НАНОЧАСТИЦА (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦЫ (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ И ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ Российский патент 2016 года по МПК A23L5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение принадлежит к пищевой, фармацевтической и косметической отраслям и отрасли нанотехнологии и относится к инкапсулированию биологически активных соединений с использованием зеина в качестве покровного вещества. Изобретение, в частности, относится к наночастицам, содержащим зеиновую матрицу и основную аминокислоту, используемую для инкапсулирования биологически активных соединений, а также к способам их получения и применения.

Уровень техники

Промышленность, в частности, пищевая, косметическая и фармацевтическая отрасли промышленности, нуждаются в технологическом развитии с целью удовлетворения новых запросов потребителей. Нанотехнология может обеспечивать интересные решения для указанных отраслей промышленности.

В частности, нанотехнология обладает огромным потенциалом для коренного изменения пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, поскольку позволяет инкапсулировать биологически активные соединения (БАС), например эфирные масла, антиоксиданты, минеральные вещества, пребиотики, вкусовые вещества, витамины и т.д., с целью достижения различных выгод, например для увеличения срока годности продукта, снижения количества используемых БАС, регулирования скорости их высвобождения, улучшения их биодоступности, маскирования нежелательных вкусовых качеств и т.д.

Антиоксиданты - вещества, способные приносить пользу для здоровья потребителя, - образуют группу БАС, использование которых вызывает все больший интерес. Инкапсулирование указанных антиоксидантных соединений, например кверцетина или ресвератрола, в отдельных системах (например, микрочастицах или наночастицах) с целью их защиты и поддержания их стабильности в период хранения представляет собой интересную возможность.

К настоящему времени применение инкапсулированных антиоксидантных соединений обычно ограничивается косметической и фармацевтической отраслями. В качестве иллюстрации описано инкапсулирование кверцетина в (1) нанокапсулах, образованных сополимером молочной и гликолевой кислоты (PLGA) и этилацетатом (Ghosh et al., Life Sciences 2009; 84:75-80), (2) наночастицах, образованных Eudragit® [полиметакрилатами] и поливиниловым спиртом (Wu et al., Int J of Pharm 2008; 346:160-168), и (3) в липидных микрочастицах, образованных фосфатидилхолином и тристеарином (Sccalia и Mezzena, J Pharm Biomed Anal 2009; 49:90-94). Также описано инкапсулирование ресвератрола в (1) поликапролактоновых наночастицах (Lu et al., Int J of Pharm 2009; 375:89-96), (2) пектиновых наночастицах (Das и Ng, Int J of Pharm 2010; 385:20-28), (3) липосомах (Caddeo et al., Int J of Pharm 2008; 363:183-191), (4) микросферических частицах хитозана (Peng et al., Food Chem 2010; 121(1):23-28) и (5) микросферических частицах полистирола (Nam et al., Polymer 2005;46:8956-8963).

Однако применение инкапсулированных антиоксидантных соединений в пищевой отрасли очень ограничено, поскольку материалы, используемые для инкапсулирования указанных соединений, вызывают проблемы, связанные с токсичностью, или не одобрены для использования в пищевых продуктах. Кроме того, использование антиоксидантных соединений при разработке функциональных продуктов питания очень ограничено, в частности, из-за короткого периода полураспада этих соединений, высоких требований к ответственности за возможный ущерб и плохой биодоступности при пероральном введении. Целесообразно проводить инкапсулирование антиоксидантных соединений, таких как кверцетин или ресвератрол, с целью защиты их в продуктах питания и поддержания их стабильности в течение всего срока хранения, что, кроме того, позволяет обеспечить регулируемое высвобождение, повышая биодоступность соединений.

Как известно, при разработке несущей среды, подходящей для инкапсулирования БАС, очень важно правильно выбрать материал, используемый в качестве вещества для покрытия матрицы; с этой целью наряду с другими факторами надо учитывать лекарственную форму, ее токсичность, продукт, в котором вводится состав, и т.д.

В области пищевой нанотехнологии не рекомендуется использовать синтетические полимеры, поскольку они несут проблемы, связанные с токсичностью. Хотя у природных полимеров отсутствуют указанные недостатки, для их использования необходимо разрабатывать более сложные способы получения частиц и, кроме того, в большинстве случаев, размер получаемых частиц (обычно более 100 мкм) трудно регулировать, поэтому такие микрочастицы могут быть распознаны потребителем и могут изменять органолептические характеристики целевых пищевых продуктов.

Описано использование белков как животного происхождения, например казеина, альбумина и др., так и растительного происхождения, например проламинов и др. (ES 2269715, US 2004/86595, US 5679377), в качестве веществ для покрытия БАС.

Зеин является основным запасным белком, присутствующим в семенах кукурузы. Это глобулярный белок, принадлежащий группе проламинов, поскольку он проявляет тенденцию к накоплению большого количества пролина и глутамина и характеризуется плохой растворимостью в воде. В последние годы данный белок приобрел огромную важность в области науки и промышленности благодаря своим особым физико-химическим свойствам и своей молекулярной структуре, поскольку он проявляет амфифильные свойства и может образовывать различные самоорганизующиеся структуры в зависимости от гидрофильно-липофильных соединений, присутствующих в среде (Wang et al., Food Biophysics 2008;3:174-181). Таким образом, зеин обладает рядом потенциальных преимуществ в качестве исходного материала для пленок, поскольку он способен образовывать твердые и гидрофобные покрытия с отличными характеристиками гибкости и сжимаемости, которые, кроме того, стойки к биохимической активности микроорганизмов.

Благодаря данным свойствам были найдены новые применения зеина в качестве клейкого вещества, биоразлагаемой пластмассы, жевательной резинки, покрытия для пищевых продуктов, волокна, косметических порошков, микроинкапсулирующего материала для пестицидов и чернил и т.д. (Muthuselvi и Dhathathreyan, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2006; 51:39-43). Данный белок также используется фармацевтической промышленностью для покрытия капсул с целью их защиты, контролируемого высвобождения и маскирования нежелательных вкусов и запахов (Shukla и Cheryan, Industrial Crops and Products 2001;13:171-192). Более того, было предложено использовать его для микрокапсулирования инсулина, гепарина, ивермектина и гитоксина. В общем, получены устойчивые микрочастицы/микрошарики даже в условиях высокой влажности и нагрева, которые стойки к бактериальному воздействию (патент США №5679377).

Однако использование зеина в качестве инкапсулирующего вещества в пищевой отрасли для разработки функциональных пищевых продуктов с инкапсулированными ингредиентами до сих пор находится на начальной стадии. Описано получение наночастицзеина для инкапсулирования эфирных масел по методике фазового разделения (Parris et al., J Agric Food Chem 2005; 53:4788-4792), а также инкапсулирование омега-3 жирных кислот в указанном белке по методике псевдоожиженного слоя для защиты их от окисления и маскирования отрицательных органолептических характеристик при введении их в состав интересуемых пищевых продуктов (МХ2008003213). Более того, недавно было достигнуто инкапсулирование ликопина и полифенол-эпигаллокатехин-3-галлата (ЭГКГ) в зеиновых волокнах посредством электропрядения (Fernandez et al., Food Hydrocolloids 2009;23:1427-1432 и Li et al. J Food Sci 2009; 74(3):C233-C240 respectively), лизозима по способу сверхкритического антирастворителя (CAP) (Zhong et al. Food Chemistry 2009; 115(2):697-700) и рыбьего жира по способу "дисперсия жидкости в жидкости" (Zhong et al., J Food Process Pres 2009; 33(2):255-270). В указанных работах описываются способы изготовления, которые сравнительно сложны и затруднительны в плане масштабирования их на промышленном уровне или которые ограничены только инкапсулированием липофильных соединений и не подходят для инкапсулирования гидрофильных соединений.

В связи с этим существует необходимость в разработке универсальных систем для инкапсулирования биологически активных соединений, в которых устранены все или часть вышеупомянутых недостатков и которые пригодны для переноса как водорастворимых, так и жирорастворимых соединений и, в частности, соединений, введение которых другими способами сопряжено с определенными сложностями, как в случае антиоксидантных соединений. Кроме того, желательно, чтобы указанные системы могли быть получены простым способом и обладали подходящей устойчивостью при хранении и после введения, что могло бы способствовать их применению в различных технологических областях, например в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях.

Раскрытие изобретения

В ходе данной работы, к удивлению, было найдено, что покрытие как водорастворимых, так и жирорастворимых биологически активных соединений (БАС) зеиновой матрицей и основной аминокислотой обеспечивает наночастицы, которые образуют новую систему для инкапсулирования и стабилизации указанных БАС с целью их применения в пище, косметических препаратах и фармацевтике.

Различные испытания, проведенные изобретателями, показали, что добавление основной аминокислоты вместе с зеином облегчает способ получения указанных наночастиц, содержащих зеиновую матрицу и основную аминокислоту, благодаря возможности использования водно-спиртовых растворов с относительно низким содержанием спирта для растворения зеина, что, в свою очередь, позволяет инкапсулировать как жирорастворимые, так и водорастворимые БАС. Кроме того, предотвращается использование основных добавок или растворителей, которые создают проблему токсичности, тем самым улучшаются питательные свойства наночастиц. Также основная аминокислота придает устойчивость наночастицам, поскольку повышается поверхностный заряд частиц, что предотвращает их агрегацию.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к наночастицам, содержащим зеиновую матрицу и основную аминокислоту. Указанные наночастицы могут быть использованы для инкапсулирования водорастворимых или жирорастворимых БАС. В особо предпочтительном варианте осуществления БАС представляют собой антиоксидантное соединение. Кроме того, указанные частицы могут быть использованы в качестве технологических добавок (инкапсулированная добавка может быть введена в матрицы, в которых она не растворима, что способствует равномерному распределению в среде; в качестве иллюстрации согласно изобретению жирорастворимые БАС, инкапсулированные в указанных наночастицах, могут быть диспергированы в водной матрице, при этом данный способ может оказаться сложным в осуществлении, когда БАС находятся в свободном (неинкапсулированном) виде.

Указанные наночастицы устойчивы и способны защищать БАС от разложения под действием внешних факторов, например света, изменения pH, окисления и т.д., как во время обработки продукта (например, пищевого, фармацевтического или косметического продукта), так и в период хранения. Более того, при пероральном приеме указанных наночастиц (например, с пищей) они защищают БАС от воздействия кислотной среды желудка и высвобождают БАС в необходимом месте, например в кишечнике.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения указанных пустых наночастиц, т.е. не содержащих БАС.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения указанных наночастиц, загруженных БАС, например жирорастворимым БАС или водорастворимым БАС.

Указанные способы являются простыми и применимы на промышленном уровне, в них преимущественно не используются синтетические полимеры или реагенты, не одобренные для использования в качестве пищевых добавок; эти способы позволяют минимизировать включение поверхностно-активных веществ или эмульгаторов и, кроме того, позволяют получить наночастицы наномерного масштаба с регулируемым размером частиц.

В отдельном варианте осуществления указанные способы, кроме того, включают дополнительную стадию высушивания суспензии, содержащей указанные наночастицы, с целью получения состава в порошкообразной форме, что позволяет поддерживать БАС в устойчивом виде на протяжении определенного периода времени; составы в порошкообразной форме, в частности, пригодны для использования в твердых пищевых продуктах. Высушивание указанных наночастиц преимущественно осуществляется в присутствии защитного вещества для наночастиц. Полученные таким образом наночастицы, содержащие БАС, могут быть легко ресуспендированы в водной среде, что защищает БАС от разложения в растворе. Полученный конечный продукт является устойчивым и защищает БАС при хранении в течение длительного времени и, более того, применим для различных типов пищевых продуктов, как жидких (например, напитков), так и твердых.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей указанные наночастицы, для использования в фармацевтической или косметической отраслях. В действительности, указанные наночастицы могут быть включены в состав кремов, гелей или гидрогелей с целью получения стабильных косметических или фармацевтических препаратов, пригодных для использования в указанных отраслях. Указанные наночастицы таким же образом могут быть составлены вместе со вспомогательными веществами, пригодными для местного применения.

В другом аспекте изобретение относится к пищевому продукту, содержащему указанную композицию на основе зеиновых наночастиц, обеспечиваемых данным изобретением. В отдельном варианте осуществления указанный пищевой продукт находится в жидкой, полутвердой или твердой форме.

Краткое описание чертежей

На Фигурах 1-2 показаны изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) пустых наночастиц зеина. На Фигуре 1 показано 8000-кратное увеличение (черная полоса, расположенная у левого нижнего края изображений, соответствует единице масштаба в 200 нм). На Фигуре 2 показано 15750-кратное увеличение (черная полоса, расположенная у левого нижнего края изображений, соответствует единице масштаба в 100 нм).

На Фигурах 3-4 показаны микроснимки сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) наночастиц, содержащих зеиновую матрицу, лизин и ресвератрол. Изображения соответствуют порошкообразному составу после того, как промыли для удаления защитного сахарида.

На Фигурах 5-6 показаны изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) наночастиц, содержащих зеиновую матрицу, лизин, и кверцетин. На Фигуре 5 показано 25000-кратное увеличение (черная полоса, расположенная у левого нижнего края изображений, соответствует единице масштаба в 150 нм). На Фигуре 6 показано 10000-кратное увеличение (черная полоса, расположенная у левого нижнего края изображений, соответствует единице масштаба в 150 нм).

На Фигуре 7 показана зависимость количества кверцетина, инкапсулированного в наночастицы (НЧ), содержащие зеиновую матрицу и лизин, от количества кверцетина, первоначально введенного в состав.

