БИОДОБАВКА В ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ И РЕПРОДУКЦИИ НА НИХ ВИРУСОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N5/07 C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования линий клеток животных тканей и репродукции на них вирусов.

Из практики культивирования клеток известно, что для этой цели используют сыворотку крови разных видов животных (крупного рогатого скота, лошадей, кроликов, свиней, кур и др.). Известно, что сыворотка крови плодов коров и сыворотка молодых животных обладает более высокой ростостимулирующей активностью, чем сыворотка взрослых животных (Дьяконов Л.П., 2009 // Животная клетка в культуре / Методы применения в биотехнологии. - Изд-во «Спутник», М, 2009. - 656 с. ), но чаще всего клетки выращиваются на среде с сывороткой крови взрослого крупного рогатого скота. Оптимальная концентрация сыворотки в культуральной питательной среде составляет 10% (Голубев Д.Б. и др., 1976 // Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976 с. 222).

Кроме сывороток крови в состав культуральных питательных сред включают гидролизаты как растительного, так и животного происхождения: ферментативные гидролизаты белков гороха и сои (Гизитдинов Н.Н. и др. // Разработка паточного способа изготовления сухих белковых гидролизатов гороха и сои / Н.Н. Гизитдинов, Ю.Х. Бахтахунов, М.Т. Велямов / Вестник с/х. науки Казахстана. - №1. - 1984. - С. 62-64.; Патент 2103360 РФ, МКИ⁶ C12N 5/09, 1998, Бюл. №3; Онищенко Г.Г. и др., 2007); предложено значительное число белковых гидролизатов животного происхождения (казеина, молока, цельной крови, сыворотки крови, эмбрионов, внутренних органов, мышечной ткани), а также пептон Витте, бактопептон. Наибольшее распространение в практике культур клеток получила среда с гидролизатом лактальбумина - ГЛА (Melnik J., Riordan J., 1952).

Из всех аналогов, применяемых в качестве биодобавок в культуральные среды при выращивании клеток животных и репродукции на них вирусов, в качестве прототипа мы использовали сыворотку крови плодов коров, так как она оказывает минимальное негативное воздействие, как на рост клеток, так и на накопление в них вирусной массы (Патент RU №2455015 С1, 2012). Но данная биодобавка имеет ряд недостатков:

1. По некоторым оценкам, 55% общей стоимости работ на культурах клеток приходится на сывороточный компонент, хотя он составляет всего 10% от общего объема питательной среды.

2. В связи с резким снижением поголовья КРС возникли большой дефицит в данной сыворотке крови и дороговизна. Поиск замены сыворотки крови животных в культуральной среде более дешевыми биологически активными веществами является перспективным направлением.

Цель предлагаемого изобретения - возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Основополагающей позитивной стороной использования данного комбинированного экстракта, является то обстоятельство, что он заведомо не может содержать антител и вирусов против инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, а также содержит в себе биологически активные вещества как животного, так и растительного происхождения.

Химический состав полученного продукта характеризуется следующими показателями (табл. 1) www.mosbiotehworld.ru.

Схема получения фито-зооэкстратов из кабачков и мышц щуки:

1. Мацерация тканей гомогенизатором;

2. Экстрагирование измельченных тканей раствором Хэнкса в соотношении 1:3 в полиэтиленовые канистры при температуре +1-2ºC в течение 24 часов;

3. Центрифугирование и сбор супернатантов;

4. Замораживание экстрактов при температуре -20ºC в течение 5-7 суток;

5. Оттаивание экстрактов при температуре +4-20ºC;

6. Предварительная очистка экстрактов через марлю, а затем глубинный фильтр EKS;

7. Смешивание экстрактов растительного и животного происхождения в соотношении 1:1;

8. Стерилизующая фильтрация комбинированного экстракта мембранными фильтрами фирм «Millipore», «Владисарт»;

9. Контроль профильтрованных экстрактов на возможное присутствие в них контаминантов путем посева их на бактериологические среды: МПА, МПБ, Китт-Тароцци, ТПС-агар, ТПС-бульон, Сабуро, Чапека.

Пример 1. Изучение состава сыворотки крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ).

Для опытов было приготовлено по 3 серии сыворотки крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки, результаты приведены в табл. 2.

Из таблицы 1 следует, что сыворотка крови плодов коров по физико-химическим показателям соответствует требованиям, предъявляемым к ним Минздравом РФ. Что касается фито-зооэкстракта, то он имеет сравнительно низкие оптическую плотность, концентрации общего белка, общих липидов, в том числе холестерина, а свободный гемоглобин в нем отсутствует. Несмотря на низкое содержание общего белка в экстракте, как показано в дальнейших исследованиях, он является хорошей биодобавкой в питательные среды при культивировании клеток и репродукции на них вирусов, так как лишь небольшая часть биологически активных веществ используется клетками.

Пример 2. Рост культур клеток LEK, MDBK, РК-15, Vero на среде Игла MEM с 10% сыворотки крови плодов коров и фито-зооэкстрактом при посевной концентрации 40 тыс кл/мл.

В качестве контроля в опытах использовали сыворотку крови плодов коров. Монослой маточной культуры снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), далее получали клеточную суспензию и в концентрации 40 тысяч кл/мл рассевали по 2 см³ во флаконы емкостью 10 см³ с посевной площадью 3 см³.

