении с обратным холодильником в смеси абс. C₂H₅OH/DIPEA (v/v:4:1), с последующим удалением ацетильных защитных групп обработкой водным аммиаком. Соединения 3а-с получают из соответствующих производных 2а-с обработкой 4,4'-диметокситритилхлоридом (DMTr-Cl) в пиридине (фиг. 1).

Соединения 6а-b получают в 2 стадии из соответствующих производных 5-бромурацила 4а-b (фиг. 2): а) активацией С4 атома гетероциклического кольца производных 4а-b кипячением в смеси CH₂Cl₂/CCl₄ (v/v: 5:1) в присутствии трифенилфосфина (PPh₃), с последующим его замещением 2-аминорезорцином в присутствии 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU); б) конденсацией полученных производных 5а-b с бензил-N-(2-гидроксиэтил)карбаматом в CH₂Cl₂ в присутствии диэтилазодикарбоксилата (DEAD) и PPh₃ (реакция Мицунобу), с последующей циклизацией при кипячении с обратным холодильником в смеси абс. C₂H₅OH/DIPEA (v/v: 5:1) и удалением ацетильных защитных групп обработкой водным аммиаком. Соединения 8а-b получают из соответствующих производных 6а-b обработкой 4,4'-диметокситритилхлоридом (DMTr-Cl) в пиридине (фиг. 2). Наконец, производные 7а-b и 9а-b получают удалением бензилоксикарбонильной (CBz) защитной группы из соединений 6а-b или 8а-b, соответственно, каталитическим гидрированием в присутствии 10% Pd/C в атмосфере водорода.

Для получения N10-алкилированных производных, 3а алкилируют йодацетамидом в присутствии DBU, получая 10, из которого, в свою очередь, удаляют 5'-O-DMTr защитную группу, получая соединение 11 (фиг. 3). 1,3-диаза-2-оксофеноксазин 12 получают расщеплением гликозидной связи в соединении 2а обработкой его конц. HCl в воде (фиг. 3).

Производные 2а-с, 3а-с, 5b, 6b, 7a-b, 8b, 9а-b, 10, 11 и 12 тестировали на активность относительно вируса варицелла-зостер (штамм OKA (TK⁺), АТСС VR-795; штамм 07-1 (TK^-), предоставлен Shiro Shigeta, Fukushima Medical Center, Japan) и цитомегаловируса (штамм AD-169, АТСС VR-538; штамм Davis, АТСС VR-807) (Таблица).

Относительно вируса варицелла-зостер активность в микромолярных концентрациях проявляют соединения 2а, 3а, 3b, 7а, 9а и 10 (Таблица). При этом на штамме OKA (TK⁺) производное 2а является самым активным с ЕС₅₀=0.06 мкМ, что в 42 раза больше активности контрольного ацикловира. Цитотоксического или цитостатического эффекта соединения 2а в максимальной исследуемой концентрации (100 мкМ) на клетках HEL не наблюдают.

Против цитомегаловируса (штамм Davis) умеренную активность показывают соединения 3а, 3с, 7b, 8b, 9а и 10 (Таблица), сравнимую с активностью ганцикловира. Некоторые соединения проявляют незначительную цитотоксичность на клетках HEL.

Таким образом, был получен ряд производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина и исследована их активность относительно представителей семейства герпесвирусов: вируса варицелла-зостер и цитомегаловируса. Производное 2а показывает наибольшую активность относительно вируса варицелла-зостер с ЕС₅₀=0.06 мкМ (штамм OKA (TK⁺)).

Описание чертежей

Предлагаемое изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

На Фиг. 1 изображена схема химического синтеза соединений 2а-с и 3а-с (реагенты и условия: (a) PPh₃, CCl₄, CH₂Cl₂, кипячение; затем 2-аминофенол, DIPEA, комнатная температура; (b) DIPEA, С₂Н₅ОН, кипячение, затем водн. NH₃, комнатная температура; (с) DMTr-Cl, Ру, комнатная температура).

На Фиг. 2 изображена схема химического синтеза соединений 5b, 6b, 7a-b, 8b, 9а-b (реагенты и условия: (а) PPh₃, CCl₄, CH₂Cl₂, кипячение; затем 2-аминорезорцин, DBU, комнатная температура; (b) бензил-N-(2-гидроксиэтил)карбамат, DEAD, PPh₃, CH₂Cl₂, комнатная температура; (с) DIPEA, С₂Н₅ОН, кипячение, затем водн. NH₃, комнатная температура; (d) Н₂/Pd, СН₃ОН, комнатная температура; (е) DMTr-Cl, Ру, комнатная температура).

На Фиг. 3 изображена схема химического синтеза соединений 10, 11 и 12 (реагенты и условия: (а) йодацетамид, DBU, CH₂Cl₂, комнатная температура; (b) уксусная кислота/H₂O, 50°С; (с) конц. HCl/H₂O, 60°С).

