ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ ПРОТИВ α5β1 ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически распознают α5β1-интегрин, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, и к способам применения антител для ингибирования пролиферации таких раковых клеток.

Уровень техники

Связь α5β1-интегрина с опухолевым ангиогенезом хорошо известна (см., например, опубликованную патентную заявку США 2002/0172675 А1, поданную 7 мая 1999 года, которая приведена здесь в качестве ссылки). α5β1 является гетеродимерным интегрином, который специфически связывается с лигандом фибронектином. α5β1 экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток и опосредует адгезию и миграцию к фибронектину. Было показано, что связывание α5β1 и фибронектина является важным событием опухолевого ангиогенеза. Ангиогенез в опухоли начинается с высвобождения одного или нескольких проангиогенных факторов (например, FGF, VEGF, PDGF и т.д.), которые локально активируют эндотелиальные клетки. Затем эти активированные эндотелиальные клетки образуют новые кровеносные сосуды посредством связывания, через их α5β1-интегрин, с фибронектином внеклеточного матрикса. Было показано, что антитела против α5β1 ингибируют ангиогенез на моделях опухолей in vivo (см., например, US 2002/017675 А1).

Терапия рака, направленная против ангиогенеза, основана на ингибировании васкуляризации опухолей и, таким образом, на предотвращении их роста и метастазирования (для обзора см., например, Marx, "A Boost for Tumor Starvation," Science 301, 452 (2003); Sato, "Molecular Diagnosis of Tumor Angiogenesis and Anti-Angiogenic Cancer Therapy," Int. J. Clin. Oncol. 8, 200 (2003); Bissachi et al., "Anti-Angiogenesis and Angioprevention: Mechanisms, Problems and Perspectives," Cancer Detec. Prev. 27, 229 (2003)). В настоящее время в клинической разработке для лечения рака находится более 60 терапевтических веществ, направленных против ангиогенеза. Хотя в некоторых случаях можно заставить опухоль «голодать», предотвращая ее васкуляризацию, существующие исследования показывают, что, по-видимому, некоторые виды рака являются нечувствительными к противоангиогенной терапии (см., Sato, выше). Например, клинические испытания терапевтического антитела против VEGF, AVASTIN™ (бевацицумаб) были успешны в случае рака ободочной кишки, но не для рака молочной железы (см. Marx, выше). Кроме того, терапевтические способы, направленные против ангиогенеза, не подходят для лечения на ранней стадии, когда процесс васкуляризации опухоли еще не начался.

Из-за своей функции в ангиогенезе α5β1-интегрин был предложен в качестве терапевтической мишени для многочисленных заболеваний, опосредованных ангиогенными процессами, в том числе роста раковых опухолей. Были разработаны химерные и гуманизированные антитела к α5β1, которые блокируют специфическое связывание с фибронектином. Было показано, что химерное α5β1-антитело, М200 (также известное под его родовым названием волоциксимаб), индуцирует апоптоз активированных эндотелиальных клеток in vitro независимо от стимулов фактора роста.

Таким образом, существует потребность в способах терапии рака и способах лечения ранней стадии рака, способных непосредственно убивать раковые клетки до начала процесса васкуляризации опухоли, или когда нацеленная антиангиогенная терапия оказывается неэффективной.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лизиса раковых клеток с использованием антител против α5β1. В общем варианте осуществления способ предусматривает контактирование раковой клетки, которая экспрессирует на своей поверхности α5β1, с антителом против α5β1.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации раковой (или опухолевой) клетки, которая экспрессирует на своей поверхности α5β1-интегрин, предусматривающий контактирование опухолевой клетки с антителом, которое связывается с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки. В предпочтительном варианте осуществления опухолевая клетка пациента является опухолевой клеткой солидной опухоли, не поддающейся лечению. В другом предпочтительном варианте осуществления опухолевая клетка является злокачественной клеткой, где злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почек и рака селезенки.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции смерти опухолевой клетки, которая экспрессирует на своей поверхности α5β1-интегрин, предусматривающий контактирование опухолевой клетки с антителом, которое связывается с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки. В предпочтительном варианте осуществления опухолевой клеткой пациента является опухолевая клетка солидной опухоли, не поддающаяся лечению. В другом предпочтительном варианте осуществления опухолевая клетка является злокачественной клеткой, где злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстатательной железы, рака яичника, рака почки и рака селезенки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования пролиферации раковой клетки у пациента, где раковая клетка экспрессирует на своей поверхности α5β1-интегрин. В этом варианте осуществления способ предусматривает введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела, где антитело конкурентно ингибирует связывание М200 с α5β1-интегрином на поверхности раковой клетки. В другом варианте осуществления антитело содержит вариабельную область с аминокислотной последовательностью, по существу идентичной SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8. В предпочтительном варианте осуществления способа антитело, вводимое пациенту, нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность α5β1-интегрина. В другом варианте осуществления антитело, вводимое пациенту, содержит терапевтическую эффекторную часть молекулы (например, конъюгат антитело-лекарственное средство). Еще в одном варианте осуществления способа антитело вводят пациенту последовательно или вместе с другим химиотерапевтическим агентом. В другом предпочтительном варианте осуществления способа антитело вводят пациенту с не поддающейся лечению солидной опухолью последовательно или вместе с другим химиотерапевтическим агентом.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, у которого предполагают наличие рака, у которого на поверхности клеток экспрессируется α5β1, где у индивидуума рак еще не распространился, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело, которое связывается с α5β1-интегрином. В предпочтительном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки и рака селезенки.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума с генетическим предрасположением к возникновению рака, который экспрессирует α5β1, где у индивидуума рак еще не распространился, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело, которое связывается с α5β1-интегрином. В предпочтительном варианте осуществления, рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки и рака селезенки.

Предпочтительные антитела против α5β1, используемые в способах настоящего изобретения, включают в себя IIA1, М200, F200 и антитела, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом на α5β1, что и антитела IIA1, М200 и F200.

В другом варианте осуществления антитела против α5β1, которые могут использоваться в способах по изобретению, включают в себя антитела, которые конкурентно ингибируют связывание IIA1 и/или М200 с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки.

Другие антитела, которые могут использоваться в способе по изобретению, включают в себя антитела, содержащие аминокислотную последовательность вариабельной области, по существу идентичную SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8. В рамках изобретения также рассматриваются антитела, содержащие аминокислотные последовательности вариабельной области, которые по меньшей мере приблизительно на 90%, 95%, 98% или предпочтительно 99% или больше идентичны SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам против α5β1, которые входят в состав фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции могут использоваться в различных описанных в настоящих изобретениях способах. В различных вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие антитела против α5β1, могут быть введены в терапевтически эффективном количестве индивидууму различными способами, в том числе, но не только, перорально, подкожно, местно, внутривенно, интраназально, трансдермально, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, вагинально, ректально, интраокулярно, интравентрикулярно или внутриоболочечно. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическая композиция является жидкой композицией, содержащей приблизительно от 1,0 мг/мл до 15 мг/мл антитела против α5β1, приблизительно 22-27 мМ цитрата, приблизительно 145-165 мМ хлорида натрия, приблизительно 0,04%-0,06% полисорбата (TWEEN®) 80 при рН приблизительно 5,5-7,5. В другом предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция является жидкой композицией, содержащей приблизительно 10 мг/мл антитела против α5β1, приблизительно 25 мМ цитрата, приблизительно 150 мМ хлорида натрия, приблизительно 0,05% полисорбата (TWEEN®) 80, при рН приблизительно 6,5. В особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция является жидкой композицией, содержащей приблизительно 10 мг/мл М-200, приблизительно 25 мМ цитрата, приблизительно 150 мМ хлорида натрия, приблизительно 0,05% полисорбата (TWEEN®) 80 при рН приблизительно 6,5. В другом предпочтительном варианте осуществления каждая из описанных здесь фармацевтических композиций может дополнительно содержать химиотерапевтический агент. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая антитело против α5β1, может быть введена пациенту вместе с фармацевтически эффективным количеством другого химиотерапевтического агента.

Описанные выше фармацевтические композиции могут быть использованы в способе лечения пациента, у которого диагностирован рак, или подозреваемого в наличии рака, выбранного из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почек и рака селезенки, где способ предусматривает внутривенное введение пациенту терапевтически эффективной дозы жидкой композиции, содержащей приблизительно от 1,0 мг/мл до 15 мг/мл антитела против α5β1, приблизительно 22-27 мМ цитрата, приблизительно 145-165 мМ хлорида натрия, приблизительно 0,04%-0,06% полисорбата (TWEEN®) 80 при рН приблизительно 5,5-7,5. В одном из вариантов осуществления способов лечения, вводимая терапевтически эффективная доза составляет приблизительно 10 мг/кг.В предпочтительном варианте осуществления у больного, получающего фармацевтическую композицию, диагностирован рак почек или метастатическая меланома или у него подозревают рак почек или метастатическую меланому, и терапевтически эффективная доза составляет приблизительно 10 мг/кг.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 изображена: (А) Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) V_H IIF1; (В) Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:3) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) V_L IIA1.

На фиг.2 изображена: (А) Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:5) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) V_H M200; (В) Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:7) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) V_L M200.

Подробное описание изобретения

Для ясности и лучшего понимания в следующем подробном описании проиллюстрированы варианты осуществления и примеры настоящего изобретения. Варианты осуществления и примеры настоящего описания не предназначены для ограничения объема изобретения. Специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть использованы эквивалентные материалы и/или способы и/или могут быть сделаны очевидные изменения, вариации или модификации в любом из описанных вариантов осуществления и примерах без отклонения от объема прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации и заявки на патенты, цитируемые в описании, приведены здесь в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была здесь особо и индивидуально оговорена как приведенная в качестве ссылки.

