ОБНАРУЖЕНИЕ, ИЗМЕРЕНИЕ И ВИЗУАЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК, ТАКИХ КАК РАКОВЫЕ, И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ НАЦЕЛЕННЫХ НАНОЧАСТИЦ И ИХ МАГНИТНЫЕ СВОЙСТВА Российский патент 2016 года по МПК A61F2/02 

[0001] ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к in vivo обнаружению и измерению клеток или веществ с помощью нацеленных наночастиц и измерений магнитной релаксации, и особенно пригодно при обнаружении и измерении раковых клеток у людей.

[0002] ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раннее обнаружение заболевания обеспечивает максимальную вероятность успешного лечения и выздоровления. Более того, ранее обнаружение и определение локализации заболевания позволяет провести направленную терапию по отношению к месту заболевания, оптимизируя эффективность лечения. С помощью соответствующего устройства для обнаружения лечение можно подвергать мониторингу, дополнительно увеличивая эффективность применяемых лекарственных средств или других форм терапии. Способность нацеливаться на конкретные заболевания также может улучшить результаты лечения. Ранее обнаружение и локализация рака, второй основной причины смерти в США, может улучшить последствия для пациента. Все наиболее распространенные способы, используемые для клинических целей для обнаружения рака, являются неспецифическими, то есть они не могут провести различие между раковыми или доброкачественными опухолями, и ни один из них не приводит к 100% точности обнаружения. Все доступные способы имеют недостатки и слабые места, приводя к высоким уровням ложной диагностики и слишком низкому уровню достоверной диагностики, что вместе приводит к повышенным уровням смертности. Наиболее распространенные клинические методы, доступные в настоящее время, представляют собой: (1) рентгеновская маммография, (2) магнитно-резонансная томография (MRI) и (3) ультразвуковое сканирование с дополнительной опцией (4) позитрон-эмиссионной томографии (PET), если это доступно.

[0003] Измерение рентгеновского затухания дает информацию о плотности промежуточной среды и является одобренным FDA и наиболее распространенным устройством, применяемым для обнаружения различных форм заболевания и, в частности, рака. Он также отвечает за многие ложноотрицательные и ложноположительные результаты. Могут быть обнаружены раковые опухоли ранней стадии, но без специфичности в отношении того, являются ли они доброкачественными или раковыми опухолями. Артефакты могут быть вызваны здоровой тканью и давать ложноположительные результаты. Хотя доза является низкой, существует возрастающая проблема, касающаяся воздействия рентгеновских лучей и облучения в целом.

В общем, число ложноположительных результатов в рентгеновской визуализации рака остается высоким, и рентгеновский способ не может обнаружить опухоли на ранних стадиях.

[0004] Ультразвук применяют для обеспечения второго способа для визуализации опухолей. Ультразвук имеет превосходное контрастное разрешение, но страдает от ослабленного пространственного разрешения по сравнению с рентгеновскими лучами и другими техниками визуализации. Ультразвук в настоящее время не одобрен FDA в качестве основного способа скрининга рака, но обычно применяется как последующее врачебное наблюдение для исследования любых нарушений, обнаруженных в ходе стандартных процедур. Это - способ, часто применяемый для подтверждения сомнительных областей в рентгенограммах рака молочной железы и рака яичника.

[0005] MRI применяют для последующего врачебного наблюдения на потенциальных проблемных областях, наблюдаемых в ходе рентгеновских сканирований; однако, высокая стоимость MRI сканирования часто препятствует его применению. MRI может обнаружить небольшие нарушения в ткани, и он также пригоден при определении того, метастазировал ли рак. MRI с динамическим контрастированием (DCE) потенциально различает доброкачественные и раковые опухоли, но дает ряд ложноположительных результатов. Высокая стоимость MRI ограничивает его применения в качестве способа скрининга. При MRI-визуализации рака часто применяют магнитные наночастицы в качестве контрастных средств и это является признанным протоколом, обеспечивающим стандарты для введения таких наночастиц. Внутрисосудистые контрастные средства для MRI в дозе 2 мг/кг по весу наночастиц применялись для обнаружения метастатических поражений.

[0006] В связи с важностью раннего обнаружения заболевания существует разнообразие других техник, которые исследуются в настоящее время для визуализации. Они включают сцинтимаммографию с применением PET (позитронно-эмиссионная томография) или SPECT (однофонная эмиссионная компьютерная томография), импедансную томографию и различные формы RF-визуализации.

[0007] Ранее обнаружение повреждений, в то время как они все еще локализованы, является ключевым, поскольку уровень излечимости многих форм рака, обнаруженных рано, составляет около 100%. Существующие способы визуализации часто не определяют поражения, пока не произошел существенный рост. Существует происходящее в настоящее время исследование альтернативных способов, включая MRI, PET, ультразвук, сцинтиграфию и другие способы. В настоящее время ни один из этих способов не обладает специфичностью в отношении типа опухоли с помощью различий в свойствах ткани между раковой и нераковой тканью. В частности, точно необходим новый подход, не основанный на облучении, или очень дорогих процедурах и предлагающий очень ранее обнаружение опухолей. Настоящее изобретение обеспечивает новые возможности для обнаружения рака in vivo.

[0008] РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данная заявка относится к следующим заявкам, каждая из которых включена в данный документ ссылкой: США 61/259011, поданная 6 ноября 2009 года; 61/308897, поданная 27 февраля 2010 года; 61/314392, поданная 16 марта 2010 года; 61/331816, поданная 5 мая 2010 года; 61/361998, поданная 7 июля 2010 года; каждая из которых включена в данный документ ссылкой.

[0009] Настоящее изобретение обеспечивает устройства и способы для обнаружения клеток или веществ, таких как раковые клетки в ткани. Система содержит магнитную систему, включающую генератор магнитного поля, который воздействует известным магнитным полем на ткань субъекта, намагничивая нацеленные парамагнитные наночастицы, связанные с клетками или веществом, представляющими интерес; и включающую чувствительный магнитный сенсор, который может обнаруживать остаточное магнитное поле по мере затухания намагниченности наночастиц. Иллюстративная магнитная система содержит сенсор сверхпроводящего квантового интерференционного датчика, содержащий генератор магнитных импульсов, адаптированный применять однородное намагничивающее импульсное поле к раковой ткани пациента, помещенного на платформу для измерения; и детектор остаточного магнитного поля, адаптированный обнаруживать и визуализировать остаточное магнитное поле, произведенное воздействующим импульсным полем. Генератор магнитных импульсов может включать пару катушек Гельмгольца. Детектор остаточного магнитного поля может включать набор градиентометров. Другая иллюстративная магнитная система включает атомный магнитометр и набор атомных градиентометров - очень чувствительных сенсоров магнитного поля, которые можно применять для измерения очень слабых магнитных полей, основываясь на прецессии Лармора атомов в магнитном поле. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения атомный магнитометр включает набор микросхем, содержащий небольшую полость, содержащую ячейку-атомизатор. Эта испарительная ячейка содержит атомы Rb, и оптически накачивается циркулярно поляризованным лазерным лучом. Атомы подвергаются прецессии Лармора, и частота этой прецессии вызывает изменение в показателе рефракции пара в ответ на воздействующее магнитное поле. Второй лазер можно применять в качестве поля измерения для данного изменения рефракции, используя набор решеток для измерения изменений в интерференционной картине по мере изменения воздействующего магнитного поля. Испарительные ячейки могут быть отдельными или упорядоченными в конфигурации градиентометра для измерения изменений поля как функции от расстояния.

[0010] Способ согласно настоящему изобретению включает обеспечение магнитной системы; введение множества нацеленных (например, меченых антителом) парамагнитных наночастиц в субъекта для специфического связывания с раковыми клетками или другими клетками или веществом, представляющим интерес; воздействие известным (например, однородным) намагничивающим импульсным полем для намагничивания наночастиц в ткани субъекта; и обнаружение остаточного магнитного поля намагниченных наночастиц, тем самым обеспечивая визуализацию наночастиц, связанных с раковой тканью пациента. Нацеленная парамагнитная наночастица может содержать магнитный сердечник, покрытый биологически совместимым покрытием, к которому прикреплено по меньшей мере одно специфическое антитело. Например, магнитный сердечник может содержать ферромагнитный материал, такой как оксид железа. Примеры приемлемых нацеливающих средств, таких как антитела, описаны ниже.

[0011] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Сопроводительные графические материалы, которые включены в и образуют часть описания, иллюстрируют настоящее изобретение и, вместе с описанием, описывают настоящее изобретение. В графических материалах одинаковые элементы обозначены одинаковыми номерами.

[0012] Фиг.1 представляет собой схематическую иллюстрацию примерного приготовления ткани субъекта для измерения согласно настоящему изобретению.