В таблице показаны антигерпетическая активность и цитотоксичность производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина.

Осуществление изобретения

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. 3-(2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (2а)

К раствору 1-(3',5'-ди-O-ацетил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-5-бромурацила 1а (1,96 г, 5,0 ммоль) и PPh₃ (2,63 г, 10 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют тетрахлорид углерода (10 мл), и полученный в результате раствор кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем, реакционную смесь упаривают до пены в вакууме, растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл) и добавляют 2-аминофенол (0,82 г, 7,5 ммоль), с последующим добавлением DIPEA (1,3 мл, 7,5 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакционную смесь концентрируют до коричневой пены. Пену растворяют в смеси абсолютного C₂H₅OH (40 мл) и DIPEA (10 мл) и кипятят с обратным холодильником в атмосфере N₂ в течение 72 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют водный NH₃ (5 мл), и смесь нагревают при 40°С в течение 3 часов, с последующим упариванием в вакууме. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-6% МеОН в CH₂Cl₂), получая требуемый продукт 2а; выход 21% (0,34 г, 1,07 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,61 (уш с, 1Н), 7,55 (с, 1Н), 6,89-6,77 (м, 4Н), 6,13 (т, 1Н, J=6,6 Гц), 5,19 (д, 1H, J=4,2 Гц), 5,07 (т, 1Н, J=5,1 Гц), 4,24-4,20 (м, 1H), 3,79-3,75 (м, 1Н), 3,63-3,53 (м, 2Н), 2,11-2,05 (м, 1H), 2,04-1,97 (м, 1H). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₅H₁₄N₃O₅^- [М-Н]^-: 316,0939; найдено 316,0894.

Пример 2. 3-(β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (2b)

К раствору 1-(2',3',5'-три-O-ацетил-β-D-рибофуранозил)-5-бромурацила 1b (2,25 г, 5,0 ммоль) и PPh₃ (2,63 г, 10 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют тетрахлорид углерода (10 мл), и полученный в результате раствор кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем, реакционную смесь упаривают до пены в вакууме, растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл) и добавляют 2-аминофенол (0,82 г, 7,5 ммоль), с последующим добавлением DIPEA (1,3 мл, 7,5 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакционную смесь концентрируют до коричневой пены. Пену растворяют в смеси абсолютного С₂Н₅ОН (40 мл) и DIPEA (10 мл) и кипятят с обратным холодильником в атмосфере N₂ в течение 72 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют водный NH₃ (5 мл), и смесь нагревают при 40°С в течение 3 часов, с последующим упариванием в вакууме. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-6% МеОН в CH₂Cl₂), получая требуемый продукт 2b; выход 19% (0,32 г, 0,96 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,60 (уш с, 1Н), 7,61 (с, 1Н), 6,89-6,77 (м, 4Н), 5,75 (д, 1Н, J=4,0 Гц), 5,27 (д, 1H, J=5,2 Гц), 5,15 (т, 1Н, J=4,9 Гц), 4,97 (д, 1Н, J=4,8 Гц), 3,99-3,94 (м, 2Н), 3,84-3,81 (м, 1H), 3,69-3,64 (м, 1Н), 3,59-3,54 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₅H₁₄N₃O₆^- [М-Н]^-: 332,0888; найдено 332,0843.

Пример 3. 3-(2'-O-метил-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (2с)

К раствору 1-(3',5'-ди-O-ацетил-2'-O-метил-β-D-рибофуранозил)-5-бромурацила 1с (2,11 г, 5,0 ммоль) и PPh₃ (2,63 г, 10 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют тетрахлорид углерода (10 мл), и полученный в результате раствор кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем, реакционную смесь упаривают до пены в вакууме, растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл) и добавляют 2-аминофенол (0,82 г, 7,5 ммоль), с последующим добавлением DIPEA (1,3 мл, 7,5 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакционную смесь концентрируют до коричневой пены. Пену растворяют в смеси абсолютного С₂Н₅ОН (40 мл) и DIPEA (10 мл) и кипятят с обратным холодильником в атмосфере N₂ в течение 72 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют водный NH₃ (5 мл), и смесь нагревают при 40°С в течение 3 часов, с последующим упариванием в вакууме. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-6% МеОН в CH₂Cl₂), получая требуемый продукт 2с; выход 18% (0,32 г, 0,92 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,62 (уш с, 1Н), 7,67 (с, 1Н), 6,90-6,77 (м, 4Н), 5,82 (д, 1Н, J=4,3 Гц), 5,40-4,96 (м, 2Н), 4,12-4,09 (м, 1H), 3,84-3,81 (м, 1Н), 3,72-3,66 (м, 2Н), 3,60-3,56 (м, 1Н), 3,39 (с, 3Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₆H₁₆N₃O₆^- [М-Н]^-: 346,1045; найдено 346,1008.