На Фигурах 8-9 показаны микроснимки сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) наночастиц, содержащих зеиновую матрицу, лизин и кверцетин. Изображения соответствуют порошковообразному составу после того, как промыли для удаления защитного сахарида.

На Фигурах 10-11 показана зависимость концентрации фолиевой кислоты в сыворотке (нг/мл) от времени после введения различных составов витаминов лабораторным животным. Результаты представлены в виде среднего значение ± среднеквадратичное отклонение (n=5). На Фигуре 10 показана зависимость после внутривенного способа введения (в.в.), доза 1 мг/кг. На Фигуре 11 показана зависимость после перорального способа введения, доза 1 мг/кг: неинкапсулированная фолиевая кислота, растворенная в воде (■); фолиевая кислота, инкапсулированная в зеиновых наночастицах, диспергированных в воде (±).

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, содержащие зеиновую матрицу и основную аминокислоту, и способы инкапсулирования биологически активных соединений (БАС) с целью защиты их от разложения под действием внешних факторов (таких как свет, pH, окисление и т.д.). Указанные наночастицы могут быть разработаны таким образом, что будут обеспечивать регулируемое высвобождение БАС с целью повышения его биодоступности; при этом биодоступность может быть повышена двумя способами: посредством целостного высвобождения инкапсулированного БАС в кишечник (высвобождение минимизировано на начальном этапе, в пищевой матрице и/или путем хранения, а также посредством защиты от кислой среды желудка) или посредством высвобождения БАС регулируемым образом или задержанного со временем высвобождения.

Определения

Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже указано значение некоторых терминов и выражений в контексте настоящего описания.

Используемый в данном документе термин "основная аминокислота" относится к органической молекуле, содержащей аминогруппу (-NH₂) и карбоксильную группу (-COOH) и несущей положительный заряд; при этом указанной основной аминокислотой является предпочтительно основная альфа-аминокислота, такая как лизин, аргинин и гистидин.

Используемое в данном документе выражение "приблизительно" относится к диапазону значений, близких к заданной величине, например -10% от заданной величины. Например, выражение "приблизительно 20" включает -10% из 20 или от 18 до 22. Более того, независимо от наличия или отсутствия фразы "приблизительно", специалист в данной области техники понимает, что любое численное значение, указанное в данном документе, охватывает близкий диапазон значений. Такие вариации определенного значения могут являться следствием экспериментальных ошибок в ходе соответствующего измерения.

Используемый в данном документе термин "биологически активное соединение" или "БАС" относится к соединению, обладающему питательными, терапевтическими и/или косметическими свойствами; при этом указанное соединение может быть жирорастворимым или водорастворимым. Неограничительные иллюстративные примеры БАС согласно настоящему изобретению включают аминокислоты, противомикробные вещества, вкусовые вещества, консерванты, подсластители, стероиды, лекарственные вещества, гормоны, липиды, пептиды, полинуклеотиды, полисахариды, белки, протеогликаны, вкусоароматические добавки, витамины и т.д.

Используемый в данном документе термин "водорастворимое биологически активное соединение" или "водорастворимое БАС" относится к соединению, обладающему питательными, терапевтическими и/или косметическими свойствами, которое растворимо (хорошо растворимо, легко растворимо, умеренно растворимо или малорастворимо) в водной среде согласно критериям, определенным Королевской Испанской Фармакопеей:

Описательные термины Примерный объем растворителя в миллилитрах (мл) на грамм растворенного вещества при температуре от 15°C до 25°C Хорошо растворимый Менее 1 Легкорастворимый от 1 до 10 Растворимый от 10 до 30 Умеренно растворимый от 30 до 100 Малорастворимый от 100 до 1000 Очень плохо растворимый от 1000 до 10000 Почти нерастворимый более 10000

Неограничительные иллюстративные примеры водорастворимых БАС включают витамины группы B или C и их производные, соли или сложные эфиры; гиалуроновую кислоту, хондроитин сульфат, тиоктовую кислоту, их соли или сложные эфиры и т.д. В отдельном варианте осуществления указанное водорастворимое БАС выбрано из группы, включающей фолиевую кислоту, 4-аминобензойную кислоту, ниацин, пантотеновую кислоту, тиаминмонофосфат, тиаминпирофосфат, тиаминтрифосфат, аскорбиновую кислоту, птероилполиглутаминовые кислоты (производные фолиевой кислоты: фолат полиглутаматы; полиглутамат фолаты), фолиниевую кислоту, никотиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, тиоктовую кислоту (альфа-липоевую кислоту), п-кумаровую кислоту, кофеиновую кислоту, их пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, сложные эфиры или соли и их смеси.

Используемый в данном документе термин "жирорастворимое биологически активное соединение" или "жирорастворимое БАС" относится к соединению, которое обладает питательными, терапевтическими и/или косметическими свойствами и которое растворимо (хорошо растворимо, легко растворимо, умеренно растворимо или малорастворимо) в жирах и маслах согласно критериям, определенным Королевской Испанской Фармакопеей. Неограничительные иллюстративные примеры жирорастворимых БАС включают витамины, например витамины группы A, D, E, K и их производные, фосфолипиды, каротеноиды (каротины, ликопин, лютеин, капсантин, зеаксантин и т.д.), омега-3-жирные кислоты (докозагексаеновая кислота (ДГК), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и т.д.), фитостанолы и фитостерины (ситостерин, кампестерин, стигмастерин и т.д.), полифенолы (кверцетин, рутин, ресвератрол, кемпферол, мирицетин, изорамнетин и т.д.) и их производные.

Продукт называется "пищевым" продуктом, когда он безопасен для использования в пище человека или животного согласно Кодексу качества пищи какого-либо государства или организации, например Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ПСО) или Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ); следовательно "пищевой" продукт представляет собой нетоксичный продукт, "пригодный для использования в пище", так что оба выражения являются синонимичными и используются без различия в данном описании.

Используемый в этом документе термин "водная среда" относится к среде, содержащей воду. В отдельном варианте осуществления водная среда по существу состоит из воды.

Используемый в этом документе термин "водно-спиртовая среда" относится к среде, содержащей воду и спирт в различных соотношениях. В отдельном варианте осуществления указанная водно-спиртовая среда включает раствор этанола в воде при любых соотношениях между указанными соединениями.

Используемый в этом документе термин "наночастица" относится к коллоидным системам сферического типа или схожей формы с размером менее 1 микрометра (мкм), предпочтительно с размером примерно от 10 до 900 нанометров (нм).

Используемый в этом документе термин "средний размер" относится к среднему диаметру совокупности наночастиц, которые движутся вместе в водной среде. Средний размер данных систем может быть измерен по стандартным способам, известным специалисту в данной области техники, которые описаны, например, в экспериментальной части (см. ниже).

Используемый в этом документе термин "зеин" включает любой глобулярный белок, принадлежащий группе проламинов; указанный белок обычно синтезируется во время развития эндосперма (питательная ткань, образованная клетками зародышевого мешка семенных растений и обычно составляющая пищевой запас зародыша семян различных покрытосемянных растений). Зеин может быть получен из любых подходящих источников, хотя предпочтительно его получают из кукурузы. Известны различные способы и методики экстракции зеина из эндосперма кукурузы; коммерческий зеин обычно экстрагируют из кукурузной глютеновой муки (заявка на патент США №2009/0258050).

При исследовании зеина установлена высокая изменчивость на генетическом уровне и, таким образом, выявлена сложная ситуация среди различных белков, являющихся частью группы белков под названием зеины. Нативный зеин фактически относится к большому и неоднородному семейству нескольких групп белков, которые различаются молекулярным размером, растворимостью и зарядом. По оценкам, существует более двадцати различных зеинов. Анализ экстрактов зеина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ионно-обменной хроматографии, гель-проникающей хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), аминокислотным анализом и по методике ДНК-клонирования позволил достичь более лучшего понимания зеиновых белков.

При анализе состава аминокислот зеина выявлено большое содержание лейцина, аланина, глутамина и фенилаланина, однако лизин и триптофан отсутствовали или, в качестве альтернативы, присутствовали в очень малых количествах. Высокое содержание неполярных аминокислотных остатков и необычное отсутствие ионных групп обуславливает гидрофобную природу зеина и его особенную растворимость.

Белковые тельца зеина образованы тремя типами структурно отличных белков: альфа-зеином (α-зеин), гамма-зеином (γ-зейн) [который включает бета-зеин (β-зеин)] и дельта-зеином (δ-зеин). Указанные белки могут быть подразделены на четыре класса (α-зеин, β-зеин, γ-зеин и δ-зеин) на основе различий в их растворимости и последовательности.

Зеин, экстрагированный без использования восстановителей, составляет большое мультигенное семейство полипептидов под названием α-зеин. α-Зеины, составляющие, как правило, большую часть нативного зеина, содержат около 40 аминокислот при N-конце, которым предшествует ряд из 9 или 10 повторяющихся пептидов из 20 аминокислот. Полагают, что эти повторения являются α-спиралями и вплетают белок в палочкообразную молекулу.

Другие фракции зеина (β-, γ- и δ-зеины) должны экстрагироваться с помощью спиртовых растворов спиртов, содержащих восстанавливающие агенты для разрыва дисульфидных связей. В качестве иллюстрации, для лабораторной экстракции используют меркаптоэтанол. У β-, γ- и δ-зеинов не обнаруживается гомология последовательностей с α-зеином.

γ-Зеин растворим как в водных, так и спиртовых растворителях в восстановительных условиях. Каждый из γ-зеинов обладает уникальной N-концевой последовательностью. В качестве примера, в γ-зеине массой 50 кДа длина данного участка составляет 136 аминокислот и он очень обогащен гистидином. В γ-зеине массой 25 кДа имеется ряд из восьми тандемных повторов гексапептида, который дает 11 -аминокислот после N-конца. Первые восемь аминокислот γ-зеинового белка массой 16 кДа одинаковы с аминокислотами γ-зеинового белка массой 27 кДа, но в γ-зеиновом белке массой 16 кДа имеется три вырожденных варианта пролин-обогащенных повторов. γ-Зеин обычно составляет от 10 до 15% от общего количества зеинов.

β-Зеин, который связан с γ-зеином, включает полипептид массой 17 кДа, обогащенный метионином, и составляет до 10% от общего количества зеинов. Приблизительно 140 последних аминокислот β- и γ-зеинов совпадают на 85%. В β-зеине отсутствуют повторяющиеся пептиды, и, по-видимому, он состоит главным образом из β-слоев и имеет повернутую конформацию.

δ-Зеин представляет собой белок массой 10 кДа и составляет незначительную долю зеина. δ-Зеины являются наиболее гидрофобными из данной группы, не содержат повторяющихся пептидов и в большой степени обогащены метионином и цистеином.

С 1985 года зеин рассматривается Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств (США) как "признанный безопасным" (GRAS) продукт [номер по CAS (Chemical Abstract Service): 9010-66-6].

В настоящем изобретении источник или качество зеина не ограничивается одиночным зеином, и, в действительности, любой зеин может быть использован для осуществления настоящего изобретения на практике. В качестве иллюстрации, к коммерческим зеинам, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, относятся, помимо прочего, зеин, поставляемый компанией Sigma-Aldrich (номер продукта Z 3625); Wako Puras Chemical Industries (номер продукта 261-00015, 264-01281 и 260-01283); Spectrum Chemical (номера продукта Z1131 и ZE105); изделия ScienceLab SLZ1150; зеин, поставляемый компанией SJZ Chem-Pharma Company (название продукта ZEIN (GLIDZIN); Arco Organics (номера по каталогу 17931-0000, 17931-1000 и 17931-5000) и Freeman Industries, зеин обычного сорта F4000, зеин обычного сорта F4400, зеин особого сорта F6000 и т.д. В отдельном варианте осуществления используют коммерческий зеин, поставляемый компанией Sigma-Aldrich (номер продукта Z3625), который получают из кукурузы.

Используемый в настоящем документе термин "зеин" включает как нативный зеин, так и модифицированный зеин. Термин "модифицированный зеин" включает любой зеин с аминокислотной последовательностью, которой обычно не существует в природе, но поведение которого схоже с оригинальными зеинами и который растворим в спирте. Могут быть введены аминокислотные замены, в особенности, те, что по существу не модифицируют гидрофобность. В качестве иллюстрации, аминокислотные замены могут быть осуществлены в пределах повторяющихся участков или может быть замещена одиночная аминокислота, также замены могут быть осуществлены в сегментах, связывающих домены повторяющихся последовательностей. Вставки и замены могут быть также введены в карбоксильный конец и аминоконец молекулы зеина. Кроме того, могут быть проведены делеции в аминокислотной последовательности, при условии что получающийся в результате белок функционально эквивалентен зеину, т.е. сохраняет его свойства.

Наночастицы по настоящему изобретению

В одном аспекте изобретение относится к наночастице, далее именуемой наночастицей по настоящему изобретению, содержащей зеиновую матрицу и основную аминокислоту.

Практически любой зеин может образовывать матрицу наночастицы по настоящему изобретению; тем не менее, в отдельном варианте осуществления указанным зеином является зеин из кукурузы, например зеин, поставляемый компанией Sigma-Aldrich (номер продукта Z3625).

В отдельном варианте осуществления указанная основная аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина, лизина, гистидина и их смесей.

Наночастицы по настоящему изобретения могут быть использованы для инкапсулирования биологически активного соединения (БАС). Наночастицы по настоящему изобретению могут, кроме того, быть использованы в качестве технологических добавок, которые, например, облегчают внедрение жирорастворимого БАС в водную матрицу и т.д.