Пролиферативная активность культур клеток MDBK, LEK, РК-15 и Vero исследовалась после 72-часовой инкубации в средах с фито-зооэкстрактом, а также с сывороткой крови плодов коров. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), наливая в каждый флакон по 3 см³, и подсчитывали в камере Горяева. Для дифференциации живых и мертвых клеток использовали 1%-ный раствор метиленового синего. Количество живых клеток подсчитывали в 4-х камерах. Определяли среднее значение и рассчитывали концентрацию клеток в 1 мл по формуле:

где 1000 - количество кубических миллиметров в 1 см³;

а - количество клеток в камере;

н - разведение клеточной суспензии;

0,9 - объем камеры Горяева в мм³.

С сывороткой крови плодов коров и комбинированным экстрактом из кабачков и мышц щуки было проведено по 5 серий опытов. Индекс пролиферации клеток, как показатель ростстимулирующей активности, рассчитывали общепринятым методом по Антонову Б.И. (1986).

Более детально ростстимулирующую активность биодобавок на перечисленных выше перевиваемых культурах клеток приведена в табл. 3.

Из таблицы 2 следует, при культивировании перевиваемых клеток LEK, MDBK, РК-15, Vero, что лучшую пролиферацию их обеспечивает сыворотка крови плодов коров как контрольная (ИП 6,06-7,02), хотя комбинированная биодобавка из экстрактов кабачков и мышц щуки обеспечивает рост клеток почти на том же уровне (ИП 5,65-6,85).

Пример 3. Рост культур клеток РК-15 и Vero при плотности посева 20 тыс кл/см² на среде Игла MEM с 10% сыворотки крови плодов коров и фито-зооэкстрактом. Результаты исследований отражены в табл. 4.

Из таблицы 3 видно, что комбинированный экстракт из кабачков и мышц щуки хорошо стимулирует рост клеток РК-15 и Vero даже при сравнительно низкой плотности их посева (20 тыс. кл/см²).

Пример 4. Изучение репродукции вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3) на перевиваемых культурах клеток MDBK, LEK, соответственно.

В ходе эксперимента было проведено 5 последовательных пассажей каждого вируса. Результаты исследований приведены в табл. 5.

Из таблицы 4 следует, что репродукция вируса инфекционного ринотрахеита в культуре клеток MDBK выше, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови плодов коров (титр = 7,1º0,2 lg ТЦД50/см³), но на 0,5 lg ТЦД50/мл меньше в случае использования комбинированной биодобавки из кабачков и мышц щуки (6,6º0,2 lg ТЦД50/см³). Титр вируса парагриппа-3 в культуре клеток LEK, выращенной на среде с фито-зооэкстрактом, был незначительно ниже (6,4º0,3 lg ТЦД50/см³), по сравнению с тем, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови плодов коров (6,8º0,3 lg ТЦД50/см³).

Пример 5. Изучение репродукции реовируса тип I штамм «Lang» на перевиваемой культуре клеток Vero. Результаты исследований отражены в табл. 6.

Как видно из таблицы 5, репродукция реовируса на культуре клеток Vero, с добавлением в культуральную среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки совпадала по значению, когда клетки культивировались в среде с сывороткой крови плодов коров (1:64 в РГА, $$\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$n$}\right.$$ ). Полученные результаты свидетельствуют о беспрепятственном накоплении массы реовируса в культуре клеток Vero, выращиваемой на среде Игла MEM с 10% фито-зооэкстракта.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов, представляющая собой экстракт из кабачков и мышц щуки. Указанный экстракт получают экстрагированием измельченных гомогенизатором тканей кабачков и мышц щуки раствором Хэнкса в соотношении 1:3 при температуре 1-2°С в течение 24 ч, центрифугированием и сбором супернатантов. Осуществляют замораживание супернатантов при температуре -20°С в течение 5-7 суток, оттаивание при температуре 4-20°С, очистку. Смешивают полученные экстракты растительного и животного происхождения в соотношении 1:1 и стерилизуют фильтрацией. Полученный экстракт характеризуется следующими показателями: оптической плотностью 0,081±0,004 ед. опт. пл., рН 7,26±0,04, содержанием общего белка 9,1±0,04 г/л, свободного гемоглобина 0 г/л, общих липидов 0,15±0,07 г/л, общего холестерина 0,02±0,01 ммоль/л. Изобретение обеспечивает повышение роста клеток животных и репродукции на них вирусов. 6 табл., 5 пр.

Биодобавка в питательную среду для культивирования клеток животных и репродукции на них вирусов, представляющая собой экстракт из кабачков и мышц щуки, полученный путем экстрагирования измельченных гомогенизатором тканей кабачков и мышц щуки раствором Хэнкса в соотношении 1:3 при температуре 1-2°C в течение 24 ч, центрифугирования и сбора, полученных супернатантов, замораживания при температуре -20°C в течение 5-7 суток, оттаивания при температуре 4-20°C, очистки, смешивания экстрактов растительного и животного происхождения в соотношении 1:1, стерилизующей фильтрации полученного экстракта, характеризующегося следующими показателями: оптической плотностью 0,081±0,004 ед. опт. пл., pH 7,26±0,04, содержанием общего белка 9,1±0,04 г/л, свободного гемоглобина 0 г/л, общих липидов 0,15±0,07 г/л, общего холестерина 0,02±0,01 ммоль/л.