Данное изобретение относится к заключенным (или пойманным, или захваченным) в ловушку клеткам, таким как стволовые клетки. Пойманные в ловушку клетки при культивировании в заключающем в ловушку веществе производят продукт, который, когда находится в контакте с другими не заключенными в ловушку свободно растущими клетками in vitro или in vivo, ингибирует их пролиферацию. Кроме того, такой захват стволовых клеток ингибирует пролиферацию по крайней мере некоторых пойманных стволовых клеток и может ингибировать дифференцировку по крайней мере части пойманных стволовых клеток.
Уровень техники изобретения и предшествующий уровень техники
Захват в ловушку биологических материалов, таких как клетки, представляет собой способ, который используют для различных целей. Примерами патентной литературы в данной области являются патенты США №6303151 (Asina, et al.), №6224912 (Asina, et al.), №5888497 (Jain, et al.), №5643569 (Jain, et al.) и RE38027 (Jain, et al.), и все эти публикации в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылок. В этой серии родственных патентов показано, что раковые клетки и островки можно заключить в биосовместимый матрикс, такой как агароза, смесь агароза/коллаген и смесь агароза/желатин, а затем покрыть агарозой. Полученные захваченные клетки продуцируют вещества, которые, помимо прочего, диффундируют из проницаемых биосовместимых матриксов, в которых они удерживаются, и характеризуются полезными биологическими свойствами. В случае островков продуцируется инсулин. В случае раковых клеток вещество диффундирует из матрикса, и указанное вещество влияет на рост и пролиферацию раковых клеток. Просмотр патентов '912 и '151, цитируемых выше, показывает, что указанный эффект является перекрестным межвидовым эффектом, то есть захваченные или инкапсулированные раковые клетки от данного вида продуцируют вещество, которое ингибирует рост и/или пролиферацию раковых клеток от другого вида, а также вида, из которого происходят раковые клетки.
Дополнительные примеры способов захвата описаны, например, в патентах США №5227298 (Weber, et al.), 5053332 (Cook, et al.), 4997443 (Walthall, et al.), 4971833 (Larsson, et al.), 4902295 (Walthall, et al.), 4798786 (Tice, et al.), 4673566 (Goosen, et al.), 4647536 (Mosbach, et al.), 4409331 (Lim), 4392909 (Lim), 4352883 (Lim) и 4663286 (Tsang, et al.). Все эти ссылки включены в настоящее описание путем цитирования.
Захват в ловушку не всегда оказывает положительное воздействие на захваченные клетки. Например, см. Lloyd-George, et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech., 21 (3):323-333 (1993); Schinstine, et al., Cell Transplant, 41(1):93-102 (1995); Chicheportiche, et al., Diabetologica, 31:54-57 (1988); Jaeger, et al., Progress In Brain Research, 82:41-46 (1990); Zekorn, et al., Diabetologica, 29:99-106 (1992); Zhou, et al., Am. J. Physiol., 274:C1356-1362 (1998); Darquy, et al., Diabetologica, 28:776-780 (1985); Tse, et al., Biotech. & Bioeng., 51:271-280 (1996): Jaeger, et al., J. Neurol., 21-469-480 (1992); Hortelano, et al., Blood, 87(12):5095-5103 (1996): Gardiner, et al., Transp.Proc, 29:2019-2020 (1997). Bee указанные ссылки включены в настоящее описание путем цитирования.
Ни в одной из обсуждаемых выше ссылок не рассматривается класс клеток, известных как стволовые клетки, включая эмбриональные стволовые клетки.
Одно определение стволовых клеток, выдвинутое Reya et al., Nature, 414: 105-111 (2001), включенное путем цитирования, относится к стволовым клеткам, которые обладают способностью длительно сохраняться посредством самообновления и образовывать зрелые клетки определенных тканей в результате дифференцировки. Можно получать различные типы стволовых клеток, включая нервные, гематолимфоидные, миелоидные и другие типы стволовых клеток из различных органов. Все указанные клетки имеют возможность развиваться в определенные органы и ткани. Некоторые стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, являются полипотентными в том смысле, что путь их дифференцировки не установлен вообще, и они могут развиваться в различные органы и ткани.
