НЕКОНКУРЕНТНЫЕ АНТАГОНИСТЫ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ Российский патент 2016 года по МПК C07C211/41 C07C211/38 C07D493/20 C07D491/22 A61K31/13 A61K31/34 A61P25/30 A61P25/26 A61P9/12 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые модулируют никотиновые рецепторы в качестве неконкурентных модуляторов (например, неконкурентных антагонистов), способам их синтеза, способам применения и их фармацевтическим композициям.

Предпосылки создания изобретения

Никотиновые рецепторы представляют собой мишень для большого числа экзогенных и эндогенных соединений, аллостерически модулирующих их функцию. См. Arias H.R., Binding sites for exogenous and endogenous non-competitive inhibitors of the nicotinic acetylcholine receptor, Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes 1376:173-220 (1998) и Arias H.R., Bhumireddy P., Anesthetics as chemical tools to study the structure and function of nicotinic acetylcholine receptors, Current Protein & Peptide Science 6: 451-472 (2005). Функция никотиновых рецепторов может быть снижена или блокирована структурно различными соединениями, называемыми неконкурентными модуляторами, включая неконкурентные антагонисты (Arias H.R., Bhumireddy P., Bouzat C., Molecular mechanisms and binding site locations for noncompetitive antagonists of nicotinic acetylcholine receptors. The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 38; 1254-1276 (2006)).

Неконкурентные модуляторы включают широкий диапазон структурно различных соединений, которые ингибируют функцию рецептора, действуя на участок или участки, отличные от ортостерического участка связывания. Доказано, что модуляция рецептора является в высшей степени сложной. Механизмы действия и аффинности связывания неконкурентных модуляторов различаются по подтипам никотиновых рецепторов (Arias et al., 2006). Неконкурентные модуляторы могут действовать посредством, по меньшей мере, двух различных механизмов: аллостерического и/или стерического механизма.

Механизм действия аллостерического антагониста включает связывание неконкурентного антагониста с рецептором и стабилизацию непроводящего конформационного состояния, а именно состояния покоя или десенсибилизации и/или повышения в рецепторе степени десенсибилизации.

В противоположность этому, непосредственное представление стерического механизма заключается в том, что молекула антагониста физически блокирует ионный канал. Такие антагонисты могут быть названы неконкурентными модуляторами канала (NCM). Некоторые из них ингибируют рецепторы посредством связывания в поре, когда рецептор находится в открытом состоянии, таким образом, физически блокируя проницаемость ионов. Кроме того, некоторые действуют только в качестве абсолютных блокаторов канала в открытом состоянии, другие блокируют открытые и закрытые каналы. Такие антагонисты ингибируют поток ионов посредством механизма, который не подразумевает связывания с ортостерическими участками.

Показано, что барбитураты, диссоциативные анестетики, антидепрессанты и определенные стероиды ингибируют никотиновые рецепторы посредством аллостерических механизмов, включая блокаду каналов в открытых и закрытых состояниях. Исследования барбитуратов поддерживают модель, согласно которой связывание происходит при открытых и закрытых состояниях рецепторов, что приводит к блокаде потока ионов. См. Dilger J.P., Boguslavsky R. Barann M., Kate T., Vidal A.M., Mechanisms of barbiturate inhibition of acetylcholine receptor channels, Journal General Physiology 109: 401-414 (1997). Хотя ингибирующее действие местных анестетиков на нервную проводимость является преимущественно опосредованным блокированием потенциалзависимых натриевых каналов, никотиновые рецепторы также являются мишенями местных анестетиков. См. Arias H.R., Role of local anesthetics on both cholinergic and serotonergic ionotropic receptors, Neuroscience and Biobehavioral Reviews 23: 817-843 (1999) и Arias H.R. & Blanton M.P., Molecular and physicochemical aspects of local anesthetics acting on nicotinic acetylcholine receptor-containing membranes, Mini Reviews in Medicinal Chemistry 2: 385-410 (2002).

Например, тетракаин связывается с каналами рецепторов предпочтительно в состоянии покоя. Диссоциативные анестетики ингибируют ряд никотиновых рецепторов нейронального типа в диапазонах клинических концентраций, например, такие как фенциклидин (PCP) (Connolly J., Boulter J. & Heinemann S.F., Alpha 4-befa 2 and other nicotinic acetylcholine receptor subtypes as targets of psychoactive and addictive drugs, British Journal of Pharmacology 105: 657-666 (1992)), кетамин (Flood P. & Krasowski M.D., Intravenous anesthetics differentially modulate ligand-gated ion channels, Anesthesiology 92: 1418-1425(2000) и Ho K.K. & Flood P., Single amino acid residue in the extracellular portion of transmembrane segment 2 in the nicotinic α7 acetylcholine receptor modulates sensitivity to ketamine, Anesthesiology 100: 857-682 (2004)) и дизоцилпин (Krasowski M.D. & Harrison N.L., General anaesthetic actions on ligand-gated ion channels, Cellular and Molecular Life Sciences 55; 1278-1303 (1999)). Исследования указывают, что диссоциативные анестетики связываются с единственными или перекрывающимися участками в ионных каналах в состоянии покоя, и позволяют предположить, что локус кетамин/PCP частично перекрывает участок связывания тетракаина в канале рецептора. Дизоцилпин, также известный как MK-801, представляет собой диссоциативный анестетик и противосудорожное средство, которое также действует в качестве неконкурентного антагониста для различных никотиновых рецепторов. Опубликовано, что дизоцилпин является блокатором канала в открытом состоянии нейрональных α4β2-никотиновых рецепторов. См. Buisson B. & Bertrand D., Open-channel blockers at the human α4β2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor, Molecular Pharmacology 53: 555-563 (1998).

В дополнение к их хорошо известным действиям на системы обратного захвата моноаминов и серотонина, также показано, что антидепрессанты модулируют никотиновые рецепторы. Первые исследования показали, что трициклические антидепрессанты действуют в качестве неконкурентных антагонистов. См. Gumilar F., Arias H.R., Spitzmaul G., Bouzat C., Molecular mechanisms of inhibition of nicotinic acetylcholine receptors by tricyclic antidepressants. Neuropharmacology 45: 984-76 (2003). В статье Garcia-Golunga et al. опубликовано, что флуоксетин, селективный ингибитор обратного захвата серотонина (SSRI), ингибирует мембранные токи, вызванные активацией мышечных или нейрональных никотиновых рецепторов неконкурентным способом, а также увеличением степени десенсибилизации и/или включением блокады каналов. См. Garcia-Colunga J., Awad J.N. & Miledi R., Blockage of muscle and neuronal nicotinic acetylcholine receptors by fluoxetine (Prozac), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 94: 2041-2044 (1937) и Garcia-Colunga J., Vazquez-Gomez E. &. Miledi R., Combined actions of zinc and fluoxetine on nicotinic acetylcholine receptors, The Phafmacogenomics Journal 4: 388-393 (2004). Мекамиламин, ранее одобренный для лечения гипертензии, представляет собой классический неконкурентный антагонист никотиновых рецепторов, а также хорошо известно, что он ингибирует функцию рецептора, блокируя ионный канал. См. Giniatuliin R.A., Sokolova E.M., Di Angelantonio S., Skorinkin A., Talantova M.V., Nistri A. Rapid relief of block by mecamyiarnine of neuronal nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells in vitro: an electrophysiological and modeling study. Molecular Pharmacology 58: 778-787 (2000).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

Формула I

где

каждый из R¹ и R² в отдельности представляет собой H, C_1-6алкил или арилзамещенный C_1-6алкил, или R¹ и R² связаны с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного кольца, необязательно замещенного C_1-6алкильными, арильными, C_1-6алкокси или арилокси заместителиями;

R³ представляет собой H, C_1-6алкил или C_1-6алкоксизамещенный C_1-6алкил;

каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ в отдельности представляет собой H, C_1-6алкил или C_1-6алкоксигруппу;

L¹ представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CR⁸R⁸, CR⁵R⁹CR¹⁰R¹¹ и O;

L² представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂ или CH₂CH₂CH₂CH₂;

каждый из R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ в отдельности представляет собой водород или C_1-6алкил, и

пунктирная линия обозначает необязательную двойную связь;

или их фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемую соль. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения широкого спектра состояний или нарушений и в частности нарушений, характеризующихся дисфункцией никотиновой холинергической нейротрансмиссии или дегенерацией никотиновых холинергических нейронов.

Настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения нарушений и дисфункций, таких как нарушения и дисфункции ЦНС, а также к лечению или предотвращению определенных состояний, например облегчению боли, гипертензии и воспаления у нуждающихся в таком лечении млекопитающих. Способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению, включая его соли, или фармацевтической композиции, которая содержит такие соединения.

Подробное описание изобретения

I. Соединения

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формулы I:

Формула I

где

каждый из R¹ и R² в отдельности представляет собой H, C_1-6алкил или арилзамещенный C_1-6алкил, или R¹ и R² связаны с атом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного кольца, необязательно замещенного C_1-6алкильными, арильными, C_1-6алкокси или арилокси заместителиями;

R³ представляет собой H, C_1-6алкил или C_1-6алкоксизамещенный C_1-6алкил;

каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ в отдельности представляет собой H, C_1-6алкил или C_1-6алкоксигруппу;

L¹ представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CR⁸R⁸, CR⁵R⁹CR¹⁰R¹¹ и O;

L² представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂ или CH₂CH₂CH₂CH₂;

каждый из R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ в отдельности представляет собой водород или C_1-6алкил, и

пунктирная линия обозначает необязательную двойную связь;

или их фармацевтически приемлемой соли.

В одном из вариантов осуществления R¹ представляет собой H, и R² представляет собой C_1-6алкил. В одном из вариантов осуществления R³ представляет собой C_1-6алкил. В одном из вариантов осуществления каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ представляет собой H. В одном из вариантов осуществления L¹ представляет собой CR⁸R⁹, и каждый из R⁸ и R⁹ представляет собой водород. В одном из вариантов осуществления L² представляет собой CH₂CH₂, в одном из вариантов осуществления пунктирная линия обозначает одинарную связь.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу платного лечения или предотвращения заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором, конкретно посредством применения неконкурентных модуляторов (например, неконкурентных антагонистов), включая, но, не ограничиваясь ими, блокаторы каналов, включающему введение соединения по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой нарушение ЦНС. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой воспаление или воспалительный ответ. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой боль. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой неоваскуляризацию, в другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой гипертензию. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой другое описываемое в данном описании нарушение.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к применению соединения по настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором, конкретно посредством применения неконкурентных антагонистов, таких как блокаторы каналов. В одном из вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой нарушение ЦНС, в другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой воспаление или воспалительный ответ. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой боль. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой неоваскуляризацию. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой гипертензию. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой другое описываемое в данном описании нарушение.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к соединению по настоящему изобретению, предназначенному для применения в качестве активного терапевтического вещества. Один аспект, таким образом, относится к соединению по настоящему изобретению, предназначенному для применения в лечении или предотвращении заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором, конкретно посредством применения неконкурентных антагонистов, таких как блокаторы каналов. В одном из вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой нарушение ЦНС. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой воспаление или воспалительный ответ. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой боль. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой неоваскуляризацию. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой гипертензию. В другом варианте осуществления заболевание или состояние представляет собой другое описываемое в данном описании нарушение.

Конкретные заболевания или состояния включают депрессию, в том числе большое депрессивное расстройство, гипертензию, синдром раздраженного кишечника (IBS), в том числе IBS-D (с преобладанием диареи), сверхактивный мочевой пузырь (GAB) и зависимости, включая прекращение курения.

В объем настоящего изобретения включены все комбинации аспектов и вариантов осуществления.

Следующие определения предназначены для разъяснения, а не для ограничения определяемых терминов, если конкретный термин, используемый в настоящем описании, не определен конкретно, такой термин следует полагать неопределенным. Предпочтительно термины используют в их принятых значениях.

Как используется на всем протяжении данного описания, предпочтительное количество атомов, таких как атомы углерода, представлены, например, фразой "C_x-yалкил", которая означает алкильную группу, как определено в настоящем описании, содержащую конкретное количество атомов углерода. Подобную терминологию применяют для других предпочтительных терминов, а также диапазонов. Таким образом, например, алкил представляет собой углеводород с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от одного до шести атомов углерода.

Как используется в настоящем описании, термин "алкил" относится к углеводороду с неразветвленной или разветвленной цепью, которая может быть необязательно замещенной, с многократными степенями допустимого замещения. Примеры "алкила", как используется в настоящем описании, включают, но, не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, н-бутил, трет-бутил, изопентил и н-пентил.

Как используется в настоящем описании, термин "алкилен" относится к двухвалентной группе, такой как "метилен", "этилен" и "ацетилен", которые относятся к двухвалентным формам -CH₂-, -CH₂-CH₂- и -CH=CH-, соответственно.