Если не указано иного, то все используемые здесь термины имеют обычное значение, установленное специалистами в области, к которой относится изобретение.

Общий обзор

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что α5β1-интегрин экспрессируется на поверхности опухолевых эпителиальных клеток многих типов рака. Кроме того, было обнаружено, что нацеленное связывание антител с поверхностным α5β1 приводит к непосредственному лизису раковых клеток. Поскольку такой способ атаки на раковые клетки и лизиса раковых клеток является прямым, то он может использоваться для лечения опухоли на очень ранней стадии (например, до существенного распространения опухоли). Кроме того, способ прямого лизиса раковых клеток по изобретению может быть особенно эффективен для лечения раков, которые экспрессируют на своей поверхности α5β1, но не чувствительны к антиангиогенным подходам. Типы рака этой категории включают в себя, но ими не ограничиваются, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак почек, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак предстательной железы, рак яичника и метастатическую меланому.

Настоящее изобретение относится к способам лизиса или предотвращения иным способом пролиферации раковых клеток с использованием антител против α5β1. В наиболее общем варианте осуществления способ предусматривает контактирование раковой клетки, которая экспрессирует на своей поверхности α5β1 с антителом против α5β1, и индукцию посредством этого смерти (например, через апоптоз) раковой клетки.

Способы настоящего изобретения могут быть использованы для лизиса раковых клеток in vivo (например, у пациента) и посредством этого предотвращения или ослабления образования и роста опухоли. Кроме того, способ может быть использован для лечения уже существующих опухолей и может быть использован вместе с другими способами терапии рака (например, химиотерапевтическими агентами или другими терапевтическими агентами на молекулярной основе). Например, больному с ростом раковой опухоли можно вводить композицию антитела М200 вместе с химиотерапевтическим соединением, таким как доксорубицин. Поскольку М200 является химерным антителом с относительно низкой токсичностью у человека, это комбинированное лечение может обеспечивать сравнимую эффективность лизиса раковых клеток без токсичных побочных эффектов, которые возникают при более высоких дозах того же химиотерапевтического агента.

Настоящее изобретение относится к способу, в котором антитела против α5β1 убивают раковые клетки или ингибируют пролиферацию раковых клеток непосредственно, даже в отсутствие какой-либо опухолевой сосудистой сети, которая может быть чувствительной к антиангиогенному действию таких антител. Таким образом, способ особенно эффективен для профилактики или терапевтического лечения рака, который экспрессирует α5β1, но не образует сильно васкуляризованные опухоли, и/или не является иным образом чувствительным к действующим на ангиогенез терапевтическим веществам, таким как рак поджелудочной железы, рак почек, метастатическая меланома, рак легкого и рак молочной железы.

Кроме того, благодаря способности антител М200 непосредственно лизировать раковые клетки (и других описанных здесь антител против α5β1) их можно использовать в терапии рака на ранней стадии до образования васкуляризованных опухолей. Способ лечения рака на ранней стадии особенно важен в связи с появлением новых, более чувствительных диагностических тестов рака, которые были разработаны с использованием информации генетических маркеров, доступной из последовательности генома человека. По-видимому, большое количество типов рака можно будет распознать и диагностировать на очень ранней стадии, т.е. на предопухолевой стадии, когда раковые клетки могут присутствовать в ткани и/или в кровотоке, но еще не установилась опухолевая структура, визуализируемая менее чувствительными негенетическими диагностическими способами. В таком методе диагностики на ранней стадии подходы антиангиогенной терапии могут иметь слабый или не иметь никакого эффекта, когда у опухоли нет сосудистой сети, и обычные химиотерапевтические средства могут давать слишком много токсичных побочных действий, чтобы их применение было бы оправдано. Поскольку способ по изобретению приводит к нацеленному лизису антителами раковых клеток, которые экспрессируют на своей поверхности α5β1-интегрин, он является особенно эффективным для превентивного лечения на ранней стадии рака.

Индивидуумы, для которых метод лечения на ранней стадии, вероятно, мог бы быть эффективным, включают, но ими не ограничиваются: 1) индивидуумов, у которых предопухолевые тесты указывали на высокую вероятность развития и/или присутствия опухолей (или микроопухолей); 2) индивидуума, который был подвергнут воздействию мощного канцерогенного стимула и у которого высока вероятность развития опухоли; 3) индивидуума, у которого имеется высокое генетическое предрасположение к развитию рака, где раковые клетки на своей поверхности экспрессируют α5β1.

Антитела против α5β1

В способах настоящего изобретения используют антитела против α5β1 в качестве агентов прямого лизиса раковых клеток. В контексте настоящего описания термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с конкретным антигеном или является иммунологически реактивной, и включает в себя поликлональные, моноклональные, генетически сконструированные и другим образом модифицированные формы антител, в том числе, но не только, химерные антитела, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты антител (например, биспецифические антитела, диатела, триатела и тетратела) и антигенсвязывающие фрагменты антител, в том числе фрагменты Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, rIgG и scFv. Термин "scFv" относится к одноцепочечному Fv-антителу, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепи обычного антитела соединены с образованием одной цепи. Кроме того, термин "антитело" в контексте описанного здесь изобретения включает в себя смеси более одного антитела, реагирующего со специфическим антигеном (например, смесь различных типов моноклональных антител, реагирующих с α5β1-интегрином).

Предпочтительно антитела против α5β1, используемые в настоящем изобретении, являются моноклональными антителами. Моноклональные антитела, которые могут использоваться в способах настоящего изобретения, могут быть получены с использованием большого разнообразия способов, известных в данной области, в том числе с использованием гибридомных способов, рекомбинантных способов и способов фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных способов, в том числе способов, известных в данной области и описанных, например, в Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988); Hammerling et al., in "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," Elsevier, New York (1981), pp.563-681 (которые приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме). Получение антител отбором из библиотек рекомбинантных антител в фаговых или подобных векторах см., например, Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989) и Vaughan et al., Nature Biotechnol. 14: 309-314 (1996) или иммунизацией животного антигеном или ДНК, кодирующей этот антиген.

В предпочтительных вариантах осуществления способы прямого лизиса раковых клеток по настоящему изобретению могут проводиться с использованием ранее охарактеризованных антител против α5β1, IIA1, М200 или F200. IIA1 является исходным антителом мыши класса IgGI, которое, как было показано, ингибирует связывание α5β1-интегрина с фибронектином (см., например, публикацию патентной заявки США 2002/0172675 A1, поданной 7 мая 1999 года, которая приведена здесь в качестве ссылки). М200 является химерным IgG4-антителом, полученным из IIA1. F200 является Fab-фрагментом, полученным из М200. Описание получения этих антител, их функциональная характеристика и специфические аминокислотные последовательности приведены в патентных заявках США №10/724274, поданной 26 ноября 2003 года, и 10/830956, поданной 23 апреля 2004 года, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки. Было показано, что как М200, так и F200 проявляют антиангиогенную эффективность in vivo на моделях глазных заболеваний обезьяны или кролика (см. патентные заявки США 10/724274, поданную 26 ноября 2003 года, и 10/830956, поданную 23 апреля 2004 года).

Антитела, которые могут использоваться в способе по настоящему изобретению, также включают в себя антитела, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом на α5β1, как и антитела IIA1, М200 и F200. «Эпитоп» (или «антигенная детерминанта») обозначает сайт на антигене, с которым связывается антитело. Эпитопы могут быть образованы из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, расположенных рядом в результате образования третичной структуры белка. Например, эпитоп на α5β1-интегрине может содержать аминокислоты на каждой из α- и β-полипептидных цепей, которые образуют гетеродимерную структуру. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, обычно сохраняются под действием денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные третичной структурой, обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает в себя по меньшей мере 3, чаще 5 или 6-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают в себя, например, рентгеновскую кристаллографию и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

Говорят, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом белка, если мутации в белке, которые уменьшают или элиминируют связывание одного антитела, также уменьшают или элиминируют связывание другого антитела. Также можно сделать вывод, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если эти два антитела конкурируют за связывание с этим белком, т.е. связывание одного антитела с этим белком конкурентно ингибирует, уменьшает или элиминирует связывание другого антитела. Таким образом, способы по изобретению могут проводиться с антителом, которое, как было определено, конкурентно ингибирует связывание IIA1, V200 (волоциксимаба) или F200 с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности раковых клеток.

Антитела против α5β1, которые могут использоваться в способах настоящего изобретения, не ограничиваются IIA1, М200 и F200, но могут включать в себя антитела, содержащие вариабельную область, каркасную область или аминокислотную последовательность определяющих комплементарность районов (CDR), идентичные аминокислотной последовательности CDR IIA1, М200 и F200. Нахождение и длина вариабельных областей, каркасных районов и CDR хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5^th ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). В контексте описания, вариабельная область тяжелой цепи ("V_H" или "VH") или легкой цепи ("V_L" или "VL") антитела включает в себя тяжелую и легкую цепи антигенсвязывающего фрагмента, например Fv, scFv, dcFv или Fab. Вариабельные области легкой или тяжелой цепей антитела также содержат каркасные районы, прерываемые тремя гипервариабельными районами, также называемыми "определяющими комплементарность районами" или "CDR". Эти CDR являются первично ответственными за связывание с эпитопом антигена.

