Тест-система для количественной диагностики мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к средствам молекулярной диагностики и может быть использовано в клинической иммунологии и медицине для оценки иммунного статуса пациента методом ПЦР в реальном времени. Настоящее изобретение представляет собой диагностическую тест-систему для количественной оценки уровней мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека в биологическом образце. Тест-система включает в себя две пробы (I и II), в которых одновременно проходят несколько реакций: в пробе I - определение уровней экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека, в пробе II - определение уровня экспрессии гена GAPDH (ген нормировки).

С момента открытия интерферонов (ИФН) был достигнут значительный прогресс в описании природы самих цитокинов - сигнальных компонентов, которые управляют клеточным ответом, и их противовирусной активности. Выявлено четыре основных эффекторных пути ИФН-опосредованного противовирусного ответа: путь Mx GTPase, путь 2′-5′-олигоаденилатсинтетазы (OAS1), управляемый рибонуклеазой L, путь протеинкиназы R (эукариотический фактор инициации трансляции 2-альфа-киназа 2, который у человека кодируется геном EIF2AK2) и путь, подобный убиквитину ISG15. Данные эффекторные пути индивидуально блокируют вирусную транскрипцию, разрушают вирусную РНК, ингибируют трансляцию и модифицируют функцию белка, чтобы контролировать все этапы репликации вируса [1].

В ответ на инфицирование гриппом клетка вырабатывает врожденный иммунный ответ, ограничивающий размножение вируса. Основным драйвером этого ответа является группа цитокинов под общим названием ИФН I типа. Экспрессия ИФН требует выявления вирус-специфических паттернов (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [PAMPs]), которые распознаются клеточными сенсорами (рецепторами распознавания паттернов [PRRs]) как чужеродные, из которых RIG-I актуален во время инфицирования эпителиальных клеток вирусом гриппа. RIG-I активируется при распознавании двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащей 5′-трифосфат, и передает сигнал ниже по пути через взаимодействие с митохондриальным белком IPS-1 / MAVS / VISA / Cardif. Следствием этой нижестоящей передачи сигналов является активация факторов транскрипции IRF3, NF-κB и ATF-2 / c-Jun, которые активируют транскрипцию ИФН. Секретируемые ИФН действуют аутокринным и паракринным образом, активируя рецептор ИФН. Сигнал передается по пути Jak / STAT в ядро, где он активирует транскрипцию сотен ИФН-зависимых генов (ISG), многие из которых обладают противовирусной активностью, включая EIF2AK2, MxA, OAS1, необходимой клетке для преодоления вирусной инфекции и ограничения распространения вируса на соседние неинфицированные клетки [2].

Индуцируемый интерфероном I типа MxA-белок обладает избирательной активностью против нескольких вирусов. Однако точный механизм противовирусного действия не выяснен. Связываясь с дцРНК, OAS-1 катализирует образование 20-50-связанного олигоаденилата и активирует РНКазу, которая расщепляет вирусную и клеточную РНК. EIF2AK2 также активируется дцРНК; это приводит к фосфорилированию его субстрата, eIF2a, который ингибирует фактор обмена гуанозиновых нуклеотидов, eIF2b, и останавливает репликацию вируса. EIF2AK2 может действовать путем отключения белка после инфицирования клетки и ограничивают передачу вируса неинфицированным клеткам [3].

Совместное определение уровня экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 позволяет определить уровень активации врожденного иммунного ответа организма и дать оценку активации ИФН-опосредованного противовирусного ответа. Особенную актуальность данная оценка приобретает при анализе патогенеза острых респираторных вирусных инфекций, вызванных вирусами гриппа, пневмовирусами, аденовирусами, коронавирусами. Наиболее чувствительным и специфичным методом определения уровня экспрессии генов является ПЦР в реальном времени. В данной методике предполагается наличие двух праймеров и флуоресцентно меченого олигонуклеотидного зонда, специфических к интересующей мРНК.