Как используется в настоящем описании, термин "арил" относится к одному бензольному кольцу или к системе конденсированных бензольных колец, необязательно замещенных с многократными степенями допустимого замещения. Примеры "арильных" групп, включают, но, не ограничиваясь ими, фенил, 2-нафтил, 1-нафтил, антрацен и фенантрен. Предпочтительно арильные кольца содержат от пяти до десяти членов.

Как используется в настоящем описании, система конденсированных бензольных колец, включенная в термин "арил", содержит конденсированные полициклические углеводороды, а именно циклический углеводород менее чем с максимальным количеством некумулятивных двойных связей, например, где насыщенное углеводородное кольцо (циклоалкильное, такое как циклопентильное кольцо) конденсировано с ароматическим кольцом (арильным, таким как бензольное кольцо) с образованием, например, групп, таких как инданил и аценафталенил, а также включает такие группы, в качестве неограничивающих примеров, как дигидронафталин и тетрагидронафталин.

Как используется в настоящем описании, термин "алкокси" относится к группе -OR^a, где R^a представляет собой алкил, как определено в настоящем описании.

Как используется в настоящем описании, термин "арилокси" относится к группе -OR^a, где R^a представляет собой арил, как определено в настоящем описании.

Как используется в настоящем описании, "амино" относится к группе -NR^aR^b, где каждый из R^a и R^b представляет собой водород. Дополнительно "замещенный амино" относится к группе -NR^aR^b, где каждый из R^a и R^b в отдельности представляет собой алкил, ариалкил или арил. Как используется в настоящем описании, когда R^a или R^b отличны от водорода, такая группа может быть обозначена как "замещенный амино" или, например, если R^a представляет собой H, и R^b представляет собой алкил, как "алкиламино".

Как используется в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый" относится к носителю(ям), разбавителю(ям), эксципиенту(ам) или солевым формам соединений по настоящему изобретению, которые совместимы с другими ингредиентами состава и не являются вредными для реципиента фармацевтической композиции.

Как используется в настоящем описании, термин "фармацевтическая композиция" относится к соединению по настоящему изобретению необязательно смешанному с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами. Фармацевтические композиции предпочтительно демонстрируют такую степень стабильности в условиях окружающей среды, что делает их подходящими для целей получения и коммерции.

Как используется в настоящем описании, термины "эффективное количество", "терапевтическое количество" и "эффективная доза" относятся к количеству соединения по настоящему изобретению, достаточному для получения желаемых фармакологических или терапевтических эффектов, таким образом, приводящих к эффективному лечению нарушения. Лечение нарушения может проявляться в задержке или предотвращении начала или прогрессирования нарушения, а также начала или прогрессирования симптомов, ассоциированных с нарушением. Лечение нарушения может также проявляться в снижении или устранении симптомов, купировании прогрессирования нарушения, а также в любом другом вкладе в самочувствие пациента.

Эффективная доза может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние пациента, тяжесть симптомов нарушения и способа введения фармацевтической композиции. Как правило, для введения в эффективной дозе соединения могут быть введены в количестве менее 5 мг/кг массы пациента. Соединения можно вводить в количестве приблизительно от менее 1 мг/кг массы пациента приблизительно до менее 100 мкг/кг массы пациента, и дополнительно приблизительно от 1 мкг/кг до менее 100 мкг/кг массы пациента. Указанные выше эффективные дозы, как правило, представляют такое количество, которое можно вводить в виде однократной дозы или в виде одной или более доз, которые можно вводить в течение периода 24 часов.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены различными способами, включая общепринятые синтетические способы. Иллюстративные общие синтетические способы описаны ниже, а также конкретные соединения по изобретению получены в рабочих примерах.

В описанных ниже примерах для чувствительных или реакционноспособных групп при необходимости используют защитные группы согласно общим принципам синтетической химии. Защитными группами манипулируют стандартными способами органического синтеза (T.W. Green and P.G.M. Wuts (1999) Protecting Groups in Organic Synthesis, 3^rd Edition, John Wiley & Sons, включенная в настоящее описание посредством ссылки касательно защитных групп). Эти группы удаляют на подходящей стадии синтеза соединения способами, очевидными специалистам в данной области. Выбор способа, а также условий реакции и порядка их выполнения, находится в соответствии с получением соединений по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу синтеза соединений, пригодных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по настоящему изобретению, а также к способам их получения.

Соединения можно получать описанными ниже способами с использованием легкодоступных исходных веществ и реагентов. В таких реакциях можно применять модификации, известные специалистам в данной области, но не описанные подробно в настоящем описании.

Если не указано иное, также подразумевают, что описанные в настоящем описании структуры включают соединения, отличающиеся только наличием одного или более изотопно обогащенных атомов. Соединения, имеющие настоящую структуру, за исключением замены атома водорода дейтерием или тритием или замены атома углерода ¹³C- или ¹⁴C-обогащенным углеродом, входят в объем изобретения. Например, дейтерий широко используется для исследования фармакокинетики и метаболизма биологически активных соединений. Хотя дейтерий ведет себя аналогично водороду с химической точки зрения, существуют значительные отличия в энергии связей и длине связей между связью дейтерий-углерод и связью водород-углерод. Таким образом, замена водорода дейтерием в биологически активном соединении может приводить к соединению, которое, как правило, сохраняет свою биохимическую активность и избирательность, но проявляет значительно отличающиеся свойства (ADME) абсорбции, распределения, метаболизма и/или экскреции по сравнению с его аналогом, не содержащим изотоп. Таким образом, замена дейтерием может приводить к улучшенной эффективности лекарственного средства, безопасности и/или переносимости для некоторых биологически активных соединений.

Соединения по настоящему изобретению могут кристаллизоваться более чем в одной форме, свойство известное как полиморфизм, и такие полиморфные формы ("полиморфы") входят в объем настоящего изобретения. Полиморфизм, как правило, возникает в ответ на изменения температуры, давления или того и другого. Полиморфизм может также являться результатом вариаций в способе кристаллизации. Полиморфы могут отличаться по различным известным в данной области физическим характеристикам, таким как дифракционная рентгенограмма, растворимость и температура плавления.

Определенные соединения, из описываемых в настоящем описании, содержат один или более хиральных центров или, в других случаях, могут существовать в виде многочисленных стереоизомеров. В объем настоящего изобретения включены смеси стереоизомеров, а также очищенные энантиомеры или энантиомерно/диастереомерно обогащенные смеси. В объем изобретения также включены отдельные изомеры соединений, представленных формулами по настоящему изобретению, а также их любые полностью или частично уравновешенные смеси. Настоящее изобретение также включает отдельные изомеры соединений, представленных указанными выше формулами, в виде смесей с их изомерами, в которых один или более хиральных центров являются инвертированными.

Когда соединение желательно в виде одного энантиомера, то оно может быть получено стереоспецифическим синтезом, путем разделения конечного продукта или любого подходящего промежуточного соединения или методами хиральной хроматографии, как известно в данной области. Разделение конечного продукта, промежуточного соединения или исходного вещества можно проводить любым известным в данной области подходящим способом. См., например, Stereochemistry of organic compounds (Wiley-Interscience, 1994).

Настоящее изобретение включает соль или сольват описанных в настоящем описании соединений, включая их комбинации, такие как сольват соли. Соединения по настоящему изобретению могут существовать в сольватированных, например, гитратированных, а также несольватированных формах, и настоящее изобретение включает все такие формы.

Как правило, но не обязательно, соли по настоящему изобретению представляют собой фармацевтически приемлемые соли. Соли, включенные в термин "фармацевтически приемлемые соли" относятся к нетоксичным солям соединений по настоящему изобретению.

Примеры подходящих фармацевтически приемлемых солей включают аддитивные соли неорганических кислот, такие как хлорид, бромид, сульфат, фосфат и нитрат; аддитивные соли органических кислот, такие как ацетат, галактарат, пропионат, сукцинат, лактат, гликолят, малат, тартрат, цитрат, малеат, фумарат, метансульфонат, п-толуолсульфонат и аскорбат; соли с кислой аминокислотой, такие как аспартат и глутамат; соли щелочных металлов, такие как натриевая соль и калиевая соль; соли щелочноземельных металлов, такие как магниевая соль и кальциевая соль; аммонийная соль; соли органических оснований, такие как соль триметиламина, соль триэтиламина, соль пиридина, соль пиколина, соль дициклогексиламина и соль N,N'-дибензилэтилендиамина, и соли с основной аминокислотой, такие как соль лизина и соль аргинина. В некоторых случаях, соли могут представлять собой гидраты или сольваты этанола.

Специалистам в области органической химии будет очевидно, что многим органическим соединениям может быть дано более одного систематического названия. Объем настоящего изобретения не следует рассматривать как недостаточность наглядности, вследствие нескольких потенциальных названий, возможных для соединений.

II. Общие синтетические способы

Специалистам в области органического синтеза будет понятно, что существуют многочисленные способы получения соединений по настоящему изобретению, а также способы получения соединений по настоящему изобретению, которые мечены радиоактивным изотопом, подходящим для различных применений.

Один из способов получения соединений по настоящему изобретению представлен на схеме 1 (см. примеры синтеза). Таким образом, норкамфор (2-норборнанон) может быть алкилирован по соседней карбонильной функциональной группе способами, хорошо известными специалистам в области органического синтеза. Как правило, для таких преобразований применяют обработку кетона сильным основанием (например, гидридом натрия, алкоксидом натрия, амидом натрия) с образованием промежуточного соединения енолята, с последующей обработкой алкилгалогенидом или алкилсульфонатом. В определенных условиях алкилирование можно проводить α,ω-дигалоалканом (таким как 1,3-дибромпропан) с образованием спиросвязи. Хотя на схеме 1 показано образование спироциклобутана (соединение II), другие размеры колец (например, спироциклопентаны) также можно получать таким образом с использованием других α,ω-дигалогеналканов. Карбонильная функциональная группа может быть затем преобразована в экзоциклический метилен (соединение III) реакцией Виттига (или эквивалентной). Обработкой соединений экзометилена цианидом водорода (или сходными реагентами, такими как тиоцианаты) в присутствии сильной кислоты можно получить соответствующие третичные формамидосоединения способом, известным как реакция Риттера.

Восстановление формамидосоединения с использованием гидридного восстановителя, такого как алюмогидрид лития или бис(метоксиэтокси)алюмогидрид натрия, дает соответствующий вторичный амин, соединение IV.

Альтернативно, также можно использовать замещенные 2-норборнаноны в качестве исходных веществ при преобразованиях, представленных на схеме 2. Таким образом, каждый из D-камфора и L-камфора (оба коммерчески доступны) можно преобразовать в стереоизомеры соединения V. Другие исходные вещества на основе кетонов также можно использовать. Например, гомолог 2-норборнанона бицикло[2.2.2]октан-2-она можно получить гидрированием бицикло[2.2.2]октан-5-ен-2-она, который в свою очередь может быть получен по методикам, аналогично опубликованным Kozikowski and Schmiesing в J. Org. Chem. 48: 1000-1007 (1983), включенной в настоящее описание посредством ссылки касательно такой реакции. Аналогично, 7-оксабицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-он, полученный, как описано у Black and Vogel, в Helv. Chim. Acta 67: 1612 (1984), включенной в настоящее описание посредством ссылки касательно такой реакции, может быть подвергнут гидрированию, с получением 7-оксабицикло[2.2.1]гептан-2-она. Каждый из этих кетонов представляет собой потенциальное исходное вещество для преобразования, подобно представленным на схемах 1 и 2.

Спироциклoпропановую функциональную группу можно установить с использованием реакции Симмонса-Смита и подобных реакций. Таким образом, взаимодействием 3-мителен-2-норборнанона с дийодметаном в присутствии пары цинк-медь получают спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропанол]-3-он, который затем можно преобразовать в соединения по настоящему изобретению с применением описанных выше реакций. Определенные соединения, содержащие спироциклопропаны, известны в литературе, а также служат в качестве начальной точки синтеза соединений по настоящему изобретению. См., например, статью Gream and Pincombe, Aust. J. Chem, 27: 543-585 (1974), включенную в настоящее описание посредством ссылки касательно такой реакции.

Вторичные амины, такие как соединения IV и V, можно преобразовать в третичные амины с промежуточным образованием амидов и карбаматов. Таким образом, последовательной обработкой таких соединений ди-трет-бутилдикарбонатом и алюмогидридом лития получают соответствующий третичный N-метиламин.

Схема I

Схема II

Также возможно введение конкретных радиоактивных изотопов. Например, восстановлением амидов и карбаматов алюмодейтеридом лития или алюмититридом лития в качестве восстановителей можно получить N-тридейтерометиламины или N-тритритиометиламины. Альтернативно, из генерации амида или карбамата, в которой карбонильный углерод представляет собой атом ¹¹C, ¹³C или ¹⁴C, с последующим восстановлением алюмогидридом лития получают амин со встроенным атомом ¹¹C, ¹³C или ¹⁴C, соответственно. При получении соединений, которые необходимо использовать в диагностике (например, в качестве средств визуализации) или при исследованиях функций и метаболизма, часто желательно введение конкретных радиоактивных изотопов.

