СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РАКОВОЙ КЛЕТКИ, РЕЗИСТЕНТНОЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМУ АГЕНТУ И ОБЛАДАЮЩЕЙ СВОЙСТВАМИ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ Российский патент 2016 года по МПК C12N5/00 A01N43/02 

Данная заявка претендует на приоритет предварительных заявок на патент США №61/458390 и №61/458391, обе из которых поданы 23 ноября 2010 г. и полностью включены в данную заявку посредством отсылок.

Область техники

Данное изобретение относится к способам выделения раковых стволовых клеток и к выделенным таким образом стволовым клеткам. Оно относится также к способам скрининга соединений, представляющих интерес, с целью определения их возможной эффективности в качестве противораковых агентов.

Предпосылки создания изобретения и уровень техники

Большая часть смертных случаев от рака после химиотерапии и ремиссии вызвана повторным проявлением первоначальной опухоли или опухолей, которые подвергались лечению. Кажется, что это противоречит здравому смыслу, так как известные способы лечения рака иногда, но не всегда, приводят к исчезновению опухолей до такой степени, что пациент может считаться "излеченным".

Была предложена теория, объясняющая повторное проявление опухолей, а также рост опухолей per se, эта теория называется теорией "раковой стволовой клетки" или CSC. Вкратце, эта теория предполагает, что немногочисленная популяция раковых клеток, которые обладают некоторыми характеристиками стволовых клеток, подвергается асимметричному делению, которое в свою очередь приводит к замене стволовых клеток и к появлению более ограниченных популяций клеток, амплифицирующих опухоль. Эти "новые" клетки быстро размножаются и составляют большую часть опухоли в противоположность стволовым клеткам, которые характеризуются медленным клеточным циклом, неактивны и резистентны к терапевтическим агентам, которые нацелены на клетки, подвергающиеся быстрому делению. Результатом этого является то, что хотя большинство клеток в опухоли восприимчиво к одному или более терапевтическим агентам, небольшая популяция клеток, подобных стволовым клеткам и являющихся резистентными к химиотерапии, не разрушается, и цикл, описанный выше, повторяется.

Очевидно, что существует необходимость в идентификации этих раковых клеток, подобных стволовым клеткам, как и необходимость в количественном определении их в опухолях конкретного субъекта или пациента. Кроме того, хотя в области онкологии признан ряд химиотерапевтических агентов для дифференцированного подхода к лечению рака, существует необходимость в создании нацеленных терапевтических агентов, а также более общего способа идентификации потенциально полезных противоопухолевых средств.

В патентах США №№5888497, 6303151, 6808705, 6818230, 7041504 и 7297331, все из которых включены в данную заявку посредством отсылок, описаны способы инкапсулирования раковых клеток в гранулах агарозы, которые в свою очередь содержат покрытие на основы агарозы. Тип агарозы может меняться в зависимости от других типов клеток (островков) в соответствии с, например, опубликованной заявкой 2007/0071732, также включенной в данную заявку посредством отсылки.

Исследования, проведенные с этими инкапсулированными раковыми клетками, выявили, что развиваются популяции клеток, которые обладают свойствами стволовых клеток. Поэтому было интересно определить, можно ли материалы, описанные в указанных ссылках, применять для выделения резистентных к химиотерапии раковых клеток, которые также обладают свойствами, характерными для стволовых клеток. При этом исследовании было установлено, что указанные инкапсулаты можно использовать для скрининга соединений, представляющих интерес, с целью определения, является ли данное соединение эффективным при лечении рака.

Из следующего далее описания видно, как достигаются эти и другие аспекты данного изобретения.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Агарозные гранулы, покрытые агарозой, содержащие клетки RENCA, были получены в соответствии с публикациями Smith et al., Cane. Res. 71 (3): 716-724 (2011) и Smith et al., Cane. Res. 71 (3): 725-735 (2011), которые включены в данную заявку посредством отсылок. Полученные гранулы культивировали в среде в течение 12 недель.

Затем эти гранулы подвергались воздействию одного известного противоракового лекарственного средства с одной из трех разных концентраций. Воздействие включало инкубацию гранул в присутствии лекарства в течение промежутка времени, основанного на периоде полужизни лекарства. После инкубации гранулы дважды промывали и помещали в культуральную интактную среду. Были приготовлены также контрольные образцы, которые включали необработанные гранулы, а также гранулы, обработанные носителем, который применялся для солюбилизации лекарства.