Дискуссии относительно различных терапевтических применений, для которых могут быть предложены стволовые клетки, хорошо известны, и нет необходимости обсуждать их здесь. Заслуживает упоминания, поскольку относится к настоящему изобретению, то, что стволовые клетки являются очень необычными клетками, их очистка и отделение от других клеток трудоемки и трудны, и стволовые клетки дифференцируются в зрелую клетку, если только их не обрабатывают каким-либо образом, чтобы предотвратить дифференцировку.
В настоящее время установлено, что процедуры захвата клеток, в соответствии со способами, описанными Jain et al. и Iwata et al., Journ. Biomedical Material and Res., 26: 967 (1992), влияют на стволовые клетки весьма желательным образом. Следует уточнить, что пойманные в ловушку стволовые клетки продуцируют вещества, которые ингибируют пролиферацию различных типов клеток, включая стволовые клетки и раковые клетки. Указанное вещество перекрестно действует на линии клеток разных видов. Кроме того, обнаружено, что стволовые клетки, когда они заключены в ловушку, как описано в настоящем изобретении, сохраняют свою способность дифференцироваться, включая их полипотентность, в течение неопределенно длительного периода.
Описанные, а также другие признаки будут понятны из описания, которое следует далее.
Подробное описание предпочтительных воплощений
ПРИМЕР 1
Две различные линии мышиных эмбриональных стволовых [ES] клеток (то есть ES-D3 и SCC-PSA1, обе из которых доступны) получали из Американской коллекции типовых культур («АТСС»).
Обе линии выращивали в стандартных условиях культивирования, которые включали в себя рост в виде монослоя поверх подслоя "STO"-клеток эмбриональных фибробластов.
Указанные клетки также получали из АТСС. Стволовые клетки культивировали в среде DMEM, которую дополняли подходящей для ES фетальной бычьей сывороткой, фактором, ингибирующим активность лейкозных клеток (LIF), и β-меркаптоэтанолом (в совокупности -«среда А»). Клетки, которые консервировали путем замораживания при получении, подвергали оттаиванию и культивировали для стабилизации культуры по меньшей мере в течение 3 пассажей перед собственно культивированием, как описано выше.
Через три дня клетки ES оказывались на 70-80% конфлуэнтными, и их трипсинизировали, а затем захватывали в агарозные гранулы, покрывали агарозой, в соответствии с патентами США №6303151, 6224912 и 5888497, все из которых включены в настоящее описание путем цитирования. Вкратце, использовали агарозу Sigma XII в исходной концентрации приблизительно 1,0%. Аликвоты раствора указанной агарозы по 100 мкл добавляли к 34 мкл клеточной суспензии. Полученные гранулы содержали 2,0х105±1,5х104 мышиных эмбриональных стволовых клеток. На гранулы наносили второй слой агарозы в концентрации приблизительно 5,0%. Гранулы культивировали в среде, как описано выше, за исключением того, что среда не содержала ни LIF, ни жизнеспособных STO-клеток подслоя («среда В»).
Жизнеспособность клеток в гранулах оценивали с течением времени с помощью стандартного гистохимического и микроскопического исследования, а также стандартного МТТ-анализа, используя клетки, удаленные из гранул или удерживаемые в гранулах, в различные периоды.
Обнаружено, что в пойманных в ловушку стволовых клетках повышалась их метаболическая активность после первого покрытия агарозой. За этим повышением следовало снижение активности, так как клетки погибали в результате апоптоза, достигая наиболее низкого уровня их метаболической активности примерно к 21 дню. Однако после достижения указанного низкого уровня активности выжившие клетки медленно пролиферировали, и наблюдалось постепенное повышение общей метаболической активности вплоть до 35 дня после захвата. Это соответствует результатам исследования пойманных в ловушку раковых клеток.