III. Фармацевтические композиции

Хотя возможно введение соединения по настоящему изобретению в форме совокупного активного химического вещества, предпочтительно вводить соединение в форме фармацевтической композиции или состава. Таким образом, один аспект настоящего изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим одно или более соединений формулы I и/или их фармацевтически приемлемые соли и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов. Другой аспект изобретения относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему смешивание одного или более соединений формулы I и/или их фармацевтически приемлемых солей с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами.

Способ, которым вводится соединение по настоящему изобретению, может быть различным. Соединение по настоящему изобретению предпочтительно вводят перорально. Предпочтительные фармацевтические композиции для перорального введения включают таблетки, капсулы, каплеты, сиропы, растворы и суспензии. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть предоставлены в дозированных формах с модифицированным высвобождением, таким как составы таблеток и капсул с замедленным высвобождением.

Фармацевтические композиции также можно вводить посредством инъекции, а именно: внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, внутриартериально, интратекально и интрацеребровентрикулярно. Внутривенное введение является предпочтительным способом инъекции. Подходящие носители для инъекции хорошо известны специалистам в данной области и включают 5% растворы декстрозы, физиологический раствор и забуференный фосфатном солевой раствор.

Составы также можно вводить другими способами, например, ректальным введением. Пригодные для ректального введения составы, такие как суппозитории, хорошо известны специалистам в данной области. Соединения также можно вводить посредством ингаляции, например, в форме аэрозоля; местно, например, в форме лосьона; трансдермально, например, с использованием трансдермального пластыря (например, с применением коммерчески доступной технологии от Novartis and Alza Corporation), посредством порошковой инъекции или посредством буккального, сублингвального или интраназального всасывания.

Фармацевтические композиции можно формулировать в единичной дозированной форме или в форме многократных или субединичных доз.

Введение описываемых в настоящем описании фармацевтических композиций может быть периодическим или поэтапным, непрерывным, постоянным или контролируемым путем. Фармацевтические композиции можно вводить теплокровному животному, например, млекопитающему, такому как мышь, крыса, кошка, кролик, собака, свинья, корова или обезьяна, но предпочтительно вводить человеку. Кроме того, время суток и число раз в сутки введения фармацевтической композиции можно изменять.

Соединения по настоящему изобретению можно использовать при лечении ряда нарушений и состояний, и, по существу, их можно использовать в комбинации с рядом других подходящих терапевтических средств, пригодных для лечения или профилактики таких нарушений или состояний. Таким образом, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к введению соединения по настоящему изобретению в комбинации с другими терапевтическими соединениями. Например, соединение по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими лигандами NNR (такими как варениклин), аллостерическими модуляторами NNR, антиоксидантами (такими как средства, улавливающие свободные радикалы), антибактериальными средствами (такими как пенициллиновые антибиотики), противовирусными средствами (такими как аналоги нуклеозидов, как зидовудин и ацикловир), антикоагулянтами (такими как варфарин), противовоспалительными средствами (такими как NSAID), антипиретиками, анальгетиками, анестетиками (такими как используемые в хирургии), ингибиторами ацетилхолинэстеразы (такими как донепезил и галантамин), антипсихотическими средствами (такими как галоперидол, клозапин, оланзапин и кветиапин), иммунодепрессантами (такими как циклоспорин и метотрексат), нейропротективными средствами, стероидами (такими как стероидные гормоны), кортикостероидами (такими как дексаметазон, преднизон и гидрокортизон), витаминами, минералами, нутрицевтиками, антидепрессантами (такими как имипрамин, флуоксетин, пароксетин, экситалопрам, сертралин, венлафаксин и дулоксетин), анксиолитиками (такими как алпразолам и буспирон), противосудорожными средствами (такими как фенитоин и габапентин), сосудорасширяющими средствами (такими как празозин и силденафил), стабилизаторами настроения (такими как вальпроат и арипипразол), противоопухолевыми средствами (такими как антипролиферативные), антигипертензивными средствами (такими как атенолол, клонидин, амлопидин, верапамил и олмесартан), слабительными средствами, размягчителями стула, диуретиками (такими как фуросемид), антиспазматическими средствами (такими как дицикломин), антидискинетическими средствами и противоязвенными лекарственными средствами (такими как эзомерпазол). Такие комбинации фармацевтически активных средств можно вводить совместно или раздельно, и введение можно проводить одновременно или последовательно в любом порядке при раздельном введении. Количество соединений или средств и относительные сроки введения выбирают для получения желаемого терапевтического эффекта. Введение соединения по настоящему изобретению с другими лекарственными средствами можно проводить в комбинации сопутствующим введением (1) одной фармацевтической композиции, содержащей оба соединения или (2) отдельных фармацевтических композиций, где каждая содержит одно соединение. Альтернативно, комбинацию соединений можно вводить раздельно последовательным способом, где одно лекарственное средство вводят первым и другое вторым. Такое последовательное введение можно быть близким по времени или отдаленным по времени.

Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинированному лечение, включающему введение индивидууму терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по настоящему изобретению и одну или более других терапий, включая химиотерапию, лучевую терапию, генотерапию или иммунотерапию.

IV. Способ применения фармацевтических композиций

Соединения по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или лечения различных состояний или нарушений, для которых предложены другие типы никотиновых соединений или показана их пригодность в качестве терапевтических средств, таких как нарушения ЦНС, воспаление, воспалительный ответ, ассоциированный с бактериальной и/или вирусной инфекцией, боль, метаболический синдром, аутоиммунные нарушения, зависимости, ожирение или другие нарушения, описанные более подробно в настоящем описании. Такое соединение также можно использовать в качестве диагностического средства (in vitro и in vivo). Такие терапевтические и другие способы описаны, например, в перечисленных выше в настоящем описании ссылках, включая Williams et al., Drug News Perspec. 7(4): 205 (1994), Americ et al., CNS Drug Rev. 1(1): 1-26 (1995), Americ et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 5(1): 79-100 (1996), Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1413 (1998), Lippiello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1422 (1996), Damaj et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 390 (1999), Chiari et al., Anesthesiology 91: 1:447 (1999), Lavand'homme and Eisenbach, Anesthesiology 91: 1455 (1999), Holladay et al., J. Med. Chem. 40(28): 4189-94 (1997), Bannon et al., Science 279: 77 (1998), PCT WO 94/08992, PCT WO 96/31475, PCT WO 98/40682 и патент США 5583140 на имя Bencherif et al., 5597919 на имя Dull et al., 5604231 на имя Smith et al. и 5852041 на имя Cosford et al.

Нарушения ЦНС

Соединения и их фармацевтические композиции пригодны для лечения или предотвращения ряда нарушений ЦНС, включая нейродегенеративные нарушения, психоневрологические нарушения, неврологические нарушения и зависимости. Соединения и их фармацевтические композиции можно применять при лечении или предотвращении когнитивного дефицита и когнитивных дисфункций, связанных с возрастом и других; нарушения внимания и деменции, включая вызванные возбудителями инфекций или нарушениями обмена веществ; для обеспечения нейропротекции; при лечении судорог и множественных церебральных инфарктов; при лечении нарушений настроения, компульсивного поведения и аддиктивного поведения; при обезболивании; для регуляции воспаления, такого как опосредованного цитокинами и ядерным фактором каппа B; при лечении воспалительных нарушений; для облегчения боли и при лечении инфекций, в качестве противоинфекционных средств для лечения бактериальных, грибковых и вирусных инфекций. Среди нарушений, заболеваний и состояний, для лечения или предотвращения которых можно использовать соединения и фармацевтические композиции по настоящему изобретению, выделяют: возрастное нарушение памяти (AAMI), умеренное когнитивное нарушение (MCI), связанное с возрастом снижение когнитивной функции (ARCD), пресенильную деменцию, болезнь Альцгеймера с ранним началом, сенильную деменцию, деменцию типа Альцгеймера, болезни Альцгеймера, когнитивное нарушение без деменции (CIND), деменцию с тельцами Леви, ассоциированную с ВИЧ деменцию, комплекс СПИД-деменция, сосудистую деменцию, синдром Дауна, травму головы, травматическое повреждение головного мозга (TBI), деменцию боксеров, болезнь Крейцфельда-Якоба и прионные болезни, инсульт, центральную ишемию, периферическую ишемию, расстройство дефицита внимания, синдром дефицита внимания с гиперактивностью, дислексию, шизофрению, шизофреноформное расстройство, шизоаффективное расстройство, когнитивную дисфункцию при шизофрении, когнитивный дефицит при шизофрении, паркинсонизм, включая болезнь Паркинсона, постэнцефалитический паркинсонизм, комплекс паркинсонизм-деменция острова Гуам, лобно-височную деменцию по типу болезни Паркинсона (FTDP), болезнь Пика, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Хантингтона, хорею Хантингтона, дискинезию, позднюю дискинезию, спастическую дискинезию, гиперкинезию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, прогрессирующий супрануклеарный парез, синдром усталых ног, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь мотонейронов (MND), множественную системную атрофию (MSA), кортико-базальную дегенерацию, синдром Гийена-Барре (GBS) и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (CIDP), эпилепсию, аутосомно-доминантную ночную лобную эпилепсию, манию, тревожность, депрессию, включая большое депрессивное расстройство (MDD), предменструальную дисфорию, панические расстройства, булимию, анорексию, нарколепсию, избыточную дневную сонливость, биполярные расстройства, генерализованное тревожное расстройство, обсессивно-компульсивное расстройство, приступы ярости, расстройство поведения, вызывающее оппозиционное расстройство, синдром Туретта, аутизм, наркотическую и алкогольную зависимость, табакозависимость и, таким образом, пригодно в качестве средства для прекращения курения, компульсивное переедание и сексуальную дисфункцию.

Когнитивные нарушения или дисфункции могут быть ассоциированы с психиатрическими расстройствами или состояниями, такими как шизофрения и другие психотические расстройства, включая, но, не ограничиваясь ими, психотическое расстройство, шизофреноформное расстройство, шизоаффективное расстройство, бредовое расстройство, кратковременные психические расстройства, индуцированное психотическое расстройство и психотические расстройства, обусловленные общим медицинским состоянием, деменции и другие когнитивные нарушения, включая, но, не ограничиваясь ими, умеренное когнитивное нарушение, пресенильную деменцию, болезнь Альцгеймера, сенильную деменцию, деменцию типа Альцгеймера, связанные с возрастом нарушение памяти, деменцию с тельцами Леви, сосудистую деменцию, комплекс СПИД-деменция, дислексию, паркинсонизм, включая болезнь Паркинсона, когнитивное нарушение и деменцию при болезни Паркинсона, когнитивное нарушение при рассеянном склерозе, когнитивное нарушение, вызванное травматическим повреждением головного мозга, деменции, обусловленные общим медицинским состоянием, тревожные расстройства, включая, но, не ограничиваясь ими, паническое расстройство без агорафобии, паническое расстройство с агорафобией, агорафобию без панического расстройства в истории болезни, специфическую фобию, социофобию, обсессивно-компульсивное расстройство, посттравматический стресс, острое стрессовое расстройство, генерализованное тревожное расстройство и генерализованное тревожное расстройство, обусловленное общим медицинским состоянием, нарушения настроения, включая, но, не ограничиваясь ими, большое депрессивное расстройство, дисмитию, биполярную депрессию, биполярную манию, биполярное нарушение I, депрессию, ассоциированную с манией, депрессивные и другие эпизоды, биполярное нарушение II, циклотимическое расстройство и нарушения настроения, обусловленные соматическими заболеваниями, расстройства сна, включая, но, не ограничиваясь ими, диссомнии, первичную бессонницу, первичную гиперсомнию, нарколепсию, нарушения сна, кошмарные сновидения, нарушение сна, связанное со страхом, и лунатизм, задержку умственного развития, расстройства обучения, нарушения двигательных навыков, коммуникативные расстройства, первазивные расстройства развития, дизраптивные расстройства поведения и дефицитарные расстройства внимания, синдром дефицита внимания, синдром дефицита внимания с гиперактивностью, расстройства питания и пищевого поведения у детей младшего возраста, детского возраста или у взрослых, тиковые расстройства, нарушения обмена веществ, зависимости от веществ, включая, но, не ограничиваясь ими, наркотическую зависимость и токсикоманию, злоупотребление наркотиками, наркотическую интоксикацию, абстинентный синдром, расстройства, связанные со злоупотреблением алкоголя, связанные со злоупотреблением амфетамина или подобных амфетамину веществ, расстройства, связанные со злоупотреблением кофеина, расстройства, связанные со злоупотреблением марихуаны, расстройства, связанные со злоупотреблением кокаина, расстройства, связанные со злоупотреблением галлюциногенов, расстройства, связанные со злоупотреблением летучих препаратов, расстройства, связанные со злоупотреблением никотина, расстройства, связанные со злоупотреблением опиоидов, расстройства, связанные со злоупотреблением фенциклидина или подобных фенциклидину веществ, и расстройства, связанные со злоупотреблением седативных, снотворных средств или анксиолитиков, расстройства личности, включая, но, не ограничиваясь ими, обсессивно-компульсивное расстройство личности и расстройства побуждений.