"По существу идентичные" вариабельная, константная, каркасная области или CDR обозначают район антитела, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере приблизительно на 85-90% и предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична вариабельной или константной области природного или неизмененного антитела. Термины "идентичные" или процентная "идентичность", в контексте двух или более аминокислотных или нуклеотидных последовательностей обозначают две или более последовательности или субпоследовательности, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. приблизительно 60% идентичность, приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность в указанном районе, при сравнении и сопоставлении для максимального соответствия в окне сравнения или обозначенного района) при измерении с использованием алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или сопоставлением вручную и визуальном контроле (см., например, описание BLAST в веб-сайте National Center for Biotechnology Information (NCBI), находящегося в www.ncbi.nlm.nih.gov.).

Идентичные или по существу идентичные последовательности включают в себя последовательности с делециями и/или добавлениями, а также последовательности с заменами, а также природные, например полиморфные или аллельные, варианты и созданные человеком варианты, такие как консервативно модифицированные варианты. Хорошо известные алгоритмы для измерения идентичности последовательностей могут отвечать за пропуски и т.п. Предпочтительно идентичность последовательности существует в районе, длина которого составляет по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот или нуклеотидов, или, более предпочтительно, в районе, длина которого составляет 50-100 аминокислот или нуклеотидов.

Аминокислотные последовательности антитела против α5β1, которые могут использоваться в способах по настоящему изобретению, не ограничиваются последовательностями, обнаруживаемыми в природных антителах; антитела могут быть переконструированы для получения желаемых характеристик с использованием способов рекомбинантных ДНК. Такие "генетически измененные антитела" включают в себя антитела, в которых аминокислотная последовательность была изменена относительно последовательности исходного (т.е. неизмененного) антитела. Возможные вариации находятся в диапазоне от изменения всего лишь одной или небольшого числа аминокислот до полного переконструирования, например, вариабельной или константной области. Для улучшения или изменения функциональных характеристик терапевтического антитела, таких как иммуногенность, фармакокинетические свойства (например, период полувыведения из сыворотки), фиксация комплемента, взаимодействие с мембранами и другие эффекторные функции в константной области могут быть произведены изменения посредством сайт-направленного мутагенеза. Для улучшения характеристик связывания антигена обычно могут быть произведены изменения вариабельной области антител.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления химерное антитело М200 может быть использовано в способах прямого лизиса раковых клеток изобретения. Термин "химерное антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, в которой (а) ее константная область или ее часть изменена, заменена или обменена таким образом, что антигенсвязывающий сайт (вариабельная область) связан с константной областью другого или измененного класса, другой эффекторной функции и/или другого вида, или полностью другой молекулой, которая придает новые свойства этому химерному антителу, например токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным средством и т.д.; или (b) эта вариабельная область или ее часть изменена, заменена или обменена на вариабельную область, имеющую другую или измененную специфичность в отношении антигена. Способы получения химерных антител хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Morrison et al.. Science 229: 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214-221 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989) и патенты США с №№5807715; 4816567 и 4816397, каждый из которых приведен здесь в качестве ссылки в полном виде.

В другом предпочтительном варианте осуществления в способах прямого лизиса раковых клеток изобретения могут быть использованы гуманизированные антитела против α5β1. Дополнительные последовательности человека в гуманизированных антителах дополнительно уменьшают возможную иммуногенность антитела при его использовании в качестве терапевтического средства для человека. Гуманизированные версии IIA1 описаны в патентных заявках США 10/724,274, поданной 26 ноября 2003 года, и 10/830,956, поданной 23 апреля 2004 года, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки. Термин «гуманизированное антитело» относится к иммуноглобулину, содержащему каркасную область антитела человека, по меньшей мере один и предпочтительно все CDR антитела, не являющегося антителом человека, в котором любая присутствующая константная область по существу идентична константной области иммуноглобулина человека, т.е. идентична по меньшей мере приблизительно на 85-90% и предпочтительно по меньшей мере на 95%. Таким образом, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением CDR, по существу идентичны соответствующим частям одной или нескольких природных последовательностей иммуноглобулина человека. Таким образом, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами, в которых по существу менее, чем одна интактная вариабельная область иммуноглобулина человека, была заменена соответствующей последовательностью другого вида. Каркасные остатки в каркасных районах человека могут быть заменены соответствующим остатком из антитела-донора CDR для изменения, предпочтительно для улучшения связывания антигена. Эти каркасные замены могут быть идентифицированы способами, хорошо известными в данной области, например моделированием взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антител, и сравнением последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. См., например. Queen et al., патенты США №№5530101; 5585089; 5693761; 5693762; 6180370 (каждый из которых приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме). Антитела могут быть гуманизированы различными способами, известными в данной области, в том числе, например, путем CDR-трансплантации (ЕР 239400; РСТ публикация WO 91/09967; патенты США №№5225539; 5530101 и 5585089), облицовки или изменения поверхности антител (ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan, Mol. Immunol., 28: 489-498 (1991); Studnicka et al., Prot. Eng. 7: 805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973 (1994) и перетасовки цепей (патент США №5565332), каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

В другом варианте осуществления антитела человека (т.е. антитела, содержащие как вариабельную, так и константную области человека) к α5β1 могут быть использованы для терапевтического лечения пациентов-людей в соответствии со способами изобретения. Антитела человека могут быть сделаны или получены различными способами, известными в данной области, в том числе способами фагового дисплея, описанными выше, с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. См. патенты США №№4444887 и 4716111 и РСТ публикации WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741, каждая/ый из которых приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Антитела человека могут быть также получены с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулина человека. Для обзора этой технологии получения антител человека см. Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). В отношении подробного обсуждения этой технологии получения антител человека и моноклональных антител человека и протоколов для получения таких антител см., например, РСТ публикации WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Европейский патент №0598877; патенты США №№5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 и 5939597, которые приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме. Полностью человеческие антитела, которые узнают выбранный эпитоп, могут быть также получены с использованием способа, называемого «управляемым отбором». В этом подходе выбранное моноклональное антитело, не являющееся антителом человека, например мышиное антитело, используют для управления отбором полностью человеческого антитела, узнающего тот же самый эпитоп (Jespers et al., Biotechnology 12: 899-903 (1988).

В альтернативном варианте осуществления, приматизированные антитела (т.е. антитела, содержащие вариабельные области обезьяны и константные области человека), могут быть использованы для терапевтического лечения в соответствии со способами по настоящему изобретению. Способы получения приматизированных антител известны в данной области. См., например, патенты США №№5658570; 5681722 и 5693780, которые приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Функция антител

В способах по изобретению используют функциональные антитела, которые обнаруживают специфическое связывание с α5β1-интегрином. Тестирование авидности антител в отношении специфического связывания с антигеном позволяет специалисту с квалификацией в данной области идентифицировать антитела, специфически распознающие один или более эпитопов α5β1-интегрина. Антитела определяются как специфически связывающие, если 1) они обнаруживают пороговый уровень связывающей активности; и/или 2) у них отсутствует значительное перекрестное связывание с родственными полипептидными молекулами.

Во-первых, антитела против α5β1, которые могут использоваться для описанных здесь способов, специфически связывают (или "специфически реагируют" или "специфически иммунсреагируют"), если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом α5β1-интегрина с аффинностью связывания (К_а) 10⁶ моль^-1 или более, предпочтительно, 10⁷ моль^-1 или более, более предпочтительно, 10⁸ моль^-1 или более и, наиболее предпочтительно, 10⁹ моль^-1 или более. Аффинность связывания антитела может быть легко определена специалистом в данной области, например, анализом Скетчарда (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949) или резонансом поверхностных плазмонов с использованием BIAcore. Разнообразие анализов связывания антител, которые могут использоваться для характеристики антител против α5β1, описано в патентных заявках США 10/724274, поданной 26 ноября 2003 года, и 10/830956, поданной 23 апреля 2004 года, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки.

Во-вторых, антитела специфически связываются, если у них отсутствует значительное перекрестное связывание с родственными полипептидами. У антител отсутствует значительное перекрестное связывание с родственными полипептидными молекулами, например, если с помощью них обнаруживают полипептид α5β1-интегрина, а не известные родственные полипептиды при использовании стандартного анализа Вестерн-блот (см., например, "Current Protocols in Molecular Biology," eds. Ausubel et al., 1995). Примеры известных родственных полипептидов включают в себя ортологи, белки из того же самого вида, которые являются членами семейства белков интегринов, или мутантные полипептиды α5β1-интегрина, где мутация изменяет эпитоп антитела против α5β1. Кроме того, антитела могут быть подвергнуты «скринингу против» известных родственных полипептидов для выделения популяции, которая специфично связывается с α5β1-интегрином. Например, антитела, индуцированные к полипептидам α5β1-интегрина человека, адсорбируются родственными полипептидами, прикрепленными к нерастворимому матриксу; антитела, специфические в отношении полипептидов α5β1-интегрина человека, будут протекать через этот матрикс при правильных буферных условиях. Такой скрининг позволяет выделить поликлональные и моноклональные антитела, у которых отсутствует перекрестное связывание с близкородственными полипептидами (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.) National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Скрининг и выделение специфических антител хорошо известно в данной области (см. Fundamental Immunology, Paul (eds.). Raven Press, 1993; Getzoff et al.. Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Coding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Характерные примеры таких анализов включают в себя: конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ, радиоиммунопреципитацию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), дот-блот- или Вестерн-блот-анализ, анализ ингибирования или конкурентный анализ и сэндвич-анализ. Для обзора иммунологических процедур и процедур иммуноанализов см. Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7^th ed. 1991).