Гистологическое исследование гранул проводили через неделю после окончания действия лекарственного средства. В некоторых случаях не было никаких изменений, в то время как в других случаях лекарственное средство приводило к полной потере жизнеспособности клеток или к промежуточному результату. Были получены следующие результаты:

Пример 2

Обработка доцетакселом и паклитакселом не приводит к разрушению всех клеток в колониях инкапсулированных опухолей, и поэтому гранулы, которые были обработаны этими лекарственными средствами, были выбраны для дальнейшего исследования. Можно было также использовать гранулы, обработанные карбоплатином с низкой концентрацией или винорельбином с промежуточной концентрацией.

Гранулы, обработанные доцетакселом и паклитакселом, культивировали в стандартных условиях, как и контрольные гранулы, которые были обработаны DMSO, служившим носителем для доставки обоих лекарств. Время культивирования составляло 18 недель.

Клетки, инкапсулированные в гранулах, которые были обработаны DMSO, имели нормальную морфологию, это были колонии эллиптических опухолей, состоящих из ободка клеток толщиной 1-2 клетки, окружающего внутренний дебрис. В противоположность этому, гранулы, которые были обработаны 3,5 мкг/мл паклитаксела, теряли клетки в течение 6 недель с возвратом к количеству клеток, имевшихся до обработки в течение 18 недель. Гранулы, обработанные доцетакселом (5,0 мкг/мл), имели закономерность, заключающуюся в наличии 1-2 клеток на колонию, через 6 недель после обработки. Примерно в 10% гранул развивались 1 или 2 большие колонии через 18 недель.

Для того чтобы количественно определить потерю клеток, репрезентативные контрольные гранулы, обработанные DMSO, гранулы, обработанные паклитакселом и доцетакселом, разрезали и окрашивали при помощи стандартных методов, позволяющих подсчитать ядра клеток.

В случае обработки паклитакселом в течение 1-3 недель наблюдалась потеря клеток, составившая примерно 25% на колонию. Большинство колоний не содержало жизнеспособных клеток. Количество клеток возрастало через 18 недель и становилось эквивалентным количеству клеток в контрольных гранулах, обработанных DMSO. В случае гранул, обработанных доцетакселом, они теряли жизнеспособные клетки очень быстро, и через 6 недель после обработки колонии содержали только 1-2 жизнеспособные клетки. Через 18 недель примерно в 10% гранул развились 1-2 больших колонии клеток, что свидетельствовало о том, что редкие резистентные к доцетакселу клетки RENCA могут образовывать новые колонии внутри гранул.

Пример 3

Недавно полученные данные позволяют предположить, что ОСТ4 (октамер связующий транскрипционный фактор 4), являющийся маркером эмбриональных стволовых клеток, может быть использован с другими факторами транскрипции для индуцирования взрослых клеток с широким спектром действия подобно стволовым клеткам. См. Park et al., Nature, 451 (7475):141-146 (2008). Дополнительные характеристики стволовых клеток в отношении маркеров могут быть найдены, например, в источнике International Stem Cell Initiative, et al., Nat. Biotechnol. 25 (7):803-816 (2007), который также включен в данную заявку посредством отсылки.

Проводили опыты с целью определения того, демонстрируют ли клетки, которые остались в гранулах, обработанных доцетакселом, этот маркер через 6 недель после обработки.

Клетки окрашивали с помощью DAPI для идентификации живых клеток, в то время как для окрашивания ОСТ4 применяли стандартные процедуры с использованием кроличьего поликлонального антитела против ОСТ4 и козьего антитела против IgG, меченного конъюгатом Fluor 488.

Результаты показали, что живые клетки экспрессировали ОСТ4. Факт этой экспрессии наряду с резистентностью к доцетакселу позволяет предположить, что оставшиеся клетки представляют собой раковые стволовые клетки.