Пример 4. 3-(5'-O-диметокситритил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (3a)

Соединение 2а (0,13 г, 0,40 ммоль) упаривают с безводным пиридином (10 мл), затем растворяют его в безводном пиридине (10 мл) и добавляют одной порцией при комнатной температуре 4,4'-диметокситритилхлорид (0,18 г, 0,50 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакцию прекращают добавлением 5% водного раствора NaHCO₃ (5 мл), и продукт экстрагируют CH₂Cl₂ (2×20 мл). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, фильтруют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Очистку осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле (0-3% МеОН в CH₂Cl₂ в присутствии 0,1% TEA), получая требуемый продукт 3а; выход 77% (0,19 г, 0,30 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,61 (уш с, 1Н), 7,45-7,19 (м, 10Н, DMTr), 6,93-6,78 (м, 7Н), 6,56 (д, 1Н, J=7,3 Гц), 6,12 (т, 1Н, J=6,4 Гц), 5,29 (д, 1Н, J=4,3 Гц), 4,31-4,26 (м, 1Н), 3,92-3,87 (м, 1H), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,29-3,25 (м, 1H), 3,15-3,11 (м, 1Н), 2,20-2,12 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₆H₃₂N₃O₇^- [М-Н]^-: 618,2246; найдено 618,2164.

Пример 5. 3-(5'-O-диметокситритил-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (3b)

Соединение 2b (0,13 г, 0,40 ммоль) упаривают с безводным пиридином (10 мл), затем растворяют его в безводном пиридине (10 мл) и добавляют одной порцией при комнатной температуре 4,4'-диметокситритилхлорид (0,18 г, 0,50 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакцию прекращают добавлением 5% водного раствора NaHCO₃ (5 мл), и продукт экстрагируют CH₂Cl₂ (2×20 мл). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, фильтруют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Очистку осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле (0-3% МеОН в CH₂Cl₂ в присутствии 0,1% TEA), получая требуемый продукт 3b; выход 67% (0,17 г, 0,27 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,62 (уш с, 1H), 7,45-7,20 (м, 10Н), 6,92-6,88 (м, 4Н), 6,88-6,79 (м, 3Н), 6,48 (дд, 1Н, J=1,5 Гц, J=7,7 Гц), 5,72 (д, 1Н, J=3,8 Гц), 5,41 (д, 1H, J=5,3 Гц), 5,08 (д, 1Н, J=6,1 Гц), 4,13-4,09 (м, 1Н), 4,09-4,05 (м, 1Н), 3,98-3,95 (м, 1Н), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,32-3,29 (м, 1Н), 3,20-3,16 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₆H₃₂N₃O₈^-[М-Н]^-: 634,2195; найдено 634,2110.

Пример 6. 3-(5'-O-диметокситритил-2'-O-метил-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (3с)

Соединение 2с (0,14 г, 0,40 ммоль) упаривают с безводным пиридином (10 мл), затем растворяют его в безводном пиридине (10 мл) и добавляют одной порцией при комнатной температуре 4,4'-диметокситритилхлорид (0,18 г, 0,50 ммоль). После 3 часов выдерживания при комнатной температуре реакцию прекращают добавлением 5% водного раствора NaHCO₃ (5 мл), и продукт экстрагируют CH₂Cl₂ (2×20 мл). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, фильтруют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Очистку осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле (0-3% МеОН в CH₂Cl₂ в присутствии 0,1% TEA), получая требуемый продукт 3с; выход 73% (0,19 г, 0,30 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,65 (уш с, 1Н), 7,45-7.20 (м, 10H), 6.92-6,88 (м, 4Н), 6,88-6,78 (м, 3Н), 6,46 (дд, 1H, J=1,4 Гц, J=7,8 Гц), 5,77 (д, 1Н, J=3,3 Гц), 5,15 (д, 1Н, J=6,9 Гц), 4,24-4,20 (м, 1H), 3,97-3,94 (м, 1Н), 3,78-3,76 (м, 1Н), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,44 (с, 3Н), 3,36-3,32 (м, 1Н), 3,21-3,17 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₇H₃₄N₃O₈^-[М-Н]^-: 648,2351; найдено 648,2303.