Когнитивную функцию можно оценивать по валидизированной шкале оценки когнитивных способностей, такой как, например, вспомогательная шкала оценки когнитивных способностей шкалы оценки болезни Альцгеймера (ADAS-cog). Одно из измерений эффективности соединений по настоящему изобретению в улучшении познавательной способности может включать измерение величины изменения у пациента по такой шкале.

В отношении компульсивного и аддиктивного поведения соединения по настоящему изобретению можно использовать в качестве терапии никотиновой зависимости, включая в качестве средства для прекращения курения, и других нарушений головного мозга, связанных с удовольствием, таких как зависимости от веществ, включая алкогольную зависимость, зависимость от незаконных и прописанных лекарственных средств, расстройства пищевого поведения, включая ожирение, и поведенческие зависимости, такие как пристрастие к азартным играм или другие сходные поведенческие проявления зависимости.

Указанные выше состояния и нарушения подробно описаны, например, в American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Text Revision, Washington, DC, American Psychiatric Association, 2000. В этом справочнике также можно найти более подробную информацию о симптомах и диагностических признаках, ассоциированных с использованием веществ, злоупотреблением и зависимостью.

Воспаление

Известно, что нервная система, преимущественно блуждающий нерв, регулируют величину естественного иммунного ответа, ингибируя высвобождение фактора некроза опухоли (TNF) макрофагами. Этот физиологический механизм известен как "холинергический противовоспалительный путь" (см., например, Tracey, "The-Inflammatory Reflex", Nature 420: 853-9 (2002)). Избыточное воспаление и синтез фактора некроза опухоли являются причиной заболеваемости и даже смертности при ряде заболеваний. Эти заболевания включают, но не ограничиваются ими, эндотоксикоз, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, астму, атеросклероз, идиопатический легочный фиброз и воспалительное заболевание кишечника.

Воспалительные состояния, которые можно лечить или предотвращать введением описываемого в настоящем описании соединения, включают, но не ограничиваются ими, хроническое и острое воспаление, псориаз, эндотоксикоз, подагру, острую псевдоподагру острый подагрический артрит, артрит, ревматоидный артрит, остеоартрит, отторжение аллотрансплантата, хроническое отторжение трансплантата, астму, атеросклероз, повреждение легких, обусловленное монуклеарными фагоцитами, идиопатический легочный фиброз, атопический дерматит, хроническое обструктивное заболевание легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, острый грудной синдром, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, включая преобладание диареи IBS, болезнь Крона, язвы, язвенный колит, острый холангит, афтозный стоматит, кахексию, паучит, гломерулонефрит, волчаночный нефрит, тромбоз и реакцию трансплантат против хозяина.

Ассоциированный с бактериальной и/или вирусной инфекцией воспалительный ответ

Многие бактериальные и/или вирусные инфекции ассоциированы с побочными эффектами, вызванными образованием токсинов и естественной реакцией организма на бактерии или вирус и/или токсины. Как указано выше, реакция организма на инфекцию часто приводит к образованию существенного количества TNF и/или других цитокинов. Повышенная экспрессия этих цитокинов может вызывать значительное поражение, такое как септический шок (когда бактерии вызывают сепсис), эндотоксический шок, уросепсис, вирусная пневмония и синдром токсического шока.

Эти соединения также можно использовать в качестве вспомогательной терапии в комбинации с существующими препаратами для лечения бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, такими как антибиотики, противовирусные и противогрибковые средства. Также можно использовать антитоксины для связывания токсинов, образованных возбудителями инфекции, и для обеспечения прохождения связанных токсинов через организм, не вызывая воспалительного ответа. Примеры антитоксинов описаны, например, в патенте США 6310043 на имя Bundle et al. Другие эффективные против бактериальных и других токсинов средства могут быть эффективными, и их терапевтический эффект можно дополнить совместным введением с описываемыми в настоящем описании соединениями.

Боль

Соединения можно вводить для лечения и/или предотвращения боли, включая острую, невралгическую, воспалительную, нейропатическую и хроническую боль. Соединения можно использовать в сочетании с опиатами для снижения вероятности возникновения зависимости от опиатов (например, сберегающая морфин терапия). Анальгетическое действие описываемых в настоящем описании соединений можно продемонстрировать на моделях постоянной воспалительной боли и нейропатической боли, проведенных, как описано в опубликованной патентной заявке США № 20010056084 A1 (Allgeier et al.) (например, механическая гипералгезия на модели воспалительной боли у крысы с полным адъювантом Фрейнда, и механическая гипералгезия на модели нейропатической боли у мыши с частичным лигированием седативного нерва).

Анальгетический эффект подходит для лечения боли различного генезиса или этиологии, в частности для лечения воспалительной боли и ассоциированной гипералгезии, нейропатической боли и ассоциированной гипералгезии, хронической боли (например, сильной хронической боли, послеоперационной боли и боли, ассоциированной с различными состояниями, включая рак, ангину, почечную или печеночную колику, менструацию, мигрень и подагру). Воспалительная боль может быть различного генезиса, включая артрит и ревматоидное заболевание, теносиновит и васкулит. Нейропатическая боль включает невралгию тройничного нерва или герпесную невралгию, нейропатии, такие как нейропатическая боль при диабете, каузалгия, поясничная боль и синдромы деафферентации, такие как разрыв плечевого сцепления.

Неоваскуляризация

Ингибируя неоваскуляризации, например, введением антагонистов (или частичных агонистов при определенных дозированиях) никотиновых рецепторов можно лечить или предотвращать состояния, характеризующиеся нежелательной неоваскуляризацией или ангиогенезом. Такие состояния могут включать состояния, характеризующиеся воспалительным ангиогенезом и/или вызванным ишемией ангиогенезом. Также можно ингибировать ассоциированную с ростом опухоли неоваскуляризацию посредством введения таких описываемых в настоящем описании соединений, которые действуют в качестве антагонистов или частичных агонистов никотиновых рецепторов.

Избирательный антагонизм никотиновых рецепторов снижает ангиогенный ответ при воспалении, ишемии и неоплазии. Руководство в отношении подходящих систем животных моделей для оценки описываемых в настоящем описании соединений можно найти, например, у Heeschen C. et al., в "A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors", J. Clin. Invest. 110(4):527-36 (2002).

Конкретные виды опухолей, которые можно лечить применением описываемых в настоящем описании соединений, включают SCLC, NSCLC, рак яичников, рак поджелудочной железы, карциному молочной железы, карциному толстой кишки, карциному прямой кишки, карциному легких, карциному мезофаринкса, карциному гипофаринкса, карциному пищевода, карциному желудка, карциному поджелудочной железы, карциному печени, карциному желчного пузыря, карциному желчных протоков, карциному тонкого кишечника, карциному мочевыводящих путей, карциному почки, карциному мочевого пузыря, карциному уротелия, карциному женских половых путей, карциному шейки матки, карциному матки, карциному яичников, хориокарциному, гестационное трофобластическое заболевание, карциному мужских половых путей, карциному предстательной железы, карциному семенных пузырьков, карциному семенников, герминомы, карциному эндокринных желез, карциному щитовидной железы, карциному надпочечников, карциному гипофиза, карциному кожи, гемангиомы, меланомы, саркомы, саркому кости и мягких тканей, саркому Капоши, опухоли головного мозга, опухоли нервов, опухоли глаз, опухоли оболочек головного мозга, астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, Шванномы, менингиомы, солидные опухоли, обусловленные гемопоэтическими злокачественными новообразованиями (такими как лейкозы, хлоромы, плазмоцитомы и бляшки и опухоли грибовидного микоза и кожная T-клеточная лимфома/лейкоз) и солидные опухоли, обусловленные лимфомами.

Соединения также можно вводить в сочетании с другими формами лечения злокачественных опухолей, включая совместное введение с антибластомными противоопухолевыми средствами, такими как цисплатин, адриамицин, дауномицин и т.п., и/или средствами, ингибирующими VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), такими как известные в данной области.

Соединения могут быть введены таким способом, что они нацелены на участок локализации опухоли. Например, соединения можно вводить в микросферах, микрочастицах или липосомах, конъюгированных с различными антителами, которые направляют микрочастицы к опухоли. Дополнительно, соединения можно помещать в микросферы, микрочастицы или липосомы, которым придают соответствующий размер для прохождения через артерии и вены, но депонирования в капиллярных слоях, окружающих опухоли, и локального введения соединения в опухоль. Такие средства доставки лекарственных средств известны в данной области.

Другие нарушения

В дополнение к лечению нарушений ЦНС, воспаления, неоваскуляризации и боли соединения по настоящему изобретению также можно использовать для предотвращения и лечения других определенных состояний, заболеваний и нарушений, в которых NNR играют некоторую роль. Примеры включают аутоиммунные нарушения, такие как волчанка, ассоциированные с высвобождением цитокинов нарушения, кахексию на фоне инфекции (например, которая возникает при СПИД, СПИД-ассоциированном комплексе и неоплазиях), ожирение, пемфигус, недержание мочи, гиперактивность мочевого пузыря (OAB), диарею, запор, заболевания сетчатки глаза, инфекционные заболевания, миастению, синдром Итона-Ламберта, гипертензию, преэклампсию, остеопороз, вазоконстрикцию, вазодилатацию, аритмии сердца, диабет типа I, диабет типа II, булимию, анорексию и сексуальную дисфункцию, а также такие показания, как описано в опубликованной заявке PCT WO 98/25819. Соединения по настоящему изобретению также можно вводить для лечения судорог, таких, которые являются клиническим проявлением эпилепсии, и для лечения состояний, таких как сифилис и болезнь Крейтцфельдта-Якоба.

Соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения бактериальных инфекций и кожных состояний, таких как листовидная пузырчатка, обыкновенная пузырчатка и другие нарушения, такие как акантолиз, где присутствует аутоиммунный ответ с высоким титром антител NNR ганглиозного подтипа. При этих нарушениях и при других аутоиммунных заболеваниях, таких как миастения, фрагмент Fab антитела связывается с рецептором NNR (сшивая 2 рецептора), что индуцирует интернализацию и разрушение.

Применение в диагностике

Соединения можно применять в диагностических композициях, таких как зонды, в частности, когда их модифицируют для введения подходящих меток. Для этой цели соединения по настоящему изобретению наиболее предпочтительно метить радиоактивным изотопом ¹¹C.

Введенные соединения можно детектировать посредством позитронно-эмиссионной томографии (PET). Для визуализации выбранного подтипа рецептора при ненасыщенных концентрациях желательна высокая специфическая активность. Вводимые дозы, как правило, ниже предела токсичности и обеспечивают высококонтрастные изображения. Предположительно возможно вводить соединения на нетоксических уровнях. Определение дозы проводят способом, известным специалисту в области получения изображений с радиоактивной меткой. См., например, патент США 5989144 на имя London et al.

Соединения можно вводить известными способами. См., например, патент США 5969144 на имя London et al., как указано выше. Соединения можно вводить в состав композиций, которые содержат другие ингредиенты, такие как типы ингредиентов, которые пригодны для формулирования диагностической композиции. Наиболее предпочтительно, соединения, пригодные в соответствии с осуществлением настоящего изобретения, используют в формах высокой степени очистки. См., патент США 5853696 на имя Elmalch et al.

После введения соединений индивидууму (например, человеку) наличие соединения внутри индивидуума можно визуализировать и количественно определить соответствующими способами для регистрации наличия, количественного определения и функциональных характеристик. В дополнение к ведению людям соединения также можно вводить животным, таким как мыши, крысы, собаки и обезьяны. Получение изображений SPECT и PET можно проводить любым подходящим способом и с использованием любого подходящего прибора. Для информации о конкретных способах получения изображения см. Villemagne et al.,. в Arnerie et al. (Eds.) Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic Opportunities, 235-250 (1998) и в патенте США 5853696 на имя Elmalch et al., каждый включен в настоящее описание посредством ссылки.