Пример 4

Необходимой характеристикой раковых стволовых клеток является способность образовывать колонии раковых клеток. Для определения способности клеток, описанных supra осуществлять это, колонии извлекали из гранул и собирали выжившие клетки, применяя механическое разрушение, через 5-6 недель после их удаления, колонии измельчали форцепсами в среде RPMI 1640, содержащей 10% сыворотки новорожденного теленка. Затем полученную суспензию пропускали через сито 40 мкм для снижения до минимума количества любого агарозного дебриса и получали гранулы путем центрифугирования. Полученные гранулы снова суспендировали в интактной культуральной среде и культивировали или in vitro (200 кл/мл, в среде RPMI 1640, дополненной 10% сыворотки новорожденного теленка), или культивировали in vivo. Далее, 200 клеток смешивали с каплей крови, отобранной у реципиента-мыши, при этом образовывался сгусток, который затем имплантировали под капсулой почки мыши, у которой отбирали кровь. Затем наблюдали за ростом опухолей. Развитие опухоли после in vivo трансплантации очищенных стволовых клеток рассматривается как "золотой стандарт" для идентификации раковых стволовых клеток.

Клетки RENCA, выращенные in vitro, были гораздо больше, чем обычные клетки RENCA, которые выращивали в монослое, и их рост не наблюдался в течение примерно 16 недель. Через 16-17 недель после культивирования клетки образовывали стерильное пятно и начинали разрастаться путем новообразований на уровне недельных пассажей и росли в виде монослоя в культуре. Но через 2 недели после начала роста монослоя эти клетки характеризовались скоростью роста, сравнимой со скоростью роста нормальных клеток RENCA и оказывались нормальными монослойными клетками RENCA с эквивалентными размером и морфологией. Из 10 мышей, которым ввели импланты, у одной мыши развилась опухоль под капсулой почки, и она погибла через 98 дн после начала индукции. У нее также развились метастазы в легких.

Полученные результаты показывают, что эти клетки могут рассматриваться как раковые стволовые клетки.

Описанные выше примеры представляют различные аспекты данного изобретения, которые включают способ выделения раковых клеток, которые являются резистентными к химиотерапевтическим агентам, таким как доцетаксел, и которые обладают одним или более свойствами стволовых клеток, такими как экспрессия ОСТ4. Другие свойства стволовых клеток хорошо известны в уровне техники и не повторяются в данной заявке. Способ включает инкапсулирование образца раковых клеток в грануле, содержащей агарозу, которая затем покрывается агарозой, культивирование полученной гранулы с целью роста раковых клеток, содержащихся в ней, контактирование гранулы с химиотерапевтическим агентом и определение того, какие из оставшихся клеток экспрессируют ОСТ4 или in situ, или при их удалении.

Этот способ может быть использован, например, для выработки прогноза для субъекта, который страдает от рака, потому что, как отмечено выше, клетки типа, описанных в данной заявке, являются ответственными за повторное проявление рака у субъектов. Существенным является то, что наличие большого количества этих клеток показывает более неблагоприятный прогноз для пациента, чем для пациентов, у которых есть небольшое количество таких клеток в инкапсулированном образце или их вообще нет.

В способе согласно данному изобретению может быть использован любой химиотерапевтический агент для любого вида рака. Специалисту в данной области известны многие другие химиотерапевтические агенты для раковой терапии. Точно так же следует указать, например, на основе ссылок, указанных выше, что могут быть различные типы рака и виды агарозы наряду с описанными в данной заявке. Далее, гранулы по изобретению могут включать такие материалы как коллаген или другие материалы, совместимые с агарозой. Раковые клетки предпочтительно являются клетками млекопитающих и, наиболее предпочтительно, клетками человека.

Тот факт, что выделенные клетки являются резистентными к известным химиотерапевтическим агентам, указанным в данной заявке, однако, не означает, что они химиорезистентны per se (сами по себе). Как показано выше, агенты, испытанные в данной заявке, представляют собой лекарственные средства, которые обычно применяются для разрушения быстро пролиферирующих клеток. Существуют другие агенты, доступные для клеток типа клеток, которые находятся в агарозных гранулах с покрытием из агарозы, которые известны специалистам в данной области. Хотя эти лекарственные средства не описаны в данной заявке, эти лекарственные средства могут быть испытаны на этих клетках типа стволовых клеток, химиорезистентных и экспрессирующих ОСТ4, и может быть разработана схема лечения, при которой, например, субъект получает во время первого курса лечения стандартный противораковый агент и затем агент, направленный на тип клеток, которые были выделены и описаны в данной заявке. Такие клетки являются выделенными раковыми клетками, которые резистентны к таким химиотерапевтическим агентам, как доцетаксел, и которые экспрессируют ОСТ4. Согласно этому аспекту изобретения вещество, представляющее интерес, может быть испытано на раковых клетках, подобных стволовым клеткам, оставшимся после контактирования с первым агентом, или можно инкапсулировать отдельный образец раковых клеток, подобных стволовым клеткам, и дальше продолжать процесс, описанный выше.