Пример 7. 3',5'-O-дипропионил-4-N-(2,6-дигидроксифенил)-5-бром-2'-дезоксицитозин (5а)

К раствору 1-(3',5'-ди-O-пропионил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-5-бромурацила 4а (2,10 г, 5 ммоль) и PPh₃ (2,63 г, 10 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют тетрахлорид углерода (10 мл), и полученный в результате раствор кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем, реакционную смесь упаривают до пены в вакууме, растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл) и добавляют 2-аминорезорцин (1,38 г, 11 ммоль), с последующим добавлением DBU (1,65 мл, 11 ммоль) при 0°С. Полученную в результате смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и промывают 2% раствором лимонной кислоты (50 мл). Органический слой отделяют, сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-10% EtOAc в CH₂Cl₂). Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток растирают с горячим толуолом, фильтруют и сушат в вакууме, получая требуемый продукт 5а; выход 80% (2,11 г, 4,01 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 9,67 (с, 2Н), 8,22 (с, 1Н), 8,01 (с, 1H), 6,92 (т, J=8,1 Гц, 1Н), 6,36 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 6,12 (т, J=6,9 Гц, 1Н), 5,24-5,17 (м, 1Н), 4,34-4,25 (м, 2Н), 4,25-4,18 (м, 1H), 2,45-2,29 (м, 6Н), 1,06 (т, J=7,5 Гц, 3Н), 1,03 (т, J=7,5 Гц, 3Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₂₁H₂₃BrN₃O₈^- [М-Н]^-:524,0674; найдено 524,0621.

Пример 8. 2',3',5'-O-триацетил-4-N-(2,6-дигидроксифенил)-5-бромцитозин (5b)

К раствору 1-(2',3',5'-три-O-ацетил-β-D-рибофуранозил)-5-бромурацила 4b (2,25 г, 5 ммоль) и PPh₃ (2,63 г, 10 ммоль) в CH₂Cl₂ (50 мл) добавляют тетрахлорид углерода (10 мл), и полученный в результате раствор кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем, реакционную смесь упаривают до пены в вакууме, растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл) и добавляют 2-аминорезорцин (1,38 г, 11 ммоль), с последующим добавлением DBU (1,65 мл, 11 ммоль) при 0°С. Полученную в результате смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и промывают 2% раствором лимонной кислоты (50 мл). Органический слой отделяют, сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-10% EtOAc в CH₂Cl₂). Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток растирают с горячим толуолом, фильтруют и сушат в вакууме, получая требуемый продукт 5b; выход 82% (2,29 г, 4,12 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 9,59 (с, 2Н), 8,29 (уш с, 1Н), 8,16 (с, 1Н), 6,92 (т, J=8,1 Гц, 1H), 6,36 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 5,87(д, J=4,6 Гц, 1Н), 5,48 (дд, J=4,7 Гц, J=6,3 Гц, 1Н), 5,36-5,33 (м, 1H), 4,36-4,31 (м, 1Н), 4,27-4,21 (м, 3Н), 2,07 (с, 3Н), 2,06 (с, 3Н), 2,06 (с, 3Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₂₁H₂₁BrN₃O₁₀^- [М-Н]^-: 554,0416; найдено 554,0359.

Пример 9. 3-(2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-9-(2-N-бензилкарбамилэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (6а)

К соединению 5а (1,58 г, 3,00 ммоль) последовательно добавляют CH₂Cl₂ (20 мл), PPh₃ (1,18 г; 4,5 ммоль), бензил N-(2-гидроксиэтил)карбамат (0,76 г; 3,90 ммоль) и DEAD (720 мкл; 4,5 ммоль) при 0°С в атмосфере N₂, и полученный в результате раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. После упаривания полученную пену растворяют в смеси абсолютного С₂Н₅ОН (25 мл) и DIPEA (5 мл) и кипятят с обратным холодильником в атмосфере N₂ в течение 72 часов. Затем, добавляют водный NH₃ (3 мл), и смесь нагревают при 40°С в течение 3 часов. После концентрирования в вакууме остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-6% МеОН в CH₂Cl₂), получая 6а; выход 37% (0,57 г, 1,11 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 7,73 (т, J=5,2 Гц, 1Н), 7,65 (с, 1Н), 7,39-7,27 (м, 5Н), 6,80 (дд, J=8,3 Гц, J=8,2 Гц, 1Н), 6,61 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 6,45 (д, J=8,2 Гц, 1H), 6,13 (т, J=6,7 Гц, 1Н), 5,05 (с, 2Н), 4,26-4,20 (м, 1Н), 4,19-3,99 (м, 3Н), 3,94 (т, J=4,8 Гц, 2Н), 3,80-3,77 (м, 1H), 3,63-3,59 (м, 1Н), 3,59-3,55 (м, 1Н), 3,42 (дт, J=5,2 Гц, J=4,8 Гц, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₂₅H₂₇N₄O₈⁺ [М+Н]⁺: 511,1823; найдено 511,1801.