В связи с этим в другом отдельном варианте осуществления наночастица по настоящему изобретению, кроме того, содержит БАС. Указанное БАС может представлять собой водорастворимое БАС или жирорастворимое БАС; в данном случае наночастица по настоящему изобретению временами идентифицируется в настоящем описании как "загруженная наночастица по настоящему изобретению" для проведения различия с другими наночастицами по настоящему изобретению, которые не содержат БАС (порой идентифицируемые как "пустые наночастицы по настоящему изобретению").

В отдельном варианте осуществления указанное БАС представляет собой жирорастворимое БАС. В более конкретном варианте осуществления указанное жирорастворимое БАС выбрано из группы, состоящей из:

a) полифенола;

b) витамина из группы витаминов A, D, Е или K;

c) предшественника (провитамина) или производного витамина из пункта Ь);

d) фосфолипида;

e) каротеноида;

f) жирной кислоты;

g) фитостанола или фитостерина;

h) соли или сложного эфира любого из предшествующих соединений по пп.a)-g); и

i) их комбинаций.

В более конкретном варианте осуществления указанное жирорастворимое БАС представляет собой:

i) полифенол, например такой как флавонол (например, катехин, эпикатехин, изорамнетин, кемпферол, мирицетин, кверцетин и т.д.); антоциан (например, цианидин, дельфинидин, мальвидин, пеонидин, петунидин и т.д.); фитоалексин (например, ресвератрол и т.д.); гидрокситирозол и т.д.;

ii) жирорастворимый витамин, например такой как витамин A и его производные (например, ретиноевая кислота, ретиналь, ретинол и т.д.); витамин Е и его производные (например, токоферол, к примеру альфа-токоферол и т.д., токотриенол и т.д.); витамин D и его производные (например, витамин D₁, витамин D₂ (эргокальциферол), витамин D₃ (холекальциферол), витамин D₄ (22-дигидроэргокалыдиферол), витамин D₅ (ситокальциферол) и т.д.); витамин К, или фитоменадион, и его производные (например, витамин K1 (филлохинон), витамин K2 (менахинон), менадион и т.д.);

iii) каротеноид, например такой как каротин (например, альфа-каротин, бета-каротин, криптоксантин, ликопин и т.д.); ксантофилл (например, астаксантин, кантаксантин, капсантин, криптоксантин, флавоксантин, лютеин, родоксантин, рубиксантин, виолаксантин, зеаксантин и т.д.);

iv) жирная кислота, например такая как омега-3-жирная кислота (например, α-линоленовая кислота (АЛК), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), докозагексаеновая кислота (ДГК) и т.д.; омега-6-жирная кислота (например, γ-линолевая кислота и т.д.); или

v) фитостерин или фитостанол (например, брассикастерин, кампестерин, эргостерин, стигмастерин, ситостанол, ситостерин и т.д.).

В особом варианте осуществления указанное жирорастворимое БАС выбрано из группы, включающей флавонол (например, кверцетин и т.д.), антоциан, фитоалексин (например, ресвератрол и т.д.), гидрокситирозол, ретиноевую кислоту, ретиналь, ретинол, кальциферол (эргокальциферол и колекальфицерол), альфа-токоферол, токотриенол, фитоменадион, альфа-каротин, бета-каротин, ликопин, капсантин, лютеин, зеаксантин, ксантофилл, ЭПК, ДГК, линолевую кислоту, кампестерин, стигмастерин, ситостерин, их пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, сложные эфиры или соли и их смеси.

В более конкретном варианте осуществления указанное жирорастворимое БАС выбрано из группы, состоящей из кверцетина, ресвератрола, их пищевых, фармацевтически или косметически приемлемых производных, сложных эфиров или солей и их смесей.

В другом отдельном варианте осуществления указанное БАС представляет собой водорастворимое БАС. В более конкретном варианте осуществления указанное водорастворимое БАС представляет собой:

a) витамин из группы витаминов B или C;

b) производное витамина из пункта а);

c) соединение, выбранное из гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата и тиоктовой кислоты;

d) соль или сложный эфир любого из предшествующих соединений по пп.a)-c); и

e) их комбинаций.

В более конкретном варианте осуществления указанное водорастворимое БАС выбрано из группы, состоящей из фолиевой кислоты, ее пищевых, фармацевтически или косметически приемлемых сложных эфиров или солей и их смесей.

Использование наночастиц по настоящему изобретению в качестве систем для инкапсулирования антиоксидантных соединений представляет собой отдельный и предпочтительный вариант осуществления.

Способ получения наночастиц по настоящему изобретению

В другом аспекте изобретение относится к способу получения наночастиц, содержащих зеиновую матрицу и основную аминокислоту (наночастиц по настоящему изобретению), именуемому далее "способом [1] по настоящему изобретению", который включает:

a) приготовление водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту; и

b) добавление воды к раствору из стадии а).

Водно-спиртовой раствор, использованный на стадии а) способа [1] по настоящему изобретению, содержит воду и спирт, как правило, этанол; в отдельном варианте осуществления указанный водно-спиртовой раствор содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 60%, а более предпочтительно 50%.

Количество зеина, которое может содержаться в водно-спиртовом растворе, приготовленном на стадии а) способа [1] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления количество зеина, содержащегося в указанном водно-спиртовом растворе, составляет от 0,1% до 10% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 0,2% до 2,5%, а более предпочтительно от 0,5% до 1%.

Количество основной аминокислоты, которая может содержаться в указанном водно-спиртовом растворе, приготовленном на стадии а) способа [1] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах. Как правило, указанное количество выражается в соответствии с количеством растворенного зеина. Таким образом, хотя весовое соотношение между основной аминокислотой и зеином [основная аминокислота:зеин], присутствующими в указанном водно-спиртовом растворе, обычно зависит от типа инкапсулируемого БАС и может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления указанное весовое соотношение основная аминокислота: зеин составляет от 1:0,01 до 1:50, как правило, от 1:0,5 до 1:25, предпочтительно от 1:1 до 1:20, более предпочтительно от 1:5 до 1:15; в особом варианте осуществления весовое соотношение основная аминокислота:зеин составляет приблизительно 1:6.

На стадии b) способа [1] по настоящему изобретению добавляют воду в количестве, достаточном для образования наночастиц по настоящему изобретению. Хотя количество добавляемой воды может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления воду добавляют в количестве, достаточном для получения конечного содержания спирта в среде, которое составляет от 10% до 60% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 15% до 30%, более предпочтительно приблизительно 25%.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения наночастиц, содержащих зеиновую матрицу, основную аминокислоту и жирорастворимое БАС (наночастицы по настоящему изобретению, загруженные жирорастворимым БАС), именуемому далее "способом [2] по настоящему изобретению", который включает:

a) приготовление водно-спиртового раствора (i), содержащего зеин и основную аминокислоту;

b) приготовление спиртового раствора, содержащего жирорастворимое БАС, и разбавление его водой для получения водно-спиртового раствора (ii), содержащего жирорастворимое БАС;

c) смешивание указанного водно-спиртового раствора (i), содержащего зеин и основную аминокислоту, с указанным водно-спиртовым раствором (ii), содержащим жирорастворимое БАС; и

d) добавление воды к смеси, полученной на стадии с).

Водно-спиртовой раствор (i), содержащий зеин и основную аминокислоту, использованный на стадии а) способа [2] по настоящему изобретению, содержит воду и спирт, как правило, этанол; в отдельном варианте осуществления указанный водно-спиртовой раствор содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 60%, а более предпочтительно приблизительно 50%. Указанный водно-спиртовой раствор (i) готовят смешиванием его компонентов в подходящих количествах.

Количество зеина, которое может содержаться в водно-спиртовом растворе (i), содержащем зеин и основную аминокислоту и используемом на стадии а) способа [2] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления количество зеина, содержащегося в указанном водно-спиртовом растворе (i) составляет от 0,1% до 10% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 0,2% до 2,5%, а более предпочтительно от 0,5% до 1%.

Количество основной аминокислоты, которая может содержаться в указанном водно-спиртовом растворе (i), содержащим зеин и основную аминокислоту и используемым на стадии а) способа [2] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах. Указанное количество обычно будет выражаться в соответствии с количеством растворенного зеина. Таким образом, хотя весовое соотношение между основной аминокислотой и зеином [основная аминокислота:зеин], присутствующими в указанном водно-спиртовом растворе (i), может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления указанное весовое соотношение основная аминокислота:зеин составляет от 1:0,01 до 1:50, как правило, от 1:0,5 до 1:25, предпочтительно от 1:1 до 1:20, более предпочтительно от 1:5 до 1:15; в особом варианте осуществления весовое соотношение основная аминокислота:зеин составляет приблизительно 1:6 (в том случае, когда БАС - это ресвератрол) и 1:11 (когда БАС - это кверцетин).

Водно-спиртовой раствор (ii), содержащий жирорастворимое БАС, приготавливаемый на стадии b) способа [2] по настоящему изобретению, может быть получен растворением или солюбилизацией указанного жирорастворимого БАС в спирте (например, этаноле) с последующим разбавлением полученного спиртового раствора водой. Таким образом, указанный водно-спиртовой раствор (ii), содержащий жирорастворимое БАС и приготовленный на стадии b) способа [2] по настоящему изобретению, содержит воду и спирт, как правило, этанол; в отдельном варианте осуществления указанный водно-спиртовой раствор (ii) содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 65%, а более предпочтительно от 50% до 60%.

Количество жирорастворимого БАС, которое может содержаться в водно-спиртовом растворе (ii), может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления количество жирорастворимого БАС, содержащегося в указанном водно-спиртовом растворе (ii), составляет от 0,05% до 10% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 0,1% до 1%, а более предпочтительно от 0,2% до 0,3%.

Согласно стадии c) способа [2] по настоящему изобретению водно-спиртовой раствор (i), содержащий зеин и основную аминокислоту, смешивают с водно-спиртовым раствором (ii), содержащим жирорастворимое БАС, и таким образом в водно-спиртовой среде получают смесь, содержащую зеин, основную аминокислоту и жирорастворимое БАС. Весовое соотношение жирорастворимое БАС:зеин, присутствующих в смеси, образованной на указанной стадии с), может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления весовое соотношение между жирорастворимым БАС и зеином [жирорастворимое БАС:зеин] составляет от 1:0,5 до 1:70, предпочтительно от 1:5 до 1:50, более предпочтительно от 1:10 до 1:30.

На стадии d) способа [2] по настоящему изобретению добавляют воду к смеси, полученной на стадии с), в количестве, достаточном для образования наночастиц изобретения. Хотя количество добавляемой воды может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления воду добавляют в количестве, достаточном для получения конечного содержания спирта в среде, которое составляет от 10% до 60% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 15% до 30%, более предпочтительно приблизительно 25%.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения наночастиц, содержащих зеиновую матрицу, основную аминокислоту и водорастворимое биологические активное соединение (наночастицы по настоящему изобретению, загруженные водорастворимым БАС), именуемому далее "способом [3] по настоящему изобретению", который включает:

a) приготовление водно-спиртового раствора (i), содержащего зеин и основную аминокислоту;

b) приготовление водного раствора, содержащего водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту, и разбавление его спиртом для получения водно-спиртового раствора (ii), содержащего водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту;

c) смешивание указанного водно-спиртового раствора (i), содержащего зеин и основную аминокислоту, с указанным водно-спиртовым раствором (ii), содержащим водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту;

d) необязательно, добавление поверхностно-активного вещества к смеси, полученной на стадии c); и

e) добавление воды к смеси, полученной на стадии c) или стадии d).

Водно-спиртовой раствор (i), содержащий зеин и основную аминокислоту, использованный на стадии а) способа [3] по настоящему изобретению, содержит воду и спирт, как правило, этанол; в отдельном варианте осуществления указанный водно-спиртовой раствор содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 60%, а более предпочтительно приблизительно 50%. Указанный водно-спиртовой раствор (i) готовят смешиванием его компонентов в подходящих количествах.

Количество зеина, которое может содержаться в водно-спиртовом растворе (i), содержащем зеин и основную аминокислоту и используемом на стадии а) способа [3] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления количество зеина, содержащегося в указанном водно-спиртовом растворе (i), составляет от 0,1% до 10% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 0,2% до 2,5%, а более предпочтительно от 0,5% до 1%.

Количество основной аминокислоты, которая может содержаться в указанном водно-спиртовом растворе (i), содержащем зеин и основную аминокислоту и используемом на стадии а) способа [3] по настоящему изобретению, может варьироваться в широких пределах. Указанное количество обычно будет выражаться в соответствии с количеством растворенного зеина. Таким образом, хотя весовое соотношение между основной аминокислотой и зеином [основная аминокислота:зеин], присутствующими в указанном водно-спиртовом растворе (i), может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления указанное весовое соотношение основная аминокислота:зеин составляет от 1:0,01 до 1:50, как правило, от 1:0,5 до 1:25, предпочтительно от 1:1 до 1:20, более предпочтительно от 1:5 до 1:15; в особом варианте осуществления весовое соотношение основная аминокислота:зеин составляет приблизительно 1:6,7.

Водно-спиртовой раствор (ii), содержащий водорастворимое БАС, приготавливаемый на стадии b) способа [3] по настоящему изобретению, может быть получен растворением или солюбилизацией указанного водорастворимого БАС в воде, необязательно в присутствии второй основной аминокислоты, с последующим разбавлением полученного водного раствора спиртом (например, этанолом). Таким образом, указанный водно-спиртовой раствор (ii), содержащий водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту, приготовленный на стадии b) способа [3] по настоящему изобретению, содержит воду и спирт, как правило, этанол; в отдельном варианте осуществления указанный водно-спиртовой раствор (ii) содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 60%, а более предпочтительно приблизительно 50%.