Специфическое связывание антител против α5β1, которое может использоваться в способах настоящего изобретения, может быть получено способом отбора на α5β1-связывание. Обычно поликлональные антитела, индуцированные для специфического связывания с конкретным белком, или их полиморфные варианты, аллели, ортологи, консервативно модифицированные варианты, сплайсинговые варианты, могут быть отобраны для получения только тех антител, которые являются специфически иммунореактивными с выбранным белком (например, α5β1-интегрином), но не с другими белками. Отбор на специфическое связывание достигается субтракцией (вычитанием) антител, у которых отсутствует перекрестное связывание с другими молекулами. Разнообразные форматы иммуноанализа могут быть использованы для отбора антител, специфически связывающихся с полипептидом α5β1-интегрина. Например, твердофазные иммуноанализы ELISA могут быть использованы для отбора антител, специфически связывающихся с белком (см., например, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988) в отношении описания форматов иммуноанализа и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство

В некоторых вариантах осуществления в способе лизиса раковых клеток может использоваться антитело против α5β1, конъюгированное с эффекторной молекулой. Эффекторной молекулой может быть любое число молекул, в том числе метящие молекулы, такие как радиоактивные метки или флуоресцентные метки, или предпочтительно ею может быть терапевтический компонент. Эта эффекторная часть молекулы (или "эффекторный компонент") может быть связана (или соединена или конъюгирована) с антителом против α5β1 либо ковалентно, через линкер или химическую связь, либо нековалентно, через ионные, вандерваальсовы, электростатические или водородные связи.

В одном из аспектов таким терапевтическим компонентом молекулы является малая молекула, которая модулирует активность α5β1-интегрина. В другом аспекте терапевтический компонент молекулы влияет на активность молекул или клеток, ассоциированных с α5β1-интегрином или находящихся в тесной близости с α5β1-интегрином. Например, этим терапевтическим компонентом молекулы может быть цитотоксичный агент. Термин "цитотоксичный агент" обозначает в данном контексте вещество, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Предполагается, что этот термин включает в себя радиоактивные изотопы (например, I¹²⁵, Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или их фрагменты. Подходящие токсины и их соответствующие фрагменты включают в себя А-цепь дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина, А-цепь рицина, А-цепь абрина, курцин, кротин, феномицин, эномицин, ауристатины (например, ауристатин Е или ауристатин F) и т.п. Нацеливание терапевтической части молекулы на α5β1-интегрин, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, не только служит для увеличения локальной концентрации терапевтического компонента молекулы в пораженной раком зоне, но также служит для уменьшения побочных действий, которые могут быть связаны с этим терапевтическим компонентом молекулы.

Примеры химиотерапевтических агентов, которые могут быть использованы в качестве терапевтических компонентов молекул с антителами против α5β1 по изобретению, включают в себя, но ими не ограничиваются, адриамицин, доксорубицин, доксил, эпирубицин, 5-фторурацил, цитозинарабинозид ("Аrа-С"), циклофосфамид, тиотепа, бусульфан, цитоксин, таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.Y.) и доксетаксел (TAXOTERE™, Rhone-Poulenc Rorer), токсотере, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, эсперамицины (см. патент США №4675187), 5-ФУ, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, актиномицин D, VP-16, хлорамбуцил, мелфалан и другие родственные азотные аналоги иприта. В это определение включены также гормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как тамоксифен и онапристон.

Альтернативно, может проводиться способ изобретения, в котором описанные выше химиотерапевтические агенты вводят в препарате вместе с антителом против α5β1, хотя и не в виде конъюгата.

Медицинские показания

Настоящее изобретение относится к способам лизиса раковых клеток, ингибирования пролиферации и/или метастазирования раковых клеток, нацеливанием α5β1-интегрина на поверхность раковых клеток при помощи антитела. Рак представляет собой физиологическое состояние, обычно характеризующееся клетками, подвергающимися неконтролируемому росту. Рак включает в себя все злокачественные неоплазмы, в том числе, но не только, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры раков, которые на своей клеточной поверхности экспрессируют α5β1, на которые может производиться нацеливание с использованием описанных здесь способов, включают в себя, но ими не ограничиваются, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки, фибросаркому, рак легкого, метастатическую меланому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак почек и рак селезенки.

Опухоль представляет собой пролиферирующую массу клеток, лишенную нормальных регуляторов роста. Опухоль может быть доброкачественной или злокачественной и может включать в себя предраковые или раковые клетки и ткани. Раковые клетки обычно образуют опухоли по мере прогрессирования рака. Рост опухоли сопровождается увеличением плотности сосудов. Эта опухолевая сосудистая сеть обеспечивает требуемое снабжение питанием, которое позволяет опухоли расти. Для антиангиогенных терапевтических антител против α5β1 и анти-VEGF (VEGF = васкулярный эндотелиальный фактор роста) была показана эффективность в задержке опухолевого роста на разнообразных раковых моделях (см., например. Kirn et al., J Clin Invest., 110(7):933-41 (2002); Ferrara, Nat Rev Cancer, 2(10): 795-803 (2002)). Было показано, что антитело против α5β1, M200, ингибирует ангиогенез на in vitro и in vivo моделях ангиогенных глазных заболеваний кроликов и обезьян (например, прогрессировании дегенерации желтого пятна; см. патентные заявки США №№10/724274, поданную 26 ноября 2003 года и 10/830956, поданную 23 апреля 2004 года, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки).

Изобретение основано на неожиданном открытии, что для многих типов рака α5β1-интегрин экспрессируется на поверхности опухолевых эпителиальных клеток (наряду с эндотелиальными клетками опухолевой сосудистой сети) и что нацеленное связывание α5β1 на поверхности при помощи антител приводит к прямому лизису этих раковых клеток. Таким образом, лечение рака характеризуется пролиферацией эпителиальных клеток, экспрессирующих α5β1, можно осуществлять антителами против α5β1 и/или клетки могут быть мишенью антител против α5β1 даже в отсутствие какого-либо образования опухолевой сосудистой сети. Поскольку этот способ атаки на раковые клетки и лизиса раковых клеток является прямым, он может использоваться для лечения рака на очень ранней стадии (например, до существенного распространения опухоли).

Пациентами, у которых такое лечение на ранней стадии будет, вероятно, эффективно, включают в себя, но ими не ограничиваются, 1) пациентов, у которых предопухолевые диагностические тесты указывают на высокую вероятность развития и/или наличия опухолей (или микроопухолей); 2) пациентов, подвергнутых очень сильной канцерогенной среде, вероятность прогрессирования опухоли которых является высокой; 3) субъекта, генетическое предрасположение которого (например, обнаруживаемое при помощи генетического маркера рака) делает высокой вероятность развития рака, в котором раковые клетки экспрессируют α5β1 на их поверхности. Например, у пациента с генетической предрасположенностью к раку молочной железы (например, BRCA-ген-положительного) или у которого был обнаружен какой-либо предопухолевый раковый маркер (например, микрометастазы, детектируемые при помощи ПЦР), этот способ превентивного прямого лизиса раковых клеток ранней стадии, предусматривающий введение фармацевтической композиции антитела против α5β1 будет особенно эффективен.

Гены, указывающие на повышенную вероятность развития рака, и опухолевые маркеры, указывающие на вероятность развития опухоли, могут быть найдены в биомедицинской литературе, посвященной раку, и в базах данных. Кроме того, списки канцерогенов и уровни их воздействия, которые в значительной степени повышают риск развития рака, являются доступными в биомедицинской литературе, хорошо известной специалистам в данной области. Специалист может использовать эти источники наряду с хорошо известными способами визуализации экспрессии α5β1-интегрина на раковых клетках, описанными ниже, для определения, могут ли способы лечения рака ранней стадии по изобретению использоваться у индивидуума или нет. Как описано в примере 2 ниже, проточно-цитометрический анализ выявляет α5β1-интегрин, который экспрессируется на поверхности клеточных линий, полученных по меньшей мере следующих типов рака: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника и рака почек.

Кроме того, способ прямого лизиса раковых клеток по изобретению может быть особенно эффективным для лечения рака, который экспрессирует α5β1, но не обнаруживает чувствительности к антиангиогенным подходам. Рак в этом случае включает в себя, но ими не ограничивается, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, фибросаркому, рак почек, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак легкого и метастатическую меланому. В особенно предпочтительном варианте осуществления, способы по изобретению могут быть использованы для лечения любого из перечисленных выше рака, где солидные опухоли пациента не поддаются лечению. Было показано, что антитело против α5β1, М200 (волоциксимаб), обнаруживает некоторую эффективность в отношении лечения пациентов-людей с различными типами рака, с солидными опухолями, не поддающимися лечению, в том числе колоректального рака (CRC), меланомы (MEL), рака почек (RCC), рака печени (НСС), рака легкого (NSCLC), рака поджелудочной железы (PC), рака околоушной железы (РАНО) и рака молочной железы (ВС).

Специалист в данной области может определить тип рака, который экспрессируют α5β1 на поверхности эпителиальных клеток с использованием антитела против α5β1 (например, IIA1 или М200) для зондирования проб биопсии опухоли в соответствии со стандартными способами иммуногистохимии. Как описано в примере 2 ниже, иммуногистохимический анализ (IHC) проб биопсии опухоли, взятых у пациентов с меланомой, раком легкого, раком почек, раком поджелудочной железы и молочной железы, показал во всех случаях экспрессию α5β1-интегрина на опухолевых эпителиальных клетках. Следует ожидать, что будут обнаружены и другие типы рака, экспрессирующие на поверхности опухолевых эпителиальных клеток α5β1, с использованием IHC (или других способов), и авторы считают, что такие типы рака будут чувствительными к способу лизиса раковых клеток по изобретению.