Фиг.2(а, b, с, d) приводит схематическую иллюстрацию примера измерения согласно настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой схематическую иллюстрацию измерений из процесса, описанного в связи с Фиг.2.

Фиг.4 представляет собой схематическую иллюстрацию устройства, подходящего для применения в настоящем изобретении.

Фиг.5 представляет собой схематическую иллюстрацию образца устройства, использующего магнитные сенсоры сверхпроводящего квантового интерференционного датчика (SQUID).

Фиг.6 представляет собой схематическую иллюстрацию образца SQUID-сенсорного устройства, которое можно применять для исследований рака человека.

Фиг.7 представляет собой схематическую иллюстрацию и фотографию атомного магнитометра для измерений слабого поля.

Фиг.8 представляет собой схематическую иллюстрацию магнитной наночастицы с биологически совместимым покрытием и прикрепленными антителами для нацеливания на специфические клетки.

Фиг.9 представляет собой изображение числа сайтов Неr2 на клетку, рассчитанного путем сравнения с диапазоном микросфер с известными способностями к связыванию. Фиг.10 представляет собой иллюстрацию магнитных моментов двух клеточных линий рака молочной железы, MCF7/HER218 и MDA-MB-231, измеренных как функция от времени после инкубации с антителами к HER2/neu и наночастицами.

[0013] Фиг.11 представляет собой иллюстрацию магнитных моментов клеточных образцов, измеренных как функция от числа клеток путем разбавления в два раза пипетированием. Фиг.12 представляет собой иллюстрацию фантома с введенными ампулами с клетками MCF7, левый 2Е+06, правый=1Е+06 клеток.

Фиг.13 представляет собой фотографию бестимусной мыши под SQUID-системой. Фиг.14 содержит графики достоверности положений, полученных от опухолей у мышей. Фиг.15 представляет собой иллюстрацию магнитных контурных линий, наблюдаемых для 35 различных мест измерения.

Фиг.16 представляет собой иллюстрацию временной динамики измерений для двух мышей и обеих опухолей каждой мыши.

Фиг.17 представляет собой иллюстрацию результатов этих измерений и показывает очень хорошее соответствие с измерениями in vivo на живой мыши.

Фиг.18 представляет собой иллюстрацию 2-мерного 95% предела достоверности для местонахождений двух опухолей, наложенного на действительные опухоли мыши.

Фиг.19 представляет собой фотографию гистологии опухолей после выделения.

Фиг.20 представляет собой иллюстрацию рака яичника, показывающую рост опухоли на яичнике.

[0014] Фиг.21 представляет собой фотографию полноразмерного фантома яичника, помещенного под SQUID-сенсорное устройство на расстоянии, которое будет типичным для субъекта-пациента.

Фиг.22 представляет собой иллюстрацию результатов исследований чувствительности для живых клеток яичника, введенных в фантом, показанный на Фиг.21.

Фиг.23 представляет собой иллюстрацию подтверждение сайтов антител для этих клеток с помощью проточной цитометрии.

Фиг.24 представляет собой иллюстрацию магнитных моментов от магнитных наночастиц (от Ocean Nanotech), прикрепленных к опухолям рака яичника человека у живой мыши.

Фиг.25 представляет собой фотографию мыши, используемой для подтверждения того, что SQUID-сенсорный способ работает in vivo вместе с магнитными контурными полями от мыши. Фиг.26 представляет собой график измерения магнитного момента SQUID-сенсорной системы как функции от времени для инкубации прикрепляющихся магнитных наночастиц к клеточным линиям лимфомы.

Фиг.27 представляет собой иллюстрацию результатов измерений проточной цитометрии RS-кяеток из лимфатической системы при определении числа сайтов, доступных для наночастиц и обнаружения SQUID-сенсорами.

Фиг.28 представляет собой гистологический срез от пациента с болезнью Ходжкина.

[0015] СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Настоящее изобретение описано в контексте различных иллюстративных вариантов осуществления и применений. В некоторых частях описания выражение "обнаружение" применяют для краткости; настоящее изобретение может обеспечивать обнаружение присутствия клеток или веществ, измерение числа клеток или количества вещества, определение местонахождения клеток или вещества, определение изменения или скорости изменения в предыдущем, и подобные определения, все из которых включены в выражение "обнаружение".

[0016] Сначала описывают упрощенный пример измерения магнитной релаксации согласно настоящему изобретению. Фиг.1 представляет собой схематическую иллюстрацию примерного получения ткани субъекта для измерения согласно настоящему изобретению. Иллюстрации на фигуре являются очень упрощенными и предназначены только для простоты объяснения и не предназначены для отображения действительных форм, размеров, пропорций или сложностей действительных привлеченных материалов. Часть ткани 11, например орган, подлежащий исследованию, или известное или предполагаемое место опухоли, содержит несколько клеток представляющего интерес типа (показаны на фигуре как круги с "V"-образными структурами по периметру) и несколько клеток других типов (показаны на фигуре как овалы с прямоугольными структурами по периметру). Обеспечивают множество магнитных наночастиц 12, показанных на фигуре в виде небольших кружков. Также обеспечивают множество нацеливающих молекул 13, показанных на фигуре в виде небольших треугольников. Наночастицы и нацеливающие молекулы объединяют (или конъюгируют) с образованием нацеленных наночастиц 14.

Нацеленные наночастицы затем можно ввести в ткань 15. Клетки представляющего интерес типа имеют сайты связывания или другие аффинности к нацеливающей молекуле, проиллюстрированной на фигуре "V"-образными структурами по периметру таких клеток.

Нацеливающие молекулы прикрепляются к клеткам представляющего интерес типа, проиллюстрированным на фигуре треугольными нацеливающими молекулами, расположенными внутри "V'-образных структур. В целом, каждая клетка будет иметь большое количество таких сайтов связывания или аффинностей. Клетки других типов не имеют таких сайтов связывания или аффинностей, проиллюстрированы на фигуре овалами без прикрепленных нацеленных наночастиц. Нацеленные наночастицы, которые не связываются с клетками и остаются свободными в полученном образце, проиллюстрированы на фигуре небольшими кружками с прикрепленными треугольниками, которые не соединены с какой-либо специфической клеткой.

[0017] Фиг.2(а, b, с, d) приводят схематическую иллюстрацию иллюстративного измерения согласно настоящему изобретению. На Фиг.2а ткань является такой как на Фиг.1, с добавлением стрелок возле каждой наночастицы. Стрелки представляют намагниченность каждой наночастицы, и указывают на то, что намагниченность наночастиц в ткани является случайным (на фигуре стрелки показаны в одном из четырех направлений только для простоты иллюстрации; на практике намагниченность может иметь любое направление).

[0018] На Фиг.2b воздействуют внешним магнитным полем (представленным обведенной по контуру стрелкой в нижнем правом углу фигуры). Намагниченность наночастиц в ответ на воздействующее магнитное поле сейчас является однородным, представленным на фигуре с помощью всех стрелок намагниченности, указывающих в одном направлении.

[0019] Фиг.2 с иллюстрирует ткань через короткое время после того, как устраняют магнитное поле. Наночастицы, не связанные с клетками, свободны в своем перемещении в броуновском движении, и их намагниченность быстро возвращается произвольной, представленному на фигуре стрелками намагниченности несвязанных наночастиц, показывающими в разных направлениях. Наночастицы, связанные с клетками, однако, удерживаются от такого физического движения и, следовательно, их намагниченность остается, по существу, такой же, как и в присутствии воздействующего магнитного поля.

[0020] Фиг.2d иллюстрирует полученный образец через более длительный период времени после устранения воздействующего магнитного поля. Намагниченность связанных наночастиц теперь также возвратилась к произвольной.

[0021] Фиг.3 представляет собой схематическую иллюстрацию измерений из процесса, описанного в связи с Фиг.2. Магнитное поле показано как функция от времени в упрощенном представлении для простоты иллюстрации; в действительности на практике единицы, шкалы и формы сигналов могут быть различными и более сложными. В начале процесса, что соответствует состоянию Фиг.2а, намагниченность наночастиц является произвольной и воздействуют внешним магнитным полем. С этого момента времени намагниченность наночастиц является однородной, что соответствует состоянию Фиг.2b. Магнитное поле может игнорироваться в течение короткого промежутка времени до тех пор, пока несвязанные наночастицы не вернуться к случайной намагниченности, что соответствует состоянию Фиг.2с. Затем можно измерить намагниченность по мере перехода связанных наночастиц от однородной к случайной намагниченности, что соответствует состоянию Фиг.2d. Характеристики намагниченности при измерении от состояния Фиг.2с до состояния Фиг.2d связаны с числом связанных наночастиц в образце и, следовательно, с числом клеток представляющего интерес типа в образце.

[0022] Фиг.4 представляет собой схематическую иллюстрацию устройства, подходящего для применения в настоящем изобретении. Платформа 41 для субъекта сконфигурирована для размещения субъекта в координированном положении по отношению к остальному устройству. Намагничивающая система 42, например, катушки Гельмгольца, устанавливается относительно платформы для субъекта так, чтобы намагничивающая система могла воздействовать магнитным полем на образец. Магнитная сенсорная система 43 устанавливается относительно платформы для субъекта так, чтобы она смогла регистрировать малые магнитные поля, связанные с намагниченными наночастицами. Системой управляют и данные от сенсора анализируют с помощью системы управления и анализа 44; например, компьютером с соответствующей программой.

[0023] Фиг.5 представляет собой схематическую иллюстрацию образца устройства, использующего магнитные сенсоры сверхпроводящего квантового интерференционного датчика (SQUID). Резервуар Дьюара 51 для жидкого гелия вверху рисунка поддерживает температуру SQUID-сенсоров. Аксиальные SQUID-градиентометры 2-го порядка содержатся в белом выступе 52, проходящем через несущий каркас 53. Есть семь градиентометров, содержащихся в этом иллюстративном выступе; один в центре и 6 в круге с радиусом 2,15 см. Каждый градиентометр индуктивно соединен с низкотемпературным SQUID. Две кольцевые катушки 54 образуют пару Гельмгольца, которая может обеспечивать намагничивающее импульсное поле для наночастиц. Однородное поле, производимое этими катушками, может изменяться, но как правило составляет 40-50 Гаусс, и длина импульса составляет как правило 300-800 мс. В этом примере деревянный каркас поддерживает SQUID и платформу для измерения, а также намагничивающие катушки. Немагнитная каркасная система включает 3-мерную платформу 55, которая может быть выполнена без металлических компонентов, например, из пластика. Верхние две черные ручки управляют х-у перемещениями платформы в диапазоне +/-10 см, а нижнюю ручку применяют для поднимания и опускания платформы для измерения в диапазоне 20 см. Держатель образца может быть выставлен на платформу, которая может содержать живые субъекты, такие как мыши или другие маленькие животные.

[0024] Фиг.6 представляет собой схематическую иллюстрацию иллюстративного SQUID-сенсорного устройства, которое можно применять для исследований рака человека. Деревянная структура 63 может быть сходной с несущим каркасом, показанным на Фиг.5. Платформа для измерения может быть замещена кроватью 65 для размещения пациента. Две большие катушки Гельмгольца 64 включают деревянные кольцевые формы выше и ниже кровати. Эти большие катушки можно применять для создания однородного импульсного поля и намагничивания магнитных наночастиц, которые вводят пациенту. Токи можно модифицировать, например, увеличить по сравнению с теми, которые применяют в устройстве, показанном на Фиг.5, чтобы снова произвести поля в диапазоне от 40 до 50 Гаусс. Подобно устройству, показанному на Фиг.5, сосуд Дьюара 61 для SQUID с набором магнитных градиентометров можно применять для измерения изменения остаточного магнитного поля, произведенного намагниченными наночастицами.

[0025] Фиг.7 представляет собой схему и фотографию атомного магнитометра для измерений слабого поля. Это устройство миниатюризируют с помощью способов производства микрочипов, а множественные единицы можно поместить бок о бок с образованием набора сенсоров. Работа магнитометра происходит посредством применения лазерного светового луча, направляемого посредством оптического волокна. Этот луч накачивает нагретый газ Rb в испарительной ячейке в специфические атомные состояния. Луч вначале эллиптически поляризуется и коллимируется в испарительную ячейку. Зеркало отражает этот луч обратно через ячейку и линзы в анализатор поляризации. Магнитное поле, воздействующее перпендикулярно к длине магнитометра, измеряет показатель рефракции газа в ячейке, изменение поляризации света, проходящего через ячейку. Изменение в поляризации дает в результате величину воздействующего магнитного поля. Накачивающий лазер подается во множественные оптоволоконные кабели и, таким образом, применяется для множественных магнитометров. Набор этих магнитометров для релаксометрических измерений может содержать 7 испарительных ячеек, помещенных с одной в центре, окруженной 6 остальными. Воздействующее поле от намагничивающих катушек перпендикулярно расположению, показанному на Фиг.5 для того, чтобы индуцировать максимальные наблюдаемые магнитные моменты у наночастиц. Фотография внизу Фиг.7 показывает иллюстративное физическое расположение и размер атомного магнитометра для применения с настоящим изобретением. Чувствительность показанного прибора составляет 0,16 ϕТл/√Гц по сравнению с чувствительностью иллюстративной SQUID-системой, показанной на Фиг.5, 1,0 пТл/√Гц (1000 ϕТл/√Гц). Атомные магнитометры не нуждаются в криогенном охладителе, что может делать их желательными для клинических применений, где такие охладители, в частности, жидкий гелий, не всегда можно легко получить.

[0026] Иллюстративное применение для обнаружения рака молочной железы. Для рака молочной железы современным предпочтительным способом для скрининга и обнаружения является маммография. Не смотря на то, что маммография привела к значительному улучшению нашей способности к обнаружению рака молочной на более ранней стадии, она все еще страдает от неспособности отличить доброкачественные и злокачественные поражения, сложности в обнаружении опухолей в плотной и рубцеватой ткани молочной железы и не может обнаружить 10-30% случаев рака молочной железы. Применение магнитных наночастиц, конъюгированных со специфическими к опухоли реагентами, комбинированное с обнаружением этих частиц посредством измерения их релаксирующих полей, представляет многообещающую новую технологию, которая обладает потенциалом для улучшения нашей способности к обнаружению опухолей на более ранней стадии. Более того, обнаружение нацеленных магнитных наночастиц с помощью сенсоров слабого поля является быстрым и может быть более чувствительным, чем MRI-обнаружение, поскольку обнаруживаются только частицы, связанные с их целевыми клетками.

[0027] Мы разработали конъюгированные магнитные наночастицы, нацеленные на клетки рака молочной железы, которые экспрессируют антиген HER2, который сверхэкспрессируется в ~30% случаях рака молочной железы человека. Мы охарактеризовали наночастицы по их магнитным свойствам и выбрали те, которые имеют оптимальный размер и магнитный момент на мг Fe. Ряд различных клеточных линий, которые имеют специфичность к HER2, был изучен для определения их плотности сайтов и чувствительности сенсорной системы для обнаружения. Была исследована мышиная модель SCID с применением опухолей, выращенных из клеточных линий человека, с визуализацией мыши под действием сенсорной системы с последующим подтверждением гистологическими исследованиями. Эти результаты показывают достоверность магнитного сенсорного подхода для чувствительного обнаружения рака молочной железы.

[0028] Фиг. 8 представляет собой схематическую иллюстрацию магнитной наночастицы с биологически совместимым покрытием и прикрепленными антителами для нацеливания на специфические клетки. При демонстрации иллюстративного варианта осуществления настоящего изобретения мы применяли антитела (АЬ) к HER2, которые являются специфическими для 30-40% случаев рака молочной железы. Наночастицы имели покрытия, содержащие карбоксильные группы, а сульфо-NHS способ применяют для конъюгации наночастиц с антителами. Проточная цитометрия, проведенная для клеточных линий рака молочной железы MCF7, MCF7/Her2-18 (клон MCF7, стабильно трансфицированный Неr2), ВТ474 и MDA-MB-231. Число сайтов связывания Неr2 определяли с помощью проточной цитометрии, антитела к Нег2 конъюгировали с флюоресцентным зондом FITC. Фиг.9 представляет собой изображение числа сайтов Неr2 на клетку, рассчитанного путем сравнения с диапазоном микросфер с известными способностями к связыванию. Клетки MCF7, сконструированные для сверхэкспрессии Неr2-18, имеют 11×106 сайтов связывания Неr2/клетку, ВТ-474 имеют 2,8×106, MCF7 0,18×106, MDA-MB-231 0,11×106. Клеточные линии, не принадлежащие молочной железе, имеют<4000 сайтов связывания Неr2/клетку.