Пример 10. 3-(β-D-рибофуранозил)-9-(2-N-бензилкарбамилэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (6b)

К соединению 5b (1,66 г, 3,00 ммоль) последовательно добавляют CH₂Cl₂ (20 мл), PPh₃ (1,18 г; 4,5 ммоль), бензил N-(2-гидроксиэтил)карбамат (0,76 г; 3,90 ммоль) и DEAD (720 мкл; 4,5 ммоль) при 0°С в атмосфере N₂, и полученный в результате раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. После упаривания полученную пену растворяют в смеси абсолютного С₂Н₅ОН (25 мл) и DIPEA (5 мл) и кипятят с обратным холодильником в атмосфере N₂ в течение 72 часов. Затем, добавляют водный NH₃ (3 мл), и смесь нагревают при 40°С в течение 3 часов. После концентрирования в вакууме остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-6% МеОН в CH₂Cl₂), получая 6b; выход 34% (0,54 г, 1,02 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 9,81 (уш с, 1Н), 7,74 (уш с, 2Н), 7,37-7,28 (м, 5Н), 6,80 (дд, J=8,3 Гц, J=8,1 Гц, 1Н), 6,61 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 6,45 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 5,76 (д, J=3,6 Гц, 1Н), 5,28 (д, J=5,0 Гц, 1Н), 5,16 (т, J=4,9 Гц, 1Н), 5,05 (с, 2Н), 4,98 (д, J=5,0 Гц, 1Н), 3,99-3,92 (м, 4Н), 3,85-3,81 (м, 1Н), 3,70-3,65 (м, 1Н), 3,59-3,55 (м, 1Н), 3,45-3,40 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₂₅H₂₇N₄O₉⁺ [М+Н]⁺: 527,1773; найдено 527,1758.

Пример 11. 3-(5'-O-диметокситритил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-9-(2-N-бензилкарбамилэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (8а)

Соединение 6а (0,20 г, 0,4 ммоль) упаривают с безводным пиридином (10 мл), затем растворяют его в безводном пиридине (10 мл) и добавляют одной порцией 4,4'-диметокситритилхлорид (0,17 г, 0,50 ммоль) при комнатной температуре. После выдерживания в течение 3 часов при комнатной температуре реакцию прекращают добавлением 5% водного раствора NaHCO₃ (10 мл), и продукт экстрагируют CH₂Cl₂ (2×15 мл). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, фильтруют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Очистку осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле (0-4% МеОН в CH₂Cl₂ в присутствии 0,1% TEA), получая требуемый продукт 8а; выход 77% (0,25 г, 0,31 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 9,82 (уш с, 1Н), 7,75 (уш с, 1H), 7,44-7,19 (м, 15Н), 6,93-6,85 (м, 4Н), 6,79 (дд, J=8,2 Гц, J=8,1 Гц, 1Н), 6,60 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 6,23 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 6,13 (т, J=6,2 Гц, 1Н), 5,30 (д, J=3,9 Гц, 1Н), 5,05 (с, 2Н), 4,32-4,27 (м, 1Н), 3,96-3,89 (м, 3Н), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,46-3,40 (м, 2Н), 3,30-3,25 (м, 1Н), 3,16-3,11 (м, 1Н), 2,23-2,11 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₄₆H₄₅N₄O₁₀⁺ [М+Н]⁺: 813,3130; найдено 813,3097.

Пример 12. 3-(5'-O-диметокситритил-β-D-рибофуранозил)-9-(2-N-бензилкарбамилэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (8b)

Соединение 6b (0,21 г, 0,4 ммоль) упаривают с безводным пиридином (10 мл), затем растворяют его в безводном пиридине (10 мл) и добавляют одной порцией 4,4'-диметокситритилхлорид (0,17 г, 0,50 ммоль) при комнатной температуре. После выдерживания в течение 3 часов при комнатной температуре реакцию прекращают добавлением 5% водного раствора NaHCO₃ (10 мл), и продукт экстрагируют CH₂Cl₂ (2×15 мл). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, фильтруют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Очистку осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле (0-4% МеОН в CH₂Cl₂ в присутствии 0,1% TEA), получая требуемый продукт 8b; выход 72% (0,24 г, 0,29 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 9,84 (уш с, 1Н), 7,74 (уш с, 1H), 7,47-7,19 (м, 15Н), 6,92-6,85 (м, 5Н), 6,78 (дд, J=8,4 Гц, J=8,2 Гц, 1Н), 6,60 (д, J=8,4 Гц, 1H), 6,14 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 5,73 (д, J=3,5 Гц, 1Н), 5,41 (д, J=5,2 Гц, 1Н), 5,08 (д, J=6,2 Гц, 1Н), 5,05 (с, 2Н), 4,14-4,09 (м, 1Н), 4,00-3,92 (м, 3Н), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,46-3,39 (м, 2Н), 3,32-3,26 (м, 1Н), 3,20-3,16 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₄₆H₄₅N₄O₁₁⁺ [М+Н]⁺: 829,3079; найдено 829,3040.