V. Примеры синтеза

Пример 1. Экзо-N_,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амин

К раствору 2-норборнанона (норкамфора) (16,0 г, 145 ммоль) и 1,3-дибромпропана (203 ммоль, 20,7 мл, 41,1 г) в простом диэтиловом эфире (450 мл) добавляли амид натрия (363 ммоль, 14,8 г) и перемешивали смесь при кипячении с обратным холодильником в течение 24 часов. Смесь выливали в 200 мл ледяной воды и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали 200 мл простого эфира. Объединенные экстракты простого эфира концентрировали и перегоняли жидкий остаток при 60-100°C при 10-20 мм рт. ст. вакуума, с получением 14 г неочищенного продукта. Его растворяли в 150 мл гексана и перемешивали с раствором перманганата калия (12,0 г, 75,9 ммоль) в воде (150 мл) в течение 5 часов. Двухфазную смесь фильтровали через слой диатомовой земли, которую затем промывали гексаном (100 мл). Гексановый слой отделяли и экстрагировали водный слой 600 мл гексана. Гексановые слои объединяли, концентрировали и очищали на колонке с силикагелем, элюируя 10-40% простым эфиром в гексане, с получением спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-она (соединение II на схеме 1) (6,1 г, 28% выхода) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 2,55-2,49 (м, 2H), 2,18-2,08 (м, 2H), 2,00-1,58 (м, 7H), 1,49-1,38 (м, 3H); ЖХМС (m/z): 151 (M+1).

К суспензии (метил)трифенилфосфонийбромида (49,9 ммоль, 18,2 г) в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) (100 мл) при -78°C добавляли н-бутиллитий (48,5 ммоль, 18,6 мл 2,5М раствора в гексане). Смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°C. К полученной смеси добавляли спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-он (5,00 г, 33,3 ммоль). Полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 20 часов. Добавляли гексан (300 мл) и фильтровали смесь. Фильтраты концентрировали и остаток очищали на колонке с 80 г силикагеля, элюируя гексаном, с получением 3-метиленспиро[бицикло[2.2.1]гептан-3-она (соединение III на схеме 1) (3,7 г, 75%) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 4,82 (с, 2H), 2,63 (ушир.с, 1H), 2,22 (ушир.с, 1H), 2,05-1,78 (м, 6H), 1,63-1,52 (м, 1H), 1,48-1,34 (м, 3H), 1,21-1,12 (м, 2H).

К суспензии 3-метиленспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутана] (2,10 г, 14,2 ммоль) и тиоцианата калия (14,2 ммоль, 1,39 г) медленно добавляли раствор серной кислоты (1,40 г, 14,3 ммоль) в воде (0,52 мл) в течение 15 мин при 50°C, перемешивали раствор при 85°C в течение 5,5 часов. Раствор охлаждали до температуры окружающей среды, разбавляли толуолом (20 мл) и последовательно промывали водой (20 мл) и насыщенным водным бикарбонатом натрия (10 мл). Толуольный слой собирали, сушили в избытке безводного сульфата натрия и фильтровали. К фильтрату добавляли натрийбис(метоксиэтокси)алюминийгидрид (28 ммоль, 7,9 мл 65-70% раствора в толуоле) и полученную смесь перемешивали при 85°C в течение 2 часов. Смесь охлаждали до 0°C и смесь 3н. водного гидроксида натрия (3 мл) и 5% гипохлорита натрия (15 мл) медленно по каплям добавляли через определенные промежутки времени. Толуольный слой отделяли и промывали водой (30 мл), затем экстрагировали толуольный слой 1н. водной хлористоводородной кислотой (2×10 мл). Удаляли толуольный слой, и объединенные экстракты хлористоводородной кислоты делали основными добавлением 10% водного гидроксида натрия (до pH 10). Основную водную смесь экстрагировали простым эфиром (2×30 мл). Экстракты простого эфира собирали, концентрировали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 0-40% CMA (хлороформ:метанол:30% водный аммиак, 9:1:0,1) в хлороформе, с получением экзо-N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,38 г, 15% выхода) (соединение IV на схеме 1) в виде масла. Масло растворяли в 5 мл дихлорметана, охлаждали на ледяной бане и объединяли с 2 мл 6M водной хлористоводородной кислоты. Смесь концентрировали и сушили в вакууме, с получением гидрохлоридной соли.

¹H ЯМР (D₂O, 400 МГц): δ 2,41 (с, 3H), 2,24-2,18 (м, 2H), 1,98-1,90 (м, 1H), 1,82-1,74 (м, 1H), 1,67-1,58 (м, 2H), 1,52-1,11 (м, 8H), 0,95 (с, 3H); ЖХМС (m/z): 180 (M+1).

Экзостереохимию определяли ЯМР.

Пример 2. Разделение хиральной хроматографией экзо-N_,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина

Экзо-N_,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амин (2,0 г) растворяли в 20 мл ацетонитрила и разделяли в 0,2 мл впрысков на хиральной колонке (Chiral Pak AD-H, 5 микрометров, 250×20 см) с использованием 0,2% диэтиламина в смеси ацетонитрил/изопропанол (95:5), со скоростью потока 10 мл/мин. Содержащие пик 1 (начальное элюирование) и пик 2 (позднее элюирование) фракции раздельно концентрировали. Два остатка растворяли по отдельности в 10 мл дихлорметана, обрабатывали 2 мл 6н. водной хлористоводородной кислоты и концентрировали досуха. Масса продуктов гидрохлоридных солей составляла 0,74 г (пик 1) и 0,48 г (пик 2), соответственно.

Пример 3. N_,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопентан]-3-амин

К раствору 2-норборнанона (25,0 г, 227 ммоль) и 1,4-дибромбутана (68,0 г, 317 ммоль) в простом диэтиловом эфире (700 мл) добавляли амид натрия (23,1 г, 567 ммоль). Полученные смеси нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 24 часов, охлаждали и выливали в 200 мл ледяной воды. Органический слой собирали и экстрагировали водный слой 200 мл простого диэтилового эфира. Объединенные экстракты простого диэтилового эфира концентрировали, и остаток перегоняли при 65-80°C при 7-15 мм рт. ст., с получением 19 г неочищенного продукта. Его растворяли в гексане (500 мл) и перемешивали с водным перманганатом калия (30 г, 0,19 моль, в 500 мл) в течение 5 часов. Смесь фильтровали и собирали гексановый слой. Водный слой экстрагировали 600 мл гексана. Объединенные гексановые слои концентрировали и очищали остаток на колонке с силикагелем, элюируя 5-15% этилацетатом в гексане, с получением спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопентан]-3-она (12,6 г, 33,8%) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 2,56 (д, J=5,1 Гц, 1H), 2,24 (ушир.с, 1H), 1,44-1,88 (м, 14H); ЖХМС (m/z): 165 (M+1).

К суспензии (метил)трифенилфосфонийбромида (17,6 г, 48,4 ммоль) в ТГФ (100 мл) при -78°C добавляли н-бутиллитий (18,1 мл 2,5М раствора в ТГФ, 45 ммоль) и перемешивали смесь 30 минут. К полученной смеси добавляли спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопентан-3-он (5,30 г, 32,3 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Гексан (200 мл) добавляли и фильтровали смесь. Фильтраты концентрировали и очищали остаток на колонке с 80 г силикагеля, элюируя гексаном, с получением 3-метиленспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопентана] (4,80 г, 91 7%) в виде масла.

Серную кислоту (1,61 мл, 2,96 г, 30,2 ммоль) медленно добавляли к суспензии 3-метиленспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1-циклопентана] (4,80 г, 29,6 ммоль) и тиоцианата калия (2,96 г, 30,2 ммоль) при 50°C. Затем реакционную смесь перемешивали при 85°C в течение 5,5 часов, охлаждали до температуры окружающей среды, разбавляли толуолом (30 мл) и промывали водой (20 мл) с последующим промыванием насыщенным водным бикарбонатом натрия (10 мл). Толуольный слой сушили в избытке безводного сульфата натрия и фильтровали. К фильтрату добавляли натрийбис(метоксиэтокси)алюминийгидрид (40% раствор в толуоле, 2 эквивалента) и перемешивали реакционную смесь при 85°C в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и медленно добавляли (по каплям через определенные промежутки времени) 3н. раствор водного гидроксида натрия (20 мл) в 5% водном гипохлорите натрия (35 мл). Толуольный слой отделяли и промывали водой (30 мл). Затем толуольный слой экстрагировали 1н. водной хлористоводородной кислотой (2×10 мл) и отбрасывали. Слой водной хлористоводородной кислоты делали основным (до pH 10) добавлением 10% водного гидроксида натрия и экстрагировали простым диэтиловым эфиром. Экстракты простого диэтилового эфира концентрировали и очищали остаток колоночной хроматографией на силикагеле с использованием 0-40% CMA (хлороформ:метанол:30% водный аммиак, 9:1:0,1) в хлороформе, с получением N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2_,1'-циклопентан]-3-амина (1,2 г, 53%) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 2,28 (с, 3H), 2,24 (ушир.с, 1H), 1,84-1,76 (м, 2H), 1,73-1,68 (м, 1H), 1,62-1,52 (м, 4H), 1,48-1,24 (м, 7H), 1,09-1,05 (м, 1H), 1,04 (с, 3H); ЖХМС (m/z): 194 (M+1).

Пример 4. Общий способ получения N-замещенного спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-аминов

Определенные N-замещенные спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амины могут быть получены восстановительным аминированием спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1-циклобутан]-3-она. Следующая методика, использующая метиламин, и получение N- трифторацетата метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина являются иллюстративными. Восстановительное аминирование с использованием диметиламина, азетидина и пирролидина проводили аналогично.

К раствору спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-она (0,15 г, 1,0 ммоль) и метиламина (4,0 мл 2,0М раствора в ТГФ, 8,0 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (10 мл) добавляли уксусную кислоту (0,2 мл) и триацетоксиборогидрид натрия (0,85 г, 4,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 48 часов, разбавляли дихлорметаном (10 мл), промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл) и концентрировали. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя смесью 0,05% муравьиной кислоты в воде и 0,05% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Отобранные фракции концентрировали и растворяли остаток в метаноле (2 мл). Трифторуксусную кислоту (0,1 мл) добавляли, и смесь концентрировали и сушили в вакууме, с получением трифторацетата N-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,088 г) в виде смолы.

¹H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц): δ 3,06-3,02 (м, 1H), 2,568 (с, 3H), 2,54 (ушир.с, 1H), 2,34 (ушир.с, 1H), 2,02-1,83 (м, 6H), 1,56-1,42 (м, 5H), 1,26-1,32 (м, 1H); ЖХМС (m/z): 166 (M+1).

Пример 5. Гидрохлорид (1S,3R,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина и гидрохлорид (1S,3S,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина

Следующее химическое взаимодействие с использованием D-камфоры в качестве исходного вещества повторяли с использованием L-камфоры в качестве исходного вещества, с получением продуктов, являющихся энантиомерами описанных в настоящем описании продуктов.

Смесь D(+)-камфоры (4,40 г, 28,9 ммоль) и амида натрия (2,50 г, 61,5 ммоль) в толуоле (100 мл) перемешивали при 100°C в течение 30 минут. Добавляли раствор 1,3-дибромпропана (31,8 ммоль, 3,24 мл, 6,42 г) в толуоле (20 мл) и нагревали реакционную смесь при кипячении с обратным холодильником в течение 3 часов. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, промывали водой (100 мл), сушили в избытке безводного сульфата натрия и концентрировали, остаток растворяли в 5% метаноле в дихлорметане (80 мл) и охлаждали до -78°C. Пропускали озон через раствор до установления голубой окраски (~10 минут). Затем добавляли диметилсульфид (2 мл) и реакционную смесь медленно нагревали до температуры окружающей среды. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток на колонке с силикагелем (40 г), элюировали 0-20% простым эфиром в гексане, с получением (1S,4R)-4,7,7-триметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-она (1,66 г, 29,0% выхода) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 2,26 (м, 1H), 2,10-1,97 (м, 5H), 1,85-1,66 (м, 2H), 1,82-1,53 (м, 1H), 1,47-1,40 (м, 1H), 1,28-1,19 (м, 1H), 0,94 (с, 3H), 0,88 (с, 3H), 0,75 (с, 3B); ЖХМС (m/z): 193 (M+1).

Смесь (1S,4R)-4,7,7-триметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-она (1,60 г, 8,32 ммоль) и формамида (10 мл) в муравьиной кислоте (7 мл) перемешивали при 175°C в течение 72 часов. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, выливали в 200 мл ледяной воды и экстрагировали простом эфиром (2×50 мл). Объединенные экстракты простого эфира промывали водой (40 мл), сушили в избытке безводного сульфата натрия и концентрировали, с получением N-(4,7,7-триметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-ил)формамида (1,55 г, 84,2% выхода) в виде смолы.

К раствору N-(4,7,7-триметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-ил)формамида (1,50 г, 8,78 ммоль) в ТГФ (40 мл) при 0°C медленно добавляли алюмогидрид лития (27,1 ммоль, 27,1 мл 1,0М раствора в ТГФ). После добавления реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 48 часов. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и останавливали добавлением частями твердого декагидрата сульфата натрия (10 г). После перемешивания в течение 1 часа полученную смесь фильтровали и концентрировали фильтрат. Остаток очищали на колонке с 40 г силикагеля с использованием в качестве элюента 0-100% CMA (хлороформ:метанол:30% водный аммиак; 9:1:0,1) в хлороформе, с получением экзо-аминопродукта (1S,3R,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,49 г, 35% выхода) и эндо-аминопродукта (1S,3S,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,30 г, 21% выхода), оба в виде масла. Два продукта преобразовывали в их гидрохлоридные соли, растворяя каждый в 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, концентрируя и подвергая образцы сушке в вакууме.