[0029] Фиг.10 представляет собой график измерения магнитного момента в SQUID-сенсорной системе как функцию от времени для инкубации прикрепляющихся магнитных наночастиц (от Ocean Nanotech) к клеточным линиям рака молочной железы. На магнитные наночастицы нанесли карбоксильное биологически совместимое покрытие и затем конъюгировали с антителом к Her2/neu. Это антитело является специфическим к приблизительно 30% клеток рака молочной железы клетки у людей. Меченые магнитные наночастицы вводили в ампулы, содержащие живые раковые клетки, и магнитные моменты ампулы, измеренные в различные моменты времени в диапазоне от одной минуты до 16 минут. Нулевой момент времени представляет собой магнитный момент ампулы с наночастицами до добавления к клеткам. Отсутствие магнитного момента для несмешанных частиц является демонстрацией того, что несвязанные частицы не дают магнитный сигнал с данным способом SQUID-визуализации. При смешивании с клетками магнитные моменты быстро повышаются и насыщаются, показывая, что клетки собрали на своих поверхностях максимальное число возможных наночастиц за одну-две минуты. Верхняя кривая представлена для клеточной линии рака молочной железы, MCF7/Her218, которая, как известно, является очень специфической для антитела к Her2/neu, и большая величина магнитного сигнала подтверждает это. Клеточная линия рака молочной железы, MDA-MB-231, является также положительной в отношении Her2/neu, но с намного меньшим количеством сайтов для прикрепления к ним нацеленных с помощью антитела наночастиц. Меньшие величины также указывают на эту тенденцию. Клеточная линия СНО является неспецифической к Her2/neu и дает существенно меньшие магнитные моменты после инкубации. Присутствие магнитного момента указывает на некоторый фагоцитоз у этих клеток, при котором наночастицы проникают в клетки. Кривая для случая отсутствия клеток представляет собой кривую для ампул, содержащих только наночастицы, и демонстрирует, что частицы сами по себе не дают сигнал и, таким образом, не происходит агломерация с частицами. Эти результаты демонстрируют специфичность антитела к целевым раковым клеткам и подтверждают, что только связанные частицы дают магнитные моменты. Этот результат не является достоверным для других способов, таких как MRI, который видит все частицы, связанные или несвязанные.

[0030] Фиг.11 представляет собой иллюстрацию магнитных моментов клеточных образцов, измеренных как функция от числа клеток путем разбавления в два раза пипетированием. Демонстрируемая чувствительность составляет 100000 клеток для клеток MCF7 и наночастиц Ocean, для клеток на расстоянии 3,5 см от сенсора. Имеют место 2,5×106 наночастиц/клетку. Линейность демонстрирует, что магнитный момент дает число клеток; MRI контраст не является линейной функцией числа клеток. Типичная маммограмма требует 10 миллионов клеток.

[0031] Сконструировали фантом молочной железы с помощью стандартного калибровочного фантома мамограммы в качестве модели. Фантом сконструировали из глины, неметаллического материала, проницаемого для этих полей. Ампулы, содержащие живые клетки ввели в фантом. Фиг.12 представляет собой иллюстрацию фантома с введенными ампулами с клетками MCF7, левая 2Е+06, правая=1Е+06 клеток. Клетки конъюгированы с наночастицами с антителами к HER2 от Ocean Nanotech. Поля наносили на карту в пяти 7-канальных SQUID положениях=35 сайтов. 3-D контурные карты представляют распределения полей. Местонахождения и величины момента получали из обратной задачи. Моменты определяют число клеток в ампулах из данных для клеток, показанных выше.

[0032] Мышиная модель рака молочной железы была разработана приемлемой для SQUID-сенсорных измерений. SCID-бестимусные мыши использовали с клеточными линиями рака молочной железы человека. Фиг.13 представляет собой фотографию бестимусной мыши под SQUID-системой. Для изучения in vivo процессов с помощью SQUID-техники мыши вводили клетки MCF7 человека за две недели ранее в два места. Эти клетки затем продуцировали опухоли человека на боковых поверхностях тела мыши; одна такая опухоль является видимой под правым ухом мыши. Мыши вводили анестезию посредством трубки через ее рот. Меченые магнитные наночастицы вводили в мышь на этой платформе либо с помощью хвостовой, интерперитонеальной, либо внутриопухолевых инъекций. После инъекций мышь помещали под сенсорную систему, как показано, и сообщали намагничивающий импульс, и измеряли полученные магнитные моменты введенных частиц. Как и в случае живых раковых клеток не наблюдали моментов, если только частицы не были прикрепленные к клеткам в пределах опухолей. В некоторых случаях обе опухоли были клетками типа MCF7, а в других случаях применяли две различные клеточные линии для развития опухолей у мышей. Мышь оставалась на платформе, показанной на Фиг.5, и ее можно было перемещать в несколько положений под сенсорной системой для получения большей пространственной информации. Измерения осуществляли как функцию от времени для определения того, как быстро частицы захватывались из кровотока, и как быстро происходил фагоцитоз с частицами, попадающими в печень. Мышь, как правило, помещали в пять положений платформы под 7-канальной SQUID-системой для получения 35 пространственных расположений. Магнитные поля во всех положениях затем применяли в специальном коде для решения обратной электромагнитной задачи, используя теорему Левенберга-Маркардта для определения местонахождения всех источников магнитных частиц у мыши. Эту информацию затем сравнивали с известной геометрией мыши из фотографий для определения точности и чувствительности для определения местонахождения раковых опухолей молочной железы у живых животных. Фиг.14 содержит графики достоверности положений, полученных от мышиных опухолей. Левая сфера - от левой опухоли, которая в ~2 раза больше правой опухоли в магнитном моменте (см. ниже). Положения рассчитывали с помощью способа двухдипольных наименьших квадратов для выделения магнитных моментов и положений. Моменты определяют число меченых клеток в опухолях.

[0033] Результаты SQUID-системы для in vivo измерений на живых животных показаны на Фиг. 16, 17, 18 для животных, несущих две различные опухоли. Каждая мышь имела две опухоли, но различных клеточных типов. Каждой из двух опухолей абсорбировались различные количества наночастиц. Мышь с клетками MCF7 демонстрировала более высокие магнитные моменты, чем мышь с опухолями MDA-MB-231, что, как предполагается, обусловлено большим числом специфических сайтов для антител к HER2/neu на первой из них. Фиг.15 представляет собой иллюстрацию магнитных контурных линий, наблюдаемых для 35 различных мест измерения, как описано на Фиг.13. Анализ этих магнитных полей дал в результате пространственные положения опухолей, которые согласовывались с измеренными значениями этих положений; причем результаты SQUID дают более высокую точность, чем физические измерения на приблизительно 3 мм. Фиг.16 представляет собой иллюстрацию временной динамики измерений для двух мышей и обеих опухолей каждой мыши. Захват частиц происходил быстро с сигналом около максимального, полученным в первый час. Наночастицы остаются в опухолях в течение по меньшей мере 5 часов в продолжение экспериментов. После этих измерений мышей подвергали эвтаназии и опухоли и другие органы удаляли, и помещали под сенсорную систему для определения того, как много введений наночастиц было в опухолях. Графики на Фиг.17 являются иллюстрациями результатов этих измерений и показывают очень хорошее соответствие с in vivo измерениями на живой мыши. В нижней левой фигуре магнитный момент наблюдался в печени, указывая на то, что имел место некоторый фагоцитоз и частицы были доставлены в печень для выведения. Последующая гистология опухолей также показала значительное прикрепление частиц к клеткам в опухоли с помощью окрашивания берлинской лазурью для обнаружейия железа в магнитных наночастицах.

[0034] Рассчитали доверительные области для определения точности местонахождения опухолей для in vivo измерений мышей. Фиг.18 представляет собой иллюстрацию 2-мерного 95% предела достоверности для местонахождений двух опухолей, наложенных на действительные опухоли мыши. Получают точность пространственного расположения приблизительно +/-3 мм в х и у направлении. Фиг.19 представляет собой фотографию гистологии опухолей после выделения. Микроскопическое изображение одного среза опухоли MCF-7. Окрашивание берлинской лазурью клеток обнаруживает железо, присутствующее в наночастицах, прикрепленных к клеткам. Стрелка указывает на клетку, покрытую наночастицами.

[0035] Была продемонстрирована чувствительная к магнитному полю сенсорная система для раннего обнаружения in vivo рака молочной железы путем обнаружения магнитных наночастиц, конъюгированных с антителами к клеточным линиям рака молочной железы. Более 1 миллиона наночастиц прикрепляется к каждой раковой клетке. Способ является чувствительным к <100000 клеткам на расстояниях, сравнимых с опухолями молочной железы. Стандартная рентгеновская маммография как правило требует плотности клеток в десять миллионов клеток. Измеренные моменты являются линейными по отношению к числу клеток; то есть измерение магнитного момента дает в результате число присутствующих раковых клеток. Не наблюдаются очень высоко контрастные наночастицы, не прикрепленные к клеткам. Фантомные исследования демонстрируют множественные источники, которые имеют точное месторасположение и определенное число клеток на источник. Разработали мышиную модель с помощью множественных опухолей клеточных линий рака молочной железы человека и выполнили измерения in vivo для определения местонахождения и числа раковых клеток этих опухолей после введений наночастиц. Решения обратной задачи успешно определяют местонахождение опухолей и число клеток. Гистология подтверждает присутствие мышиных опухолей с наночастицами.

[0036] Иллюстративное применение для обнаружения рака яичника.