Морфологически существуют значительные различия между колониями, образованными раковыми клетками в пределах внутреннего слоя агарозы гранулы, и колониями, образованными стволовыми клетками. Хотя оба типа колоний имеют яйцевидную форму, колонии, образованные раковыми клетками, характеризуются внешней зоной жизнеспособных клеток (обычно от двух до трех клеток по толщине), с центральной зоной из обломков эозинофильных клеток. С другой стороны, колонии, образованные стволовыми клетками, полностью оккупированы жизнеспособными клетками, и в них нет никакой центральной зоны из клеточных обломков.
ПРИМЕР 2
В представленных экспериментах исследовали ингибирующее действие стволовых клеток на пролиферацию других стволовых клеток.
Десятинедельные гранулы агароза/агароза, содержащие стволовые клетки (клетки SCC-PSA1), тестировали в отношении жизнеспособности, используя МТТ-анализ, описанный выше, и культивировали в среде В, обсуждаемой в примере 1, в течение 6 дней. Через 6 дней среду кондиционировали захваченными в ловушку стволовыми клетками. Поэтому описанную среду называют кондиционированной средой стволовых клеток (SCM).
После указанных 6 дней SCM переносили в 6-луночные планшеты, которые содержали свежие клетки SCC-PSA1. Каждый из этих планшетов содержал 9×105 STO-клеток подслоя, которые покрывали клетками SCC-PSA1, 1,5×104. STO-клетки обрабатывали митомицином С, чтобы предотвратить пролиферацию. Было поставлено три контроля, то есть лунки, которые содержали среду В (некондиционированная среда), и три лунки, которые содержали SCM.
Через 3 дня содержимое всех лунок трипсинизировали и считали общее количество клеток, используя стандартные способы. Количество клеток пересчитывали на 9х105 клеток подслоя. Результаты следуют:
Подобный эксперимент проводили со следующими результатами:
Более того, как показывают следующие результаты, когда в среду добавляли клетки ES-D3, эффект не был специфичным в отношении той или иной клеточной линии:
ПРИМЕР 3
Пример 2 показал, что ингибирующее пролиферацию действие стволовых клеток не было специфичным в отношении клеточной линии. В представленных в описании экспериментах исследовали способность пойманных в ловушку стволовых клеток ингибировать пролиферацию раковых клеток.
В указанных экспериментах исследовали опухолевые клетки RENCA. Всего 15000 опухолевых клеток высевали на лунку. Применяли SCM (кондиционированную либо SCC-PSA1, либо ES-D3), описанную выше, с контрольной средой (среда В), также как описано.
Что касается SCM, кондиционирование происходило в течение 5 дней. Исследование проводили в течение периода 32 недель. Ингибирование клеток RENCA определяли фиксированием клеток 100% метанолом с последующим окрашиванием нейтральным красным, лизисом SDS и сканированием на спектрофотометре, чтобы определить количество нейтрального красного в клеточном лизате, которое пропорционально количеству клеток на лунку.
Результаты суммированы в следующих двух таблицах, в которых представлено действие стволовых клеток ES-D3 и SCC-PSA1 соответственно. Результаты для 1-3 недель коррелируют с результатами, рассматриваемыми в примере 1, то есть гибель изолированных стволовых клеток, достижение низкого уровня метаболической активности на 21 день с последующей регенерацией.
D3)
2,1%
8,8%
%
%
%
%
%
%
ПРИМЕР 4
В предшествующих экспериментах исследовали и подтвердили способность пойманных в ловушку стволовых клеток ингибировать пролиферацию стволовых и раковых клеток. В представленных далее экспериментах предполагали выяснить, могут ли пойманные в ловушку раковые клетки ингибировать пролиферацию стволовых клеток.
Стволовые клетки высевали и культивировали таким же способом, как описано выше. Гранулы, содержащие клетки RENCA, полученные, как описано в патентах США 6303151, 6224912 и 5888497, культивировали в среде В, чтобы кондиционировать ее в течение 5 дней. Полученную RENCA-кондиционированную среду (RCM) затем добавляли к высеянным стволовым клеткам, а стволовые клетки считали через 3 дня. Результаты, которые следуют, представляют сначала данные для клеток ES-D3, затем для клеток SCC-PSA1:
Полученные результаты показывают, что заключенные в ловушку раковые клетки ингибировали пролиферацию стволовых клеток.