Пример 13. 3-(2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-9-(2-аминоэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (7а)

К раствору 6а (0,13 г, 0,25 ммоль) в смеси CH₂Cl₂ (10 мл) и СН₃ОН (10 мл) добавляют 10% Pd/C (20 мг), и полученную в результате суспензию дегазируют и перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. После упаривания добавляют к остатку С₂Н₅ОН (10 мл), и катализатор отфильтровывают. Раствор концентрируют в вакууме, и полученный твердый остаток растирают с ацетонитрилом, фильтруют и сушат, получая требуемый продукт 7а; выход 85% (0,08 г, 0,21 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 8,53 (уш с, 3Н), 7,67 (с, 1H), 6,84 (дд, 1Н, J=8,3 Гц, J=8,2 Гц), 6,67 (д, 1H, J=8,3 Гц), 6,50 (д, 1H, J=8,2 Гц)_; 6,13 (т, 1Н, J=6,7 Гц), 5,41-4,90 (м, 2Н), 4,25-4,22 (м, 1H), 4,19-4,14 (м, 2Н), 3,80-3,77 (м, 1Н), 3,63-3,59 (м, 1Н), 3,59-3,55 (м, 1Н), 3,26-3,22 (м, 2Н), 2,14-2,07 (м, 1Н), 2,05-1,98 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₇H₁₉N₄O₆^- [М-Н]^-: 375,1310; найдено 375,1258.

Пример 14. 3-(5'-O-диметокситритил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-9-(2-аминоэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (9а)

К раствору 8а (0,20 г, 0,25 ммоль) в смеси CH₂Cl₂ (10 мл) и СН₃ОН (10 мл) добавляют 10% Pd/C (20 мг), и полученную в результате суспензию дегазируют и перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. После упаривания добавляют к остатку С₂Н₅ОН (10 мл), и катализатор отфильтровывают. Раствор концентрируют в вакууме, и полученный твердый остаток растирают с ацетонитрилом, фильтруют и сушат, получая требуемый продукт 9а; выход 80% (0,14 г, 0,20 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 7,43-7,19 (м, 12Н), 6,91-6,87 (м, 4Н), 6,83 (дд, 1H, J=8,4 Гц, J=8,2 Гц), 6,65 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 6,27 (дд, 1Н, J=0,8 Гц, J=8,2 Гц), 6,12 (т, 1H, J=6,5 Гц), 4,31-4,27 (м, 1H), 4,18-4,13 (м, 2H), 3,93-3,90 (м, 1H), 3,71 (с, 3Н), 3,70 (с, 3Н), 3,29-3,25 (м, 1Н), 3,24-3,20 (м, 2Н), 3,14-3,11 (м, 1Н), 2.22-2,13 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₈H₃₇N₄O₈^- [М-Н]^-: 677,2617; найдено 677,2527.

Пример 15. 3-(β-D-рибофуранозил)-9-(2-N-аминоэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (7b)

К раствору 6b (0,13 г, 0,25 ммоль) в смеси CH₂Cl₂ (10 мл) и СН₃ОН (10 мл) добавляют 10% Pd/C (20 мг), и полученную в результате суспензию дегазируют и перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. После упаривания добавляют к остатку С₂Н₅ОН (10 мл), и катализатор отфильтровывают. Раствор концентрируют в вакууме, и полученный твердый остаток растирают с ацетонитрилом, фильтруют и сушат, получая требуемый продукт 7b; выход 82% (0,08 г, 0,21 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 8,32 (уш с, 3Н), 7,74 (с, 1Н), 6,84 (дд, 1Н, J=8,2 Гц, J=8,3 Гц), 6,67 (д, 1Н, J=8,2 Гц), 6,14 (дд, 1Н, J=0,8 Гц, J=8,3 Гц), 5,76 (д, 1Н, J=3,9 Гц), 5,29 (м, 1H), 5,20 (м, 1Н), 5,07 (м, 1Н), 4,22-4,14 (м, 2Н), 4,01-3,94 (м, 2Н), 3,86-3,81 (м, 1Н), 3,69-3,64 (м, 1H), 3,60-3,55 (м, 1H), 3,26-3,22 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₇H₂₁N₄O₇⁺ [M+H]⁺: 393,1405; найдено 393,1392.

Пример 16. 3-(5'-O-диметокситритил-β-D-рибофуранозил)-9-(2-аминоэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (9b)

К раствору 8b (0,21 г, 0,25 ммоль) в смеси CH₂Cl₂ (10 мл) и СН₃ОН (10 мл) добавляют 10% Pd/C (20 мг), и полученную в результате суспензию дегазируют и перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. После упаривания добавляют к остатку С₂Н₅ОН (10 мл), и катализатор отфильтровывают. Раствор концентрируют в вакууме, и полученный твердый остаток растирают с ацетонитрилом, фильтруют и сушат, получая требуемый продукт 9b; выход 80% (0,14 г, 0,20 ммоль); ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 8,25 (уш с, 2Н), 7,46-7,16 (м, 12Н), 6,93-6,85 (м, 4Н), 6,82 (дд, 1H, J=8,3 Гц, J=8,2 Гц), 6,66 (д, 1Н, J=8,3 Гц), 6,19 (д, 1Н, J=8,2 Гц), 5,73 (д, 1Н, J=3,4 Гц), 5,50-5,33 (м, 1Н), 5,19-5,04 (м, 1Н), 4,23-4,14 (м, 2Н), 4,14-4,09 (м, 1Н), 4,09-4,05 (м, 1Н), 4,00-3,93 (м, 1Н), 3,78-3,62 (м, 8Н), 3,28-3,20 (м, 2Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₈H₃₉N₄O₉⁺ [М+Н]⁺: 695,2712; найдено 695,2681.