Специалист в данной области также может заметить, что данное изобретение относится к способу определения наличия эффективности в качестве противоракового агента у соединения, представляющего интерес. Как будет видно, этот способ включает контактирование соединения, представляющего интерес, с агарозной гранулой с покрытием из агарозы, которая содержит образец раковых клеток, в течение выбранного промежутка времени и при выбранной концентрации и определения того, разрушает ли указанное соединение клетки в количестве, которое превышает контрольное количество. В таких случаях соединение может быть рассмотрено как терапевтически полезное, а также полезное в нетерапевтическом контексте, например для применения для разрушения раковых клеток в смешанной популяции клеток или для удаления нестволовых раковых клеток из смеси клеток. Изобретение предусматривает также "коктейли", состоящие из более чем одного потенциально полезного терапевтического агента или комбинаций известных терапевтических агентов с испытуемыми соединениями для определения того, являются ли комбинированная терапия или применение в нетерапевтическом контексте подходящими.

Для специалиста в данной области другие признаки данного изобретения являются ясными и не нуждаются в разъяснении.

Термины и выражения, которые были использованы в данной заявке, применяются как описательные и не ограничивающие данное изобретение. Заявители не намереваются использовать такие термины и выражения для исключения любых эквивалентов признаков, описанных в данной заявке, или их частей; разумеется, что возможны любые модификации в объеме данного изобретения.

Изобретение относится к биохимии. Описано выделение раковой клетки, которая резистентна к химиотерапевтическому агенту и обладает свойствами стволовой клетки, включая экспрессию ОСТ4. Инкапсулируют образец раковых клеток в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле. Приводят в контакт гранулы по меньшей мере с одним противораковым химиотерапевтическим агентом в течение промежутка времени, достаточного для гибели по меньшей мере части клеток. Удаляют любые выжившие клетки из указанной гранулы. Определяют у указанной выжившей клетки по меньшей мере одно свойство стволовой клетки. Отделяют раковые клетки, которые экспрессируют ОСТ4, от клеток, не обладающих этим свойством. Также представлен способ определения того, обладает ли вещество, представляющее интерес, активностью против раковых стволовых клеток. Для этого приводят в контакт раковые стволовые клетки, инкапсулированные в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле, с указанным веществом. Сравнивают количества оставшихся клеток с количеством раковых стволовых клеток, содержащихся в эквивалентной грануле, не приводившейся в контакт с указанным веществом. Наличие меньшего количества клеток в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле свидетельствует об активности указанного вещества против раковых стволовых клеток. Изобретение расширяет арсенал средств и методов терапии рака. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ выделения раковой клетки, которая резистентна к химиотерапевтическому агенту и обладает свойствами стволовой клетки, включая экспрессию ОСТ4, причем способ включает:
(i) инкапсулирование образца раковых клеток в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле;
(ii) приведение в контакт указанной гранулы по меньшей мере с одним противораковым химиотерапевтическим агентом в течение промежутка времени, достаточного для гибели по меньшей мере части указанных раковых клеток;
(iii) удаление любых выживших клеток из указанной гранулы;
(iv) определение у указанной выжившей клетки по меньшей мере одного свойства стволовой клетки; и
(v) отделение любых раковых клеток, которые экспрессируют ОСТ4, от любых клеток, не обладающих этим свойством.

2. Способ по п. 1, в котором указанным химиотерапевтическим агентом является доцетаксел.

3. Способ по п. 1, в котором указанными раковыми клетками являются клетки млекопитающего.

4. Способ по п. 3, в котором указанными клетками млекопитающего являются человеческие клетки.

5. Способ определения того, обладает ли вещество, представляющее интерес, активностью против раковых стволовых клеток, выделенных способом по п. 1, включающий приведение в контакт указанных раковых стволовых клеток, инкапсулированных в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле, с указанным веществом и сравнение количества оставшихся клеток с количеством раковых стволовых клеток, содержащихся в эквивалентной грануле, не приводившейся в контакт с указанным веществом, причем наличие меньшего количества клеток в содержащей агарозу, покрытой агарозой грануле свидетельствует об активности указанного вещества против раковых стволовых клеток.