СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ ГИПЕРРЕАКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей у больных персистирующей бронхиальной астмой легкой и средней степени тяжести.

В качестве прототипа выбран способ прогнозирования неспецифической гиперреактивности дыхательных путей на метахолин у больных бронхиальной астмой путей в зависимости от генотипа по полиморфизму гена β₂-адренорецепторов (ADRB2), заключающийся в генотипировании обследуемого больного по полиморфизму Arg16Gly и прогнозе гиперреактивности дыхательных путей при выявлении генотипа АА (1). Недостатком данного способа является ограниченность его применения только для прогнозирования гиперреактивности в ответ на метахолин, поскольку полиморфизмы генов, специфичных для осмотической гиперреактивности дыхательных путей, не учитываются. Кроме этого, способ не учитывает состояние функции внешнего дыхания и не предоставляет количественной оценки риска формирования гиперреактивности.

Задачей настоящего изобретения являлось создание способа прогнозирования риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой путем оценки специфического генетического маркера и функциональных показателей дыхательной системы.

Поставленная задача достигается тем, что оценка риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей проводится на основании данных генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs6606743 гена осморецепторных катионных каналов TRPV4, при этом дополнительно учитывается спирометрическая оценка функции внешнего дыхания.

Способ осуществляют следующим образом

1. Производят генотипирование полиморфизма rs6606743 гена TRPV4. Для этого выделяют геномную ДНК и с помощью полимеразной цепной реакции осуществляют амплификацию участка гена TRPV4, содержащего исследуемый полиморфизм. Структура праймеров для реакции: прямой - 5-ACAAGAGAGGGTGGCAGTGGGT-3, обратный - 5-TCTGTCGCCCCCTACTCACAGGATC-3. Смесь для ПНР объемом 25 мкл включает: 100 нг ДНК, 1× ПЦР буфер, 0.2 мкмоль/л каждого праймера, 0.2 ммол/л каждого dNTP, 1.5 ммол/л MgCl2 и 1 ед. Tag полимеразы. Амплификация проводится в следующем температурном режиме: 95°С/2 мин - первый цикл, затем 35 циклов: 95°С/30 с, 60°С/30 с, 72°С/30 с, последний цикл 72°С/5 мин. Полученный ПНР-продукт длиной 114 пн подвергают рестрикции с 10 ед. рестриктазы TaqI (инкубация при 37°С в течение 16 часов). Продукт разрезается рестриктазой при наличии аллеля G на два фрагмента 90 и 24 пн. Детекция продуктов амплификации и рестрикции проводится методом электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. При детекции на трансиллюминаторе в случае генотипа АА в геле видны фрагменты длиной 114 пн, AG - 114, 90 и 24 пн, GG - 90 и 24 пн.

2. Проводят спирометрическое исследование с оценкой показателей объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ₁), форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) и соотношения ОФВ₁/ФЖЕЛ.

3. Определяют риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей. Для этого вычисляют значение F по формуле

где TRPV4 - переменная, отражающая генотип по полиморфизму rs6606743 гена TRPV4 и принимающая значение «1» при наличии аллеля G в генотипе (AG, GG) и «0» - при его отсутствии (АА).

Вероятность (Р) рассчитывают по формуле

где е - константа (основание натурального логарифма, приближенно равное 2,718);

F - значение, полученное вычислением по формуле, приведенной выше.

Полученную вероятность сравнивают с граничным значением 0,46. При Р>0,46 прогнозируют повышенный риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей у больного.

Возможность использования предложенного способа для прогнозирования риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей подтверждает анализ, проведенный на выборке из 81 больного бронхиальной астмой европеоидной расы, проживающих на территории Амурской области. Средний возраст обследованных составил 37±9,5 лет. Персистирующая бронхиальная астма легкой и средней степени тяжести была диагностирована в 30% и 70% случаев соответственно.

