НАБОР С ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫМИ ПРАЙМЕРАМИ ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ ГЕНА РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА ПО КРОВИ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и используется для диагностики резус-фактора плода по крови резус-отрицательной беременной женщины для своевременной профилактики гемолитической болезни плода и новорожденного.

Известен «Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления» по патенту РФ №2296328 от 21.09.2005, опубликовано 27 03.2007, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, включающий выделение ДНК; проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из начального плавления, ряда циклов из плавления, отжига и синтеза и финального синтеза; проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindi I и BstFNI, а также электрофорез в полиакриламидном геле.

Самым близким к заявляемому изобретению по технической сущности является способ определения ДНК гена резус-фактора и диагностический набор для его осуществления, описанный в заявке на изобретение №2010130842 от 23.07.2010 г., опубл. 27.01.2012 г., включающий диагностический набор для определения ДНК гена резус-фактора, включающий компоненты 67 мМ трис-HCl, pH 8,8 при 25°C; 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, отличающийся тем, что все компоненты для проведения полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции вода ампулированная и следующие олигопраймеры:

RHD-7-F: GGGTGTTGTAACCGAGTGCTG

RHD-7-R: CCGGCTCCGACGGTATC

RHD-7-FAM: FAM-CCCACAGCTCCATCATGGGCTACAA-BHQ1

RHD-5-F: CGCCCTCTTCTTGTGGATG

RHD-5-R: GAACACGGCATTCTTCCTTTC

RHD-5-FAM: FAM-TCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCTGCT-BHQ1

GAPDH-F: TGCTCCCACTCCTGATTTCTG

GAPDH-R: TTCTCTAAGTCCCTCCTACAAAAG

GAPDH-F AM: FAM-TTCCCCTCTTCCCACCCGCCCC-BHQ1

Но данные диагностические наборы имеют ограниченный срок годности до 1 года и чувствительны к перепадам температур, поэтому требуют сохранения температурного режима при хранении и транспортировке, что затрудняет транспортировку в дальние регионы. А также поставка в виде стоковых растворов праймеров и Taq-полимеразы требует затрат времени и большого числа манипуляций при подготовке к амплификации, в частности надо произвести подсчет необходимого объема в зависимости от числа образцов, «раскапывание» по реакционным пробиркам. Важным обстоятельством является то, что фетальная ДНК сильно разбавлена и ее количества может не хватить для реакции амплификации, т.о. будет наблюдаться ложноотрицательный результат.

Предлагаемое изобретение направлено на получение следующего технического результата: создание набора для ПЦР-диагностики гена резус-фактора развивающегося плода по крови беременной женщины, обладающего большей чувствительностью и специфичностью, с подготовленными реакционными пробирками к амплификации, с увеличенным сроком годности до 5 лет, с возможностью транспортировки набора в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима, при этом увеличить точность и скорость процесса постановки теста при уменьшении трудозатрат.

Поставленная задача решается за счет того, что набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Основной причиной гемолитической болезни новорожденных является иммунологическая несовместимость плода и матери. Несовместимость по резус-фактору составляет до 95% клинически значимых случаев. В качестве профилактики резус-сенсибилизации используют антирезус-иммуноглобулин, что подтверждает свою эффективность в 80% случаев. Однако при беременности резус-отрицательным плодом нет необходимости введения иммуноглобулина, так как этот белковый препарат в данном случае будет бесполезным, небезопасным и затратным в финансовом плане. В связи с этим пренатальное определение резус-фактора не инвазивным методом на ранней стадии беременности (10-12 недель) решает вопрос своевременной профилактики у резус-отрицательных беременных при положительном резус-факторе плода и исключает ненужные процедуры при резус-отрицательной принадлежности плода. Основа анализа - ПЦР-реакция с флуоресцентной спектрометрией (Real-time) с помощью праймеров и праймеров-зондов. Праймеры и праймеры-зонды доводят до необходимой концентрации и ставят реакцию для проверки работоспособности и контроля контаминации на ДНК Jurkat и деионизированной воде. При ожидаемом результате стоковые растворы праймеров и праймеров-зондов аликвотируются в реакционные пробирки. Для сохранения работоспособности микрообъема праймера используется лиофилизация, что позволяет не зависеть от перепада температур при транспортировке и хранении, а также увеличить срок годности набора с одного года до пяти лет. А содержание дополнительного объема праймера для постановки ПЦР-реакции на определение гена RHD (3 пробирки, вместо стандартных 2) увеличивает чувствительность метода. Все смеси праймеров в необходимых пропорциях добавлены в амплификационные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, что уменьшает время постановки и риск контаминации за счет уменьшения числа манипуляций, т.е. увеличивается точность и уменьшаются трудозатраты. Лиофилизация смеси праймеров и праймеров-зондов проводится в лиофильной сушке ALPHA 1-4 LSC №102041. Праймеры в необходимых концентрациях подготовлены к реакции, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин. Финальная сушка - при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Процесс лиофилизации позволяет сохранить стабильность праймера, транспортировать и хранить набор без строгого соблюдения температурного режима, также позволяет увеличить срок годности набора с одного года до 5 лет. Все смеси праймеров и праймеров-зондов в необходимых концентрациях подготовлены для реакции и добавлены в реакционные пробирки, сводя процесс подготовки образцов к амплификации к одному действию, а именно добавлению раствора ДНК, что позволяет ускорить процедуру подготовки образцов к амплификации. По результатам исследований дополнительная амплификационная пробирка, используемая в предлагаемом наборе, позволяет увеличить чувствительность с 97,2% до 98,4%, а специфичность с 94,4% до 95,2% соответственно.

При определении гена резус-фактора сотрудник лаборатории после выделения ДНК при постановке амплификации использует тонкостенные оптически-прозрачные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, в которых уже находится необходимый объем праймера, добавляет ПЦР-смесь в пробирку с выделенной ДНК и уже из нее аликвотирует по 20 мкл раствора в подготовленные пробирки, затем запускает программу амплификации. Определение гена резус-фактора проводится с помощью полимеразно-цепной реакции следующим образом: начальное плавление 5 мин при температуре 95°С, далее проводят цикл 60 раз, включающий плавление при 94°С в течение 15 с, отжиг и синтез при температуре 60°С в течение 1 мин, во время отжига проводят детекцию с помощью флуоресцентной спектрометрии. Регистрируется накопление специфического продукта амплификации путем изменения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой в режиме «реального времени». По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ДНК гена RHD и гена GAPDH. В предлагаемом техническом решении используется дополнительная реакционная пробирка, т.е. для каждого образца проводится амплификация гена GAPDH, как контроль выделения ДНК, 7 экзона гена RHD и две пробирки для 5 экзона гена RHD, а смеси праймеров и праймеров-зондов для каждого экзона гена RHD и гена GAPDH, содержащиеся в амплификационных пробирках, лиофилизированны.

Проверка работоспособности проводилась на образцах крови 80 пациенток, срок беременности 27-35 недель. При рождении ребенка резус-фактор был определен серологическим методом. По результатам исследований набор и способ может использоваться для диагностики со следующими аналитическими характеристиками: чувствительность 98,4%, специфичность 95,2%.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины. Предложен набор с лиофилизированными праймерами, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD. Все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации. Изобретение обеспечивает создание набора, эффективного для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины с увеличенным сроком годности, с возможностью транспортировки в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима. 1 табл.

Набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин.