Способ прогнозирования риска клинически значимого снижения контроля бронхиальной астмы в сезон с высокой влажностью воздуха Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 A61B5/91 G16H50/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования риска клинически значимого снижения контроля бронхиальной астмы (БА), вызванного увеличением относительной влажности воздуха до уровня 70% и более в теплый сезон года.

Одним из важнейших физических факторов окружающей среды, способных оказывать влияние на клиническое течение БА, является относительная влажность воздуха. Как было показано ранее, с наступлением теплого и влажного сезона года (уровень относительной влажности воздуха 70% и более) у значительного числа пациентов снижается вентиляционная функция легких (ВФЛ), увеличивается количество больных, реагирующих на бронхопровокационную пробу с ультразвуковой ингаляцией дистиллированной воды (ИДВ), а также усиливается степень выраженности реакции бронхов на данный стимул, что ведет к потере контроля БА. Наличие осмотической гиперреактивности дыхательных путей (ОГДП) у больных утяжеляет течение БА в неблагоприятный сезон года [1]. Это диктует необходимость заблаговременного пересмотра и коррекции базисной терапии у таких больных для предотвращения ухудшения клинико-функциональных показателей. С целью выявления больных БА, предрасположенных к снижению контроля заболевания на фоне сезонного увеличения влажности воздуха, и оптимизации проводимого лечения, был разработан предлагаемый способ, учитывающий не только клинико-функциональные, но и молекулярно-генетические особенности пациента.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования недостижения контроля БА у больных с ОГДП [2]. При этом проводят бронхопровокационную пробу с ИДВ, подсчитывают изменение объема форсированного выдоха за 1 секунду на 1-й минуте после пробы ИДВ в процентах от исходного значения (ΔОФВ1_ИДВ), затем осуществляют прогнозирование посредством сравнения расчетной величины дискриминантной функции (D) с граничным значением. При величине D ≥ 17,86 прогнозируют недостижение контроля заболевания в теплый сезон года с высокой относительной влажностью воздуха. Недостатками данного способа являются:

1. Способ рассчитан на применение только среди больных БА с ОГДП, базовое значение ОФВ1 у которых составляет не менее 75% от должного, поскольку в противном случае проведение пробы с ИДВ противопоказано.

2. Возможность развития тяжелого приступа удушья вследствие проведения бронхопровокационной пробы с ИДВ, а также необходимость наличия препаратов и присутствия среднего медицинского персонала для оказания неотложной помощи в случае возникновения выраженной бронхоконстрикторной реакции.

3. Способ не принимает во внимание индивидуальную вариабельность последовательности генов, кодирующих белки, обеспечивающие осмотическую чувствительность клеток.

4. Не учитывается исходный уровень контроля согласно вопроснику «Asthma Control Test» (ACT) [3] и прогнозируемая клиническая значимость снижения контроля.

Целью предлагаемого изобретения являлось создание способа, позволяющего прогнозировать клинически значимое снижение контроля БА с увеличением относительной влажности воздуха в теплый сезон года, и учитывающего факторы генетической предрасположенности, ассоциированные с особенностями осморецепторного аппарата дыхательных путей.

Цель достигается за счет того, что для прогнозирования отрицательной динамики контроля БА проводят генотипирование полиморфизмов AQP5 rs1964676 и TRPV4 rs3825394, измеряют параметры ВФЛ методом спирометрии, а также определяют исходный уровень контроля БА согласно вопроснику ACT в теплый сезон года с низкой относительной влажностью воздуха.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выполняют оценку контроля БА в баллах с помощью вопросника АСТ, состоящего из пяти вопросов, с оценкой каждого вопроса по пятибалльной шкале и суммированием результатов ответов.

2. Оценивают индекс Тиффно (ИТ), пиковою объемную скорость (ПОС) и максимальную объемную скорость на уровне 50% форсированной жизненной емкости легких (МОС50) по данным кривой "поток-объем" форсированного выдоха, полученной при выполнении стандартного спирометрического исследования.

3. Производят генотипирование полиморфизмов TRPV4 rs3825394 и AQP5 rs1964676. Для генотипирования полиморфизма rs3825394 гена TRPV4 выделяют геномную ДНК и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляют амплификацию целевого участка гена TRPV4, содержащего полиморфный сайт. Смесь для ПЦР должна включать: ДНК – 50 нг, буфер для ПЦР 1х, MgCl₂ – 2,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты – 0,25 мМ, прямой праймер – 0,02 мкМ, обратный праймер – 0,5 мкМ, флуоресцентный зонд – 0,5 мкМ, Hot-Start Taq-полимераза – 1 ЕД, вода – до 25 мкл. Последовательность олигонуклеотидов, используемых в реакции: праймер прямой 5`- TGAGGAAACAGGCTTGGAGAGGAGAT-3`, обратный 5`-GTAGATGTCACGGAAGGGC-3`, зонд 5`-FAM-CGGTCGCAACATGAGGGAGGACCG-BHQ1-3`. Амплификацию проводят в следующем температурном режиме: первоначальная денатурация при 95°С/1,5 мин.; первые 25 циклов – денатурация при 95°С/1 сек., отжиг/элонгация при 64°С/15 сек.; последующие 45 циклов – денатурация при 95°С/1 сек., отжиг/элонгация при 61°С/15 сек.; финальная элонгация при 72°С/5 мин. Непосредственно после амплификации проводят анализ плавления олигонуклеотидного зонда, для этого выполняют предварительную денатурацию при 95°С/3 мин., гибридизацию при 30°С/3 мин., а затем увеличивают температуру от 30°С до 70°С с шагом 0,5°С/5 сек. Используя программное обеспечение амплификатора, на каждом шаге регистрируют уровень флуоресцентного сигнала на канале FAM. Получаемые при этом кривые плавления, отражающие зависимость производной уровня флуоресценции от температуры, позволяют идентифицировать конкретные генотипы. Одиночные пики плавления на 49°С и 46°С соответствуют генотипам AA и CC, а одновременное присутствие двух пиков – гетерозиготному генотипу AC.

Генотипирование полиморфизма rs1964676 гена AQP5 осуществляют аналогичным способом. Реакционная смесь для ПЦР должна включать: ДНК – 50 нг, буфер для ПЦР 1х, MgCl₂ – 2,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты – 0,25 мМ, прямой праймер – 0,02 мкМ, обратный праймер – 0,5 мкМ, флуоресцентный зонд – 0,5 мкМ, Hot-Start Taq-полимераза – 1 ЕД, вода – до 25 мкл. Последовательность олигонуклеотидов, используемых в реакции: праймер прямой 5`- GCTACCCAATAAATCACTGATACTCAC-3`, обратный 5`-CCTGCTCTGTTCCCAT-3`, зонд 5`-FAM-CGGCTCGTTCCACCTCTGTCTAGCCG-BHQ1-3`. Амплификацию проводят в следующем температурном режиме: первоначальная денатурация при 95°С/1,5 мин.; первые 25 циклов – денатурация при 95°С/1 сек., отжиг/элонгация при 62°С/15 сек.; последующие 45 циклов – денатурация при 95°С/1 сек., отжиг/элонгация при 58°С/15 сек.; финальная элонгация при 72°С/5 мин. Непосредственно после амплификации проводят анализ плавления олигонуклеотидного зонда, для этого выполняют предварительную денатурацию при 95°С/3 мин., гибридизацию при 30°С/3 мин., а затем увеличивают температуру от 30°С до 70°С с шагом 0,5°/5 сек. Используя программное обеспечение амплификатора, на каждом шаге регистрируют уровень флуоресцентного сигнала на канале FAM. Получаемые при этом кривые плавления, отражающие зависимость производной уровня флуоресценции от температуры, позволяют идентифицировать конкретные генотипы. Одиночные пики плавления на 50°С и 43°С соответствуют генотипам GG и AA, а одновременное присутствие двух пиков – гетерозиготному генотипу AG.

4. Используя полученные данные, вычисляют значение F, решая уравнение:

где: rs3825394 – переменная, принимающая значение 1 в случае генотипа AA по полиморфизму TRPV4 rs3825394 и значение 0 в случае генотипов AC или CC;

rs1964676 – переменная, принимающая значение 1 в случае генотипа GG по полиморфизму AQP5 rs1964676 и значение 0 в случае генотипов AG или AA;

ИТ, ПОС и МОС50 – индекс Тиффно, пиковая объемная скорость и максимальная объемная скорость на уровне 50% форсированной жизненной емкости легких, соответственно, измеренные спирометрически, выраженные в % от должного значения;

ACT – показатель контроля БА в баллах, полученный с помощью вопросника ACT.

5. Определяют вероятность сезонного снижения контроля (P), подставляя ранее полученное значение F в уравнение:

P = 1 / (1 + e^-F),

где e – математическая константа, основание натурального логарифма, равное 2,718;

F – значение, полученное решением уравнения логистической регрессии (1).

Полученную вероятность P сравнивают с граничным значением 0,87. В случае P > 0,87, прогнозируют снижение контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого и влажного сезона года. При P ≤ 0,87 больного относят в группу низкого риска по снижению уровня контроля заболевания в теплый сезон с высокой влажностью воздуха.

Апробация способа проведена на 82 пациентах персистирующей БА, обследованных в динамике в теплые сезоны с низкой и высокой относительной влажностью воздуха. Отмечено, что полиморфизмы AQP5 rs1964676 и TRPV4 rs3825394 значимо влияли на контроль заболевания. Так, носители генотипа GG по полиморфизму AQP5 rs1964676 чаще встречались среди больных со снижением ACT≥5 баллов, чем среди тех, у кого такого снижения не происходило (33,3% против 8,7%, p=0,01). Аналогичным образом, носители с генотипом AA по полиморфизму TRPV4 rs3825394 преобладали среди пациентов с существенной отрицательной динамикой контроля, по сравнению с теми больными, у кого контроль снижался менее, чем на 5 баллов, либо возрастал (50,0% против 15,8%, p=0,007). Использование разработанного уравнения с включением переменных генотипов полиморфизмов rs3825394 гена TRPV4 и rs1964676 гена AQP5, значения показателей ИТ (%), ПОС (%) и МОС50 (%), результата АСТ в баллах, показало следующие прогностические характеристики: чувствительность – 83%, специфичность – 84%, точность – 84%.

Примеры использования заявляемого способа:

1. Пациент Н., 46 лет. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, средней степени тяжести, частично контролируемое течение. ДН 0 ст. Обратился в клинику в апреле 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха менее 70%). Результаты обследования: определен генотип АА по полиморфизму TRPV4 rs3825394 и генотип GG по AQP5 rs1964676; по данным спирометрии ИТ 82%, ПОС 88%, МОС50 64%; АСТ – 21 балл.

F = 14,32655 + 1,68496 × TRPV4 + 1,66128 × AQP5 - 0,19574 × ИТ - 0,06516 × ПОС + 0,08036 × МОС50 + 0,2803 × ACT = 14,32655 + 1,68496 × 1 + 1,66128 ×1 - 0,19574 × 82 - 0,06516 × 88 + 0,08036 × 64 + 0,2803 × 21 = 6,91737

P = 1 / (1 + e^-F) = 1 / (1 + 2,718^-6,91737) = 0,999

Полученное значение вероятности P превышает 0,87, следовательно, риск снижение контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого сезона года с высокой влажностью воздуха может расцениваться как высокий. Пациент явился на контрольный визит в клинику в июле 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха более 70%). Результат АСТ составил 15 баллов, что соответствует неконтролируемому течению БА.

2. Пациентка Б., 32 года. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, средней степени тяжести, частично контролируемое течение. ДН 0 ст. Обратилась в клинику в мае 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха менее 70%). Результаты обследования: определен генотип АС по полиморфизму TRPV4 rs3825394 и генотип GG по полимофизму AQP5 rs1964676; по данным спирометрии ИТ 85%, ПОС 94%, МОС50 72%; АСТ – 24 балла.

F = 14,32655 + 1,68496 × TRPV4 + 1,66128 × AQP5 - 0,19574 × ИТ - 0,06516 × ПОС + 0,08036 × МОС50 + 0,2803 × ACT = 14,32655 + 1,68496 × 0 + 1,66128 × 1 - 0,19574 × 85 - 0,06516 × 94 + 0,08036 × 72 + 0,2803 × 24 = 5,73801

P = 1 / (1 + e^-F) = 1 / (1 + 2,718 ^-5,73801) = 0,997

Полученное значение вероятности P превышает 0,87, следовательно, риск снижение контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого сезона года с высокой влажностью воздуха может расцениваться как высокий. Пациентка явилась на контрольный визит в клинику в июле 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха более 70%). Результат АСТ составил 17 баллов, что соответствует неконтролируемому течению БА.

3. Пациентка Р., 51 год. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, легкое персистирующее частично контролируемое течение. ДН 0 ст. Обратилась в клинику в апреле 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха менее 70%). Результаты обследования: определен генотип СС по полиморфизму TRPV4 rs3825394 и генотип АG по полиморфизму AQP5 rs1964676; по данным спирометрии ИТ 89%, ПОС 90%, МОС50 60%; АСТ – 20 баллов.

F = 14,32655 + 1,68496 × TRPV4 + 1,66128 × AQP5 - 0,19574 × ИТ - 0,06516 × ПОС + 0,08036 × МОС50 + 0,2803 × ACT = 14,32655 + 1,68496 × 0 + 1,66128 × 0 - 0,19574 × 89 - 0,06516 × 90 + 0,08036 × 60 + 0,2803 × 20 = 1,46889

P = 1 / (1 + e^-F) = 1 / (1 + 2,718^-1,46889) = 0,813

Полученное значение вероятности P не превышает 0,87, следовательно, риск снижение контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого сезона года с высокой влажностью воздуха может расцениваться как низкий. Пациентка явилась на контрольный визит в клинику в августе 2021 года (теплый сезон года с влажностью воздуха более 70%). Результат АСТ составил 22 балла, что соответствует частично контролируемому течению БА.