Пример 17. 3-(5'-O-диметокситритил-2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-5-(2-амино-2-оксоэтил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (10)

К раствору 3а (0,19 г, 0,3 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляют DBU (75 мкл, 0,5 ммоль) при комнатной температуре. Через 15 мин добавляют одной порцией йодацетамид (0,08 г, 0,4 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, и затем промывают 5% водным раствором NaHCO₃ (10 мл). Органический слой отделяют, сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-4% МеОН в CH₂Cl₂), получая требуемый продукт 10 в виде желтоватой пены (0,13 г, 0,18 ммоль, 61%). ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 7,68 (уш с, 1H), 7,49 (с, 1H), 7,44-7,41 (м, 2Н), 7,35-7,29 (м, 6Н), 7,26-7,21 (м, 2Н), 6,95-6,92 (м, 2Н), 6,92-6,89 (м, 4Н), 6,79-6,77 (м, 1Н), 6,60-6,58 (м, 1H), 6,12 (т, 1Н, J=6,5 Гц), 5,31 (уш с, 1Н), 4,53 (уш с, 2Н), 4,33-4,29 (м, 1Н), 3,93-3,90 (м, 1Н), 3,72 (с, 3Н), 3,71 (с, 3Н), 3,16-3,12 (м, 1Н), 3,12-3,07 (м, 1Н), 2,24-2,19 (м, 1H), 2,18-2,12 (м, 1Н). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₃₈H₃₅N₄O₈^- [М-Н]^-: 675,2460; найдено 675,2414.

Пример 18. 3-(2'-дезокси-β-D-рибофуранозил)-5-(2-амино-2-оксоэтил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин (11)

Соединение 10 (0,10 Г, 0,15 ммоль) растворяют в смеси уксусной кислоты (3 мл) и H₂O (0,3 мл), и полученный в результате раствор нагревают при 50°С в течение ночи. Остаток распределяют между CH₂Cl₂ (15 мл) и Н₂О (15 мл). Водный слой отделяют, концентрируют и упаривают с толуолом (3×10 мл). Полученный остаток растирают с ацетонитрилом, фильтруют и сушат, получая 11 в виде бежевого твердого остатка (0,043 г, 0,12 ммоль, 77%). ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 7,73 (с, 1Н), 7,67 (уш с, 1H), 7,24 (уш с, 1Н), 6,97-6,91 (м, 2Н), 6,88-6,85 (м, 1Н), 6,80-6,76 (м, 1H), 6,12 (т, 1Н, J=6,6 Гц), 5,21 (уш с, 1Н), 5,10 (уш с, 1H), 4,53 (с, 2Н), 4,27-4,19 (м, 1Н), 3,82-3,78 (м, 1Н), 3,66-3,60 (м, 1H), 3,60-3,55 (м, 1Н), 2,17-2,11 (м, 1Н), 2,05-1,98 (м, 1H). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₇H₁₇N₄O₆^- [М-Н]^-: 373,1154; найдено 373,1100.

Пример 19. 1,3-диаза-2-оксофеноксазин (12)

К суспензии 2а (0,140 г, 0,44 ммоль) в воде (10 мл) добавляют одной порцией концентрированную соляную кислоту HCl (1,0 мл) при комнатной температуре, и полученную в результате смесь нагревают при 60°С в течение 24 часов. Раствор концентрируют в вакууме и упаривают с водой (5×10 мл). Остаток растворяют в воде (5 мл) при кипячении, охлаждают до комнатной температуры и помещают на ночь в холодильник. Образовавшийся осадок фильтруют, промывают водой и сушат в вакууме, получая 12 в виде бежевого твердого остатка (0,11 мг, 0,23 ммоль, 52%). ¹Н ЯМР (600 МГц, DMSO-d₆) δ 10,31 (уш с, 1Н), 10,23 (уш с, 1Н), 6,99 (с, 1Н), 6,86-6,80 (м, 2Н), 6,78 (дд, 1Н, J=7,2 Гц, J=2,0 Гц), 6,73 (дд, 1Н, J=7,6 Гц, J=1,6 Гц). HRMS (ESI) m/z: рассчитано для C₁₀H₈N₃O₂⁺ [М+Н]⁺: 202,0611; найдено 202,0607.