Наличие осмотической гиперреактивности дыхательных путей определялось с помощью бронхопровокационной пробы с 3-минутной ингаляцией аэрозоля дистиллированной воды при комнатной температуре. Снижение объема формированного выдоха за 1 секунду, измеренного спирометрически, на 10% и более от исходного, расценивалось как осмотическая гиперреактивность. По результатам пробы осмотическая гиперреактивность дыхательных путей была выявлена у 45,7% больных. Средняя реакция ОФВ₁ составляла -15 (-19; -11)% среди больных с осмотической гиперреактивностью и -2,85 (-5,4; -0,85)% у больных без гиперреактивности. В группе больных с осмотической гиперреактивностью дыхательных путей регистрировалась большая частота встречаемости генотипов AG и GG (86,5%) по сравнению с больными без гиперреактивности (65,9%), р<0,03. Отношение шансов для генотипов составило 3.31, 95% Cl (1.07-10.25). Наличие осмотической гиперреактивности дыхательных путей также сопровождалось исходно сниженными значениями ОФВ₁ (р=0,03) и ОФВ₁/ФЖЕЛ (р=0,005). Использование уравнения биномиальной логистической регрессии с включением переменных генотипа и ОФВ₁/ФЖЕЛ показало наилучшие прогностические результаты с чувствительностью 76%, специфичностью 61% и точностью 68%.

Примеры использования заявленного способа

1. Больная Г., 40 лет. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, средней степени тяжести, неконтролируемое течение. При спирометрическом исследовании индекс ОФВ₁/ФЖЕЛ=70, по результатам генетического исследования выявлен генотип GG по полиморфизму rs6606743.

Полученное значение вероятности Р превышает 0,46, следовательно, риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей может расцениваться как высокий.

При проведении бронхопровокационной пробы с 3-минутной ингаляцией аэрозоля дистиллированной воды у больной развился бронхоспазм со снижением ОФВ₁ на 22%.

2. Больная Б., 36 лет. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, легкая персистирующая, неконтролируемое течение. При спирометрическом исследовании индекс ОФВ₁/ФЖЕЛ=100, по результатам генетического исследования выявлен генотип АА по полиморфизму rs6606743.

Полученное значение вероятности Р меньше 0,46, следовательно, риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей может расцениваться как низкий.

При проведении бронхопровокационной пробы с 3-минутной ингаляцией аэрозоля дистиллированной воды у больной параметры функции внешнего дыхания существенно не изменились, снижение ОФВ составило 4,9%.

Список литературы

1. ADRB2 Gly16Arg polymorphism, asthma control and lung function decline / Rebordosa C. et al. // Eur. Respir. J. 2011. Vol. 38, №5. P. 1029-1035.

Изобретение относится к области медицины. Сущность способа состоит в том, что с помощью метода полимеразной цепной реакции генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs6606743 гена катионных каналов с транзиторным рецепторным потенциалом TRPV4, дополнительно проводят спирометрическое измерение объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ₁) и форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) с вычислением отношения ОФВ₁/ФЖЕЛ. Рассчитывают вероятность формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей (Р) по формуле. Сравнивая полученную вероятность с граничным значением 0,46, определяют риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей. При величине Р больше граничного значения прогнозируют повышенный риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей. Использование заявленного способа обеспечивает новый критерий для прогнозирования риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой с высокой точностью. 2 пр.

Способ прогнозирования риска формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, отличающийся тем, что генотипируют однонуклеотидный полиморфизм rs6606743 гена TRPV4, учитывают спирометрический индекс - отношение объема форсированного выдоха за 1 секунду к форсированной жизненной емкости легких (ОФВ₁/ФЖЕЛ), вычисляют значение F по формуле F=5,323316-0,065683×(ОФВ₁/ФЖЕЛ)+0,68213×TRPV4,
где TRPV4 - переменная, отражающая генотип по полиморфизму rs6606743 гена TRPV4 и принимающая значение 1 при наличии аллеля G в генотипе и 0 - при его отсутствии;
рассчитывают вероятность (Р) формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей по формуле P=1/(1+e^-F),
где е - основание натурального логарифма, равное 2,718;
F - значение, полученное вычислением по формуле, приведенной выше;
при Р>0,46 прогнозируют повышенный риск формирования осмотической гиперреактивности дыхательных путей.