Кроме IHC проб опухолей, линии раковых клеток могут быть подвергнуты скринингу на экспрессию α5β1 на клеточной поверхности с использованием антитела против α5β1 и стандартных способов проточной цитометрии, хорошо известных специалистам в данной области. Как подробно описано в примере 2 ниже, проточно-цитометрический скрининг выявил экспрессию α5β1 на поверхности 21 хорошо известной линии раковых клеток. На основании этого результата, эти клеточные линии являются чувствительными к прямому лизису клеток антителами против α5β1 в соответствии со способами изобретения. Кроме того, если определено, что линия раковых клеток экспрессирует α5β1 на их поверхностях, и эта клеточная линия соответствует раковым клеткам, присутствующим у пациента, больного раком, происходит или получена из раковых клеток, присутствующих в раковом пациенте, то способы по изобретению могут быть использованы для лечения такого пациента. Например, линия клеток NW231, которая, как было обнаружено в примере 2, экспрессирует α5β1-интегрин на ее поверхности, происходила из опухолей молочной железы. Таким образом, специалист в данной области сможет непосредственно определить, что антитело против α5β1 может быть использовано для лечения пациента с раком молочной железы, в соответствии со способами, описанными здесь.

Композиции, составы и введение антител

Антитела против α5β1, которые могут использоваться в способах по изобретению, могут быть использованы в выделенной и очищенной форме и непосредственно контактировать с раковыми клетками или опухолями. Способы очистки антител против α5β1 (например, IIA1 и F200) описаны в патентных заявках США №№10/724274, поданной 26 ноября 2003 года, и 10/830956, поданной 23 апреля 2004 года, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки. F200 может быть также получен в виде Fab'-NAC-фрагмента в соответствии со способами, описанными в патентной заявке США 60/583127, поданной 25 июня 2004 года, которая приведена здесь в качестве ссылки. F200-Fab'-NAC обладает повышенной стабильностью в жидкой и лиофилизированной формах этого антитела. Чистота и гомогенность могут быть определены стандартными способами аналитической химии, такими как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Считается, что антитело, которое преобладает в препарате, является по существу очищенным. Например, раствор антитела, который обнаруживает по существу одну полосу в электрофоретическом геле, является по существу очищенным.

Предпочтительно антитело, используемое в фармацевтических композициях по изобретению, является по меньшей мере на 85% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чистым и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% чистым.

В предпочтительных вариантах осуществления проводят способ прямого лизиса раковых клеток, в котором очищенные антитела против α5β1 готовят в виде фармацевтической композиции, которую вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. В данном контексте "терапевтически эффективное количество" обозначает количество фармацевтической готовой формы или композиции, которое является достаточным для излечения, облегчения, ослабления или по меньшей мере частичной задержки развития рака и/или его симптомов и/или осложнений. Клинические способы определения терапевтически эффективного количества антитела против α5β1 для лечения рака хорошо известны специалистам в данной области и могут быть определены эмпирически с использованием рутинного экспериментирования. Например, в контексте лечения рака "терапевтически эффективным количеством" является количество, способное вызывать один или несколько следующих эффектов: (1) ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли, в том числе ослабление и полную задержку роста; (2) уменьшение количества раковых клеток; (3) уменьшение размера опухоли; (4) ингибирование (т.е. уменьшение, замедление или полное прекращение) инфильтрации раковых клеток периферических органов; (5) ингибирование (т.е. уменьшение, замедление или полное прекращение) метастазирования раковых клеток; (6) усиление противораковой иммунной реакции, которая может, но необязательно, приводить к регрессу или отторжению опухоли; и/или (7) облегчение, до некоторой степени, одного или более симптомов, связанных с данным нарушением.

Фармацевтические композиции для введения будут обычно содержать антитело против α5β1, растворенное в фармацевтически приемлемом носителе или эксципиенте, предпочтительно в водном носителе. Приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами для фармацевтической композиции являются носители, эксципиенты или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для этой клетки или млекопитающего, подвергнутых их действию, в используемых дозах и концентрациях. Примеры физиологически приемлемых носителей включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, в том числе аскорбиновая кислота; низкомолекулярный (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстраны; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN®, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS™. Могут быть использованы разнообразные водные носители, например забуференный солевой раствор и т.п. Эти растворы должны быть стерильными и они обычно не должны содержать нежелательного материала. Фармацевтические композиции могут стерилизоваться общепринятыми, хорошо известными способами стерилизации.

Эти фармацевтические композиции могут также содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества (добавки), которые необходимы для приближения к физиологическим условиям, такие как корректирующие рН и буферные агенты, корректирующие токсичность агенты и т.п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и другие фармацевтически приемлемые соли, которые, как предполагается, включают в себя как соли добавления кислот, так и соли добавления оснований. Эти фармацевтические композиции могут также включать в себя один или несколько из следующих компонентов: белки-носители, такие как сывороточный альбумин; буфер; фильтры, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, кукурузный крахмал или другие крахмалы; связующие агенты; подслащивающие вещества и другие улучшающие вкус и запах агенты; красители и полиэтиленгликоль. Концентрация антитела в этих готовых формах может широко изменяться и будет выбираться, прежде всего, в зависимости от объемов, вязкостей текучих сред, массы тела и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента (например, "Remingtons Pharmaceutical Sciences" (15^th ed., 1980) и Goodman & Gillman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (Hardman et al., eds., 1996)).

В предпочтительном варианте осуществления способов по изобретению антитело против α5β1 готовят в виде фармацевтической композиции, содержащей раствор приблизительно 1,0 мг/мл - 15 мг/мл антитела, приблизительно 22 мМ - 28 мМ цитрат, приблизительно 135-165 мМ хлорид натрия, 0,04%-0,06% полисорбат (TWEEN®) 80, при рН 5,5-7,5. Предпочтительно, диапазон рН жидкой готовой формы составляет приблизительно рН 6,0 - рН 7,0 и, наиболее предпочтительно, приблизительно рН 6,3 - рН 6,7. В особенно предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит раствор приблизительно 10,0 мг/мл антитела, приблизительно 25 мМ цитрат, приблизительно 150 мМ хлорид натрия, приблизительно 0,05% полисорбат (TWEEN®) 80, при рН приблизительно 6,5. В других вариантах осуществления, приведенная выше фармацевтическая композиция антитела против α5β1 может дополнительно содержать химиотерапевтический агент или, альтернативно, может вводиться пациенту вместе с фармацевтически эффективным количеством химиотерапевтического агента.

Предпочтительно, жидкая готовая форма этой фармацевтической композиции является стабильным, бесцветным или прозрачным, слегка опалесцирующим раствором, обнаруживающим не более чем 10% и, предпочтительно, 5% или менее деградированного мономера антитела при измерении при помощи SEC-HPLC. Предпочтительно, наблюдают не более чем 10% и, предпочтительно, 5% или менее, гидролитического расщепления, и образуется не более чем 10%, и предпочтительно 5% или менее агрегата антител. Предпочтительно, концентрация, рН и осмолярность этой готовой формы имеет не более чем ±10% изменение. Эффективность находится в диапазоне 70-130%, предпочтительно 80-120% от контроля.

Введение фармацевтических композиций, содержащих антитела против α5β1, индивидууму может проводиться различными способами, в том числе, но не только, перорально, подкожно, внутривенно, интраназально, местно, чрезкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, вагинально, ректально, интраокулярно, интравентрикулярно или внутриоболочечно. Понятно, что при пероральном введении антитела должны быть защищены от переваривания. Это обычно выполняется либо образованием комплексов этих молекул с композицией для придания устойчивости к кислотному и ферментативному гидролизу, или упаковкой этих молекул в подходящем устойчивом носителе, таком как липосома или защитный барьер. Средства защиты агентов от переваривания хорошо известны в данной области.

Фармацевтические композиции могут вводиться в различных стандартных лекарственных формах в зависимости от способа введения. Например, стандартные лекарственные формы для перорального введения включают в себя, но ими не ограничиваются, порошок, таблетки, пилюли, капсулы и пастилки.

Точная доза введения в конкретном варианте осуществления способа по изобретению будет зависеть от цели лечения и может быть определена специалистом в данной области с использованием хорошо известных способов (например, Ansel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;" Lieberman, "Pharmaceutical Dosage Forms" (vol.1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd, "The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding" (1999); и Pickar, "Dosage Calculations" (1999)). Как известно в данной области, поправки на деградацию препарата опухолью, на системную доставку относительно локализованной доставки и скорость синтеза новой протеазы, а также на возраст, массу тела, общее состояние, пол, диету, время введения, взаимодействие лекарственных средств и тяжесть состояния, могут быть необходимыми и будут определены рутинным экспериментированием специалистами в данной области.

В одном из вариантов осуществления по изобретению фармацевтические композиции антитела против α5β1 вводят пациенту на основе массы антитела (в мг) на массу тела пациента (в кг). Таким образом, предпочтительные уровни доз включают в себя по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5,0 мг/кг, 10,0 мг/кг и 15 мг/кг. Предпочтительно дозу вводят пациенту в виде внутривенной инфузии на протяжении 1 часа. Дополнительные дозы могут вводиться на протяжении продолжительного периода времени, так что у пациента устанавливается стационарное состояние концентрации в сыворотке. Например, инфузия 10 мг/кг может выполняться один раз в неделю на протяжении года.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления уровень и схему введения доз выбирают таким образом, чтобы гарантировать, что эта доза обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке, более низкую, чем безопасные максимальные сывороточные концентрации, наблюдаемые в фармакокинетических исследованиях, проводимых на обезьянах (например, собакоголовой обезьяне). Например, у собакоголовых обезьян максимальный уровень М200 при дозе 50 мг/кг после 4 еженедельных доз был 1862 мкг/мл (диапазон: 1000-2606 мкг/мл). Обезьяны не обнаруживали токсичности при этих сывороточных концентрациях. Кроме того, или альтернативно, доза могла быть выбрана таким образом, что на всем протяжении эксперимента сывороточный уровень был > 1 мкг/мл, т.е. концентрации, которая дает 80% ингибирование связывания α5β1 с фибронектином в анализе активности in vitro.