В настоящее время не зарегистрировано тест-систем, которые можно использовать для одновременного определения экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 методом ПЦР в реальном времени. Известен способ определения экспрессии большого числа генов (включая MxA, OAS1, EIF2AK2) методом микроэррей [4], который является более дорогостоящим методом по сравнению с методом ПЦР. Также известны методы определения экспрессии MxA с использованием мультиплексной тест-системы для количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда (IFNλ), противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 (IL23) [5], а также двух генов MxA, OAS1 с использованием набора для диагностики или прогнозирования лихорадки денге, включающего средства для обнаружения изменения уровня экспрессии одного или нескольких белков, родственных интерферону [6].

Таким образом, актуальность предлагаемого изобретения обусловлена необходимостью определения уровня экспрессии ИФН-индуцируемых генов для более глубокого понимания патогенеза острых респираторных вирусных инфекций и определения дальнейших стратегий их лечения, а также определения уровня активации интерферонового ответа. Отсутствие аналогичных коммерческих тест-систем делает данное изобретение уникальным продуктом интеллектуального творчества.

Технический результат заключается в подобранных последовательностях праймеров и олигонуклеотидных TaqMan зондов, а также условиях проведения ПЦР в реальном времени (концентрации вносимых реагентов и температурном профиле проводимых реакций). Данный результат достигается тем, что тест-система для количественной диагностики мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР включает набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов со следующей структурой:

прямой праймер на ген MxA - GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA (SEQ NO. 1)

обратный праймер на ген MxA - TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC (SEQ NO. 2)

флуоресцентный зонд на ген MxA Fam- CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2

(SEQ NO. 3)

прямой праймер на ген OAS1 - CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT (SEQ NO. 4)

обратный праймер на ген OAS1 - CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA (SEQ NO. 5)

флуоресцентный зонд на ген OAS1 - Rox-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT- BHQ3

(SEQ NO. 6)

прямой праймер на ген EIF2AK2 - GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA (SEQ NO. 7)

обратный праймер на ген EIF2AK2 - CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA (SEQ NO. 8)

флуоресцентный зонд на ген EIF2AK2 - Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1

(SEQ NO. 9).

С помощью указанной тест-системы осуществляют количественное определение уровня мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека, в ходе которого проводят предварительную реакцию обратной транскрипции, а далее полимеразную цепную реакцию в реальном времени по следующему температурному профилю: первичная денатурация в течение 5 мин при температуре 95°С, далее 40 циклов двухступенчатой реакции, состоящей из этапа денатурации в течение 10 с при температуре 95°С и этапа отжига праймеров и элонгации цепи в течение 30 с при температуре 61°С.

Описание фигур

На фиг. 1 представлен расчёт эффективности ПЦР для количественной оценки мРНК гена MxA, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -3) при анализе флуоресценции на канале FAM в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.

На фиг. 2 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной оценки мРНК гена OAS1, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -2) при анализе флуоресценции на канале ROX в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.

На фиг. 3 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной оценки мРНК гена EIF2AK2, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -2) при анализе флуоресценции на канале Cy5 в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.

На фиг. 4 представлено сравнение эффективностей реакций ПЦР в моноплексном и мультиплексном форматах: А - представлены стандартные калибровочные кривые, используемые для расчёта эффективностей амплификации MxA, OAS1 и EIF2AK2 в мультиплексном формате (одновременная детекция в одной пробирке); Б - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР в сравнении c калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена MxA; В - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР в сравнении с калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена OAS1; Г - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР, в сравнении c калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена EIF2AK2.

На фиг. 5 представлен результат электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов, полученных в ходе проведения мультиплексной и моноплексных ПЦР, для оценки возможности образования в ходе реакции нежелательных неспецифических продуктов.