ПРИМЕР 5
Вопросом обсуждения при исследовании стволовых клеток является факт, что по своей природе стволовые клетки дифференцируются. Так как трудно получать стволовые клетки и предохранять их от дифференцировки, во-первых, желательно иметь подходящую методологию, согласно которой стволовые клетки можно сохранять в их недифференцированном состоянии настолько долго, насколько возможно.
С этой целью стволовые клетки заключали в ловушку, как описано в примере 1 выше. Полученные структуры хранили в среде В, описанной выше, и тестировали в течение периода более двух лет.
В течение упомянутого двухлетнего периода стволовые клетки высвобождали из фиксирующих структур и культивировали при стандартных условиях (включая добавку сокультур STO и среды LIF). Во всех случаях высвобожденные клетки создавали традиционный монослой стволовых клеток, которые пролиферировали на манер недифференцированных клеток, но сохраняли способность дифференцироваться спонтанно. Это показывает, что захват в ловушку стволовых клеток может поддерживать их недифференцированный фенотип в течение более чем двухлетнего периода в отсутствие традиционно необходимых ингибиторов дифференцировки (например, STO и LIF).
Несмотря на приведенный факт, если клетки не получают необходимые вещества, спустя короткий период они начинают дифференцироваться.
Приведенные выше примеры описывают изобретение, которое включает в себя, помимо прочего, композиции материала, которые можно использовать, чтобы продуцировать вещество, которое подавляет пролиферацию клеток, таких как раковые клетки и стволовые, не ограничиваясь указанными клетками. Указанные композиции содержат стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, заключенные в ловушку из избирательно проницаемого материала с образованием структуры, которая ограничивает пролиферацию пойманных клеток. В результате рестрикции клетки продуцируют неожиданно большое количество вещества, которое подавляет пролиферацию других клеток. Клетки в состоянии рестрикции продуцируют больше вещества, чем аналогичные клетки, не находящиеся в состоянии рестрикции.
Материал, используемый для создания структур согласно изобретению, может включать в себя биосовместимый материал, который обеспечивает рестрикцию роста (ограничивает рост) стволовых клеток, тем самым индуцируя продуцирование ими большего количества вещества, подавляющего клеточный рост и пролиферацию. Структура имеет подходящий размер пор для того, чтобы вышеуказанное вещество могло диффундировать во внешнюю среду, а также для того, чтобы предохранять продукты или клетки от проникновения иммунной системы хозяина в структуры и от индукции отторжения клеток или иного ухудшения их способности выживать и продолжать продуцировать требуемое вещество. Материалы, используемые для образования структуры, также должны быть способны поддерживать жизнеспособность (с ограниченной пролиферацией, но выживающие) клеток как in vitro, так и in vivo, предпочтительно в период до нескольких лет, посредством обеспечения поступления надлежащих питательных веществ и удаления продуктов клеточных отходов, и должны быть совместимы с физико-химической внутриструктурной средой. Полученные структуры обеспечивают среду, подходящую для продолжительного изучения стволовых клеток и различных факторов их дифференцировки, транскрипции и ядерных факторов. Результаты можно использовать, чтобы направлять желаемую дифференцировку других стволовых клеток. Материалы, используемые для приготовления структуры, предпочтительно должны быть очень устойчивыми, когда имплантированы in vivo, наиболее предпочтительно в течение всего периода имплантации у хозяина.
Неограничивающий список материалов и комбинаций материалов, которые могут быть использованы, включает в себя альгинат-поли-(L-лизин), альгинат-поли-(L-лизин)-альгинат, альгинат-поли-(L-лизин)-полиэтиленимин, хитозан-альгинат, полигидроксиэтил-метакрилат-метил-метакрилат, карбонилметилцеллюлозу, К-караген, хитозан, агароза-полиэфир-сульфон-гексади-метирин-бромид (полибрен), этилцеллюлозу, силикагели и их комбинации.