¹H ЯМР гидрохлорида экзо-(1S,3R,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (D₂O, 400 МГц): δ 2,80 (с, 3H), 2,72 (ушир.с, 1H), 2,22-1,91 (м, 4H), 1,84-1,72 (м, 3H), 1,54-1,45 (м, 2H), 1,38-1,31 (м, 1H). 1,10-1,01 (м, 1H), 0,87 (с, 3H), 0,75 (с, 3H), 0,72 (с, 3H); ЖХМС (m/z): 20:8 (M+1).

¹H ЯМР гидрохлорида эндо-(1S,3R,4R)-N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (D₂O, 400 МГц): δ 3,12 (ушир.с, 1H), 2,79 (с, 3H), 2,26-2,16 (м, 1H), 2,01-1,85 (м, 3H), 1,78-1,69 (м, 3H), 1,60-1,51 (м, 1H), 1,36-1,24 (м, 2H), 1,08-1,00 (м, 1H), 0,85 (с, 3H), 0,78 (с, 3H), 0,75 (с, 3H); ЖХМС (m/z): 208 (M+1).

Пример 6. Общий способ преобразования вторичных аминов в третичные N-метиламины

Определенные третичные N-метиламины могут быть получены восстановительным аминированием соответствующих вторичных аминов. Следующая методика, использующая формальдегид, и получение гидрохлорида экзо-(1S,3R,4R)-N,N,4,7,7-пентаметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан-3-амина являются иллюстративными. Аналогичные реакции N-метилирования проводили с рядом вторичных аминов.

К раствору (1S,3R,4R)-N,N,4,7,7-тетраметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан-3-амина (0,10 г, 0,48 ммоль) и 30% водного формальдегида (1 мл) в метаноле (4 мл) добавляли триацетоксиборогидрид натрия (0,31 г, 1,4 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Реакцию гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (30 мл) и экстрагировали дихлорметаном (2×30 мл). Муравьиную кислоту (0,2 мл) добавляли к объединенным органическим экстрактам и концентрировали их на роторном испарителе. Остаток очищали препаративной ЖХМС с использованием смеси 0,05% муравьиной кислоты в воде и 0,05% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Отобранные фракции объединяли, делали основными (pH 9) добавлением 10% водного гидроксида натрия и экстрагировали дихлорметаном (2×30 мл). Объединенные органические экстракты обрабатывали 0,5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Полученную смесь концентрировали и сушили в вакууме, с получением гидрохлорида (1S,3R,4R)-N,N,4,7,7-пентаметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,06 г) в виде белого твердого вещества.

¹H ЯМР (D₂O, 400 МГц): δ 3,27 (с, 3H), 3,19 (с, 3H), 3,10 (с, 1H), 2,55-2,28 (м, 4H), 2,18-1,97 (м, 3H), 1,80-1,60 (м, 3H), 1,45-1,36 (м, 1H), 1,28 (с, 3H), 1,02 (с, 3H), 1,01 (с, 3H); ЖХМС (m/z): 222 (M+1).

Пример 7. Трифторацетат N-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-амина

К взвеси пары цинк-медь (9,1 г, 57 ммоль) в простом диэтиловом эфире (75 мл) добавляли чистый 3-метилен-2-норборнанон (8,9 г, 73 ммоль), и затем чистый дийодметан (8,30 мл, 103 ммоль). Полученную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 6 часов. Добавляли вторую порцию пары цинк-медь (10 г) и продолжали кипячение с обратным холодильником дополнительно в течение 16 часов. Затем реакцию гасили водой (200 мл) и разбавляли простым диэтиловым эфиром (200 мл). Двухфазную смесь фильтровали через слой диатомовой земли. Органический слой разделяли, промывали 10% водной хлористоводородной кислотой (2×50 мл), сушили в избытке безводного сульфата магния и концентрировали. Остаток пропускали через колонку с силикагелем, элюируя дихлорметаном. Отобранные фракции концентрировали и остаток подвергали перегонке в дистилляторе типа "из колбы в колбу" в вакууме при 3 мм рт. ст., с получением спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-она (1,6 г) в виде масла.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 2,71-2,69 (м, 1H), 2,06 (ушир.с, 1H), 2,00-1,72 (м, 3H), 1,66-1,57 (м, 3H), 1,09-1,00 (м, 2H), 0,91-0,89 (м, 1H), 0,80-0,75 (м, 1H).

К раствору спиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-она (0,13 г, 0,96 ммоль) и метиламина (4,0 мл 2,0М раствора в ТГФ, 8,0 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (10 мл) добавляли уксусную кислоту (0,2 мл) и триацетоксиборогидрид натрия (0,85 г 4,0 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при температуре окружающей среды в течение 48 часов. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (10 мл), промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл) и концентрировали. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ, элюируя смесями 0,05% муравьиной кислоты в воде и 0,05% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Отобранные фракции концентрировали и растворяли остаток в метаноле (2 мл). Добавляли трифторуксусную кислоту (0,1 мл), и смесь концентрировали и сушили в вакууме, с получением трифторацетата N-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклобутан]-3-амина (0,005 г) в виде смолы.

¹H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц): δ 2,76 (ушир.с, 1H), 2,59 (с, 3H), 1,85-1,82 (м, 1H), 1,69-1,55 (м, 6H), 1,34-1,28 (м, 1H), 0,83-0,78 (м, 1H), 0,67-0,62 (м, 1H), 0,58-0,50 (м, 2H); ЖХМС (m/z): 152 (M+1).

Пример 8. Гидрохлорид N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-амина

К раствору (3-метилспиро[бицикло[2.2.1]гепт[5]ен-2,1'-циклопропан]-3-ил)метанола (9,4 г, 57 ммоль), полученному, как описано в статье Gream and Pincombe, Aust. J. Chem. 27: 543-565 (1974), включенной в настоящее описание посредством ссылки касательно такого получения, в метаноле (20 мл) добавляли 0,8 г 10% Pd/C (влажный) в атмосфере азота. Атмосферу азота заменяли водородом (50 фунт/дюйм²), и смесь перемешивали в течение 4 часов при температуре окружающей среды. Затем реакционную смесь фильтровали через слой диатомовой земли, которую затем промывали метанолом. Фильтраты концентрировали, с получением 9,80 г (3-метиспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-ил)метанола в виде белого твердого вещества (99%).

К перемешиваемому раствору триоксида хрома (8,0 г, 76 ммоль) в воде (30 мл), охлажденному на ледяной бане, аккуратно добавляли 96% серную кислоту (6,9 мл, 120 ммоль). Продолжая охлаждать и перемешивать окисляющий раствор на ледяной бане, добавляли раствор (3-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-ил)метанола (9,5 г, 57 ммоль) в ацетоне (115 мл) в течение периода 20 минут. После добавления, реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при нагревании до температуры окружающей среды. Реакционную смесь разбавляли водой (45 мл) и этилацетатом (200 мл). Медленно добавляли порошок бисульфита натрия до исчезновения коричневой окраски и становления водного слоя голубым. Затем фазы разделяли и промывали водный слой этилацетатом (2×100 мл). Органические слои объединяли и сушили в избытке безводного сульфата магния. Осушающее вещество удаляли фильтрованием и концентрировали фильтраты, с получением зеленого масла. Масло очищали колоночной хроматографией на силикагеле (200 г) с использованием градиента 0-50% этилацетата в гексане. Отобранные фракции объединяли и концентрировали, с получением 8,0 г 3-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-карбоновой кислоты в виде белого твердого вещества (58%).

К перемешиваемому раствору 3-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-карбоновой кислоты (2,8 г, 15 ммоль) и триэтиламина (2,6 мл, 18 ммоль) в толуоле (70 мл), охлажденному на ледяной бане, добавляли дифенилфосфонийазид (3,5 мл, 16 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 90°C и перемешивали в течение 2,5 часов. Затем к реакционной смеси добавляли бензиловый спирт (1,7 мл, 16 ммоль) и перемешивали смесь дополнительно в течение 16 часов при 90°C. Реакционную смесь охлаждали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (60 г) с использованием градиента 0-15% этилацетата в гексане. Отобранные фракции объединяли и концентрировали, с получением 1,6 г смеси веществ, содержащей 3-изоцианато-3-метилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан] и соответствующий бензилкарбамат, в виде белого твердого вещества. Полученную смесь растворяли в безводном ТГФ (16 мл) и охлаждали на ледяной бане. Медленно добавляли алюмогидрид лития (8,5 мл 2,0М в ТГФ, 17 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 55°C в течение 3 часов. Затем реакционную смесь охлаждали на ледяной бане и разбавляли простым диэтиловым эфиром (20 мл). Реакцию гасили, аккуратно добавляя воду до прекращения выделения газа. Полученную белую вязкую суспензию перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 часа, в течение которого соли становились гранулированными. Затем суспензию фильтровали через слой диатомовой земли и промывали осадок на фильтре простым диэтиловым эфиром (10 мл), и затем этилацетатом (10 мл). Объединенные фильтраты экстрагировали 8М хлористоводородной кислотой (3×4 мл). Водные экстракты объединяли и концентрировали на роторном испарителе, с получением гидрохлорида 1,6 г N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.1]гептан-2,1'-циклопропан]-3-амина в виде белого твердого вещества (53% выхода).

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 2,52 (с, 1H), 2,46 (с, 3H), 1,72 (д, J=11 Гц, 1H), 1,49-1,41 (м, 3H), 1,39-1,32 (м, 2H), 1,28 (д, J=11 Гц, 1H), 1,02 (с, 3H), 0,59-0,51 (м, 3H), 0,45-0,43 (м, 1H); ЖХМС (m/z): 166 (M+1).

Пример 9. Гидрохлорид N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-амина и гидрохлорид N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]октан-2,1'-циклопентан]-3-амина

Промежуточное соединение бицикло[2.2.2]окт5-ен-2-он получали способом, описанным в статье Kozikowski и Schmiesing, J. Org. Chem. 48: 1000-1007 (1983), включенной посредством ссылки касательно такой реакции выше, и затем преобразовывали в N,3-диметил[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-амин и N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]октан-2,1'-циклопентан]-3-амин.

Смесь акрилонитрила (79,4 г, 1,49 моль), 1,3-циклогексадиена (60 г, 0,75 моль) и гидрохинона (1,1 г, 10 ммоль) герметизировали в пробирке и нагревали при 120°C в течение 18 часов. Полученную смесь концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетата (от 0,5% до 1%) в петролейном эфире, с получением разделимой смеси изомеров (предположительно эндо/экзо) 5-цианобицикло[2.2.2]окт-2-ена (84 г, 64% выхода) в виде белого полутвердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,32 (м, 2H), 1,75 (м, 3H), 2,04 (м, 1H), 2,43 (м, 1H), 2,62 (м, 1H), 2,78 (м, 1H), 6,23 (м, 1H), 6,30 (м, 1H); ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 128 (м, 2H), 1,50 (м, 3H), 1,94 (м, 1H), 2,68 (м, 2H), 2,87 (м, 1H), 6,29 (м, 1H), 6,44 (м, 1H); ЖХМС (m/z): 134 (M+1).

К кипящей с обратным холодильником смеси пиридина (14,2 г, 0,180 моль), пентахлорида фосфора (28,0 г, 0,135 моль) и хлороформа (100 мл) добавляли по каплям раствор 5-цианобицикло[2.2.2]окт-2-ена (12 г, 90 ммоль) в хлороформе (50 мл). Полученную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 15 часов, охлаждали и выливали на лед. Органический слой концентрировали и очищали остаток хроматографией на силикагеле, элюируя смесями этилацетата (от 0,5% до 1%) в петролейном эфире, с получением 5-хлор-5-цианобицикло[2.2.2]окт-2-ена (14,3 г, 95% выхода) в виде белого полутвердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,3-1,5 (м, 3H), 2,02-2,18 (м, 2H), 2,51 (м, 1H), 2,72 (м, 1H), 3,12 (м, 1H), 6,22 (м, 1H), 6,41 (м, 1H); ГХМС (m/z): 167.

К перемешиваемому раствору 5-хлор-5-цианобицикло[2.2.2]окт-2-ена (65 г, 0,39 моль) (выполнено несколько повторов указанного выше способа) в диметилсульфоксиде (500 мл) добавляли гидроксид калия (87,4 г, 1,56 моль) и воду (30 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов, разбавляли водой (1000 мл) и экстрагировали простым эфиром (4×500 мл). Объединенные экстракты простого эфира промывали насыщенным раствором соли, сушили в избытке безводного сульфата натрия и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, элюируя смесями простого диэтилового эфира (от 1% до 5%) в петролейном эфире, с получением бицикло[2.2.2]окт-5-ен-2-она (23,8 г, 50% выхода) в виде белого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,53-1,84 (м, 4H), 2,01-2,02 (м, 2H), 2,96-2,99 (м, 1H), 3,11-3,13 (м, 1H), 6,15-6,21 (м, 1H), 6,43-6,48 (м, 1H); ГХМС (m/z): 122.