Согласно одному из вариантов осуществления способов терапевтического лизиса раковых клеток по изобретению, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против α5β1, вводят пациенту внутривенно при фиксированной дозе, обычно приблизительно 0,1-10 мг на пациента в день. В вариантах осуществления, в которых эту фармацевтическую композицию вводят в изолированный участок, такой как полость тела или просвет органа, а не в кровоток, могут быть использованы фиксированные дозы от 0,1 мг до приблизительно 100 мг на пациента в день. Существенно более высокие дозы возможны для вариантов осуществления, в которых желательно местное введение. Фактические способы приготовления парентерально вводимых композиций будут известны или очевидны для специалистов с квалификацией в данной области, например "Remington's Pharmaceutical Sciences" и Goodman & Gillman, "The Pharmacologial Basis of Therapeutics," выше.

Фармацевтические композиции, используемые в способе лизиса раковых клеток по изобретению, могут вводиться как часть терапевтического или профилактического лечения. В терапевтическом способе, фармацевтическую композицию вводят пациенту, уже страдающему от рака, в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере частичной задержки прогрессирования этого заболевания и его осложнений. Обычно, в контексте терапевтического лечения, успех этой терапии может быть измерен как уменьшение размера опухоли или уменьшение скорости роста опухоли. Количество, достаточное для выполнения этого, определяется как "терапевтически эффективная доза". Количества, эффективные для этого использования, будут зависеть от тяжести рака и общего состояния здоровья пациента. Единственные или множественные введения фармацевтических композиций могут быть использованы в зависимости от дозы и частоты введений, переносимых конкретным пациентом.

Способ лечения ранней стадии рака направлен на предотвращение или замедление развития рака у субъекта, у которого предполагают развитие этого заболевания, или на очень ранней стадии этого заболевания. Конкретная доза, необходимая для лечения ранней стадии, будет зависеть от медицинского состояния и истории конкретного пациента, от конкретного рака, подлежащего предотвращению, а также от других факторов, таких как возраст, масса, пол, способ введения, эффективность и т.д. Способ лечения на ранней стадии может быть также использован профилактически, например, у пациента, который ранее имел рак, для предупреждения рецидива этого рака, или у пациента, в котором подозревают наличие значимой вероятности развития рака. Например, пациент с генетическим предрасположением в отношении рака молочной железы, в котором был детектирован какой-либо предопухолевый маркер рака (например, микрометастазы, детектированные при помощи ПЦР), будет особенно подходящим для способа лечения на ранней стадии.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения может проводиться способ прямого лизиса раковых клеток, в котором химиотерапевтический агент вводят, наряду с антителом против α5β1. Характерные химиотерапевтические агенты, применимые в этом варианте осуществления, описаны выше. Этот способ комбинированной терапии может быть особенно предпочтительным на ранней стадии или в контексте профилактического лечения, когда пациент лишен симптомов полностью развившегося заболевания. На этой ранней стадии, или в превентивном контексте, многие пациенты не соглашаются подвергаться токсичным действиям, которые сопровождают применение только химиотерапевтического агента. Введением более низкой дозы стандартного химиотерапевтического агента вместе с относительно нетоксичным антителом против α5β1 этот рак может лечиться профилактически, или на очень ранней стадии, с использованием схемы введения, которая является эффективной, а гораздо более хорошо переносимой для пациента.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения описанного здесь изобретения.

Примеры

Пример 1

Экспрессия α5β1 на пробах опухолей, выявляемая иммуногистохимическим анализом (IHC)

Образцы биопсии опухолей, взятые у пациентов с меланомой, раком легкого, раком почек, раком поджелудочной железы и раком молочной железы, исследовали на экспрессию α5β1-интегрина посредством иммуногистохимии (IHC).

Материалы и способы

Замороженные образцы ткани (полученные от Mayo Clinic или Cleveland Clinic) замораживали при оптимальной для приготовления срезов температуре (ОСТ) и хранили при -70°С. Срезы криостатной ткани (7 мкм) фиксировали в смеси 75% ацетон/25% этанол в течение 1 минуты. Пробы инкубировали либо с мышиным антителом против α5β1 IIA1 (5 мкг/мл), либо с контрольным мышиным IgGI (анти-тринитрофенил, гибридомный клон АТСС 1В7.11) в течение 30 минут. Связывание антител определяли с использованием биотинилированного вторичного антитела, антитела козла против IgG мыши (3 мкг/мл, 30 минут; Jackson ImmunoResearch) и проявляли с использованием набора Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) и стабильного DAB (диаминобензидина и Н₂O₂; Research Genetics). Окрашивание выполняли с использованием DAKO Autostainer при комнатной температуре.

Результаты

Как показано в таблице 1, почти все исследованные срезы опухолей окрашивались положительно на α5β1 на сосудистой сети опухолей. Неожиданно, значительная часть проб опухолей обнаружила также положительное окрашивание на экспрессию α5β1-интегрина на самом эпителии опухолей. Эти результаты показывают, что антитело против α5β1 будет непосредственно поражать раковые клетки, наряду с внедрением в новообразованную сосудистую сеть.

Таблица 1 IHC-результаты для проб опухолей, окрашенных антителом против α5β1 IIA1 Тип опухоли (количество проб) Сосудистая сеть опухоли Эпителий опухоли Отр. 1+ 2+ 3+ 4+ Отр. 1+ 2+ 3+ 4+ Почка (n=39) 2 2 13 18 4 27 8 4 0 0 Поджелудочная железа (n=32) 0 1 17 12 2 15 2 7 7 1 Легкое (n=39) 0 1 0 28 1 19 14 3 2 1 Ободочная кишка (n=21) 2 2 3 8 6 19 0 1 1 0 Меланома (n=19) 3 0 2 13 1 13 5 1 0 0 Яичник, метастазы в сальнике (n=4) 0 0 1 3 0 2 2 0 0 0 Мочевой пузырь (n=8) 0 0 4 3 1 5 2 1 0 0

Пример 2

Экспрессия α5β1 на клеточных линиях рака, визуализируемая проточной цитометрией

Набор 24 клеточных линий рака обследовали проточной цитометрией на экспрессию α5β1-интегрина на клеточной поверхности. Как показано в таблице 2, эти 24 клеточные линии были получены из многих различных типов рака, в том числе: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, фибросаркомы, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почек и рака селезенки.

Материалы и способы

Клетки извлекали из 5 мМ ЭДТА в Tris-HCl (pH 8,0) и блокировали центрифугированием в сбалансированном солевом растворе Хенкса, содержащем 3% инактивированную нагреванием FBS, 1% нормальную козью сыворотку (Sigma) и 1% BSA, при 4°С в течение 5 минут. Клетки инкубировали в течение 30-60 минут при 4°С с мышиным антителом против α5β1, IIA1 (10 мкг/мл) в FACS-буфере (PBS, содержащем 0,1% BSA). Избыток моноклонального антитела удаляли центрифугированием и клетки промывали два раза FACS-буфером перед суспендированием в РЕ-антителе против IgG мыши (H+L) (Southern Biotech, разведение 1:400) в течение 30-60 минут при 4°С. После промывки клетки ресуспендировали в буфере FACS, содержащем пропидиум иодид (1 мкг/мл). Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) измеряли на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson). MFI фона была ~5.

Результаты

Как показано в таблице 2, наблюдали значимую детектируемую поверхностную экспрессию α5β1-интегрина для 21 из 24 оцениваемых клеточных линий. У трех клеточных линий рака CHL-1, COLO 357 и С32 были обнаружены величины MFI, которые были очень близки к фону, показывая минимальную экспрессию α5β1-интегрина или ее отсутствие. 21 линия клеток, экспрессирующих на своей поверхности α5β1-интегрин, должна была быть чувствительной к прямому лизису клеток антителом против α5β1. Кроме того, рак, из которого были получены эти клеточные линии, может быть чувствительным к лечению терапевтическим антителом против α5β1.

Таблица 2 Результаты FACS-анализа различных клеточных линий рака с использованием IIA1 и анализ пролиферации in vitro с использованием М200 Клеточная линия Природа рака Экспрессия α5β1 на поверхности (MFI) Ингибирование роста, в % - сыворотка + сыворотка А549 Легкое 71,41 40 0 Н460 Легкое 87,5 40 0 SW839 Почка 65,8 30 0 MIA РАСА-2 Поджелудочная железа 61,9 20 0 НСТ-116 Ободочная кишка 42,5 15 0 786-0 Почка 144,4 10 0 EKVX Легкое 36,7 10 0 SW1990 Селезенка nd¹ 10 0 SN12C Почка 129,1 5 0 А498 Почка 67,1 5 0 А375 Меланома 156,1 5 0 А2058 Меланома 36,2 0 0 CHL-1 Меланома 6,8 0 0 ТК-10 Почка 36,6 0 0 COLO 357 Поджелудочная железа 7,8 0 0 НТ144 Меланома 102,1 0 0 С8161 Меланома 122 0 0 НТ1376 Мочевой пузырь 111,9 0 0 DU145 Предстательная железа 87,5 0 0 UACC-62 Меланома 88,5 0 0 НТ1080 Фибросаркома 421,7 0 0 ES-2 Яичник 132,8 0 0 CAPAN-1 Поджелудочная железа nd¹ 0 0 CAPAN-2 Поджелудочная железа nd¹ 0 0 AS PC-1 Поджелудочная железа nd¹ 0 0 С32 Меланома 5,7 0 0 LOX меланома 261,6 40² 35 NW231 Молочная железа 132,2 10² 35 ¹nd = не определен.
² Величины ингибирования роста в % определяли на 2-й день, а не на 4-й день анализа.