На фиг. 6 представлено определение уровня экспрессии генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с гриппозной инфекцией, новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) и здоровых волонтеров. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с множественными сравнениями. * - P < 0,05; ** - P < 0,01; **** - P < 0,0001.

Для определения уровня экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 был проведен дизайн праймеров и олигонуклеотидных зондов. Оригинальные последовательности всех праймеров и зондов для количественной оценки мРНК генов MxA, OAS, EIF2AK2 были подобраны к белок-кодирующей области генов таким образом, чтобы праймеры были разделены областью интрона, температуры их плавления были схожи, а длины ампликонов, образующихся в процессе ПЦР, не превышали 300 п.н. В качестве эндогенного контроля, используемого для нормировки экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2, был предложен ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (табл.1).

Таблица 1: Подобранные праймеры и TaqMan зонды для определения экспрессии генов MxA, OAS, EIF2AK2 ГЕН мРНК НАЗВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПОДОБРАННЫЕ ПРАЙМЕРЫ (5’-3’) Длина проду-кта ПЦР I MxA NM_001144925.2 NM_002462.5 NM_001178046.3 h MxA_F GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA 105 h MxA_R TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC h MxA_O FAM-CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2 OAS1 NM_016816.4 NM_002534.3 NM_001032409.3 NM_001320151.2 h OAS1_F CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT 200 h OAS1_R CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA h OAS1_O ROX-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT-BHQ3 EIF2AK2 NM_002759.3 NM_001135652.2 NM_001135651.3 h EIF2AK2_F GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA 175 h EIF2AK2_R CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA h EIF2AK2_O Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1 II GAPDH NM_002046.7
NM_001256799.3 NM_001289745.3 NM_001289746.2 NM_001357943.2 h GAPDH_F CCTGGCGTCGTGATTAGTG 164 h GAPDH_R TGTAATCCAGCAGGTCAGCA h GAPDH_O FAM-GCCCCCTCTGCTGATGCCCCC-BHQ1

Подобранные праймеры выявляют все транскрипционные варианты мРНК генов (3 транскрипционных варианта MxA, 4 транскрипционных варианта OAS1, 3 транскрипционных варианта EIF2AK2, 5 транскрипционных вариантов GAPDH).

Подбор и оптимизация условий ПЦР

На данном этапе работы была проведена оценка качества подобранных пар праймеров и зондов, а также возможность образования ими гетеро- и гомодимеров и неспецифических продуктов. В качестве матрицы для проведения данного исследования использовали образцы кДНК, полученные из препаратов тотальной РНК, выделенных из клеток A549, инфицированных вирусом гриппа A. Работа проводилась с использованием 2× реакционной смеси, содержащей Taq ДНК-полимеразу с «горячим» стартом, для проведения ПЦР с контролем по конечной точке (БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×), Биолабмикс). Реакцию проводили в объёме 25 мкл, содержащем от 6,25 до 12,5 пмоль прямого и обратного праймеров и TaqMan зонда. Для определения оптимального термального профиля реакций были проведены ПЦР с температурным градиентом отжига праймеров: 1) 95°С - 300 c; 2) [95°С - 10 c; градиент температур 57,5°С - 63,5°С - 30 c; 72°С - 30 c] - 40 циклов.

Детекцию результатов осуществляли по росту флуоресценции, наличие неспецифических продуктов оценивали электрофоретическим разделением продуктов в агарозном геле.

С учётом полученных результатов в качестве оптимального температурного профиля проводимой мультиплексной ПЦР было предложено использовать следующий:

1) первичная денатурация 95°С - 5 мин,

далее 40 двухступенчатых циклов:

2) денатурация 95°С - 10 с;

3) отжиг праймеров и элонгация цепи 61°С - 30 c.

Расчет эффективностей ПЦР

Для корректного проведения относительного количественного анализа экспрессии ИФН-индуцируемых генов в мультиплексном формате значения эффективностей амплификации соответствующих мРНК должны быть идентичными или максимально приближенными друг к другу. Поэтому далее при подобранных оптимальных условиях были рассчитаны эффективности проводимых ПЦР.