Структуры, которые содержат композиции материала, могут иметь разнообразные формы, такие как гранула, сфера, цилиндр, капсула, лист или любая другая форма, которая подходит для имплантации субъекту, и/или культура в среде in vitro. Размер структуры может варьировать в зависимости от ее возможного применения, что должно быть ясно квалифицированному специалисту.
Структуры согласно изобретению являются избирательно проницаемыми, с тем, чтобы питательные вещества могли входить в структуру, и с тем, чтобы ингибирующее пролиферацию вещество, а также клеточные отходы могли покидать структуру. Для применения in vivo предпочтительно, чтобы структуры предотвращали проникновение продуктов или клеток иммунной системы хозяина, которые могут вызывать отторжение клеток или иное ухудшение способности клеток продуцировать вещество, подавляющее пролиферацию.
Используемый в описании термин «пойманный в ловушку» означает, что клетки содержатся в структуре, которая предотвращает их проникновение в среду, окружающую структуру, то есть среду in vitro или in vivo. Несмотря на неспособность проникать из структуры, клетки находятся внутри структуры, которая допускает как поступление молекул, таких как вода, питательные вещества и так далее, так и проникновение из структуры клеточных отходов и молекулярных продуктов, продуцируемых клетками. Структура, в которой клетки содержатся, таким образом, поддерживает постоянную жизнеспособность и выживаемость клеток в течение длительного периода. Это также может зависеть от природы структуры/материала, фактора клеток, который содержится в них, чтобы изменить их поведение, включающее в себя такое поведение, как пролиферация, состояние дифференцировки и/или фенотипической экспрессии, не ограничиваясь перечисленным. При ингибировании дифференцировки структура de facto имеет запоминающее устройство, используемое для сохранения стволовых клеток как стволовые клетки. Типичные, но не исключительные способы захвата клеток включают в себя их инкапсулирование, их отгораживание или окружение их со всех сторон иным некоторым проницаемым материалом. Путем захвата ингибируют пролиферацию захваченных стволовых клеток. Кроме того, существуют ситуации, когда по крайней мере часть популяции, которую помещают в ловушку, также не подвергается какой-либо дифференцировке.
Другой аспект изобретения включает в себя композиции, которые используют при подавлении клеточной пролиферации. Композиции готовят, культивируя подвергнутые рестрикции клетки, как описано выше, в подходящей культуральной среде с последующим извлечением полученной кондиционированной среды. Концентраты затем могут быть получены из кондиционированной среды.
Изобретение не ограничено каким-либо определенным типом стволовых клеток; любой тип стволовых клеток можно использовать согласно изобретению. Показательными типами клеток, которые можно использовать, являются стволовые клетки человека и мыши, а также стволовые клетки других видов, особенно видов млекопитающих. Эмбриональные стволовые клетки являются особо предпочтительными, но стволовые клетки, полученные из различных органов и/или органных систем, также могут быть использованы.
Как должно быть ясно из данного описания, следующим аспектом изобретения являются терапевтические способы лечения индивидов, страдающих нарушениями клеточной пролиферации, такими как поликистозное заболевание почек, гипертрофическая тканевая реакция (включая образование рубцов), аутоиммунное заболевание, лимфопролиферативные нарушения, истинная полицитемия, а также как доброкачественная, так и злокачественная клеточная неоплазия. При использовании в терапевтическом контексте, который будет рассмотрен ниже, тип клетки, подвергнутой рестрикции в структуре, не обязательно является тем же типом клетки, который является причиной нарушения, от которого страдает индивид, хотя может им и быть. Один такой способ включает в себя введение по меньшей мере одной из структур согласно изобретению субъекту в количестве, достаточном, чтобы вызвать подавление клеточной пролиферации у субъекта. Предпочтительно субъектом является человек, хотя способ применим и к другим животным, таким как домашние животные, фермерские животные или любой тип животного.