Пример 3

Ингибирование антителом М200 пролиферации раковых клеток in vitro

Набор из 28 клеточных линий рака оценивали на чувствительность к химерному антителу против α5β1 в анализе пролиферации клеток в присутствии или при отсутствии сыворотки.

Материалы и способы

Клеточные линии рака высевали с плотностью 2500 клеток на лунку в 96-луночных планшетах в среде IMDM с добавками в присутствии или при отсутствии 10% FBS. В момент посева клетки стимулировали различными концентрациями М200 или нефункционального блокирующего антитела против α5, VC5. Через четыре дня жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа пролиферации нерадиоактивных клеток (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega)) в соответствии с инструкциями изготовителя. Все исследования роста выполняли по меньшей мере 3 раза в трех повторах.

Результаты

Как показано в таблице 2, антитело М200 ингибировало рост тринадцати клеточных линий рака в отсутствие сыворотки и две клеточные линии в присутствии сыворотки. Было обнаружено, что две из этих клеточных линий, LOX и NW231, являются чувствительными к М200 при обоих условиях. На основании этих результатов раки, из которых происходят эти клеточные линии (меланома и рак молочной железы), по-видимому, отвечают на обработку антителом М200.

Пример 4

Ингибирование in vivo пролиферации опухолевых клеток в моделях ксенотрансплантатов NW231 и LOX

Клетки NW231 и LOX выращивали в виде ортотопических ксенотрансплантатов в мышах SCID и стимулировали антителами против α5β1 M200 и IIA1 внутрибрюшинной инъекцией.

Материалы и способы

Мышей с ухудшенным иммунитетом СВ-17 SCID (штамм С. В-Ighl/IcrTac-Prkdc) получали из Taconic Farms (Germantown, NY). Исследования начинали с использованием самок мышей в 6-10-недельном возрасте (с массой ~20 г). Животным вводили предварительно M200, IIA1 или контрольный IgG внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 1 час перед инокуляцией NW231 (1×10 ⁷ клеток в IMDM) в скопление жировой ткани молочной железы. Введение доз продолжали в течение 3 недель с частотой 3 раза в неделю при 10 мг/кг. Объем опухоли измеряли два раза в неделю при помощи штангенциркуля и рассчитывали по формуле π/6 × длина × ширина × высота. Клинические наблюдения и наблюдения летальности выполняли ежедневно в соответствии с правилами IACUC.

Результаты

Было обнаружено, что IIA1 воспроизводимо ингибирует рост как ксенотрансплантата NW231, так и ксенотрансплантата LOX в этой модели. Было обнаружено, что M200 воспроизводимо ингибирует рост опухоли в этих моделях. Поскольку IIA1 не узнает мышиный α5β1 в сосудистой сети ксенотрансплантированной опухоли, все ингибирующее действие IIA1 на рост опухоли может быть приписано прямому антипролиферирующему действию на раковые клетки этой опухоли.

Пример 5

IIA1 в комбинации с DOXIL® предотвращает закладку опухоли в модели трансплантата NW231 in vivo

Следующий эксперимент проводили для определения эффективности антитела против α5β1-интегрина, IIA1 в комбинации с химиотерапевтическим агентом, DOXIL®, для предотвращения закладки опухолей NW231 человека in vivo. DOXIL® является инкапсулированной в липосомах формой доксорубицина-HCl, цитотоксичного антрациклинового антибиотика, выделенного из Streptomyces peucetius. Клеточная линия NW231 происходит из рака молочной железы и является хорошей моделью для исследования способов лечения для рака молочной железы.

Материалы и способы

Четырех-шестинедельных самок мышей SCID, полученных из Taconic Farms и находящихся в клетках микроизолятора, инокулировали в жировые скопления молочной железы 1×10⁷ клетками NW231. Животные получали либо контроль TIB (n=20), либо М200 (n=20) при 5 мг/кг для первой инъекции в момент инокуляции опухолевых клеток. Последующие обработки были в виде 0,7 мг/кг на инъекцию. Обработку DOXIL® проводили через 5 дней после инокуляции опухолевых клеток. Химиотерапевтические дозы были 4 мг/кг для первой инъекции и 2 мг/кг для последующих инъекций. Реагенты доставляли внутрибрюшинной инъекцией для четырех доз. Объем опухоли измеряли два раза в неделю и клинические наблюдения и наблюдения летальности выполняли ежедневно в соответствии с правилами IACUC.

Результаты

Обработка IIA1 обнаруживала значимое действие в замедлении закладки опухолей NW231 в мышах. При 24 днях после имплантации опухолей NW231 средний объем опухоли контрольных обработанных TIB ксенотрансплантатов увеличивался экспоненциальным образом до ~425 мм³, в то время как обработанные IIA1 ксенотрансплантаты увеличивались до среднего объема ~175 мм³.

Сама обработка DOXIL® также обнаруживала значимое действие в предотвращении закладки опухоли. Для обработанных только DOXIL® ксенотрансплантатов средний объем опухоли сначала увеличивался только до ~25 мм³ во время первых 45 дней после имплантации и затем увеличивался постепенно до ~275 мм³ в день 74.

Обработка мышей комбинированной терапией IIA1 и доксилом имела даже более высокое ингибирующее действие на скорость закладки опухоли в сравнении с любой обработкой по отдельности. Для обработанных IIA1 плюс DOXIL® ксенотрансплантатов средний объем опухоли оставался близким к нулю до дня 54, затем увеличивался постепенно, но только до ~125 мм³ в день 74. Эти результаты показывают увеличенную эффективность (т.е. комбинированное ингибирующее опухоль действие) in vivo для комбинированной обработки антителом против α5β1, IIA1 и химиотерапевтическим агентом, DOXIL®.

Пример 6

Эффективность антитела М200, измеренная в модели опухоли кролика VX2

Хотя М200 не реагирует перекрестно с мышиным или крысиным α5β1-интегрином, он действительно узнает α5β1-интегрин, обнаруживаемый в кролике. Таким образом, кроличья карцинома VX2 может представлять хорошую модель для определения эффективности М200 в прямом лизисе раковых клеток in vivo. VX2 является широко признанной моделью кролика для исследований лечения первичных опухолей различных местоположений (см., например, Chen JG, et al.. Lab Anim. 2004 Jan; 38(1):79-84; Purdie, TG et al., Phys Med Biol. 2001 Dec; 46 (12):3161-75); Geschwind, JH, et al., Cancer Res. 2002 Jul 62(1): 3909-3913).

А. Поисковое (пилотное) исследование эффективности М200 в модели VX2

Начальное поисковое исследование проводили для определения общих параметров для проведения исследования эффективности М200 в модели опухоли VX2 кролика.

Инокуляция опухоли

Кроликов инокулировали в день 0 суспензией клеток (100 мкл) подкожно (в левую заднюю конечность) и внутримышечно при глубине приблизительно 3 мм (в правую заднюю конечность). Внутримышечную инокуляцию проводили следующим образом. При анестезии кролика смесью кетамин/изофлуран делали разрез ~2 см параллельно правой бедренной кости скальпелем на передней, латеральной стороне бедренной оси, ~1/3 общей длины бедренной кости дистально от тазобедренного сустава. Группы мышц разделяли для создания полости глубиной ~0,5 см. Один фрагмент опухоли VX2 из животного-донора помещали в эту полость. Кожу надежно закрывали стерильными хирургическими скобками или швами и антибиотик для местного применения наносили на место раны.

Измерения опухолей

Начиная с дня 5, измеряли размеры опухоли (длину, ширину и высоту) в миллиметрах с использованием электронного циркуля Вернье, подключенного к лэптоп(дорожному)-компьютеру, при минимальной частоте два раза в неделю. Для согласованности один и тот же обученный специалист выполнял измерения опухоли на всем протяжении этого исследования. Объем опухоли рассчитывали с использованием формулы: длина × ширина × высота × 0,52. После умерщвления животных опухоли осторожно вырезали, подрезали и взвешивали. Кроме того, животных взвешивали как минимум один раз в неделю. Репрезентативные пробы каждой опухоли консервировали в кассете для проб в формалине или ОСТ и быстро замораживали в жидком азоте.

Пассирование опухолей VX2 in vivo

Опухоли VX2, используемые как в пилотном (поисковом) исследовании, так и в исследовании эффективности М200, поддерживали пассированием in vivo один раз в месяц. Либо суспензию клеток (100 мкл), либо кусочки опухоли (~5-10 мм³) использовали для внутримышечной инокуляции в каждой задней конечности. Животных и опухоли подвергали визуальному мониторингу и опухоли удаляли перед достижением диаметра 2 см для пассирования in vivo. Пассирование in vivo проводили умерщвлением животного, извлечением опухоли и обработкой опухоли разделением ее на кусочки 5-10 мм³. Эти кусочки повторно имплантировали в следующую группу из 2 кроликов.

IHC-анализ опухолей VX2 из обработанных М200 кроликов

М200 вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг несущему опухоль кролику и эту опухоль вырезали спустя 1 час. Срезы опухоли окрашивали: (i) вторичным антителом против Ig человека, специфическим в отношении связанного с опухолью М200; (ii) IIA1, с последующим вторичным антителом против Ig мыши для детектирования общего α5β1; или (iii) контрольным IgG и вторичным антителом против Ig мыши.

Результаты

Было обнаружено, что как подкожные опухоли, так и внутримышечные опухоли были доступными для М200, инъецированного внутривенно в этих животных, как было оценено при помощи IHC. IHC-анализ (иммуногистохимический анализ) окрашенных срезов выявил высокие уровни экспрессии α5β1 как в опухолевых клетках VX2, так и в сосудистой сети опухолей кроликов.