Этиология рака яичника является не до конца понятной и существует немного свидетельств в отношении факторов риска, которые предполагали бы профилактический скрининг. Обычное скрининговое исследование представляет собой обследование таза в отношении того, есть ли подозрительные симптомы, такие как абдоминальное увеличение, и результаты, как правило, обнаруживают прогрессирующую стадию рака. Плановый скрининг женщин в настоящее время не выполняется, так как не существуют надежных скрининговых исследований. Большая сложность в настоящее время в отношении рака яичника состоит в том, что ко времени, когда его обнаруживают, он метастазировал из яичника в другие органы. По этой причине гистерэктомию часто проводят вместе с удалением яичника. Если присутствие рака яичника может быть определено на ранней стадии, и он содержится в яичнике, уровень пятилетней выживаемости составляет 95%. Однако только 29% обнаруживают на этой стадии. Если заболевание распространилось локально, его уровень выживаемости падает до 72% и если метастазировало до отдаленных местоположений, то уровень выживаемости составляет 31%. Таким образом, разработка способов раннего обнаружения является настоятельной необходимостью.

[0037] Фиг.20 представляет собой иллюстрацию рака яичника, показывающую рост опухоли на яичнике. Эти опухоли состоят из клеток с высокими количествами рецепторов к антителу к СА-125 и могут являться мишенями для магнитных наночастиц, меченых этим антителом. Фиг.21 представляет собой фотографию полноразмерного фантома яичника, помещенного под SQUID-сенсорное устройство на расстоянии, которое будет типичным для пациента-субъекта. Фантом имеет ампулу, содержащую живые клетки рака яичника, введенные в нее. Магнитные наночастицы, меченые антителом к СА-125, ввели в эту ампулу, и поскольку эти антитела являются высокоспецифичными к этим клеткам рака яичника, к клеточной поверхности они прикрепляются в большом количестве. Эти магнитные наночастицы затем обнаруживали с помощью SQUID-сенсорного устройства с получением калибровок чувствительности для измерений in vivo как для животных, так и для человеческих моделей in vivo.

[0038] Результаты изучений чувствительности для живых клеток яичника, вставленных в фантом, показанный на Фиг.21, проиллюстрированы на Фиг.22 для трех различных клеточных линий рака яичника; а именно tov-112D, Ov-90 и nihovcar-3. График показывает минимальное число клеток, которые были обнаружены этим устройством для трех различных клеточных линий как функцию расстояния от сенсора до яичников пациента. Раковая клеточная линия ov-90, как известно, является одной из наиболее агрессивных форм рака и эти результаты показывают, что существует много рецепторов к СА-125 на поверхности клетки. Число наночастиц на клетку может быть оценено из этих измерений и соответствует 20000 частиц на клетку для tov-112D, 3400 для ov-90 и 6700 для ovcar-3.

[0039] Фиг.23 представляет собой иллюстрацию подтверждения сайтов антител для этих клеток с помощью проточной цитометрии. Фиг. 23а и 23b показывают две из четырех проанализированных клеточных линий. Показан сигнал только от клеток, а изотип (с помощью молекулы с неспецифичным связыванием, Igg), антитело к Her2/neu и антитело к СА-125 показаны с возрастающим числом сайтов справа на этих графиках. На этих фигурах показано, что антитело к СА-125 имеет большое число сайтов на этих клеток, причем SK-OV-3 является наибольшим из этих двух. Антитело к Неr2/пеи является также специфичным к 30% клеток рака молочной железы.

[0040] Выполнили измерения как функцию от времени для определения того, как быстро частицы захватывались из кровотока, и как быстро происходил фагоцитоз частиц, попадающих в печень. Измерение магнитного момента в SQUID-сенсорном устройстве как функция от времени для магнитных моментов от магнитных наночастиц (от Ocean Nanotech), прикрепленных к раковым опухолям яичника человека в живой мыши, показано на Фиг.24. У мыши были две опухоли яичника, одна - SK-OV-3, а другая - NIH-OVCAR3. На магнитные наночастицы нанесли карбоксильное биологически совместимое покрытие и затем конъюгировали с антителом к СА-125. Это антитело является специфичным к клеткам рака яичника у людей. Вводили меченые магнитные наночастицы в мышиные опухоли и измеряли магнитные моменты мыши в различные моменты времени в диапазоне от одной минуты до 300 минут. Захват частиц происходил быстро, с сигналом, близким к максимальному, получаемым в первый час. Временная динамика показывает, что наночастицы остаются в опухолях в течение нескольких часов. Наночастицы оставались в опухолях в течение по меньшей мере 5 часов в продолжение экспериментов. Каждая из двух опухолей абсорбировала различные количества наночастиц. Мышиная опухоль с клетками SK-OV-3 демонстрировала более высокие магнитные моменты, чем мышь с опухолями NIH-OVCAR-3, как и предполагалось вследствие более высокого числа специфических сайтов к антителам к СА-125 на первой из вышеупомянутых. Наночастицы не давали магнитного момента до введения и дают магнитный сигнал лишь при прикреплении к чему-нибудь, например, клеткам опухоли. Эксперименты показали, что введения в места, отличные от опухоли, не дают сигнал, так как частицы не связываются с нормальными клетками. После периода времени печень начинает демонстрировать признаки накопления этих частиц по мере их фагоцитоза из системы. После этих измерений мышей подвергли эвтаназии, опухоли и другие органы удалили и поместили под сенсорное устройство для определения количество введений наночастиц в опухоли. Эти измерения очень хорошо согласовались с измерениями in vivo на живой мыши. Последующая гистология опухолей показала значительное прикрепление частиц к клеткам опухоли с помощью окрашивания берлинской лазурью для обнаружения железа в магнитных наночастицах.

[0041) Фотография мыши, используемой для подтверждения того, что SQUID-сенсорный способ применим in vivo, вместе с магнитными контурными полями от этой мыши показана на Фиг.25. Человеческие опухоли показаны на боковых поверхностях мыши; они представляют собой бугорки выше и на боковых сторонах хвоста на Фиг.25. Эти опухоли были получены путем введения живых клеток рака яичника человека в эту мышь с иммунодефицитом в тяжелой стадии и им позволили расти в течение нескольких недель до появления 6-10 мм опухоли. Мыши давали анестезию при помощи трубки через рот в течение всех SQUID-сенсорных экспериментов. Меченые магнитные наночастицы вводили в мышь на этой платформе либо с помощью хвостовой, интерперитонеальной, либо внутриопухолевой инъекций. После инъекций мышь помещали под сенсор, как показано на ФИГ.1, и прилагали намагничивающий импульс, и измеряли полученные магнитные моменты введенных частиц. Как в случае живых раковых клеток моменты не наблюдали, если только частицы не были прикреплены к клеткам в пределах опухолей. В некоторых случаях обе опухоли были клетками SK-OV-3 типа, а в других случаях для развития опухолей у мышей применяли две различные клеточные линии.

[0042] Мышь, помещенную на платформу, показанную на Фиг.5, можно переместить в несколько положений под сенсором для получения большей пространственной информации. Мышь как правило помещали в пять положений платформы под 7-канальным SQUID для получения 35 пространственных локализаций. Магнитные поля на всех положениях затем применяли в коде для решения обратной электромагнитной задачи с помощью теоремы Левенберга-Маркардта для определения местонахождения всех источников магнитных частиц у мыши. Эту информацию затем сравнивали с известной геометрией мыши с фотографий для определения точности и чувствительности для определения местонахождения раковых опухолей в живых животных. Фиг.25 демонстрирует магнитные контурные линии, наблюдаемые для 35 различных измерений. Анализ этих магнитных полей давал в результате пространственные положения опухолей, которые согласовывались с измеренными значениями этих положений; причем SQUID результаты дают более высокую точность, чем физические измерения на приблизительно 3 мм.

[0043] Иллюстративное применение для обнаружения лимфомы Ходжкина. Лимфома Ходжкина (HL) составляет 30% всех лимфом. HL как правило возникает в лимфатических узлах, предпочтительно в шейных отделах, и тимусе; но преимущественно заболевание может вовлекать отдаленные лимфатические узлы, селезенку и костный мозг. Основная часть случаев приходится на молодежь от 15 до 34, а второй пик возникновения имеет место у людей старше 55. В настоящее время для диагностики необходима оценка с помощью биопсии. Хирургическая биопсия имеет осложнения, такие как инфекция и кровотечение, и оценка биопсии как правило занимает 3-5 дней. Таким образом, в случаях HL, и которых масса опухоли является препятствующей обратному кровотоку в сердце (а именно, синдром верхней полой вены, 10% случаев), в ходе этого периода ожидания могут иметь место значительная болезненность и смертность. Были определены некоторые из антител, которые нацеливаются на лимфому Ходжкина; а именно CD15, CD30 и CD25. Последнее антитело, однако, нацеливается на многие клетки и является менее специфичным. Другое применение, где настоящее изобретение может иметь существенное клиническое воздействие, состоит в обнаружении персистирующей HL после терапии. Если пациент, переживающий обострение, подвергается лучевой терапии в высокой дозе, то существует хороший прогноз, если обострение обнаруживается на ранней стадии. Пациенты с обострением будут иметь прогноз, определяемый в первую очередь длительностью первой ремиссии. Персистирование больших фиброзных узлов, особенно в средостении, после терапии приводит к неясности при определении того, присутствует ли персистирующий рак, а хирургия фиброзных узлов чревата сложностью контролирования проблемы с кровотечением и болезненностью для пациента.