Для определения эффективностей реакций использовали специфические очищенные ампликоны, полученные в неколичественных ПЦР (без использования TaqMan зонда). Расчёт проводили по углу наклона кривой, полученной в результате постановки qПЦР с серией последовательных разбавлений подготовленных ампликонов.

На Фиг. 1Б показаны результаты расчёта эффективности ПЦР при амплификации гена MxA в формате моноплексной ПЦР. Рассчитанная эффективность ПЦР на MxA (Фиг. 1Б) составила 106%, что является хорошим параметром амплификации. Аналогичным образом были получены эффективности амплификации ПЦР для OAS1 (Фиг. 2Б) и для EIF2AK2 (Фиг. 3Б). Таким образом, продемонстрировано, что в моноплексном формате эффективности амплификации продуктов трех генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 составили: 106%, 90%, 118%, соответственно. Стандартные калибровочные кривые, представленные на Фиг. 1-3Б, имеют похожие углы наклона, т.е. параллельны.

При постановке мультиплексной ПЦР амплификация всех генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 проводилась одновременно в одной пробирке. При этом в пробу ПЦР, содержащую фермент ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и прилагаемый к ней буфер, также добавлялись все подобранные пары праймеров и олигонуклеотидные зонды, специфически выявляющие заявленные гены. Конечные концентрации праймеров и зондов, содержащиеся в пробе при проведении мультиплексной ПЦР, представлены в таблице 2.

Таблица 2: Концентрации праймеров и олигонуклеотидных зондов, используемых для проведения мультиплексной ПЦР НАЗВАНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЯ, нМ h MxA_F 250 h MxA_R 250 h MxA_O 100 h OAS1_F 500 h OAS1_R 500 h OAS1_O 200 h EIF2AK2_F 500 h EIF2AK2_R 500 h EIF2AK2_O 200

Ввиду того, что во время реакции пары праймеров могут давать неспецифические химерные продукты, был проведен анализ продуктов мультиплексной и моноплексной ПЦР методом электрофоретического разделения в агарозном геле (Фиг. 5).

Результаты, представленные на Фиг. 5, свидетельствуют о том, что при проведении моноплексной ПЦР в пробирках амплифицировались только целевые продукты, соответствующие заявленным генам MxA, OAS1, EIF2AK2. Продукты ПЦР представлены яркими бэндами с длинами, соответствующими расчётным: 105 п.н., 200 п.н. и 175 п.н. для каждого анализируемого гена (MxA, OAS1, EIF2AK2, соответственно). При проведении мультиплексной ПЦР в пробирке одновременно выявлялись все три гена, имеющие аналогичные длины. Таким образом, в ходе мультиплексной ПЦР не образовывались какие-либо нежелательные неспецифические продукты.

Далее были рассчитаны эффективности амплификации каждого из заявленных генов при проведении мультиплексной ПЦР. Как продемонстрировано на Фиг. 4А, эффективности амплификации всех специфических продуктов MxA, OAS1 и EIF2AK2 при проведении ПЦР в одной пробирке составили: 102%, 93%, 113%, соответственно. Кроме того, мультиплексирование праймеров приводит к снижению амплификации не более чем на 3-5% по сравнению с амплификацией в моноплексном формате для каждого из специфических продуктов (Фиг. 4Б-Г).

Верификация тест-системы на клинических образцах

Разработанная тест-система применялась для одновременного измерения экспрессии генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с диагнозом COVID-19, гриппозной инфекцией, а также контрольной группы здоровых доноров. Диагностика инфекций была проведена ПЦР-наборами, сертифицированными для проведения подобных исследований.