Список используемой литературы:

1. Afanaseva E., Prikhodko A.G., Perelman J.M. Seasonal dynamics of osmotic airway responsiveness in patients with asthma // Amer. J. Respir. Crit. Care Med. 2020. Vol. 201: A5642. doi: 10.1164/ajrccm-conference.2020.201.1_MeetingAbstracts.A5642.

2. RU 2738567 C1, Афанасьева Е.Ю. и др. «Способ прогнозирования недостижения контроля бронхиальной астмы у больных с осмотической гиперреактивностью дыхательных путей», 2020.12.14.

3. Schatz M. et al. Asthma Control Test: reliability, validity, and responsiveness in patients not previously followed by asthma specialists // J. Allergy Clin. Immunol. 2006. Vol. 117. P.549–556.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования риска клинически значимого снижения контроля бронхиальной астмы (БА) с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более. В теплый сезон года с относительной влажностью воздуха менее 70% генотипируют однонуклеотидные полиморфизмы rs1964676 гена AQP5 и rs3825394 гена TRPV4. Спирометрически измеряют значение индекса Тиффно (ИТ), пиковую объемную скорость (ПОС) и максимальную объемную скорость на уровне 50% форсированной жизненной емкости легких (МОС50) и выражают их в % от должного значения. Учитывают результат оценки контроля БА по вопроснику Asthma Control Test (ACT). Вычисляют значение F по формуле (1): F = 14,32655 + 1,68496 × rs3825394 + 1,66128 × rs1964676 - 0,19574 × ИТ - 0,06516 × ПОС + 0,08036 × МОС50 + 0,2803 × ACT. Рассчитывают вероятность риска клинически значимого снижения контроля заболевания по формуле: P=1/(1+е^-F), где F – значение, полученное вычислением по формуле (1). При P>0,87 прогнозируют высокий риск снижения контроля БА на 5 и более баллов от исходного согласно вопроснику ACT с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более. При P≤0,87 прогнозируют низкий риск снижения контроля БА на 5 и более баллов от исходного согласно вопроснику ACT с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более. Способ обеспечивает возможность прогнозирования клинически значимого снижения контроля БА с увеличением относительной влажности воздуха в теплый сезон года за счет использования оригинальной расчетной формулы, учитывающей данные генотипирования, параметры вентиляционной функции легких и исходный уровень контроля БА согласно вопроснику ACT. 3 пр.

Способ прогнозирования риска клинически значимого снижения контроля бронхиальной астмы (БА) с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более, отличающийся тем, что в теплый сезон года с относительной влажностью воздуха менее 70% генотипируют однонуклеотидные полиморфизмы rs1964676 гена AQP5 и rs3825394 гена TRPV4, спирометрически измеряют значение индекса Тиффно, пиковую объемную скорость и максимальную объемную скорость на уровне 50% форсированной жизненной емкости легких и выражают их в % от должного значения, учитывают результат оценки контроля БА по вопроснику Asthma Control Test (ACT), вычисляют значение F по формуле (1):

F = 14,32655 + 1,68496 × rs3825394 + 1,66128 × rs1964676 - 0,19574 × ИТ - 0,06516 × ПОС + 0,08036 × МОС50 + 0,2803 × ACT,

где rs3825394 – переменная, принимающая значение 1 в случае генотипа AA по полиморфизму TRPV4 rs3825394 и значение 0 в случае генотипов AC или CC;

rs1964676 – переменная, принимающая значение 1 в случае генотипа GG по полиморфизму AQP5 rs1964676 и значение 0 в случае генотипов AG или AA;

ИТ – индекс Тиффно;

ПОС – пиковая объемная скорость;

МОС50 – максимальная объемная скорость на уровне 50% форсированной жизненной емкости легких;

ACT – показатель контроля БА в баллах, полученный с помощью вопросника ACT;

рассчитывают вероятность (P) риска клинически значимого снижения контроля заболевания по формуле:

P=1/(1+е^-F),

где e – основание натурального логарифма, равное 2,718;

F – значение, полученное вычислением по формуле (1);

при P>0,87 прогнозируют высокий риск снижения контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более, а при P≤0,87 прогнозируют низкий риск снижения контроля БА на 5 и более баллов от исходного, согласно вопроснику ACT, с наступлением теплого сезона с относительной влажностью воздуха 70% и более.