[0044] Релаксометрический способ настоящего изобретения может обеспечить количественную оценку числа лимфомных клеток, присутствующих в органах, пораженных болезнью Ходжкина, таких как тимус и селезенка. RS-клетки являются гигантскими клетками, происходящими от В-лимфоцитов, которые содержат миллионы рецепторов CD30 и CD15. Предыдущие результаты с SQUID-сенсорами, нацеливающимися на Т-клеточные лимфоциты, показали, что для меньших клеток к каждой Т-клетке могут быть прикреплены приблизительно миллион наночастиц. Стерическое несоответствие ограничивает число наночастиц, прикрепленных к нормальному лимфоциту, но намного большие RS клетки могут иметь в 25-50 раз больше связанных наночастиц. Количество железа на наночастицу составляет 4,4×10^-6 нг/наночастицу. Учитывая большой размер RS-клеток, может быть несколько миллионов наночастиц на клетку, так что каждая клетка может иметь до 10 нг железа. Сто RS-клеток, накопленных в селезенке или тимусе, могут содержать микрограмм железа. Менее микрограмма является достаточным для SQUID-обнаружения, следовательно, вероятна возможность обнаружения 100 RS-клеток. Измеренная амплитуда остаточной намагниченности меченых антителом наночастиц in vivo может обеспечить важный диагностический инструмент при лимфомном раке. Сила сигнала зависит от плотности антигенов на клеточных поверхностях опухоли, и, таким образом, сила поля, производимого наночастицами, является пропорциональной численной плотности антигенных сайтов на лимфомных клетках. Можно определить число частиц и плотность с тем, чтобы получить амплитуду обнаруживаемого магнитного поля. Эту информацию можно использовать при планировании in vivo обнаружения, а также в качестве вспомогательной при выборе наночастиц для применения. SQUID-сенсор является оптимальной сенсорной системой для болезни Ходжкина с большой чувствительностью к RS-клеткам, и in vivo обнаружения заболевания без биопсии, и возможности отслеживать лечение заболевания в ходе химиотерапии.

[0045] Фиг.26 представляет собой график измерения магнитного момента в SQUID-сенсорной системе как функции от времени для инкубации прикрепляющихся магнитных наночастиц (от Ocean Nanotech) к лимфомным клеточным линиям. На магнитные наночастицы нанесли карбоксильное биологически совместимое покрытие и затем их конъюгировали с антителом к CD34. Это антитело является специфическим к одному типу лимфомных клеток, а именно, острой лимфоматической лейкемии у людей. Меченые магнитные наночастицы внесли в ампулы, содержащие живые раковые клетки, и измерили магнитные моменты ампулы в различные моменты времени в диапазоне от одной минуты до 16 минут. Нулевой момент времени представляет собой магнитный момент ампулы с наночастицами до добавления к клеткам. Отсутствие магнитного момента для несмешанных частиц в нулевой момент времени показывает, что несвязанные частицы не дают магнитный сигнал с данным способом SQUID-визуализации. При смешивании с клетками магнитные моменты быстро возрастают и насыщаются, показывая, что клетки собрали на своих поверхностях максимальное число возможных наночастиц за одну-две минуты. Верхняя кривая представлена для лимфомной раковой клеточной линии U937, которая, как известно, очень специфична для антитела к CD34, и большая величина магнитного сигнала подтверждает это. Нижняя кривая представлена для той же клеточной линии, но неспецифического маркера, BSA, и показывает существенно меньшие магнитные моменты после инкубации. Наличие магнитного момента для BSA является признаком некоторого фагоцитоза этих клеток, при котором наночастицы проникают в клетки. U937 представляет собой лимфому Т-лимфоцитов, a RS представляет собой лимфому В-лимфоцитов. Поскольку одной из основных целей лимфоцитов является захват частиц, которые не принадлежат организму, то это количество неспецифичности является ожидаемым. Эти результаты демонстрируют специфичность антитела к целевым раковым клеткам и подтверждают, что только связанные частицы дают магнитные моменты. Этот результат не наблюдается для других способов, таких как MRI, который видит все частицы, связанные или несвязанные.

[0046] Образцы RS-клеток получили из фонда Тканевого банка (Tissue Bank facility) при Университете Нью-Мехико (University of New Mexico), национальной организации для хранения клеток и множества образцов. Эффективность SQUID-сенсорной системы для обнаружения RS-клеток сравнивали с числом RS клеток в образце, определенным путем гематоцитометрических подсчетов вручную. Эти выделенные RS-клетки метили наночастицами, специфично связанными с CD15 и CD30 в ходе процедуры выделения. Калибровку чувствительности проводили путем серийного разведения в диапазоне 1 в 10 до 1 в 100000 клеток. Диапазоны плотности наночастиц на злокачественных клетках превышали 107 наночастиц/клетку. Плотность сайтов CD15 определяют, используя технику проточной цитометрии, которая подсчитывает рецепторы/клетку. Число CD15- и СD30-сайтов/клетку подтверждали, используя количественную технику иммунофлюоресцентного окрашивания.

[0047] Фиг.27 представляет собой иллюстрацию результатов измерений проточной цитометрии RS-клеток из лимфатической системы при определении числа мест, доступных для наночастиц и обнаружения SQUID-сенсорами. Фиг.27А представляет собой фотографию, на которой показан морфологический вид RS-клеток, выделенных из образца лимфатического узла. Фиг.27 В демонстрирует анализ проточной цитометрии образца костного мозга, где (В1) представляет собой до, а (В2) после проведения процедуры обогащения для увеличения частоты RS-клеток в образце для проточной цитометрии. В норме RS-клетки возникают с частотой 1 в 104 или 105 нормальных лимфоцитах и должны быть увеличены до применения CD15- и СD30-окрашивания с помощью проточной цитометрии для возможности обнаружения. SQUID-сенсорная система обнаруживает все RS-клетки in vivo и не нуждается во взятии образца, следовательно, усиление не является необходимым, как необходимо при определениях с помощью проточной цитометрии.

[0048] Лимфатические узлы являются одним из основных мест, где накапливаются RS-клетки, помимо тимуса. Фиг.28 представляет собой гистологический срез от пациента с болезнью Ходжкина. RS-клетки были окрашены иммунопероксидазным окрашиванием. Антитело CD15 показано справа, а антитело CD30 - слева. Окружающие клетки являются незлокачественными клетками в лимфатическом узле. SQUID-сенсор может обнаруживать несколько сотен этих меченых RS-клеток в лимфатическом узле.

[0049] Иллюстративное применение для обнаружения рака простаты. Рак простаты имеет высокий уровень смертности из-за отсутствия раннего обнаружения с помощью стандартных скрининговых методик. Число случаев за 2009 год в США составило 192280 с 27360 смертельными случаями. Рак простаты составляет 9% смертей мужчин и сейчас существует 1 на 6 вероятность развития рака простаты в течение жизни. Заболевание обычно не обнаруживают, пока оно не вызвало увеличения простаты, проблем с мочеиспусканием или распространилось на другие органы. Бессимптомное обнаружение заболевания обычно осуществляют с помощью цифрового исследования, результата теста на повышенный PSA (специфического антигена простаты) или биопсии. Тест на PSA сейчас считают ненадежным, приводящим ко многим ненужным биопсиям, которые сопровождаются опасностью инфицирования. Цифровое исследование также является высоко субъективным. Тестирование на рак простаты является очень спорным. Затраты на тесты на PSA только в США превышают 3 миллиарда долларов, а недавнее исследование, опубликованное в New England Journal of Medicine, выявило, что современные способы скрининга не снижают уровень смертности у мужчин старше 55 лет. Настоящее изобретение может обнаруживать этот рак до того, как он метастазировал.