В результате измерения было установлено, что у пациентов с COVID-19 происходило повышение экспрессии OAS1 практически на два порядка по сравнению с контрольной группой пациентов, тогда как у пациентов с гриппозной инфекцией экспрессия OAS1 была достоверно ниже, чем у пациентов с COVID-19, но достоверно выше, чем у контрольной группы. Экспрессия генов MxA и EIF2AK2 возрастала как в случае гриппозной инфекции, так и в случае заражения COVID-19.

Использование разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы позволяет с высокой эффективностью проводить количественный анализ генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в клинических образцах.

Список литературы

1. Anthony J. Sadler and Bryan R. G. Williams. Interferon-inducible antiviral effectors// Nature Reviews Immunology. - 2008. - 8(7). - С. 559-568.

2. Haller, O. et al. Protective role of interferon-induced Mx GTPases against influenza viruses// Scientific and Technical Review. - 2009. - 28(1). С. 219-231.

3. Knapp, S. et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR// Genes & Immunity. - 2003. - 4(6). - С. 411-419.

4. Compositions and Methods for Diagnosing and Assessing Inflammatory Myopathies: patent application US2010190659A1, the United States of America, filed 07.07.2008, publ. 29.07.2010.

5. Test system for determination of interferon, IL23 interleukine and MXA anti-virus protein RNA: patent RU2627179, Russian Federation, appl. RU2016131205, filed 28.07.2016, publ. 03.08.2017.

6. Dengue diagnosis and treatment: patent application US2010068147, the United States of America, filed 05.10.2007, publ. 18.03.2010.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><!DOCTYPE ST26SequenceListing

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN"

"ST26SequenceListing_V1_3.dtd"><ST26SequenceListing

dtdVersion="V1_3" fileName="/Users/fedorivanov/Downloads/Seq.

list.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-03-15"> <ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate> </ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>MxA, OAS1, EIF2AK2</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

автономное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Санкт-Петербургский политехнический университет Петра

Великого&quot; (ФГАОУ ВО &quot;СПбПУ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Autonomous Educational Institution

of Higher Education &quot;Peter the Great St. Petersburg Polytechnic

University&quot; (SPbPU)</ApplicantNameLatin> <InventionTitle

languageCode="ru">Тест-система для количественной диагностики мРНК

генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity> <SequenceData

sequenceIDNumber="1"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData></ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение относится к средствам молекулярной диагностики и может быть использовано в клинической иммунологии и медицине для оценки иммунного статуса пациента методом ПЦР в реальном времени. Описана диагностическая тест-система для количественной оценки уровней мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека в биологическом образце. Тест-система включает набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов: прямой праймер на ген MxA GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA, обратный праймер на ген MxA TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC, флуоресцентный зонд на ген MxA Fam- CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2, прямой праймер на ген OAS1 CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT, обратный праймер на ген OAS1 CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA, флуоресцентный зонд на ген OAS1 Rox-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT- BHQ3, прямой праймер на ген EIF2AK2 GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA, обратный праймер на ген EIF2AK2 CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA, флуоресцентный зонд на ген EIF2AK2 Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1. Технический результат состоит в обеспечении возможности проведения быстрой и точной количественной оценки уровней мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека. 6 ил., 2 табл.

Тест-система для количественной диагностики мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов:

прямой праймер на ген MxA GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA;

обратный праймер на ген MxA TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC;

флуоресцентный зонд на ген MxA Fam-CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2;

прямой праймер на ген OAS1 CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT;

обратный праймер на ген OAS1 CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA;

флуоресцентный зонд на ген OAS1 Rox-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT- BHQ3; прямой праймер на ген EIF2AK2 GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA; обратный праймер на ген EIF2AK2 CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA; флуоресцентный зонд на ген EIF2AK2 Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1, отличающаяся тем, что концентрация праймеров и зонда к гену MxA составляет 250 нМ и 100 нМ, соответственно; праймеров и зонда к гену OAS1 — 500 нМ и 200 нМ, соответственно; праймеров и зонда к гену EIF2AK2 — 500 нМ и 200 нМ, соответственно.