Водный раствор, полученный в результате растворения водорастворимого БАС в воде, необязательно в присутствии указанной второй аминокислоты, содержит в отдельном варианте осуществления указанное водорастворимое БАС и воду, а в другом отдельном варианте осуществления - указанное водорастворимое БАС, указанную основную аминокислоту и воду. Указанная вторая аминокислота обычно будет содержаться в указанном водном растворе [и, следовательно, в указанном водно-спиртовом растворе (ii)], когда ее присутствие необходимо для растворения водорастворимого БАС, поскольку солюбилизация некоторых водорастворимых БАС, например фолиевой кислоты, может быть облегчена с помощью водного раствора, основность которого повышена указанной основной аминокислотой; в таких случаях весовое соотношение между водорастворимым БАС и второй основной аминокислотой в указанном водном растворе с повышенной основностью может составлять от 1:0,25 до 1:5, предпочтительно от 1:0,5 до 1:2, более предпочтительно от 1:0,8 до 1:1,8; а затем, как упомянуто выше, данный водный раствор разбавляют в водно-спиртовой среде (например, в этаноле) для получения указанного водно-спиртового раствора (ii), который, как упомянуто выше, содержит от 25% до 75% (по отношению массы к объему) спирта, предпочтительно от 30% до 60%, более предпочтительно приблизительно 50%.

Способ [3] изобретения предполагает возможность использования 2 различных основных аминокислот. Таким образом, в отдельном варианте осуществления основная аминокислота, использованная при приготовлении водно-спиртового раствора (i), содержащего зеин и основную аминокислоту (первая аминокислота), и основная аминокислота, использованная при приготовлении водно-спиртового раствора (ii), содержащего водорастворимое БАС и (в данном случае) вторую основную аминокислоту (вторая основная аминокислота), совпадают, и она выбрана из группы, состоящей из аргинина, лизина, гистидина и их смесей, предпочтительно лизина.

Количество водорастворимого БАС, которое может содержаться в водно-спиртовом растворе (ii), может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления количество водорастворимого БАС, содержащегося в указанном водно-спиртовом растворе (ii), составляет от 0,01% до 10% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 0,05% до 5%, а более предпочтительно от 0,1% до 1%.

Согласно стадии с) способа [3] по настоящему изобретению водно-спиртовой раствор (i), содержащий зеин и основную аминокислоту, смешивают с водно-спиртовым раствором (ii), содержащим водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту, и таким образом получают смесь, содержащую зеин, основную аминокислоту, водорастворимое БАС и, необязательно, вторую основную аминокислоту (которая, как упомянуто выше, может совпадать с основной аминокислотой, содержащейся в указанном водно-спиртовом растворе (i)). Весовое соотношение между водорастворимым БАС и зеином, присутствующими в смеси, образованной на стадии с), может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления весовое соотношение между водорастворимым БАС и зеином [водорастворимое БАС:зеин] в указанной смеси, полученной на стадии c), составляет от 1:0,2 до 1:50, предпочтительно от 1:1 до 1:15, более предпочтительно от 1:6 до 1:12.

На необязательной стадии d) способа [3] по настоящему изобретению к смеси, полученной на стадии c), добавляют поверхностно-активное вещество. Не стремясь связать это с какой-либо теорией, полагают, что поверхностно-активное вещество способствует инкапсулированию водорастворимого БАС в наночастицах, поскольку оно дает возможность водорастворимому БАС приблизиться к липофильной полимерной матрице [зеину], облегчая тем самым его захват в момент индуцирования коацервации. В отдельном варианте осуществления указанное поверхностно-активное вещество представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат, например сложный эфир, полученный из жирной кислоты (например, олеиновой кислоты) и полиэтоксилированного сорбитана, например сорбитана под торговым названием Tween® 80.

В конце, на стадии е) способа [3] по настоящему изобретению, добавляют воду к смеси, полученной на стадии c) или стадии d), в количестве, достаточном для образования наночастиц изобретения. Хотя количество добавляемой воды может варьироваться в широких пределах, в отдельном варианте осуществления воду добавляют в количестве, достаточном для получения конечного содержания спирта в среде, которое составляет от 10% до 60% (по отношению массы к объему), предпочтительно от 15% до 30%, более предпочтительно приблизительно 25%.

Практически любой зеин может быть использован для воплощения указанных способов [1] и [2] по настоящему изобретению на практике; тем не менее, в отдельном варианте осуществления указанным зеином является зеин из кукурузы, например зеин, поставляемый компанией Sigma-Aldrich (номер продукта Z3625).

Хотя могут быть использованы спирты совсем различной природы, в отдельном и предпочтительном варианте данного изобретения водно-спиртовым раствором, используемым в способах [1], [2] и [3] по настоящему изобретению, является этанол.

Практически любая основная аминокислота может быть использована для воплощения указанных способов [1], [2] и [3] по настоящему изобретению на практике; тем не менее, в отдельном варианте осуществления указанная основная аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина, лизина, гистидина и их смесей, предпочтительно из лизина. Указанная основная аминокислота, которая может находиться внутри и снаружи от наночастиц изобретения, играет принципиально значимую технологическую роль, поскольку:

- она облегчает растворение компонентов до образования наночастиц; вносит специфический вклад в растворение зеина, поскольку последний в присутствии основной аминокислоты может растворяться в водно-спиртовом растворе с низким содержанием спирта (например, 50%) в сравнении с его растворением в отсутствие указанной аминокислоты; и более того, она способствует растворению БАС, в частности, некоторых водорастворимых БАС, в особенности кислотных водорастворимых БАС (например, фолиевой кислоты);

- она поддерживает pH на подходящем уровне после образования указанных наночастиц на обоих сторонах (внутри и снаружи); и

- она позволяет получать наночастицы с отрицательным поверхностным зарядом, далеким от значения - 10 мВ, что предотвращает агрегацию наночастиц.

В связи с этим основная аминокислота играет очень важную роль в образовании наночастиц по настоящему изобретению, как загруженных, так и незагруженных БАС.

Наночастицы по настоящему изобретению характеризуются средним размером частиц менее 1 мкм, как правило, их средний размер составляет от 1 до 999 нм, предпочтительно от 10 до 900 нм, более предпочтительно от 50 до 500 нм, еще более предпочтительно от 100 до 450 нм, а еще более предпочтительно от 140 до 400 нм. Наночастицы по настоящему изобретению преимущественно имеют размер частиц около 200 нм с целью предотвращения изменения их органолептических свойств (качества на вкус), что особенно важно при использовании их в пищевой отрасли.

Наночастицы по настоящему изобретению, как загруженные БАС, так и незагруженные БАС (пустые наночастицы), могут включать в свой состав антиоксидант, например аскорбиновую кислоту (витамин C) и т.д., с целью повышения их устойчивости от воздействия температуры и окисления. В данном случае указанный антиоксидант может быть введен совместно с инкапсулированными БАС виде (когда это уместно) или в оболочку наночастиц по настоящему изобретению; для этого указанные способы [1], [2] и [3] по настоящему изобретению будут подходящим образом приспособлены для включения антиоксиданта в состав наночастиц, например, путем добавления антиоксиданта к водному раствору, содержащему указанное БАС и, необязательно, указанную вторую основную аминокислоту.

В отдельном варианте осуществления БАС представляет собой фолиевую кислоту, а антиоксидант представляет собой аскорбиновую кислоту, которые, по-видимому, служат для защиты фолиевой кислоты от разложения под действием ультрафиолетового света, при изменении pH, воздействии тепла, кислорода и т.д., внося, кроме того, вклад в питательные свойства самой аскорбиновой кислоты. Указанный антиоксидант может быть введен совместно с инкапсулированными БАС или в оболочку наночастиц по настоящему изобретению.

Кроме того, при необходимости способ [1] по настоящему изобретению, а также способы [2] и [3] по настоящему изобретению могут включать одну или несколько стадий дополнительной стабилизации наночастиц, достигаемой посредством различных обработок.

В отдельном варианте осуществления указанная стабилизационная обработка включает обработку суспензии, содержащей полученные наночастицы по настоящему изобретению, как загруженные БАС, так и не содержащие БАС, при высоком давлении, например при давлении в пределах от 100 до 800 МПа, как правило, от 350 до 600 МПа. В отдельном варианте осуществления указанная обработка включает обработку суспензии наночастиц в циклах по 3-5 минут при давлении от 100 до 800 МПа, как правило, от 350 до 600 МПа; в действительности, хорошие результаты получаются при давлении 400 МПа.

В другом отдельном варианте осуществления указанная стабилизационная обработка включает ультравысокотемпературную обработку суспензии, содержащей полученные наночастицы по настоящему изобретению, как загруженные БАС, так и не содержащие БАС, например, при температуре от 130°C до 140°C в течение 2-5 секунд с последующим быстрым охлаждением.

Таким же образом, при необходимости способ [1] по настоящему изобретению, а также способы [2] и [3] по настоящему изобретению могут включать стадию высушивания суспензии, содержащей образованные наночастицы, с целью получения наночастиц по настоящему изобретению, как загруженных БАС, так и не содержащих БАС, в виде порошка. Данная форма выпуска указанных наночастиц способствует повышению их устойчивости и, более того, особенно пригодна в случае их возможного применения в твердых пищевых продуктах, таких как мука, хлеб, кондитерские изделия, крупы, сухое молоко и т.д., а также в косметических и/или фармацевтических продуктах. Можно использовать практически любой традиционный способ или методику, подходящую для высушивания суспензий, содержащих наночастицы, для осуществления данной стадии высушивания; тем не менее, в отдельном варианте осуществления суспензию, содержащую наночастицы, высушивают аспирацией или распылением (распылительная сушка) или посредством лиофилизации. Такая обработка обычно проводится добавлением к суспензии наночастиц подходящего защитного вещества для указанных наночастиц, такого как сахарид, например лактозы, трегалозы, маннита, сахарозы, мальтодекстрина, глюкозы, сорбита, мальтозы и т.д., а также их смесей. Указанное защитное вещество защищает наночастицы по настоящему изобретению как от термического разложения, так и от окисления в процессе высушивания.

Весовое соотношение зеин:сахарид может варьироваться в широких пределах; тем не менее, в отдельном варианте осуществления весовое соотношение зеин:сахарид составляет от 1:1 до 1:4, предпочтительно около 1:2.

Кроме того, в отдельном варианте осуществления раствор, содержащий сахарид, может, кроме того, содержать антиоксидантное вещество, такое как аскорбиновая кислота (витамин C) и т.д.; в данном случае весовое отношение зеин:сахарид:защитное вещество (например, витамин С) может составлять 1:0,75-2,5:0,25-1,5, предпочтительно 1:1,5:0,5.

Наночастицы по настоящему изобретению, полученные по способу [1] по настоящему изобретению, т.е. наночастицы, содержащие зеиновую матрицу и основную аминокислоту и полученные по способу [1], представляют собой дополнительный аспект настоящего изобретения.

Аналогичным образом, загруженные наночастицы по настоящему изобретению, полученные по способам [2] или [3] по настоящему изобретению, т.е. наночастицы, содержащие зеиновую матрицу и основную аминокислоту и загруженные жирорастворимым или водорастворимым БАС, представляют собой дополнительный аспект настоящего изобретения.

Применения

Наночастицы по настоящему изобретению обладают способностью инкапсулировать БАС, например водорастворимое БАС или жирорастворимое БАС. Они могут, кроме того, быть использованы в качестве технологических добавок, способствуя, например, равномерному распределению БАС в среде, в которой оно не растворяется, и т.д.

В отдельном варианте осуществления наночастицы по настоящему изобретению обеспечивают инкапсуляцию БАС и его внедрение в фармацевтические, косметические и пищевые композиции, поскольку при их приготовлении и в конечном продукте (наночастицах) не используются другие ингредиенты, не являющиеся природными полимерами (что позволяет избежать токсичности, связанной с синтетическими полимерами) и пищевыми ингредиентами. Указанные наночастицы защищают БАС от разложения под действием внешних факторов (свет, изменение pH, окисление и т.д.).

Наночастицы по настоящему изобретению могут быть ресуспендированы в водной среде, что защищает БАС от разложения в растворе. Кроме того, они могут быть выпущены в виде сухого порошка, что позволяет сохранить БАС в устойчивом виде и обеспечивает их хранение на протяжении длительного времени (в частности, для их внедрения в твердые пищевые препараты).

В дополнение, наночастицы по настоящему изобретению также пригодны для приготовления косметических и фармацевтических композиций для местного применения.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к композиции, именуемой далее "композицией по настоящему изобретению", содержащей, по меньшей мере, одну наночастицу по настоящему изобретению и носитель, приемлемый в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях; в отдельном варианте осуществления указанный состав изобретения содержит множество наночастиц по настоящему изобретению. В отдельном варианте осуществления указанная наночастица по настоящему изобретению представляет собой наночастицу, содержащую зеиновую матрицу и основную аминокислоту; в другом варианте осуществления указанная наночастица по настоящему изобретению представляет собой загруженную наночастицу изобретения, т.е. наночастицу, содержащую зеиновую матрицу, основную аминокислоту и БАС с питательными, терапевтическими и/или косметическими свойствами, а также фармацевтически или косметически приемлемый носитель или носитель, пригодный для пищи.

Средний размер указанных наночастиц по настоящему изобретению составляет менее 1 мкм, как правило, находится в пределах от 1 до 999 нм, предпочтительно от 10 до 900 нм, более предпочтительно от 50 до 500 нм, еще более предпочтительно от 100 до 450 нм, а еще более предпочтительно от 140 до 400 нм. Наночастицы по настоящему изобретению преимущественно имеют размер частиц около 200 нм с целью предотвращения изменения их органолептических свойств (качества на вкус), что особенно важно при использовании их в пищевой отрасли.