[0050] Иллюстративный способ обнаружения рака простаты в ткани включает помещение пациента на платформу для измерения сенсорного устройства сверхпроводящего квантового интерференционного датчика; введение множества меченых антителом магнитных наночастиц в пациента для специфического связывания с тканью пациента; воздействие однородным намагничивающим импульсным полем для намагничивания наночастиц, введенных в пациента; и обнаружение остаточного магнитного поля намагниченных наночастиц, тем самым, получая изображение наночастиц, связанных с тканью пациента. Ткань может включать ткань простаты, а меченые антителом магнитные наночастицы могут специфически связываться с антигенами клеток рака простаты. Меченая антителом магнитная наночастица может содержать магнитный сердечник, покрытый биологически совместимым покрытием, к которому прикреплены специфические антитела. Например, магнитный сердечник может содержать ферромагнитный материал, такой как оксид железа. Например, биологически совместимое покрытие может содержать декстран, карбоксил или амин. Для обнаружения рака простаты специфическое антитело может приставлять собой антитело к PSMA.

[0051] Специфический для простаты мембранный антиген (PSMA) является трансмембранным гликопротеином, который сильно экспрессируется большинством форм рака простаты. Его также называют mAb 7Е11. Он экспрессируется на поверхности сосудистого эндотелия опухоли солидных карцином, но не на нормальных клетках простаты. Количество PSMA, наблюдаемого при раке простаты, указывает на тяжесть или степень опухоли. Проточная цитометрия показала, что существует большие количества рецепторных сайтов для этого антитела на некоторых клеточных линиях рака простаты, включая LNCaP и РС-3, тогда как PSMA-отрицательная клеточная линия DU-145 не показывает какой-либо экспрессии.

Результаты прикрепления магнитных наночастиц к этим положительным клеточным линиям демонстрируют один миллион или более наночастиц на клетку. Эти результаты являются сопоставимыми с результатами для рака яичника и молочной железы в отношении наночастиц на клетку и глубин опухолей в организме, и биомагнитные способы обнаружения с применением SQUID-сенсоров будут иметь такую же чувствительность к раку простаты, как и к раку яичника (описанную в одной или нескольких из родственных заявок, включенных ссылкой выше). Результаты исследований на раке яичника могут, таким образом, быть напрямую применены для обнаружения и определения местонахождения рака простаты. По сравнению с антителом к СА-125 для рака яичника PSMA является даже более специфическим для in vivo стратегий для специфического нацеливания на простату.

[0052] SQUID-сенсорный способ может обеспечить количественную оценку микрососудистой структуры в опухолях, приводящую к новому заменителю для образования сосудов (ангиогенеза) и градации отдельной опухоли. Было показано в исследовании микрососудистой характеристики опухоли в экспериментальной модели рака простаты с помощью наночастиц, что рост и агрессивность/стадия опухоли имеют непосредственную связь с неоваскуляризацией опухоли. Другие исследования оценивают концентрацию магнитных частиц в опухоли как равную приблизительно 2,3 мг наночастиц на грамм ткани. Эта концентрация обычно достигается в опухолях пациентов с раком печени человека, получающих лечение посредством внутрипеченочных артериально вводимых радиоактивных микросфер; наночастицы имеют тенденцию концентрироваться в кольце роста сосудов опухоли. Менее нанограмма является достаточным для SQUID-обнаружения. Измеренная амплитуда остаточной намагниченности меченых антителом наночастиц in vivo может обеспечивать важный диагностический инструмент рака простаты. Сила сигнала зависит от плотности антигенов на клеточных поверхностях опухоли и, таким образом, сила поля, произведенного наночастицами, является пропорциональной численной плотности антигенных сайтов на клетках опухоли простаты. Таким образом, число и плотность частиц обеспечивают амплитуду обнаруживаемого магнитного поля. Эту информацию можно затем использовать при планировании in vivo, а также в качестве вспомогательной при выборе наночастиц для применения.

[0053] Иллюстративное применение для обнаружения глиобластомы. Рак мозга является особенно смертельным и возникает в ряде форм. Рак, вовлекающий глиальные клетки, является наиболее распространенной формой и также наиболее агрессивной опухолью мозга у людей. Могут быть вовлечены различные глиальные клетки, вызывая рак по типу олигодендроглиомы (вовлекающий олигодендроциты), астроцитомы (вовлекающий астроциты) и глиобластомы. Последняя является наиболее часто встречающейся формой рака мозга. Эти типы рака обычно приводят к смерти за очень короткий промежуток времени. На глиабластомные клетки можно нацелить с помощью маркеров, таких как антитела к EGFR, 81С6 и PTN, которые можно применять для визуализации этого типа рака. Мышиные модели и клеточные линии рака мозга, такие как U-251, доступны для тестирования перед применениями на людях.

[0054] Важным моментом при нацеливании на рак мозга является доставка через гематоэнцефалический барьер наночастиц с прикрепленными маркерами. Этот барьер в некоторой степени является открытым в сосудистой системе, связанной со злокачественными опухолями, но все еще остается препятствием. Применение наночастиц, покрытых липофильными поверхностями и затем конъюгированных с антителами или пептидами, увеличивает способность пересекать барьер. Дополнительно, наночастицу с маркерами можно инкапсулировать в полимерную оболочку с липосомной поверхностью в мицелле, что является другим подходом, и высвобождающую конъюгированные наночастицы из полимера после попадания в мозг с помощью приложения слабонагревающих РЧ или ультразвукового импульса.

[0055] Иллюстративный способ обнаружения рака мозга включает помещение пациента на платформу для измерения сенсорного устройства с сверхпроводящим квантовым интерференционным датчиком; введение множества меченых антителом магнитных наночастиц в пациента со специфическим связыванием с опухолью мозга у пациента; воздействие однородного намагничивающего импульсного поля с намагничиванием наночастиц, введенных в пациента; и обнаружение остаточного магнитного поля намагниченных наночастиц, тем самым обеспечивая визуализацию наночастиц, связанных с тканью пациента. Мишенью является опухоль мозга, и меченые антителом магнитные наночастицы могут специфически связываться с антигенами клеток рака мозга. Меченая антителом магнитная наночастица может содержать магнитный сердечник, покрытый биологически совместимым покрытием, к которому прикреплены специфические антитела. Например, магнитный сердечник может включать ферромагнитный материал, такой как оксид железа. Например, биологически совместимое покрытие может включать декстран, карбоксил или амин. Для обнаружения глиобластом специфическое антитело может быть EGFR или подобным антителом.

[0056] EGFR ангиогенеза имеет несколько форм и является вариантом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который сверхэкспрессируется некоторыми типами раковых клеток, включая клетки глиобластомы, но не нормальными клетками. EGFR в настоящее время подвергается иммунотерапевтическим клиническим исследованиям пациентов с диагностированной глиобластомой. Его можно конъюгировать с магнитными наночастицами, приемлемыми для обнаружения с помощью магнитной релаксометрии, и вводить в организм. Эти магнитные наночастицы могут включать покрытие, такое как полиэтиленгликоль (PEG), которое будет повышать эффективность нацеленных наночастиц для проникновения через гематоэнцефалический барьер. В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения магнитные наночастицы с прикрепленными маркерами могут содержаться внутри полимерных покрытий, которые способны проникать через гематоэнцефалический барьер и затем высвобождаться при применении небольшого РЧ нагревательного импульса или использовании ультразвука. Результаты прикрепления этих пептидов ангиогенеза к магнитным наночастицам и прикрепления их к клеткам являются сопоставимыми с применением других результатов для антител рака яичника и молочной железы в отношении наночастиц на клетку и глубин опухолей в организме. Биомагнитные способы обнаружения с применением систем, таких как SQUID-сенсоры, будут обладать такой же чувствительностью в отношении рака мозга, как и рака яичника (описаны в одной или нескольких из родственных заявок, включенных по ссылке выше). Результаты исследований на раке молочной железы и раке яичника могут, таким образом, быть напрямую применены к обнаружению и определению местонахождения рака мозга.

[0057] Иллюстративное применение для обнаружения рака поджелудочной железы. Ряд опухолевых маркеров присутствуют при раке поджелудочной железы. СА19-9 является одним примером маркера, уровень которого повышается при этом раке, но он является не очень чувствительным (77%) и неспецифическим (87%). Комбинации маркеров были предложены центром изучения рака при техасском университете (M.D. Anderson Cancer Center) и их исследовали для скрининга рака поджелудочной железы. Эти маркеры представляют собой микроРНК и включают miR-21, MiR-210, miR-155 и miR-196a. Однако эта комбинация также достигает лишь низкой чувствительности (64%), но большей специфичности (89%), чем СА19-9. Дополнительно, был определен ряд антител к определенным клеточным линиям рака поджелудочной железы человека, например клеточная линия FG, и они включают S3-15, S3-23, S3-41, S3-60, S3-110 и S3-53. Другой маркер определения представляет собой рецептор урокиназного активатора плазминогена (uPAR), который экспрессируется на высоком уровне при раке поджелудочной железы и также в опухолевых стромальных клетках. Последний маркер применяли для доставки магнитных наночастиц к типам рака поджелудочной железы, выращенным в виде ксенотрансплантатов в бестимусных мышах. Эти маркеры привели к обнаружению с помощью MRI опухолей у мышей при использовании в качестве меченых контрастных средств. Механизм в первую очередь представляет доставку наночастиц к опухолевым эндотелиальным клеткам.