К раствору диизопропиламина (11,2 мл, 8,05 г, 79,6 ммоль) в безводном ТГФ (108 мл) при -78°C добавляли н-бутиллитий (56,5 мл 1,6М в гексане, 90,4 ммоль), смесь нагревали до 90°C и перемешивали в течение 30 мин. Раствор снова охлаждали до -78°C и добавляли растворенный в ТГФ (10 мл) бицикло[2.2.2]окт-5-ен-2-он (5,00 г, 36,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°C, и затем добавляли гексаметилфосфортриамид (13,9 мл, 14,3 г, 79,6 ммоль) с последующим добавлением 1,4-дибромбутана (4,76 мл, 8,59 г, 39,8 ммоль). Реакционную смесь нагревали до температуры окружающей среды, перемешивали в течение 16 часов, гасили насыщенным водным хлорида аммония (50 мл), разбавляли простым эфиром (100 мл) и промывали водой (3×50 мл). Органический слой сушили в избытке безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с 12,0 г диоксида кремния, элюировали 100% гексаном в объеме для 4 колонок, с последующим ступенчатым градиентом 9:1 гексана/этилацетата. Отобранные фракции концентрировали, с получением спиро[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-она (5,1 г, ≈90% чистый ГХ/МС) в виде прозрачного масла. Вещество в дальнейшем использовали без дополнительной очистки, растворяя в безводном ТГФ (20 мл) и охлаждая до 78°C. Затем добавляли метилмагнийбромид (28,6 мл 3,0М в простом диэтиловом эфире, 85,8 ммоль) и медленно нагревали реакционную смесь до температуры окружающей среды. Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 часов и гасили, аккуратно добавляя насыщенный водный хлорид аммония. Реакционную смесь переносили в делительную воронку и удаляли водный слой. Органический слой дважды промывали водой (10 мл), сушили в избытке безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали. Оставшееся вещество (бесцветное масло) представляло собой смесь 3-метилспиро[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-ола (4,9 г) и исходного вещества.

Без дополнительной очистки только что полученный образец объединяли с цианидом натрия (1,93 г, 37,8 ммоль) в уксусной кислоте (20 мл). Полученную смесь охлаждали до 0°C и перемешивали при этой температуре, т.к. медленно добавляли серную кислоту (20 мл). Реакционную смесь, которая стала темно-красного цвета после всех добавлений реагентов, перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Затем ее гасили добавлением 100 мл воды, делали основной (pH 9) добавлением 3М водного гидроксида натрия и экстрагировали дихлорметаном (4×50 мл). Объединенные органические слои сушили в избытке безводного сульфата натрия и концентрировали, с получением не совсем белого твердого вещества. Твердое вещество растворяли в безводном ТГФ (200 мл), охлаждали до 0°C и выдерживали при этой температуре, т.к. медленно добавляли раствор алюмогидрида лития (25,2 мл 2М в ТГФ, 50,4 ммоль). Реакционную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 18 часов, охлаждали на ледяной бане и гасили, осторожно добавляя 5 г декагидрата сульфата натрия. Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали на колонке с 120 г силикагеля с использованием 0-70% CMA в хлороформе, с получением N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-амина (0,20 г, 2,7% выхода). Данное вещество получали в дихлорметане (5 мл), преобразовывали в соль HCl обработкой 0,5 мл 4М хлористоводородной кислоты в диоксане и концентрированием полученной смеси. Полученное аморфное твердое вещество растворяли в метаноле (3 мл) и осаждали простым диэтиловым эфиром (3 мл). Растворитель удаляли аспирацией и трижды растирали осадок с простым диэтиловым эфиром (3 мл). Затем образец гидрохлоридной соли сушили в вакууме.

¹H ЯМР (300 МГц, CD₃OD) δ 1,02 (с, 3H), 1,19-1,42 (м, 4H), 1,51-1,64 (м, 7H), 1,81 (м, 1H), 2,21 (м, 2H), 2,73 (с, 3H), 5,57 (дд, J₁=9 Гц, J₂=3 Гц, 1H), 6,01 (д, J=6 Гц, 1H); ЖХМС (m/z): 206 (M+1).

N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]окт[5]ен-2,1'-циклопентан]-3-амин (80 мг, 0,39 ммоль) растворяли в метаноле (7,8 мл) и добавляли 10% Pd/C (влажный) (41 мг). Полученную смесь помещали в атмосферу газообразного водорода из баллона и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Затем реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю и концентрировали фильтрат, с получением N,3-диметилспиро[бицикло[2.2.2]октан-2,1'-циклопентан]-3-амина (45 мг, 58% выхода). Полученное вещество растворяли в дихлорметане (3 мл), преобразовывали в его соль хлористоводородной кислоты обработкой 0,3 мл 4М хлористоводородной кислоты в диоксане и концентрированием полученной смеси. Полученное аморфное твердое вещество растворяли в метаноле (3 мл) и осаждали простым диэтиловым эфиром (1 мл). Растворитель удаляли аспирацией и трижды растирали осадок с простым диэтиловым эфиром (3 мл). Затем сушили в вакууме образец гидрохлоридной соли.

¹H ЯМР (300 МГц, CD₃OD) δ 0,99 (с, 3H), 1,31 (м, 2H), 1,45-1,70 (м, 10H), 1,85 (м, 1H), 2,08 (м, 3H), 2,22-2,35 (м, 1H), 2,65 (с, 3H), 3,02 (м, 1H); ЖХМС (m/z): 208 (M+1).

VI. Биологические анализы

Характеристика взаимодействия в никотиновых ацетилхолиновых рецепторах

Материалы и способы

Клеточные линии. Клеточные линии SH-EP1-α4β2 человека (Eaton et al., 2003), SH-EP1-α4β4 человека (Gentry et al., 2003) и SH-EP1-α6β3β4α5 (Grinevich et al., 2005) получали от Dr. Ron Lukas (Barrow Neurological Institute). Клеточные линии SH-EP1, клетки PC12, SH-SY5Y и TE671/RD поддерживали в пролиферативной фазе роста в модифицированной Дульбекко среде Игла (Invitrogen, Carlsbad, California) с 10% лошадиной сывороткой (Invitrogen), 5% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, Logan UT), 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ L-глутамина. Для поддержания стабильных трансфектантов в среду к клеткам α4β2 и α4β4 дополнительно добавляли 0,25 мг/мл зеоцина и 0,13 мг/мл гигромицина B. Селекцию поддерживали для клеток α6β3β4α5 добавлением 0,25 мг/мл зеоцина, 0,13 мг/мл гигромицина B, 0,4 мг/мл генетицина и 0,2 мг/мл бластицидина.

Анализы связывания с рецептором

Получение мембран из тканей крысы. Кору головного мозга крысы получали от Analytical Biological Services Incorporated (ABS, Wilmington, Delaware). Ткани самок крыс Sprague-Dawley в препарированном замороженном виде транспортировали на сухом льду. Ткани хранили при -20°C до тех пор, пока не возникала необходимость в мембранных препаратах. Кору головного мозга 10 крыс объединяли и гомогенизировали гомогенизатором Polytron (Kinematica GmbH, Switzerland) в 10 объемах (масса:объем) ледяного препаративного буфера (11 мМ KCl, 6 мM KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 8 мМ Na₂HPO₄, 20 мМ HEPES (свободная кислота), 5 мМ йодацетамид, 1,5 мМ EDTA, 0,1 мМ PMSF pH 7,4). Полученный гомогенат центрифугировали при 40000 g в течение 20 минут при 4°C и ресуспендировали полученный осадок в 20 объемах ледяной воды. После 60 минут инкубации при 4°C собирали новый осадок центрифугированием при 40000 g в течение 20 минут при 4°C. Конечный осадок ресуспендировали в препаративном буфере и хранили при -20°C. В день анализа ткань оттаивали, центрифугировали при 40000 g в течение 20 минут, и затем ресуспендировали в забуференном фосфатном солевом растворе Дульбекко pH 7,4 (PBS, Invitrogen) до конечной концентрации 2-3 мг белка/мл. Концентрации белков определяли с использованием набора Pierce BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

Получение мембран из клонированных клеточных линий. Клетки собирали в ледяном PBS pH 7,4, затем гомогенизировали гомогенизатором Polytron (Kinematica GmbH, Switzerland). Гомогенаты центрифугировали при 40000 g в течение 20 минут (4°C), и ресуспендировали осадок в PBS, и измеряли концентрацию белка с использованием набора Pierce BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Конкурентное связывание с рецепторами в мембранных препаратах. Связывание с никотиновыми рецепторами оценивали на мембранах стандартными способами на основе опубликованных методик (Lippiello and Fernandes 1986; Davies et al., 1999). Кратко, мембраны восстанавливали из замороженных исходных образцов и инкубировали в течение 2 часов на льду в 150 мкл буфера для анализа (PBS) в присутствии конкурирующего соединения (от 0,001 нМ до 100 мкМ) и радиоактивного лиганда. Для исследований связывания с α4β2 человека использовали [³H|-никотин (L-(-)-[N-метил-³H]никотин, 69,5 Ки/ммоль, Perkin-Elmer Life Sciences, Waltham, MA). Для исследований связывания с другим подтипом никотинового рецептора использовали [³H]-эпибатидин (52 Ки/ммоль, Perkin-Elmer Life Sciences). Для исследования связывания с мускариновым рецептором использовали L-[бензиловый-4,4-³H]хинуклидинилбензилат ([³H]QNB). Инкубацию останавливали быстрым фильтрованием на мультисистеме коллектора ткани (Brandel, Gaithersburg, MD) с использованием фильтров GF/B, предварительно пропитанных 0,33% полиэтиленимином (масс./об.) для уменьшения неспецифического связывания. Фильтры трижды промывали ледяным PBS и определяли остаточную радиоактивность посредством подсчета импульсов в жидкой фазе.

Анализ данных связывания. Данные связывания выражали в виде процента от общего контрольного связывания. Повторные данные для каждой точки усредняли и наносили на график против log концентрации лекарственного средства. IC₅₀ (концентрацию соединения, обеспечивающую 50% ингибирование связывания) определяли среднеквадратичной нелинейной регрессией с применением программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPAD, San Diego, CA). Ki рассчитывали с использованием уравнения Ченга-Прусоффа (Cheng and Prusoff, 1973).

Функциональные анализы потока кальция

За двадцать четыре и сорок восемь часов до каждого эксперимента клетки высевали в 86-луночные планшеты с темными стенками, прозрачным дном (Corning, Corning, NY) с плотностью 60-100000 клеток/лунка. В день эксперимента среду для выращивания осторожно удаляли, в каждую лунку добавляли 200 мкл реагента для анализа Calcium 4 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) в буфере для анализа (2,0 мМ HEPES, 7 мМ основной Трис-буфер, 4 мМ CaCl₂, 5 мМ D-глюкозы, 0,8 мМ MgSO₄, 5 мМ KCl, 0,8 мМ MgCl₂, 120 мМ N-метил D-глюкамин, 20 мМ NaCl pH 7,4 для клеток SH-EP1 α4β2 человека или 10 мМ HEPES, 2,5 мМ CaCl₂, 5,6 мМ D-глюкозы, 0,8 мМ MgSO₄, 5,3 мМ KCl, 138 мМ NaCl pH 7,4 c основным Трис-буфером для всех других клеточных линий) и инкубировали планшеты при 37°C в течение 1 часа (29°C для клеток SH-EP1-α4β2 человека обработанных при 29°C). Для исследования ингибирования во время добавления красителя добавляли конкурирующее соединение (10 пМ-10 мкМ). Планшеты извлекали из инкубатора и давали уравновеситься до комнатной температуры. Для добавления соединения и мониторинга флуоресценции (возбуждение 485 нм, эмиссия 525 нм) планшеты переносили в планшет-ридер для визуализации флуоресценции FLIPR (Molecular Devices). Количество потока кальция сравнивали с положительным (никотин) и отрицательным контролем (один буфер). Положительный контроль определяли как 100% ответ, и результаты тестируемых соединений выражали в виде процента от положительного контроля. Для исследований ингибирования использовали агонист никотина при концентрациях 1 мкМ для клеток SH-EP1-α4β2 человека и SH-EP1- α4β4 человека, 10 мкМ для клеток PC12 и SH-SY5Y и 100 мкМ для клеток TE671/RD.