Композицию согласно изобретению можно применять как основную терапию при лечении различных клеточных пролиферативных нарушений и как вспомогательное лечение в комбинации с другими терапиями. Например, при неопластических нарушениях, таких как рак, пациентов можно лечить композициями и по способам, предлагаемыми в изобретении, в сочетании с лучевой терапией, химиотерапией или с лечением другими биологически активными средствами, такими как цитокины, антисмысловые молекулы, стероидные гормоны, или в сочетании с генной терапией и тому подобным. Кроме того, композиции и способы согласно изобретению можно применять вместе с хирургическими методами лечения, чтобы лечить нарушения, такие как рак, например, путем имплантации таких структур после удаления опухоли, чтобы предотвратить повторный рост и метастазирование. При раковых заболеваниях в неоперабельном состоянии можно действенно оказывать помощь лечением антипролиферативными композициями согласно изобретению. Избыточную пролиферацию клеток, которая не является необходимой или желательной для надлежащей функции системы органов, но не является неопластической, такую как истинная полицитемия или поликистозное заболевание почек, также можно лечить предлагаемыми способами. При гиперпролиферативных нарушениях, таких как истинная полицитемия и поликистозное заболевание почек, вовлекаются клетки, которые проявляют избыточную пролиферацию, но в остальном нормальные (то есть не неопластические или трансформированные) клетки. Такие нарушения, дающие в результате многочисленные клетки, которые не являются необходимыми или желательными для надлежащей функции системы органов, также можно лечить предлагаемыми способами. Дополнительно, состояния, которые характеризуются гиперпролиферативными, нормальными клетками, такие как гипертрофические рубцы, также можно лечить подобным образом. При состояниях, таких как упомянутое состояние, нормальные клетки, то есть фибробласты, пролиферируют сверх того, что необходимо для заживления, но, в отличие от неоплазии, они не характеризуются другой, протекающей иным образом, нерегулируемой пролиферацией. Другие состояния, которые характеризуются подобным феноменом, хорошо известны специалистам, и нет необходимости их обсуждать.
Композиции согласно изобретению также можно применять профилактически индивидам с риском развития нарушений клеточной пролиферации, субъектам, у которых установлено наличие индивидуальных факторов риска, имеется семейный анамнез нарушения вообще, семейный анамнез специфического типа (например, рак молочной железы) и возможность профессионального заболевания и другие факторы. Для профилактики рака, например, профилактически эффективное количество структур согласно изобретению вводят индивиду при идентификации одного или более факторов риска.
Как показано с помощью примеров выше, антипролиферативное действие не ограничено ни типом используемых клеток, ни видом, из которого происходят стволовые клетки. Следовательно, можно вводить структуры, которые содержат стволовые клетки первого типа, субъекту другого вида. Например, мышиные стволовые клетки могут быть заключены в структуре согласно изобретению, а затем введены человеку. Конечно, структуры могут содержать стволовые клетки от того же самого вида, который лечат. Кроме того, стволовые клетки можно получать от индивида, которого лечат, помещать в ловушку и подвергать рестрикции в структуре, а затем вводить тому же самому индивиду.
Способы создания структур согласно изобретению также являются частью изобретения.
Другие аспекты изобретения будут понятны специалистам в данной области, и нет необходимости их обсуждать.
Употребляемые здесь термины и выражения использованы для описания, а не для ограничения, и не подразумевается, что любые эквиваленты представленных здесь признаков или их частей, а также различные их модификации входят в объем, охватываемый настоящим изобретением.
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоинженерии, а именно к стволовым клеткам. Предложены композиция для ингибирования пролиферации стволовых клеток млекопитающего, заключенных в структуру, содержащую агарозу, а также способы ингибирования других, не заключенных в ловушку клеток, включая стволовые клетки и раковые и/или гиперпролиферативные клетки. Изобретение может быть использовано при лечении клеточных пролиферативных заболеваний. 4 н. и 22 з.п. ф-лы.
| US 6303151, 16.10.2001 | |||
| US 6224912, 01.05.2001. |