[0058] Не существует надежных подходов визуализации для диагностики рака поджелудочной железы. Таким образом, разработка биомаркеров в качестве нацеленного средства визуализации для MRI или обеспечения более чувствительной методики магнитной релаксометрии является значительным преимуществом. MRI может обнаруживать небольшие аномалии в опухолях и также пригоден при определении того, метастазировал ли рак. MRI с динамическим контрастированием (DCE) потенциально различает доброкачественные и злокачественные опухоли, но производит ряд ложноположительных результатов. Высокая стоимость MRI ограничивает его применение в качестве инструмента скрининга. Визуализация опухолей с помощью MRI часто использует магнитные наночастицы в качестве контрастных средств, как упоминалось выше, и является принятым протоколом, обеспечивающим стандарты для введения таких наночастиц. Внутрисосудистые MRI-контрастные средства в дозе 2 мг/кг веса наночастиц применяли для обнаружения метастатических поражений. Однако применение MRI при раке поджелудочной железы сильно ограничено.

[0059] Данное изобретение может обеспечивать количественную оценку микрососудистой структуры в опухолях, приводящую к новому заменителю для образования сосудов (ангиогенеза) и градации отдельной опухоли. Результатами исследования микрососудистой характеристики опухоли в экспериментальной модели рака поджелудочной железы с применением наночастиц было показано, что рост опухоли и агрессивность/стадия имеют прямое отношение к неоваскуляризации опухоли. Другие исследования оценивают концентрацию магнитных частиц в опухоли как равную около 2,3 мг наночастиц на грамм ткани. Эта концентрация регулярно достигается в опухолях пациентов с раком печени человека, получающих лечение посредством внутрипеченочных артериально вводимых радиоактивных микросфер; наночастицы имеют тенденцию концентрироваться в кольце роста сосудов опухоли. Для обнаружения с помощью настоящего изобретения достаточно нанограммов. Измеренная амплитуда остаточной намагниченности меченных антителом наночастиц in vivo может обеспечивать важный диагностический инструмент при раке поджелудочной железы. Сила сигнала зависит от плотности антигенов на поверхности опухолевых клеток и, следовательно, напряженность поля, образуемого наночастицами, является пропорциональной численной плотности антигенных сайтов на опухолевых клетках поджелудочной железы. Число частиц и плотность можно определить с обеспечением амплитуды обнаруженного магнитного поля. Эта информация может использоваться в планировании обнаружения in vivo, а также для содействия в выборе наночастиц для применения. Примеры клеточных линий рака поджелудочной железы включают FG или MIA РаСа-2, которые, как известно, являются специфичными в отношении антитела к uPAR.

[0060] Настоящее изобретение было описано, как изложено в данном документе, в отношении различных иллюстративных вариантов осуществления и проектных решений. Будет понятно, что приведенное выше описание является исключительно иллюстративным для применений принципов настоящего изобретения, объем которых определяется формулой изобретения, рассматриваемой в свете описания изобретения. Другие варианты и модификации изобретения будут очевидными для специалистов в данной области техники.

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам обнаружения и измерения клеток или веществ с помощью нацеленных наночастиц. Устройство содержит намагничивающую подсистему для намагничивания наночастиц, которые связаны с одним или несколькими заданными типами раковых клеток или биологических веществ у пациента, сенсорную подсистему для обнаружения остаточного магнитного поля в области интереса пациента после того, как несвязанные наночастицы вернутся к случайной намагниченности, и в течение времени перехода связанных наночастиц от однородной к случайной намагниченности, и систему управления и анализа остаточного магнитного поля для обнаружения, измерения или определения местонахождения одного или нескольких заданных типов раковых клеток или биологических веществ у пациента. Способ использует устройство и включает помещение множества нацеленных наночастиц в пациента, где каждая из множества нацеленных наночастиц включает парамагнитную наночастицу, конъюгированную с нацеливающим средством, которое связывается с одним или несколькими заданными типами раковых клеток или биологических веществ, применение намагничивающей подсистемы, сенсорной подсистемы и системы управления и анализа. Использование изобретения обеспечивает раннее обнаружение повреждений ткани. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 28 ил.

1. Устройство для обнаружения, измерения или определения местонахождения одного или нескольких заданных типов раковых клеток или биологических веществ in vivo, содержащее:
a) намагничивающую подсистему, сконфигурированную для намагничивания наночастиц, которые связаны с одним или несколькими заданными типами раковых клеток или биологических веществ у пациента; и
b) сенсорную подсистему, сконфигурированную для обнаружения остаточного магнитного поля в области пациента после того, как несвязанные наночастицы вернутся к случайной намагниченности, и в течение времени перехода связанных наночастиц от однородной к случайной намагниченности, и
c) систему управления и анализа, сконфигурированную для анализа остаточного магнитного поля для обнаружения, измерения или определения местонахождения одного или нескольких заданных типов раковых клеток или биологических веществ у пациента.

2. Устройство по п. 1, где намагничивающая подсистема содержит множество катушек Гельмгольца.

3. Устройство по п. 1, где сенсорная подсистема содержит набор градиентометров.

4. Устройство по п. 1, где сенсорная подсистема содержит множество планарных градиентометров.

5. Устройство по п. 4, где по меньшей мере один планарный градиентометр имеет основание около 2 см.

6. Устройство по п. 4, где по меньшей мере один планарный градиентометр изготовлен с применением фотолитографии.

7. Устройство по п. 4, дополнительно содержащее сверхпроводящий квантовый интерференционный датчик (SQUID), связанный по меньшей мере с одним из множества планарных градиентометров, где SQUID является сверхпроводящим при температурах около температуры жидкого азота.

8. Устройство по п. 4, дополнительно содержащее множество SQUID, каждый связан с одним из множества планарных градиентометров, где SQUID являются сверхпроводящими при температурах около температуры жидкого азота.

9. Устройство по п. 1, где сенсорная подсистема содержит атомный магнитометр.

10. Устройство по п. 1, где сенсорная подсистема сконфигурирована для решения обратной электромагнитной задачи.

11. Способ обнаружения, измерения или определения местонахождения одного или нескольких заданных типов раковых клеток или биологических веществ in vivo, включающий:
a) обеспечение наличия устройства по п. 1;
b) помещение множества нацеленных наночастиц в пациента, где каждая из множества нацеленных наночастиц включает парамагнитную наночастицу, конъюгированную с нацеливающим средством, которое предпочтительно связывается с одним или несколькими заданными типами раковых клеток или биологических веществ;
c) применение намагничивающей подсистемы для намагничивания наночастиц;
d) применение сенсорной подсистемы для обнаружения остаточного магнитного поля в области пациента в течение времени после затухания результирующих магнитных моментов наночастиц, не связанных с раковыми клетками или биологическими веществами, и до затухания магнитных моментов наночастиц, связанных с раковыми клетками или биологическими веществами, и
e) применение системы управления и анализа для анализа остаточного магнитного поля для обнаружения, измерения или определения местонахождения одного или нескольких заданных типов раковых клеток или биологических веществ.

12. Способ по п. 11, где нацеленные наночастицы метят антителами, которые специфично связываются с заданным типом раковых клеток.

13. Способ по п. 12, где меченые антителом парамагнитные наночастицы содержат магнитный сердечник, покрытый биологически совместимым покрытием, к которому прикреплено по меньшей мере одно специфическое антитело.

14. Способ по п. 13, где магнитный сердечник содержит ферромагнитный материал.

15. Способ по п. 14, где ферромагнитный материал включает оксид железа.

16. Способ по п. 15, где магнитный сердечник составляет менее 30 нанометров в диаметре.

17. Способ по п. 13, где биологически совместимое покрытие включает декстран, карбоксил, амин или их комбинацию.

18. Способ по п. 13, где по меньшей мере одно специфическое антитело включает одно или несколько из: антитела, специфичного к раку простаты, антитела, специфичного к раку молочной железы, антитела, специфичного к раку яичника, антитела, специфичного к лимфоме Ходжкина, антитела, специфичного к раку поджелудочной железы, антитела, которое специфично связывается с клетками Рид-Штернберга, ассоциируемыми с лимфомой Ходжкина.

19. Способ по п. 13, где по меньшей мере одно специфическое антитело включает антитело к CD15 или CD30.

20. Способ по п. 13, где по меньшей мере одно специфическое антитело включает антитело к СА-125.

21. Способ по п. 13, где по меньшей мере одно специфическое антитело включает антитела к HER-2.