В отдельном варианте осуществления указанное БАС выбрано из группы, включающей аминокислоты, противомикробные вещества, вкусовые вещества, консерванты, подсластители, стероиды, лекарственные вещества, гормоны, липиды, пептиды, полинуклеотиды, полисахариды, белки, протеогликаны, вкусоароматические добавки, витамины и их смеси.

В отдельном варианте осуществления указанное БАС представляет собой жирорастворимое БАС. Неограничительные иллюстративные примеры жирорастворимых БАС включают витамины, например витамины группы A, D, E, K и их производные, фосфолипиды, каротеноиды (каротины, ликопин, лютеин, капсантин, зеаксантин и т.д.), омега-3-жирные кислоты (например, ДГК, ЭПК и т.д.), аминокислоты (например, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан и валин), фитостанолы и фитостерины (ситостерин, кампестерин, стигмастерин и т.д.), полифенолы (кверцетин, рутин, ресвератрол, кемпферол, мирицетин, изорамнетин и т.д.) и их производные.

В другом отдельном варианте осуществления указанное БАС представляет собой водорастворимое БАС, предпочтительно водорастворимая биологическая активная кислота. Неограничительные иллюстративные примеры водорастворимых БАС включают витамины, например витамины группы B или C, и их производные, соли или сложные эфиры; гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, тиоктовую кислоту, их соли или сложные эфиры и т.д. В отдельном варианте осуществления указанное водорастворимое БАС выбрано из группы, включающей фолиевую кислоту, 4-аминобензойную кислоту, ниацин, пантотеновую кислоту, тиаминмонофосфат, тиаминпирофосфат, тиаминтрифосфат, аскорбиновую кислоту, птероилполиглутаминовые кислоты (производныефолиевой кислоты: фолат полиглутаматы; полиглутамат фолаты), фолиниевую кислоту, никотиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, тиоктовую кислоту, п-кумаровую кислоту, кофеиновую кислоту, их пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, сложные эфиры или соли и их смеси.

В отдельном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, пригодную для местного применения; для этого указанная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, содержащий одно или несколько вспомогательных веществ, пригодных для их местного применения, например, в виде геля, мази, крема и т.д. Информацию о вспомогательных веществах, пригодных для состава фармацевтических композиций, предназначенных для их местного применения, а также о получении указанных фармацевтических композиций можно найти в книге "Tratado de Farmacia Galenica", С.Fauli i Trillo, 10 изд-е, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones. Вводимая доза наночастиц по настоящему изобретению может варьироваться в широких пределах, например от примерно 0,5 (г/см² обрабатываемого участка) и до примерно 2 (г/см² обрабатываемого участка) композиции по настоящему изобретению, содержащей от 0,1% до 30% наночастиц по настоящему изобретению, предпочтительно от 0.5% до 5%.

В отдельном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой косметическую композицию, пригодную для местного применения; для этого указанная композиция содержит косметически приемлемый носитель, содержащий одно или несколько вспомогательных веществ, пригодных для их местного применения, например, в виде геля, мази, шампуня, лосьона и т.д. Информацию о вспомогательных веществах, пригодных для состава косметических композиций, предназначенных для их местного применения, а также о получении указанных косметических композиций можно найти в книге "Manual de Cosmetologia", Octavio Diez Sales, 1-oe изд-е, 1998, Editorial Videocinco, S.A.

В другом отдельном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой пищевую композицию, например твердый, жидкий или полутвердый пищевой продукт.

В отдельном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит:

- зеин в количестве от 15 до 45 масс.%;

- основную аминокислоту в количестве от 1 до 4 масс.%;

- кверцетин или ресвератрол в количестве от 0,5 до 5 масс.%;

- сахарид в количестве от 45 до 80 масс.%;

при этом все пропорциональные доли даны в процентном отношении по массе относительно общей массы композиции.

В другом отдельном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит:

- зеин в количестве от 15 до 45 масс.%;

- основную аминокислоту в количестве от 4 до 10 масс.%;

- необязательно, полисорбат (например, твин 80) в количестве от 0,05 до 0,5 масс.%;

- фолиевую кислоту в количестве от 0,5 до 5 масс.%;

- сахарид в количестве от 45 до 80 масс.%; и

при этом все пропорциональные доли даны в процентном отношении по массе относительно общей массы композиции.

В качестве альтернативы композиция по настоящему изобретению может также быть введена в состав пищевого продукта. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к пищевому продукту, содержащему композицию изобретения. Указанный пищевой продукт может находиться в жидкой, полутвердой или твердой форме. Преимущественно с целью предотвращения или минимизации полного или частичного растворения наночастиц по настоящему изобретению и тем самым повышения их устойчивости указанный пищевой продукт имеет кислый pH, т.е. pH меньше 7, предпочтительно равный или меньше 6, более предпочтительно равный или меньше 5. Иллюстративные примеры пищевых продуктов, которые могут быть обогащены или пополнены композицией по настощему изобретению, включают молоко и его производные (йогурты, сыры, створоженное молоко и т.д.), соки, джемы, хлеб и кондитерские изделия, ферментированные пищевые продукты, соусы и т.д. Таким же образом, композиция по настоящему изобретению может также быть введена в состав продукта питания для животных, например в корм.

ПРИМЕРЫ

В следующих примерах описывается получение частиц нанозеина и основной аминокислоты, такой как лизин, которые могут содержать биологически активное соединение (БАС), в частности, ресвератрол, кверцетин или фолиевую кислоту. Указанные наночастицы способны защищать БАС от разложения, которое оно может испытывать, находясь в составе пищи, вследствие изменения pH, воздействия света, окисления и т.д.

Общий способ получения пустых зеиновых наночастиц

Общий способ получения зеиновых наночастиц включает растворение указанного белка (номер продукта по каталогу Sigma-Aldrich - Z 3625) в водно-спиртовом растворе, например, 50% (по отношению массы к объему) растворе этанола вместе с определенным количеством лизина (Sigma-Aldrich), с последующим добавлением (при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке) определенного количества воды, что приводит к образованию наночастиц в виде желтовато-молочной суспензии.

Физико-химическая характеристика наночастиц

Ниже описаны различные исследования, необходимые для проведения полной физико-химической характеристики наночастиц.

Размер и поверхностный заряд наночастиц определяют в физико-химических испытаниях. Первый из указанных параметров (размер) устанавливают методом фотон-корреляционной спектроскопии на приборе Zetasizer Nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, Испания). Второй из указанных параметров (поверхностный заряд) определяют измерением дзета-потенциала на анализаторе дзета-потенциала (Brookhaven Instruments Corporation, Нью-Йорк, США).

Выход в способе образования наночастиц рассчитывают путем подсчета оставшегося свободного зеина после получения наночастиц, собранного в надосадочной жидкости после центрифугирования состава (17000g, 20 минут). Для количественного определения надосадочные жидкости разбавляют этанолом до тех пор, пока концентрация спирта не достигнет 75% (по отношению массы к объему), при этом последний раствор является средой, в которой готовят стандарты для калибровочной кривой.

Количество белка (зеина), образующего частицы в составе, оценивают как разницу между исходным количеством и рассчитанным количеством в надосадочных жидкостях, собранных на стадии очистки. Выход оценивают следующим образом:

$$Выход(\%)=\frac{Общаямассазеина(мг)-массазеина(мг)внадосадочнойжидкости}{Общаямассазеина(мг)}*100$$

Кроме того, для подтверждения результатов, полученных по разнице между общей массой зеина и массой зеина в надосадочной жидкости проводят количественное исследование шарика, полученного после центрифугирования. В данном случае используют водно-спиртовой раствор с 75% содержанием этанола (по отношению массы к объему) для разрушения частиц, при этом последний раствор является той же самой средой, используемой при построении калибровочной кривой. Таким образом, в данном случае выход оценивают следующим образом:

$$Выход(\%)=\frac{массазеинавшарики(мг)}{общаямассазеина(мг)}*100$$

Кроме того, для подтверждения достоверности способа количественного определения и проверки отсутствия матричного эффекта отбирают заданные объемы состава до центрифугирования и разбавляют до тех пор, пока концентрация этанола не достигнет 75%. Таким образом можно рассчитать общую массу зеина, содержащегося в составе, и сравнить ее с количеством первоначально добавленного зеина, при этом во всех случаях отклонение составляет менее 5%.

Для проведения различных расчетов используют калибровочную кривую в диапазоне концентраций от 90 до 1200 мкг/мл (R²=0.999; предел обнаружения=43 мкг/мл; предел количественного определения=143 мкг/мл).

Все количественные определения проводят методом УФ-спектрофотометрии при 278 нм (Agilent 8453, система спектроскопии в УФ- и видимой области).

За морфологией наночастиц наблюдают методом сканирующей электронной спектроскопии (Zeiss, DSM 940A, Германия). Для этого наночастицы покрывают слоем молекулярного золота толщиной около 9 нм (Emitech K550 Equipment, Sputter-Coater, Великобритания) и делают снимки с помощью микроскопа Zeiss DMS 940A (США).

Общий способ получения зеиновых наночастиц, содержащих кверцетин или ресвератрол

Общий способ получения зеиновых наночастиц, загруженных кверцетином или ресвератролом, включает растворение указанного белка (зеина) в водно-спиртовой среде (50% этанол, по отношению массы к объему) вместе с определенным количеством лизина с последующим добавлением (при перемешивании на магнитной мешалке) определенного количества ранее приготовленного спиртового раствора указанного антиоксиданта, разбавленного водой. После выдерживания смеси в течение нескольких минут проводят последнюю стадию, которая состоит в добавлении определенного количества воды, что приводит к образованию наночастиц в виде желтовато-молочной суспензии.

Затем, при необходимости, после гомогенизации в течение 3 минут посредством перемешивания добавляют определенный объем раствора сахарида (лактозы, трегалозы, маннита, глюкозы, сорбита, мальтодекстрина, мальтозы и т.д.), не останавливая перемешивание. Наконец, суспензию распыляют в распылительной сушилке (Buchi Mini Spray Drier B-191, B?chi Labortechnik AG, Швейцария) при следующих условиях:

- Температура воздуха на входе: 70-110°C

- Температура воздуха на выходе: 30-90°C

- Давление воздуха: 2-10 бар [2×10⁵ - 10×10⁵ Па]

- Скорость нагнетания пробы: 2-9 мл/мин

- Отсасывание (аспиратором): 30-100%

- Скорость потока воздуха: 200-900 л/ч

Необязательно, после добавления сахарида составы могут быть высушены лиофилизацией вместо сушки аспирацией или распылением (распылительная сушка).

Определение количества кверцетина или ресвератрола, связанного с зеиновыми частицами

Количество кверцетина или ресвератрола, связанного с наночастицами, определяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) по способу, описанному Lacopini (Lacopini et al., J Food Comp Anal 2008; 21:589-598), с некоторыми изменениями. Анализ проводят на хроматографе, модель 1100 серия LC (Agilent, Waldbornn, Германия), сопряженном с диодно-матричным УФ детектором.

Для анализа свежих проб (до их высушивания) надосадочные жидкости, полученные после стадии очистки наночастиц [фильтрованием определенного объема состава через диализные трубки Vivaspin® 300,000 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Германия)], разбавляют до тех пор, пока концентрация этанола в водно-спиртовом растворе не достигнет 75% (по отношению массы к объему). Шарик, в свою очередь, также растворяют в 75% (по отношению массы к объему) этаноле для разрушения частиц и сохранения зеина, а также БАС (кверцетина или ресвератрола) и аминокислоты в растворе, после чего проводят количественное определение. Найденное суммарное содержание БАС в обоих фракциях (надосадочная жидкость и шарик) всегда совпадало с общим количеством, добавленным изначально. Более того, можно также определить общее количество БАС растворением определенного объема состава в 75% этаноле (по отношению массы к объему). Это исследование позволило подтвердить, что разница между количеством добавленного БАС и количеством БАС, полученным при определении по описанному хроматографическому способу, во всех случаях составляет менее 10%.

В дополнение, для приготовления порошковых образцов (высушенных составов) отбирают приблизительно 15 мг состава наночастиц и ресуспендируют в этаноле. Надосадочную жидкость, полученную после фильтрования определенного суспензии через диализные трубки Vivaspin® 300000 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Германия), разбавляют дистиллированной водой до тех пор, пока концентрация этанола не достигнет 75% (по отношению массы к объему). Шарик растворяют в определенном объеме 75% этанола (по отношению массы к объему). Более того, также определяют общее содержание БАС в 15 мг порошка непосредственным растворением этих соединений в 75% (по отношению массы к объему) этаноле.

Пробы анализируют на колонке Alltech С18 Alltima™ (5 мкм, 150 мм × 2,1 мм), нагретой до 40°C, с совместимой предколонкой Gemini® С18 AJ0-7596, используя в качестве подвижной фазы градиентную смесь воды, метанола и ледяной уксусной кислоты (см. Таблицу 1), прокачиваемой со скоростью 0,25 мл/мин.

Детектирование осуществляют при 360 нм в случае кверцетина и при 306 нм в случае ресвератрола. Объем введенной пробы составляет 10 мкл. Время удерживания кверцетина составляет 24,2-0,2 мин, а время удерживания ресвератрола - 22,8-0,5 мин.

Таблица 1 Градиентные условия для подвижной фазы (A: вода, B: метанол, C: ледяная уксусная кислота) Время (мин) A (%) B (%) C (%) 0 80 15 5 15 70 25 5 20 10 85 5 30 10 85 5 35 80 15 5 40 80 15 5

До проведения количественного определения проб строят различные калибровочные кривые в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/мл в водно-спиртовой среде (75% этанол), при этом получают прецизионные данные с погрешностью менее 5%.