Пример 20. Оценка клеточной цитотоксичности на HEL клетках

Цитотоксичность тестируемых соединений представлена в виде минимальной цитотоксической концентрации (МСС) или концентрации соединения, которая вызывает наблюдаемое под микроскопом изменение морфологии клеток. Альтернативно, цитостатическую активность исследуемых соединений измеряют по ингибированию роста клеток. Клетки HEL высевают по 5×10³ клеток/лунка в 96-луночные планшеты и оставляют для пролиферации в течение 24 часов. Затем добавляют среду, содержащую тестируемые соединения в разных концентрациях, начиная с 100 мкМ. Через 3 дня инкуоации при 37°С количество клеток определяют с помощью счетчика Коултера. Цитостатическую концентрацию рассчитывают как СС₅₀ (концентрация соединения, при которой пролиферация клеток снижается на 50%).

Пример 21. Цитопатичность герпесвирусов или реакция уменьшения количества бляшек

Монослой клеток культуры HEL в 96-луночных планшетах инокулируют вирусом в дозе 100 CCID₅₀ (CCID₅₀ - это доза вируса для заражения 50% клеточных культур) (ЦМВ) или 20 бляшкообразующими единицами (БОЕ) (ВЗВ), и клеточные культуры инкубируют в присутствии тестируемых соединений в разных концентрациях, начиная с 100 мкМ. Вирусную цитопатичность (ЦМВ) или бляшкообразование (ВЗВ) регистрируют, как только достигается завершение в контрольных культурах клеток, которые не обрабатывают тестируемыми соединениями. Противовирусную активность выражают в виде ЕС₅₀ (концентрация соединения, при которой снижается цитопатичность вируса (ЦМВ) или бляшкообразование (ВЗВ) на 50%).

Таблица. Антигерпетическая активность и цитотоксичность производных 1,3-диаза-2оксофеноксазина

Соединение
#

-
2a ВЗВ EC50 (мкМ) ЦМВ EC50 (мкМ) Клетки легких эмбриона человека (HEL)
Цитотоксичность (мкМ) штамм OKA
(TK+)
0,06 ± 0,01 штамм
07-1
(TK^-)
10 ± 5 штамм
AD-169
n/a^a штамм
Davis
n/a Клеточная морфология
(MCC)
>100 Клеточный
рост
(CC₅₀)
>100 2c 55 47 n/a 49 >100 ND 3a 1,5 ± 0,3 1,2 ± 0,5 4 4 20 12,2 ± 0,8 3b 2,7 ± 1,3 1,8 n/a n/a 9 ± 5 9,7 ± 1,5 3c n/a n/a n/a 2,9 20 ND 7a 2,23 1,46 n/a n/a 4 ND 7b n/a 3,57 n/a 2,19 20 ND 8b n/a n/a n/a 10,9 60 ± 40 ND 9a 1,66 ± 0,08 n/a n/a 1,27 9 ± 5 14,4 ± 0,7 10
12 8,94
67 4,63
n/a n/a
n/a 4
n/a 47 ± 27
>100 37 ± 5
ND

EC₅₀ – эффективная концентрация соединения, при которой снижается цитопатичность вируса (ЦМВ) или бляшкообразование (ВЗВ) на 50%

MCC – минимальная цитотоксическая концентрация, которая вызывает изменения клеточной морфологии, обнаруживаемые с помощью микроскопа

CC50 – цитотоксическая концентрация, при которой рост клеток снижается на 50%

^an/a – неактивно относительно соответствующего вируса при нетоксичных концентрациях

^bND – не определяли.

Изобретение относится к применению производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина формул (1), (2) и (3) в медицине в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов. Предложено применение производных формул (1), (2) и (3):

, ,

где R¹ представляет собой Н, R² представляет собой Н и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой Н и R³ представляет собой ОСН₃; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОН; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОСН; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой Н и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой Н и R³ представляет собой ОН; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH-CBz, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОН; или R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой Н в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов, включая вирус варицелла-зостер и цитомегаловирус. Предложено новое применение указанных производных, эффективных в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов, включая вирус варицелла-зостер и цитомегаловирус. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 21 пр., 3 ил.

1. Применение производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина, которые имеют формулу 1:

в которой:

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой Н и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой Н и R³ представляет собой OCH₃; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОН; или

R¹ представляет собой Н, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОСН; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой Н и R³ представляет собой Н; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой Н и R³ представляет собой ОН; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH-CBz, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой ОН; или

R¹ представляет собой OCH₂CH₂NH₂, R² представляет собой DMTr и R³ представляет собой Н

в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов, включая вирус варицелла-зостер и цитомегаловирус.

2. Применение производных 1,3-диаза-2-оксофеноксазина, которые имеют формулы 2 и 3:

в качестве ингибиторов репродукции герпесвирусов, включая вирус варицелла-зостер и цитомегаловирус.