Высвобождение нейротрансмиттера

Исследования высвобождения дофамина проводили с использованием стриарных синаптосом, полученных из головного мозга крысы, как описано ранее (Bencherif et al., 1998). Ткань стриатума от двух крыс (самки Sprague-Dawley массой 150-250 г) объединяли и гомогенизировали в ледяной 0,32M сахарозе (8 мл), содержащей 5 мМ HEPES, pH 7,4 с использованием гомогенизатора стекло/стекло. Затем ткань центрифугировали при 1000×g в течение 10 минут. Осадок удаляли и супернатант центрифугировали при 12500×g в течение 20 минут. Полученный осадок ресуспендировали в ледяном перфузионном буфере, содержащем ингибиторы моноаминоксидазы (128 мМ NaCl, 1,2 мМ KH₂PO₄, 2,4 мМ KCl, 3,2 мМ CaCl₂, 1,2 мМ MgSO₄, 25 мМ HEPES, 1 мМ аскорбиновой кислоты, 0,02 мМ паргилин HCl и 10 мМ глюкозы pH 7,4), и центрифугировали в течение 15 минут при 23000×g. Последний осадок ресуспендировали в перфузионном буфере (2 мл) для немедленного использования.

Суспензию синаптосом инкубировали в течение 10 минут в инкубатор при перемешивании при 37°C для восстановления метаболической активности. Добавляли [³H]дофамин ([³H]DA, специфическая активность=28,0 Ки/ммоль, NEN Research Products) в конечной концентрации 0,1 пМ и инкубировали суспензию при 37°C еще в течение 10 минут. Аликвоты перфузионного буфера (100 мкл) и ткани (100 мкл) помещали в супрафузионные камеры Brandel Suprafusion System (Series 2500, Gaithersburg, MD). В камеры прокачивали перфузионный буфер (комнатной температуры) со скоростью приблизительно 0,6 мл/мин в течение периода промывания, равного 8 минутам. В перфузионный поток вводили конкурирующее соединение (10 пМ-100 нМ) в течение 8 минут. Затем в перфузионный поток вводили никотин (10 пМ) в течение 48 секунд. Из каждой камеры непрерывно отбирали фракции (каждые 12 секунд) на всем протяжении эксперимента для фиксации базового высвобождения и пика высвобождения, индуцированного агонистом, и для повторной фиксации базового уровня после применения агониста. Перфузионную жидкость собирали непосредственно в сцинтилляционные флаконы, в которые добавляли сцинтилляционную жидкость. Количество высвобожденного [³H]DA определяли подсчетом сцинтилляции. Для каждой камеры нормализовали интегрированную область пика относительно его базового уровня.

Высвобождение выражали в процентах от высвобождения, полученного с контрольным никотином при отсутствии конкурирующего соединения. В каждом анализе проводили повторный эксперимент для каждой концентрации тестируемого соединения, используя 2 камеры; результаты повторных экспериментов усредняли. Определяли концентрацию соединения, приводившую к половине максимального ингибирования (IC₅₀) потока специфических ионов.

Электрофизиология пэтч-кламп

Манипуляции с клетками. После извлечения клеток GH4C1-T6'Sα7 крысы удаляли среду, трипсинизировали клетки в течение 3 минут, осторожно растирали, чтобы отделить их от чашки, дважды промывали средой для регистрации и ресуспендировали в 2 мл внешнего раствора (см. ниже для композиции). Клетки помещали в чип для препарата системы Dynaflow на предметном столе инвертированного микроскопа Zeiss (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY). В среднем требовалось 5 минут, перед тем как устанавливали конфигурацию регистрации цельной клетки. Для устранения изменения условий клеток одну клетку регистрировали при одной загрузке. Для индукции быстрых ответов соединения применяли в течение 0,5 сек с использованием системы Dynaflow (Cellectricon, Inc., Gaithersburg, MD), где в каждый канал подавали растворы под давлением или 50, или 150 фунт/дюйм².

Электрофизиология. Применяли общепринятые способы регистрации токов цельной клетки. Использовали стеклянные микроэлектроды (5-10 MΩ сопротивление) для создания герметичных участков (>1 GΩ) на клеточную поверхность, перед тем как применяли всасывание для приведения к условиям общепринятой регистрации цельной клетки. Затем в клетках фиксировали напряжение при исходных потенциалах -60 мВ и измеряли ионные токи в ответ на применение лигандов. Токи цельной клетки, регистрируемые усилителем Axon 700A, фильтровали при 1 кГц и отбирали при 5 кГц с использованием платы ADC 1440 (Molecular Devices). Входное сопротивление цельной клетки составляло менее 20 MΩ. Регистрацию данных токов цельной клетки проводили с использованием Clampex 10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) и строили график по результатам с применением Prism 5,0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Экспериментальные данные представлены как среднее значение±S.E.M., и сравнения различных условий проанализированы в отношении статистической значимости с использованием t-теста Стьюдента и теста Two Way ANOVA. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (22±1°C). Профили концентрация-ответ приводили в соответствие с уравнением Hill и анализировали с использованием Prism 5,0.

Применение растворов и лекарственных средств. Стандартный внутренний раствор содержал 120 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 2 мМ CaCl₂, 25 мМ D-глюкозы и 10 мМ HEPES, и pH доводили до 7,4 основным Трис-буфером. Внутренний раствор для регистраций цельной клетки состоял из 110 мМ двухосновного фосфатного Трис-буфера, 28 мМ основного Трис-буфера, 11 мМ EGTA, 2 мМ MgCl₂, 0,1 мМ CaCl₂ и 4 мМ Mg-АТФ pH 7,3. (Liu et al., 2008). Для инициации ответов токов цельной клетки соединения доставляли посредством перемещения клеток из контрольного раствора в содержащий агонист раствор и таким же образом обратно, так что замена растворов осуществлялась в течение ≈50 мсек (основываясь на 10-90% повышении времени тока пика). Промежутки времени между применением соединений (0,5-1 минута) специально подбирали для обеспечения стабильности ответной реакции рецептора (без функционального снижения), и с той же целью проводили выбор растворов для пипетирования, используемых в большей части описанных в настоящем описании исследований. (-)-никотин и ацетилхолин (ACh) приобретали у Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO). Все лекарственные средства получали ежедневно из исходных растворов.

Для определения ингибирования индуцированных ACh токов соединениями по настоящему изобретению авторы фиксировали стабильный основной уровень регистрации, используя 70 мкМ ACh (как правило, стабильных при 5-10 последовательных применениях). Затем совместно применяли ACh (70 мкМ) и тестируемое соединение в диапазоне концентраций от 1 нМ до 10 мкМ. Поскольку концевая часть тока (ток, измеренный в конце 0,5 сек применения ACh) претерпевала наиболее сильные изменения, графики ингибирования и восстановления представляют собой амплитуду тока концевой части.

Суммирование результатов в таблицу

Как показано в таблице 1, репрезентативные соединения по настоящему изобретению, как правило, демонстрируют константы ингибирования (значения Ki) для α4β2 человека и ганглиозного подтипа рецептора в диапазоне 1-100 мМ, указывающие на низкую аффинность в отношении ортостерических участков связывания (т.е. участка связывания конкурентного агониста) этих подтипов рецептора. Однако данные в таблице 1 также иллюстрируют, что репрезентативные соединения по настоящему изобретению эффективно ингибируют поток ионов этих подтипов рецептора с конкретными значениями IC₅₀ приблизительно менее 2 мМ и конкретными значениями I_max>95%. Совокупно эти данные демонстрируют, что репрезентативные соединения по настоящему изобретению эффективны при ингибировании потока ионов, опосредованного этими подтипами рецептора посредством механизма, который не приводит к связыванию с ортостерическими участками.

Таблица 1 Структура Ki α4β2 человека (нМ) Ki ганглия человека (нМ) IC₅₀ потока Ca в α4β2 человека [29°C/HS] (нМ) I_max потока Ca в α4β2 человека [29°C/HS] (% ингибирования) IC₅₀ потока Ca в α4β2 человека [37°C/LS] (нМ) I_max потока Ca в α4β2 человека [37°C/LS] (% ингибирования) IC₅₀ потока Ca в ганглии человека (нМ) I_max потока Ca в ганглии человека (% ингибирования) >10000 >10000 1000 99 500 97 160 97 3800 >10000 1400 99 59 96 190 79 10000 >10000 1400 96 740 98 190 89 2600 >10000 1800 98 620 98 230 98 540 >10000 2100 97 570 93 440 93 8700 >10000 610 98 230 95 98 93

>10000 >10000 210 98 97 96 23 100 >10000 >10000 260 98 65 94 40 98 >10000 >10000 1300 99 490 96 180 97 5600 >10000 710 98 430 96 74 99 >10000 >10000 1000 97 600 96 98 95 >10000 >10000 310 97 270 93 60 97 >10000 >10000 540 96 520 97 100 98

>10000 >10000 140 96 350 95 66 97 3200 >10000 1100 96 280 95 65 95 2600 >10000 740 95 380 95 86 99 >10000 >10000 1100 99 120 100 35 96 >10000 >10000 380 97 120 93 170 98 3000 >10000     400 95 240 92

Наблюдаемые специфические фармакологические ответы могут изменяться в соответствии и в зависимости от конкретного выбранного активного соединения или содержащихся фармацевтических носителей, а также от типа состава и используемого способа введения, и такие ожидаемые изменения или различия в результатах рассматриваются в соответствии с применением на практике настоящего изобретения.

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения в данном описании являются иллюстративными и подробно описаны, изобретение не ограничено тем или иным способом. Указанные выше подробные описания приведены в качестве примеров настоящего изобретения, и их не следует расценивать как ограничивающие изобретение. Модификации будут очевидны специалистам в данной области, и все модификации, не отходящие от сущности настоящего изобретения, предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям формулы I или их фармацевтически приемлемым солям, обладающим свойствами антагониста нейронального никотинового рецептора. Соединения могут найти применение для лечения заболевания или состояния, которое представляет собой синдром раздраженного кишечника с преобладанием диареи (IBS-D), гиперактивный мочевой пузырь (ОАВ), никотиновую зависимость, прекращение курения, депрессию, большое депрессивное расстройство или гипертензию опосредованных активностью нейронального никотинового рецептора. В формуле I:

каждый из R¹ и R² в отдельности представляет собой Н, C_1-6алкил, или R¹ и R² связаны с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного кольца; R³ представляет собой Н, С_1-6алкил; каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ в отдельности представляет собой Н, С_1-6алкил; L¹ представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CR⁸R⁹, CR⁸R⁹CR¹⁰R¹¹ и О; L² представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из СН₂, СН₂СН₂, СН₂СН₂СН₂ или СН₂СН₂СН₂СН₂; каждый из R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ в отдельности представляет собой водород или C_1-6алкил, и пунктирная линия обозначает необязательную двойную связь. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 табл., 9 пр.

1. Соединение формулы I:

где каждый из R¹ и R² в отдельности представляет собой Н, C_1-6алкил, или R¹ и R² связаны с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного кольца;
R³ представляет собой Н, С_1-6алкил;
каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ в отдельности представляет собой Н, С_1-6алкил;
L¹ представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из CR⁸R⁹, CR⁸R⁹CR¹⁰R¹¹ и О;
L² представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из СН₂, СН₂СН₂, СН₂СН₂СН₂ или СН₂СН₂СН₂СН₂;
каждый из R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ в отдельности представляет собой водород или C_1-6алкил, и
пунктирная линия обозначает необязательную двойную связь;
или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п. 1, где R¹ представляет собой Н, и R² представляет собой С_1-6алкил.

3. Соединение по п. 1 или 2, где R³ представляет собой C_1-6алкил.

4. Соединение по п. 1, где каждый из R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ представляет собой Н.

5. Соединение по п. 1, где L¹ представляет собой CR⁸R⁹, и каждый из R⁸ и R⁹ представляет собой водород.

6. Соединение по п. 1, где L² представляет собой СН₂СН₂.

7. Соединение по п. 1, где пунктирная линия обозначает одинарную связь.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами антагониста нейронального никотинового рецептора, содержащая соединение по любому из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Способ лечения или предотвращения заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-7.

10. Способ по п. 9, где заболевание или состояние представляет собой синдром раздраженного кишечника с преобладанием диареи (IBS-D), гиперактивный мочевой пузырь (ОАВ), никотиновую зависимость, прекращение курения, депрессию, большое депрессивное расстройство или гипертензию.

11. Применение соединения по любому из пп. 1-7 для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором.

12. Применение по п. 11, где заболевание или состояние представляет собой IBS-D, ОАВ, никотиновую зависимость, прекращение курения, депрессию, большое депрессивное расстройство или гипертензию.

13. Соединение по п. 1, предназначенное для применения в качестве активного терапевтического вещества для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором.

14. Соединение по п. 1, предназначенное для применения в лечении или предотвращении заболевания или состояния, опосредованного нейрональным никотиновым рецептором.

15. Соединение по п. 13 или 14, где заболевание или состояние представляет собой IBS-D, ОАВ, никотиновую зависимость, прекращение курения, депрессию, большое депрессивное расстройство или гипертензию.