В конце рассчитывают количество кверцетина или ресвератрола, связанного с наночастицами [эффективность инкапсулирования (Э.И.)] как разницу между количеством изначального добавленного БАС и количеством БАС, определенным в надосадочной жидкости.

$$Э.И.(\%)=\frac{ОбщееколичествоБАС(мг)-количествоБАСвнадосадочнойжидкости(мг)}{ОбщееколичествоБАС(мг)}*100$$

Общий способ получения зеиновых наночастиц, содержащих фолиевую кислоту

Общий способ получения зеиновых наночастиц, загруженных фолиевой кислотой, включает растворение указанного белка (зеина) в водно-спиртовой среде (50% (по отношению массы к объему) этанол) вместе с определенным количеством лизина с последующим добавлением (при перемешивании на магнитной мешалке) определенного объема ранее приготовленного водного раствора указанного витамина, разбавленного спиртом. После выдерживания смеси в течение нескольких минут проводят последнюю стадию, которая состоит в добавлении определенного количества воды, что приводит к образованию наночастиц в виде желтовато-молочной суспензии.

Затем, при необходимости, после гомогенизации в течение 3 минут посредством перемешивания добавляют определенный объем раствора сахарида (лактозы, трегалозы, маннита, глюкозы, сорбита, мальтодекстрина, мальтозы и т.д.), не останавливая перемешивание. Наконец, суспензию распыляют в распылительной сушилке (Buchi Mini Spray Drier B-191, Buchi Labortechnik AG, Швейцария) при следующих условиях:

- Температура воздуха на входе: 70-130°C

- Температура воздуха на выходе: 30-90°C

- Давление воздуха: 2-10 бар [2×105 - 10×105 Па]

- Скорость нагнетания пробы: 2-9 мл/мин

- Отсасывание (аспиратором): 30-100%

- Скорость потока воздуха: 200-900 л/ч

Необязательно, после добавления сахарида составы могут быть высушены лиофилизацией вместо сушки аспирацией или распылением (распылительная сушка).

Определение количества фолиевой кислоты, связанной с зеиновыми частицами

Количество фолиевой кислоты, связанной с наночастицами, определяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) по способу, описанному Faye [Faye Russell, L, Quantitative Determination of Water-Soluble Vitamins. В Food Analysis by HPLC, Nollet, L.M.L. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, Second Edition, Chapter 10 (2000), pp.444-445]. Анализ проводят на хроматографе, модель 1100 серия LC (Agilent, Waldbornn, Германия), сопряженном с диодно-матричным УФ детектором. Данные анализируют на компьютере Hewlett-Packard с помощью программного обеспечения Chem-Station G2171. Для отделения фолиевой кислоты используют колонку Alltech С18 Alltima™ (5 мкм, 150 мм × 2,1 мм), нагретую до 40°C, с совместимой предколонкой Gemini® С18 AJ0-7596. Подвижную фазу составляют из градиентной смеси H₃PO₄ (33 мМ, pH 2,3) и ацетонитрила (Таблица 2) и прокачивают со скоростью 0,25 мл/мин. Детектирование проводят при 290 нм. Объем введенной пробы составляет 10 мкл. Время удерживания фолиевой кислоты составляет 22,6-0,5 мин.

Таблица 2 Градиентные условия для подвижной фазы (А: Н₃PO₄ 33 мМ, B: ацетонитрил) Время (мин) A (%) B (%) 0 95.0 5.0 8 95.0 5.0 33 82.5 17.5 45 95.0 5.0

До проведения количественного определения проб строят различные калибровочные кривые в диапазоне концентраций от 2 до 400 мкг/мл, получая прецизионные данные с точностью более 95%, что подтверждает тот факт, что присутствие зеина и/или аминокислот в растворе не мешает правильному количественному определению фолиевой кислоты.

Для анализа свежих проб (до их высушивания) проводят количественное определение для надосадочных жидкостей, полученных после стадии фильтрования определенного объема состава через диализные трубки Vivaspin® 300000 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Германия). Шарик, в свою очередь, также растворяют в 0,05 М NaOH для разрушения частиц и сохранения зеина, а также фолиевой кислоты и аминокислоты в растворе, после чего проводят их количественное определение. Найденное суммарное содержание фолиевой кислоты в обоих фракциях (надосадочная жидкость и шарик) всегда совпадало с общим количеством, добавленным изначально. Более того, можно также определить общее количество фолиевой кислоты растворением 1 мл состава в 1 мл 0,05 М NaOH. Это исследование позволило подтвердить, что разница между количеством добавленной фолиевой кислоты и количеством фолиевой кислоты, полученным при определении по описанному хроматографическому способу, во всех случаях составляет менее 10%.

В дополнение, для количественного анализа порошковых проб отбирают 15 мг наночастиц, ресуспендируют в 2 мл воды и центрифугируют, далее с ними обращаются так же, как и в случае свежих проб.

Фармакокинетические исследования. Биодоступность фолиевой кислоты, инкапсулированной в зеиновых наночастицах

Фармакокинетические исследования проводят в соответствии с правилами комиссии по этическим нормам Института, а также Европейского законодательства в отношении экспериментальных животных (86/609/ЕС). Для этого 20 мужских особей крыс линии Wister со средним весом 200 г выдерживают в нормальных условиях светотемнового цикла (12 ч - 12 ч) и в течение недели до начала исследования они питаются пищей с недостатком фолиевой кислоты (Folic Acid Deficient Diet. TD. 95247. Harlan, США) и водой. За двенадцать часов до введения составов крыс изолируют в метаболических клетках без доступа пищи, но со свободным доступом к питьевой воде.

Животных подразделяют на 4 лечебные группы (5 крыс на группу). Первой группе вводят перорально только 1 мл ЗФФР (фосфатный буфер, pH 7,4). Двум следующим группам вводят перорально фолиевую кислоту (Aditio, Panreac Quimica, Барселона, Испания) дозой 1 мг/кг, введенную в зеиновые наночастицы, или свободную фолиевую кислоту (неинкапсулированную), растворенную в воде. Вводят по 1 мл состава, диспергированного в воде, с помощью желудочно-пищеводной канюли. Наконец, вводят внутривенно такую же дозу свободной фолиевой кислоты (1 мг/кг), растворенную в фосфатном буфере (ЗФФР) (0,5 мл), четвертой группе в подкожную вену. Перед введением составов отбирают кровь из подкожной вены хвоста для проверки исходного уровня витамина у каждой крысы. После введения отбирают кровь объемом около 500 мкл в различные моменты времени с помощью пробирок для отделения сыворотки (микротрубка SARSTEDT Microtube 1.1 мл Z-Gel). Во всех случаях во избежание болевых ощущений у крыс отбор проводят после анестезирования животного ингаляционной анестезией (изофлуран:кислород), проверяя при этом у крыс показатели жизненного важных функций на всех этапах.

После этого количество отобранной крови восстанавливали внутрибрюшинным введением 500 мкл физиологического раствора, нагретого до температуры тела животного. За это время оценивали состояние животных (подвижность, агрессивность, аллергические реакции и температуру), при этом не отмечали каких-либо существенных изменений.

Предварительная обработка и количественное определение фолиевой кислоты в пробах сыворотки

Количественное определение фолиевой кислоты в пробах сыворотки, полученных после центрифугирования пробирок с кровью (6000 об/мин, 20 мин, 20°C) проводят по методике иммуноферментного анализа. Для этого используют набор Elisa (Diagnostic automation, INC. Calabasas, Калифорния, США), одобренный Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами для количественного определения фолиевой кислоты в пищевых продуктах. Количественный анализ проб сыворотки проводят без предварительной обработки, следуя указаниям производителя.

Ввиду того что набор предназначен для использования в пищевых продуктах, проводят ряд предварительных исследований с целью подтверждения возможности его использования для количественного определения витамина в пробах сыворотки. Указанные исследования заключаются в осуществлении исчерпывающего сравнения результатов, полученных с помощью набора, с результатами, полученными высокоэффективной жидкостной хроматографией, описанными в предыдущих разделах, с последующим способом предварительного приготовления: к 50 мкл сыворотки добавляют различные количества (0-300 мкл) фолиевой кислоты, растворенной в 50 мМ растворе тетрабората натрия, приготовленном в 1% (по отношения массы к объему) растворе аскорбата натрия. Полученный раствор доводят до конечного объема в 350 мкл (разбавление сыворотки 1:7) добавлением 50 мМ раствора тетрабората натрия. Каждую смесь кипятили в течение 30 мин, а затем охлаждали до 2°C и выдерживали при указанной температуре на протяжении ночи.

После центрифугирования полученных проб со скоростью 20000 об/мин в течение 20 мин и фильтрования через 20 мкм фильтр определяют содержание фолиевой кислоты в пробах посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии по способу, описанному выше. В данном случае ввиду низкой концентрации витамина в сыворотке используют стандартную методику добавлений для минимизации ошибок при подсчете и подавления какого-либо влияния матрицы. Данный способ отбора и количественного ВЭЖХ определения оценивают по критериям, установленным Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств.

Во всех исследованных случаях разница в концентрациях фолиевой кислоты в сыворотке, найденных обоими способами, составляет менее 10%. Поэтому для количественного анализа всех проб была выбрана методика ферментативного иммуноанализа, поскольку для нее требуется меньшее количество сыворотки при анализе и она представляет собой более простую и быструю методику, предел обнаружения которой (2 нг/мл) намного ниже, чем при определении хроматографическим способом.

ПРИМЕР 1

Получение и характеристика пустых зеиновых наночастиц. Выход продукта в способе получения. Влияние количества лизина, введенного в состав, на физико-химические характеристики наночастиц

Растворяют 60 мг зеина (Sigma-Aldrich) вместе с 10 мг лизина (Sigma-Aldrich) в 8,8 мл 50% (по отношению массы к объему) растворе этанола. Затем к полученному раствору добавляют 8,8 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке, что приводит к образованию наночастиц. Данную процедуру повторяют три раза.

На Фигурах 1 и 2 показаны изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) зеиновых наночастиц, полученных данным способом.

С целью установления влияния лизина и процентного содержания этанола в исходном водно-спиртовом растворе на физико-химические характеристики наночастиц готовят 3 новых состава, варьируя данные параметры: (i) один из составов не содержит лизин, (ii) другой состав содержит лизин и исходный водно-спиртовой раствор готовят в 75% (по отношению массы к объему) этаноле вместо 50% (по отношению массы к объему) раствора, и (iii) третий состав также готовят в 75% (по отношению массы к объему) этаноле без лизина.

В таблице 3 перечислены основные физико-химические параметры полученных наночастиц.

Таблица 3 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=6) в присутствии различных количеств лизина и при различных концентрациях этанольного раствора, в котором растворяют зеин перед получением наночастиц Весовое соотношение лизин:зеин Процентное содержание этанола Размер (нм) Коэфф. ПДД^а Зета-потенциал (мВ) Выход^b (%) 0(^*) 50 150±4 0.11±0.03 -7.2±3.6 - 1:6 50 142±4 0.12±0.09 -37.8±1.6 94.7±1.1 0 75 203±2 0.09±0.01 -8.9±7.6 94.7±2.4 1:6 75 164±2 0.07±0.01 -46.0±1.5 98.5±1.6 (^*) Умеренно растворимый а Коэфф. ПД: коэффициент полидисперсности b Выход: в процентном количестве зеина, превратившегося в наночастицы (уравнение 1)

Проведенные статистические исследования (непараметрический критерий независимых выборок: критерий Крускала-Уоллиса) указывают на существование достоверного доказательства, подтверждающего, что присутствие лизина приводит к повышению поверхностного заряда. В составах, приготовленных с использованием изначально большого количества этанола (75% по отношению массы к объему), наблюдается больший размер частиц и более высокий выход в сравнении с размером частиц и выходом, полученным при исходной концентрации этанольного раствора 50% (по отношению массы к объему), при этом не наблюдалось значимых различий в величине поверхностного заряда.

Найденный поверхностный заряд в пробах, которые не содержат лизин, очень близок к нулю, это означает, что указанные частицы имеют большую склонность с агломерации. Однако в присутствии лизина поверхностный заряд достаточно высок для предотвращения указанного явления.

Таким образом, для инкапсулирования БАС выбирают составы, полученные из водно-спиртового раствора с 50% содержанием (по отношению массы к объему) этанола и в присутствии лизина, поскольку это предотвращает агрегацию наночастиц, что делает их универсальными для инкапсулирования как жирорастворимых, так и водорастворимых БАС и, более того, достигается существенная экономия в отношении используемого реагента.

ПРИМЕР 2

Получение и характеристика зеиновых наночастиц, содержащих ресвератрол. Влияние содержания лизина и ресвератрола на эффективность инкапсулирования

Готовят различные водно-спиртовые растворы, каждый из которых содержит 60 мг зеина и различные количества лизина (0, 5, 10 или 20 мг) в 50% этанольном растворе с конечным объемом 8,8 мл.

Кроме того, растворяют 47 мг ресвератрола в 15 мл этанола и затем разбавляют водой до 24 мл.

Затем добавляют различные объемы раствора ресвератрола (1, 2 и 3 мл) к различным приготовленным растворам зеина. После 5 минут выдерживания к смеси добавляют 8,8 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке. Данную процедуру повторяют три раза для каждого типа состава.

В таблице 4 перечислены физико-химические характеристики наночастиц, полученных в каждом случае.

Таблица 4 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц (изначально растворенных в 50% этаноле (по отношению массы к объему)) с различным количеством лизина (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3) и инкапсулированным ресвератролом. Весовое соотношение между ресвератролом и зеином составляет 1:16 Весовое соотношение лизин:зеин Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Содержание ресвератрол а (мкг Р/мг НЧ) Эффективность инкапсулирования (%) 0 149±1 0.08±0.02 23.3±0.7 56.3±3.6 83.7±1.9 1:12 154±1 0.08±0.03 -30.5±0.9 59.0±3.1 91.4±1.9 1:6 148±1 0.08±0.02 -45.2±3.0 54.6±2.3 85.2±1.3 1:3 167±2 0.07±0.02 -44.2±1.2 56.7±3.0 88.1±1.9 Р: Ресвератрол; НЧ: наночастица

Полученные результаты указывают на то, что присутствие лизина не оказывает существенного влияния на эффективность инкапсулирования. Таким образом, с учетом того, что указанная аминокислота модифицирует поверхностный заряд частиц и снижает вероятность их агрегации и, более того, что она повышает выход образования частиц, для продолжения исследования был выбран состав, содержащий введенную в него аминокислоту.

В таблице 5 представлены физико-химические характеристики наночастиц, полученных варьированием содержания ресвератрола при постоянном содержании лизина.

Таблица 5 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц (изначально растворенных в 50% этаноле (по отношению массы к объему)) с различным количеством ресвератрола (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3). Весовое соотношение
между лизином и зеином составляет 1:6 Весовое соотношение ресвератрол: зеин Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Содержание ресвератрола (мкг Р/мг НЧ) Эффективность инкапсулирования (%) мкг Р/мг состава 1:10.4 162±1 0.10±0.02 -48.0±0.7 70.9±6.4 70.4±1.9 76.1 1:16 148±1 0.08±0.02 -45.2±3.0 54.6±2.3 85.2±1.3 51.1 1:31.4 171±3 0.06±0.02 -42.4±2.8 28.9±1.8 92.4±3.8 26.4 Р: Ресвератрол; НЧ: наночастица

Полученные результаты указывают на то, что по мере повышения количества ресвератрола, добавленного к составу, эффективность инкапсулирования снижается, но количество биоактивного вещества, инкапсулированного внутри частиц, увеличивается.

ПРИМЕР 3

Получение и характеристика зеиновых наночастиц, содержащих ресвератрол и высушенных аспирацией (распылительной сушкой).

Растворяют 126 мг зеина вместе с 21 мг лизина в 14 мл 50% (по отношению массы к объему) этанола.

Кроме того, растворяют 60 мг ресвератрола в 10 мл этанола, отбирают 1,4 мл полученного раствора и доводят его объем до 2,8 мл добавлением воды.

Затем добавляют 1,1 мл разбавленного раствора ресвератрола к раствору зеина и смесь оставляют выдерживаться в течение 5 мин. После этого к смеси добавляют 15 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке.

В конце добавляют 260 мг мальтодекстрина к смеси до высушивания ее с помощью распылительной сушилки. Условия способа:

- Температура воздуха на входе: 110°C

- Температура воздуха на выходе: 70°C

- Давление воздуха: 6 бар [5×105 Па]

- Скорость нагнетания пробы: 4,5 мл/мин

- Аспирация: 94%

- Скорость потока воздуха: 700 л/ч

В таблице 6 перечислены физико-химические характеристики полученного состава.

Таблица 6 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с лизином и ресвератролом (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3), высушенных посредством распылительной сушки, с использованием мальтодекстрина в качестве вспомогательного вещества в способе. Весовое соотношение между лизином и зеином составляет 1:6. Весовое соотношение между сахаридом (мальтодекстрином) и зеином составляет 2:1 Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) мкг Р/мг состава 245±6 0.24±0.01 -30.3±0.3 9.4±0.8

Инкапсулированное количество на мг наночастиц и эффективность инкапсулирования не изменяются при распылительной сушке.

На Фигурах 3 и 4 показаны изображения сканирующей электронной микроскопии зеиновых наночастиц, содержащих ресвератрол.

В дополнение, проводят те же самые эксперименты при высоком давлении (150 МПа при длительности цикла 5 мин и 400 МПа при длительности цикла 5 мин) после образования наночастиц до их прохождения через распылительную сушилку. Полученные результаты инкапсулирования схожи с результатами, полученными без проведения указанной обработки.

ПРИМЕР 4

Получение и характеристика зеиновых наночастиц, содержащих кверцетин. Влияние содержания лизина и кверцетина на эффективность инкапсулирования

Готовят различные растворы, каждый из которых содержит 60 мг зеина и 10 мг лизина в 50% этанольном растворе с конечным объемом 8,8 мл.

Кроме того, растворяют 150 мг кверцетина в 50 мл этанола, а затем отбирают 31 мл полученного раствора и доводят его объем до 50 мл добавлением воды.

Затем добавляют различные объемы раствора кверцетина (0,5-3 мл) к различным приготовленным растворам зеина. После 5 минут выдерживания к смеси добавляют 8,8 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке. Данную процедуру повторяют три раза для каждого типа состава.

На Фигурах 5 и 6 показаны изображения, полученные просвечивающей электронной микроскопией, для зеиновых наночастиц с инкапсулированным кверцетином, полученных данным способом. В таблице 7 перечислены физико-химические характеристики, полученные в каждом случае.

Таблица 7 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с лизином и различным количеством кверцетина (К) (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=6). Весовое соотношение между лизином и зеином составляет 1:5,5 Весовое соотношение кверцетин: зеин Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Содержание кверцетина мкг K/мг НЧ Эффективность инкапсулирования (%) 1:64 147±1 0.22±0.01 -60.2±1.4 16.1±1.0 93.2±8.0 1:30 161±4 0.13±0.03 -57.1±1.2 29.1±1.8 85.6±1.3 1:20 161±1 0.05±0.01 -48.3±3.2 38.5±1.3 76.7±2.5 1:16 165±2 0.04±0.03 -46.8±2.4 48.7±1.1 77.9±1.8 1:11 167±2 0.06±0.01 -45.1±2.4 59.7±2.6 64.6±2.7 НЧ: Наночастица

Проведенные статистические исследования (непараметрический критерий независимых выборок: критерий Крускала-Уоллиса) указывают на существование достоверного доказательства, позволяющего судить о наличии различий в физико-химических характеристиках различных составов. С учетом полученных результатов можно считать, что по мере увеличения количества кверцетина, добавленного к составу, эффективность инкапсулирования снижается, а количество инкапсулированного БАС (кверцетина) потенциально увеличивается (Фигура 7), принимая во внимание следующее математическое выражение:

y=369.92·x^-0.7526; R²=0.9955[уравнение 3],

в котором

y соответствует количеству инкапсулированного кверцетина (мкг K/мг НЧ), а x соответствует исходном соотношению между количествами кверцетина и зеина (мг зеина/мг кверцетина).

Что касается размеров и величины потенциала, не выявлено достоверных различий между различными анализируемыми пробами.

Кроме того, была предпринята попытка установить влияние увеличения или уменьшения количества лизина в составе на физико-химические характеристики наночастиц, поэтому проводилось такое же исследование при поддержании исходного количества кверцетина на постоянном уровне и варьировании количества добавляемой в данном случае аминокислоты.

Таким образом, приготавливают различные растворы зеина, содержащие переменные количества лизина (0-20 мг). Объем добавляемого в состав раствора кверцетина, описанного выше, составляет 3 мл во всех случаях, при этом весовое соотношение кверцетин:зеин составляет 1:11.

В таблице 8 представлены результаты физико-химической характеризации, полученные в каждом случае.

Таблица 8 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с кверцетином и различным количеством лизина (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=6). Весовое соотношение между кверцетином и зеином составляет 1:11 Весовое соотношение лизин:зеин Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Содержание кверцетина мкг K/мг НЧ Эффективность инкапсулирования (%) 0 164±1 0.10±0.02 17.8±0.9 72.4±2.8 82.5±2.7 1:11 167±2 0.06±0.01 -45.1±2.4 74.7±8.2 78.9±8.4 1:5.5 158±1 0.06±0.05 -44.4±1.0 59.7±2.6 64.6±2.7 1:4 164±1 0.04±0.03 -45.6±0.4 61.6±6.4 66.4±6.9 1:3 181±3 0.05±0.03 -41.9±2.2 58.1±1.9 64.2±6.9

Полученные результаты показывают, что в случае кверцетина при добавлении лизина к исходному раствору зеина в количествах более 10 мг эффективность инкапсулирования снижается примерно на 20% относительно составов, содержащих меньшее количество лизина, возможно, вследствие того, что указанные количества аминокислоты вызывают частичное окисление активного ингредиента. Однако не выявлено достоверных различий в эффективностях инкапсулирования проб без лизина и проб, содержащих около 5 мг лизина в составе. Поэтому данный состав был выбран для продолжения исследований по высушиванию.

ПРИМЕР 5

Получение и характеристика зеиновых наночастиц, содержащих кверцетин и высушенных распылительной сушкой.

Растворяют 602 мг зеина вместе с 51 мг лизина в 80 мл 50% (по отношению массы к объему) этанола.

Кроме того, растворяют 250 мг кверцетина в 50 мл этанола, а затем отбирают 20 мл полученного раствора и доводят его объем до 32 мл добавлением воды.

Затем добавляют 20 мл разбавленного раствора кверцетина к раствору зеина и смесь оставляют выдерживаться в течение 5 мин. После этого к смеси добавляют 80 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке.

В конце добавляют 1209 мг маннита к смеси до высушивания ее с помощью распылительной сушилки. Условия способа:

- Температура воздуха на входе: 90°C

- Температура воздуха на выходе: 45°C

- Давление воздуха: 6 бар [5×105 Па]

- Скорость нагнетания пробы: 4,5 мл/мин

- Аспирация: 100%

- Скорость потока воздуха: 600 л/ч

В таблице 9 перечислены физико-химические характеристики полученного состава.

Таблица 9 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с лизином и кверцетином (K) (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3), высушенных посредством распылительной сушки, с использованием маннита в качестве вспомогательного вещества в способе. Весовое соотношение между лизином и зеином составляет 1:11. Весовое соотношение между сахаридом (маннитом) и белком составляет 2:1 Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Выход (в % по массе) мкг Р/мг состава 412±14 0.10±0.06 -28.9±2.2 50.6 22.2±2.0

Инкапсулированное количество на мг наночастиц и эффективность инкапсулирования не изменяются при распылительной сушке.

На Фигурах 8 и 9 показаны изображения сканирующей электронной микроскопии зеиновых частиц, содержащих кверцетин.

Проводят то же самое исследование, используя мальтодекстрин вместо маннита в качестве вспомогательного вещества, при этом обнаружено, что эффективность инкапсулирования больше вследствие того, что мальтодекстрин действует, покрывая наночастицы и инкапсулируя часть кверцетина, остающегося снаружи от частиц.

В дополнение, проводят те же самые эксперименты при высоком давлении (150 МПа при длительности цикла 5 мин, 400 МПа при длительности цикла 5 мин и 800 МПа при длительности цикла 5 мин) после образования частиц до их прохождения через распылительную сушилку. Полученные результаты по инкапсулированию схожи с результатами, полученными без проведения указанной обработки.

ПРИМЕР 6

Получение и характеристика зеиновых наночастиц, содержащих фолиевую кислоту

Растворяют 121 мг зеина вместе с 18 мг лизина в 14 мл 50% (по отношению массы к объему) этанола.

Кроме того, растворяют 303 мг фолиевой кислоты вместе с 402 мг лизина в 50 мл воды, а затем разбавляют наполовину этанолом.

Затем добавляют 5 мл разбавленного раствора фолиевой кислоты к раствору зеина, и смесь оставляют выдерживаться в течение 5 мин. После этого к смеси добавляют 0,6 мл Твин® 80 (полисорбата) и полученную смесь оставляют выдерживаться в течение 5 мин. Затем добавляют 15 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке, что приводит к образованию наночастиц.

В конце добавляют 253 мг лактозы к смеси до высушивания ее с помощью распылительной сушилки.

Условия способа:

- Температура воздуха на входе: 125°C

- Температура воздуха на выходе: 90°C

- Давление воздуха: 6 бар [5×105 Па]

- Скорость нагнетания пробы: 4,5 мл/мин

- Аспирация: 90%

- Скорость потока воздуха: 750 л/ч

В таблице 10 перечислены физико-химические характеристики полученного состава.

Таблица 10 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с лизином и фолиевой кислотой (ФК) (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3), высушенных посредством распылительной сушки, с использованием лактозы в качестве вспомогательного вещества в способе. Конечное весовое соотношение между лизином и зеином составляет 1:3. Весовое соотношение между сахаридом (лактозой) и зеином составляет 2:1 Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Эффективность инкапсулирования (%) Содержание фолиевой кислоты мкг ФК/мг НЧ мкг Р/мг состава 369± 7 0.32±0.06 -49.0±2.2 56.6±1.5 70.7±1.6 35.4±0.1 ФК: Фолиевая кислота; НЧ: наночастица

Кроме того, готовят новый состав зеиновых наночастиц, содержащих фолиевую кислоту, исключая в данном случае стадию добавления поверхностно-активного вещества. Для этого растворяют 1270 мг зеина вместе с 200 мг лизина в 140 мл 50% (по отношению массы к объему) этанола. Готовят другой раствор, который содержит 121 мг фолиевой кислоты и 200 мг лизина в 25 мл воды, а затем его разбавляют наполовину этанолом.

Затем добавляют 43 мл разбавленного раствора фолиевой кислоты к раствору зеина и смесь оставляют выдерживаться в течение 5 мин. После этого к смеси добавляют 150 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке и постоянном потоке, получая наночастицы.

В конце, добавляют 2415 мг маннита к смеси до высушивания ее с помощью распылительной сушилки.

Условия способа:

- Температура воздуха на входе: 120°C

- Температура воздуха на выходе: 80°С

- Давление воздуха: 6 бар [5×105 Па]

- Скорость нагнетания пробы: 4,5 мл/мин

- Аспирация: 90%

- Скорость потока воздуха: 750 л/ч

В таблице 11 перечислены физико-химические характеристики полученного состава.

Таблица 11 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с лизином и фолиевой кислотой (ФК) (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=3), высушенных посредством распылительной сушки, с использованием маннита в качестве вспомогательного вещества в способе. Конечное весовое соотношение между лизином и зеином составляет 1:3,5. Весовое соотношение между сахаридом (маннитом) и зеином составляет 2:1 Размер (нм) Коэф. ПДЦ Зета-потенциал (мВ) Содержание фолиевой кислоты мкг ФК/мг НЧ Эффективность инкапсулирования (%) мкг Р/мг состава 181±1 0.21±0.02 -55.3±2.2 41.5±2.5 50.8±3.0 24.7±1.6 ФК: Фолиевая кислота; НЧ: наночастица

Полученные наночастицы легко ресуспендируются и имеют меньший размер в сравнении с частицами, полученными при использовании поверхностно-активного вещества.

ПРИМЕР 7

Фармакокинетическое исследование фолиевой кислоты, инкапсулированной в зеиновых наночастицах

В таблице 12 приведены основные физико-химические характеристики наночастиц, испытанных в фармакокинетическом исследовании. Указанные наночастицы получают по способу, описанному во втором разделе Примера 6 (без поверхностно-активного вещества).

Таблица 12 Физико-химические характеристики зеиновых наночастиц с фолиевой кислотой (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=6), использованных в фармакокинетических исследованиях. Размер (нм) Коэф. ПДД Зета-потенциал (мВ) Содержание фолиевой кислоты мкг ФК/мг НЧ Эффективность инкапсулирования (%) 193±3 0.16± -29.1±3.3 53.6±6.5 57.9±6.0   0.02       ФК: Фолиевая кислота; НЧ: наночастица Фармакокинетическое исследование было разделено на три фазы.

Первая фаза состояла во внутривенном введении фолиевой кислоты дозой 1 мг/кг, растворенной в фосфатном буфере; вторая фаза состояла в пероральном введении 1 мл фосфатного буфера (ЗФФР) группе из 5 мужских особей крыс линии Wistar (y данной группы крыс исследуют изменение исходного уровня витамина со временем). Наконец, третья фаза состояла в пероральном введении дозы 1 мг/кг (i) фолиевой кислоты, растворенной в воде, (ii) фолиевой кислоты, инкапсулированной в зеиновых наночастицах, группе из 5 крыс.

После введения отбирают кровь объемом около 500 мкл в различные моменты времени (0, 1, 2, 3, 8 и 24 часа) и собирают ее в пробирки для отделения сыворотки, после чего восстанавливают объем изъятой у животного крови эквивалентным объемом физиологического раствора внутрибрюшинным способом. Проводят фармакокинетический анализ данных, полученных после введения фолиевой кислоты, с помощью некомпартментного процесса регулирования фармакокинетической стабилизационной программы WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, США).

Полученные результаты (после вычитания исходных значений) показаны на Фигурах 10 и 11. Как можно видеть, при внутривенном введении фолиевой кислоты (Фиг.10) наблюдается пик концентрации лекарственного вещества в сыворотке при первом отборе пробы с последующим резким уменьшением его уровня в сыворотке. Кривые, полученные при пероральном введении витамина (Фиг.11), отличны, поскольку найденная существенно более низкая концентрация встречается большее число раз и уменьшается более равномерно. Однако при сравнении уровня витамина, определенного после перорального введения фолиевой кислоты, находящейся в свободном виде (без инкапсулирования) или инкапсулированной в зеиновых наночастицах, были найдены схожие зависимости концентрации от времени, но при этом как максимальные значения, так и площади под кривыми оказались большими, чем в случае введения витамина в инкапсулированной форме.

В Таблице 13 приведены значения фармакокинетических параметров, полученных после проведения некомпартментного анализа экспериментальных данных настоящего исследования.

Таблица 13 Фармакокинетические параметры различных составов, подвергнутых испытанию (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=5) Состав Тмакс (мин) Смакс (нг/мл) ППК (×104) (нг×мин/мл) СВУ (мин) FR (%) Неинкапсу лированна я ФК 58.8±36.0 191.3±41.0 7.8±1.5 383.8±47.5 36.3±7.2 НЧ Зеин-фолиевая кислота 61.8±9.2 431.5±133.8* 15.2±4.3* 543.3±48.0* 70.8±20.2* ФК, ВВ способ … 4227.1±1651.5** 21.5±2.8** 57.8±15.5** 100** * p<0,05 в сравнении с неинкапсулированной фолиевой кислотой. U-критерий Манна-Уитни.
** p<0,01 в сравнении с неинкапсулированной фолиевой кислотой. U-критерий Манна-Уитни.
ППК: площадь под кривой зависимости концентрации в сыворотке
C_макс: максимальная концентрация
T_макс: время, за которое достигается C_макс
СВУ: среднее время удержания

F_R: относительная биодоступность в процентах.

ФК: фолиевая кислота НЧ: наночастица

НЧ: внутривенный способ введения

Как можно видеть, значения площади под кривой претерпевают существенное изменение в зависимости от типа вводимой пробы. Когда витамин инкапсулирован в зеиновых наночастицах, значения ППК значительно выше значений ППК, найденных после введения фолиевой кислоты и, более того, они сохраняются до 24 часов после введения. Кроме того, было отмечено, что среднее время удержания (СВУ) фолиевой кислоты в плазме крови также существенно превышает СВУ при введении свободного витамина.

В соответствии с данными результатами рассчитывают пероральную биодоступность зеиновых наночастиц с инкапсулированной фолиевой кислотой, которая превышала на 70-95% значения, полученные после перорального введения свободной фолиевой кислоты.

Изобретение относится к наночастицам для инкапсулирования биологически активных соединений, их получению и использованию. Наночастица для инкапсулирования биологически активных соединений включает зеиновую матрицу, основную аминокислоту и биологически активное соединение. Способ получения наночастицы предусматривает приготовление содержащего зеин и основную аминокислоту водно-спиртового раствора и приготовление водно-спиртового раствора с биологически активным соединением. Затем смешивают полученные водно-спиртовые растворы и добавляют воду к полученному смешанному раствору. В случае инкапсулирования жирорастворимого биологически активного соединения готовят спиртовой раствор жирорастворимого биологически активного соединения и смешивают с содержащим зеин и основную аминокислоту водно-спиртовым раствором. Также предложен способ получения наночастицы для инкапсулирования водорастворимого биологически активного соединения, полученная вышеуказанными способами наночастица, композиция с указанной наночастицей и пищевой продукт. Изобретение позволяет инкапсулировать как жирорастворимые, так и водорастворимые биологически активные соединения простым способом и получать продукты с хорошей устойчивостью при хранении. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 11 ил., 13 табл., 7 пр.

1. Наночастица для инкапсулирования биологически активных соединений, включающая зеиновую матрицу, основную аминокислоту и биологически активное соединение.

2. Наночастица по п. 1, в которой указанная основная аминокислота выбрана из группы аминокислот, включающей аргинин, лизин, гистидин и их смеси.

3. Наночастица по п. 1, в которой указанное биологически активное соединение выбрано из группы биологически активных соединений, включающей жирорастворимое биологически активное соединение и водорастворимое биологически активное соединение.

4. Наночастица по п. 3, в которой жирорастворимое биологически активное соединение выбрано из группы жирорастворимых биологически активных соединений, включающей полифенол, группу витаминов, включающую витамины A, D, Е и К, предшественник (провитамин) или производное вышеуказанного витамина, фосфолипид, каротеноид, жирную кислоту, фитостанол или фитостерин, их соли или их сложные эфиры и их комбинации.

5. Наночастица по п. 4, в которой указанное жирорастворимое биологически активное соединение выбрано из группы жирорастворимых биологически активных соединений, включающей флавонол, антоциан, фитоалексин, гидрокситирозол, ретиноевую кислоту, ретиналь, ретинол, кальциферол, альфа-токоферол, токотриенол, фитоменадион, альфа-каротин, бета-каротин, ликопин, капсантин, лютеин, зеаксантин, ксантофилл, ЭПК, ДГК, линолевую кислоту, кампестерин, стигмастерин, ситостерин, их пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, их сложные эфиры, их соли и их смеси.

6. Наночастица по п. 4, в которой указанное жирорастворимое биологически активное соединение выбрано из группы жирорастворимых биологически активных соединений, включающей кверцетин, ресвератрол, их пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, их сложные эфиры, их соли и их смеси.

7. Наночастица по п. 3, в которой водорастворимое биологически активное соединение выбрано из группы водорастворимых биологически активных соединений, включающей витамин, выбранный из группы витаминов, включающей витамин В и витамин С, производное названных витаминов, соединение, выбранное из группы соединений, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат и тиоктовую кислоту, их соли, их сложные эфиры и их комбинации.

8. Наночастица по п. 7, в которой водорастворимое биологически активное соединение выбрано из группы водорастворимых биологически активных соединений, включающей фолиевую кислоту, ее пищевые, фармацевтически или косметически приемлемые производные, ее сложные эфиры, ее соли и их смеси.

9. Способ получения наночастицы для инкапсулирования биологически активных соединений, содержащей зеиновую матрицу, основную аминокислоту и биологически активное соединение, включающий приготовление водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту, приготовление водно-спиртового раствора, содержащего биологически активное соединение, смешивание полученных водно-спиртовых растворов и добавление воды к полученному смешанному раствору.

10. Способ по п. 9, в котором указанный водно-спиртовой раствор является водным раствором этанола.

11. Способ по любому из пп. 9-10, в котором полученный водно-спиртовой раствор подвергают, по меньшей мере, в одном цикле испытанию гидростатическим давлением в диапазоне от 100 до 800 МПа и, при необходимости, высушивают водно-спиртовой раствор в необязательном присутствии защитного вещества и/или антиоксидантного вещества.

12. Способ получения наночастицы для инкапсулирования биологически активных соединений, содержащей зеиновую матрицу, основную аминокислоту и жирорастворимое биологически активное соединение, включающий приготовление водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту, приготовление спиртового раствора, содержащего жирорастворимое биологически активное соединение, разбавление полученного спиртового раствора водой до получения водно-спиртового раствора, содержащего жирорастворимое биологически активное соединение, смешивание указанного водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту, с указанным водно-спиртовым раствором, содержащим жирорастворимое биологически активное соединение, и добавление воды к смешанным водно-спиртовым растворам.

13. Способ по п. 12, в котором указанный водно-спиртовой раствор является водным раствором этанола.

14. Способ по любому из пп. 12-13, в котором полученный водно-спиртовой раствор подвергают, по меньшей мере, в одном цикле испытанию гидростатическим давлением в диапазоне от 100 до 800 МПа и, при необходимости, высушивают водно-спиртовой раствор в необязательном присутствии защитного вещества и/или антиоксидантного вещества.

15. Способ получения наночастицы для инкапсулирования биологически активных соединений, содержащей зеиновую матрицу, основную аминокислоту и водорастворимое биологически активное соединение, включающий приготовление водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту, приготовление водного раствора, содержащего водорастворимое биологически активное соединение и, необязательно, вторую основную аминокислоту, и разбавление его спиртом до получения водно-спиртового раствора, содержащего водорастворимое биологически активное соединение, и, необязательно, вторую основную аминокислоту, смешивание указанного водно-спиртового раствора, содержащего зеин и основную аминокислоту, с указанным водно-спиртовым раствором, содержащим водорастворимое биологически активное соединение, и, необязательно, вторую основную аминокислоту, необязательно, добавление поверхностно-активного вещества к полученным смешанным растворам и добавление воды к смешанным растворам или к смешанным растворам с добавленным к ним поверхностно-активным веществом.

16. Способ по п. 15, в котором указанный водно-спиртовой раствор является водным раствором этанола.

17. Способ по любому из пп. 15-16, в котором полученный водно-спиртовой раствор подвергают, по меньшей мере, в одном цикле испытанию гидростатическим давлением в диапазоне от 100 до 800 МПа и, при необходимости, высушивают водно-спиртовой раствор в необязательном присутствии защитного вещества и/или антиоксидантного вещества.

18. Наночастица, полученная способом по любому из пп. 9-17.

19. Композиция для инкапсулирования биологически активных соединений, включающая, по меньшей мере, одну наночастицу по любому из пп. 1-8 или 18 и пищевой, фармацевтически или косметически приемлемый носитель.

20. Композиция по п. 19, в которой средний размер частиц составляет от 100 до 450 нм, предпочтительно около 200 нм.

21. Композиция по любому из пп. 19-20, которая содержит зеин, основную аминокислоту, кверцетин или ресвератрол и сахарид при следующем содержании % (масс.):
зеин 15÷45 основная аминокислота 1÷4 кверцетин или ресвератрол 0,5÷5 сахарид 45÷80

22. Композиция по любому из пп. 19-20, которая содержит зеин, основную аминокислоту, необязательно полисорбат, фолиевую кислоту и сахарид при следующем содержании % (масс.):
зеин 15÷45 основная аминокислота 4÷10 необязательно, полисорбат 0,05÷0,5 фолиевая кислота 0,5÷5 сахарид 45÷80

23. Пищевой продукт, включающий композицию по любому из пп. 19-22.