В. Исследование эффективности М200 в модели VX2

На основе результатов IHC этого поискового (пилотного) исследования модель VX2 кроликов использовали для оценки эффективности М200 in vivo.

Методы

Кроликов (всего 30) инокулировали, подкожно или внутримышечно, либо суспензией клеток VX2 (100 мкл), либо кусочками опухоли (~5-10 мм³). Тест-группу из 20 кроликов обрабатывали М200 при 10 мг/кг внутривенно, два раза в неделю в течение 3 недель. Контрольную группу из 10 животных обрабатывали контрольным IgG, доставляемым таким же способом, каким доставляли М200. Измерение опухолей, терминацию, взвешивание, консервирование опухолей и продолжительность исследования проводили в соответствии со способами, описанными выше для поискового исследования. Кроме того, один миллилитр крови брали из сосуда уха один раз в неделю для анализа сыворотки.

Результаты

Значительную корреляцию наблюдали между ингибированием опухолевого роста и уровнями М200 в кровотоке в этих животных. Обычно при поддержании уровней М200 при или выше 50 мкг/мл рост опухолей ингибировался. Поскольку М200 является иммуногенным в кроликах, некоторые из кроликов тест-группы генерировали иммунную реакцию на М200 так рано, как при двух неделях после введения М200, и было обнаружено, что со временем все эти животные видоизменяли их серологическую специфичность. В животных тест-группы, которые генерировали антиидиотипическую реакцию, приводящую к клиренсу М200 (т.е. М200<50 мкг/мл в день 14), наблюдали больший рост опухоли. Таким образом, результаты, наблюдаемые с использованием модели карциномы VX2, показывают, что М200 способен ингибировать рост опухоли в ясной модели онкологии in vivo.

Пример 7

Эффективность М200 и IIA1 в модели ксенотрансплантата VX2 мыши SCID

Как описано в примере 6, М200 обнаруживал эффективность в кроличьей модели карциномы VX2. Следующее измерение способности прямого лизиса раковых клеток антителами М200 и IIA1 проводили в модели ксенотрансплантата VX2 мыши SCID. Поскольку М200 и IIA1 не узнают мышиный α5β1-интегрин, присутствующий на сосудистой сети ксенотрансплантата VX2, любое ингибирующее действие на рост ксенотрансплантата VX2 может быть приписано прямому антипролиферативному действию, которое М200 и IIA1 оказывают на раковые клетки VX2.

Материалы и способы

Мышей с ухудшенным иммунитетом СВ-17 SCID (штамм С. В-Ighl/IcrTac-Prkdc) получали из Taconic Farms (Germantown, NY). Исследования начинали с использованием самок мышей в 6-10-недельном возрасте (с массой ~20 г). Животным вводили предварительно М200, IIA1 или контрольный IgG внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за один час перед инокуляцией VX2 (1×10⁷ клеток в модифицированной Исков среде Дульбекко) в скопление жировой ткани молочной железы. Введение доз продолжали в течение 3 недель с частотой 3 раза в неделю при 10 мг/кг. Объем опухоли измеряли два раза в неделю при помощи штангенциркуля и рассчитывали по формуле π/6 × длина × ширина × высота. Клинические наблюдения и наблюдения летальности выполняли ежедневно в соответствии с правилами IACUC.

Результаты

Введение доз М200 или IIA1 не коррелировало с уменьшенной скоростью роста опухоли VX2 или общим уменьшенным размером опухоли в сравнении с мышами, которым вводили дозы контрольного IgG. Эти результаты предполагают, что ни М200, ни IIA1 не были способны прямо убивать клетки VX2 в этой мышиной модели ксенотрансплантата.

Пример 8

Исследование фазы I с эскалацией дозы М200 у пациентов-людей с не поддающимися лечению солидными опухолями

А. Обзор

Состоящее из двух частей открытое исследование фазы I проводили для определения действий лечения с использованием до 6 уровней дозы, от 0,5 мг/кг до 15,0 мг/кг М200 (волоциксимаба), у 21 пациента-человека с различными типами не поддающихся лечению солидных опухолей. Общая продолжительность лечения для первой части была 6 недель с физическими оценками на протяжении 45 дней после последней дозы. Вторая часть была расширенным исследованием, в котором 6 из 11 пациентов, которые обнаруживали стабильную реакцию заболевания в первой части, продолжали введение дозы до 52 недель.

В. Параметры и протоколы исследования

1. Выбор пациентов

Для этого исследования выбирали пациентов, которые удовлетворяли следующим критериям включения/исключения:

а. По меньшей мере одно измеримое повреждение на изображении рутинной компьютерной томографии (СТ) или на изображении ядерно-магнитного резонанса (MRI).

b. Приближенно оцениваемое выживание ≥3 месяцев; статус работоспособности Западной кооперированной онкологической научно-исследовательской группы (ECOG) ≤2.

с. Отсутствие опухолей или метастазирования центральной нервной системы (ЦНС) (документированных при скрининге изображения головы).

d. Отсутствие обширного оперативного вмешательства («большой» операции) в пределах 4 недель перед зачислением.

е. Отсутствие малого хирургического вмешательства («малой» операции) в пределах одной недели перед зачислением; отсутствие химиотерапии, иммунотерапии или лучевой терапии в пределах 4 недель перед зачислением.

f. Отсутствие активного нарушения с кровотечением или тромбоэмболических событий.

g. Отсутствие другого клинически значимого или нестабильного медицинского состояния.

n. Пациенты, которые получали ранее терапию мышиными или химерными mAb, должны быть отрицательными в скрининге на антитела против М200 (т.е. перекрестно-реактивные антимышиное антитело человека [НАМА] или антитело человека против химерного антитела [НАСА]).

В это исследование были зачислены в целом 22 пациента. Типы опухолей этих 22 пациентов включали в себя: колоректальный рак (4 пациента; CRC), меланому (4 пациента; MEL), почечно-клеточную карциному (3 пациента; RCC), эзофагеальный рак (2 пациента; ЕС), печеночно-клеточный рак (2 пациента; НСС), рак легкого (1 пациент; NSCLC), рак предстательной железы (1 пациент; PRO), рак щитовидной железы (1 пациент; THY), рак поджелудочной железы (2 пациента; PC), рак околоушной железы (1 пациент; PARO) и рак молочной железы (1 пациент; ВС). Лечение получали 21 из 22 пациентов и 20 из 21 получавшего лечение пациента завершили все 5 введений доз плюс последующее наблюдение на протяжении 45 дней. Эти получавшие лечение пациенты (21 пациент, 12 мужчин, 9 женщин) имели медиану возрастов 59 лет (диапазон 29-81) и средний балл Западной кооперативной онкологической научно-исследовательской группы (ECOG) 1 (диапазон 0-2).

2. Выбор уровней и схемы введения доз М200

Уровни и схему введения доз выбирали таким образом, чтобы гарантировать, что наивысшая доза (15,0 мг/кг) будет давать максимальные концентрации в сыворотке, достаточно более низкие, чем безопасные средние максимальные концентрации, наблюдаемые у собакоголовых обезьян, и что все уровни в сыворотке для минимальных доз ≥1.0 мг/кг будут давать сывороточные концентрации ≥1 мкг/мл, концентрацию, которая обеспечивает 80%-ное ингибирование связывания α5β1 с фибронектином в анализе активности in vitro.

Уровни и схема введения доз, используемые в этом исследовании, были следующими. М200 вводили 21 пациенту в дни 1, 15, 22, 29 и 36. Уровни доз и количества пациентов на уровень были: 0,5 мг/кг (1 пациент), 1,0 мг/кг (2 пациента), 2,5 мг/кг (3 пациента), 5,0 мг/кг (3 пациента), 10,0 мг/кг (6 пациентов) и 15 мг/кг (6 пациентов). Эту дозу вводили в виде внутривенной инфузии на протяжении 1 часа. Первая и вторая дозы были разделены периодом двух недель для возможности взятия проб для фармакокинетических (ФК) данных для отдельных доз. Эти ФК-измерения, выполняемые после первой дозы, использовали для предсказания максимальной сывороточной концентрации каждого пациента после пятой дозы. Если предсказанная максимальная сывороточная концентрация после первой дозы была <750 мкг/мл, то пациент получал все 5 доз М200. Остальные 3 дозы предоставляли один раз в неделю с последующим 45-дневным периодом оценки.

Концентрации М200 в сыворотке человека предсказывали на основе приведенной выше схемы введения доз с использованием того же диапазона вариабельности, который наблюдали у собакоголовых обезьян (т.е. 54%-140% средней величины). Было предсказано, что при наивысшей дозе у людей (15,0 мг/кг) средний максимум после 5 доз равен 592 мкг/мл с предсказанным диапазоном вариабельности у людей, равным 320-829 мкг/мл. Таблица 3 была компилирована с использованием данных ФК из исследований обезьян для предсказания максимальных и минимальных сывороточных концентраций (Сmах и Cmin, соответственно) для каждой дозы при каждом уровне дозы у людей.

Таблица 3 Оцененные максимальные и минимальные сывороточные уровни М200 у людей Уровень Доза (мг/кг) ФК-величина^a Количество доз 1 2 3 4 5 1 0,5 Cmax 11 11 12 13 13 Cmin^b 1,5 1,6 2 2,1 2,2 2 1,0 Cmax 22 22 25 26 26   Cmin 3 3 4 5 5 3 2,5 Cmax 54 57 64 67 68   Cmin 9 10 13 14 15 4 5,0 Cmax 108 114 132 141 147   Cmin 20 24 33 39 43 5 10,0 Cmax 216 236 282 317 346   Cmin 51 66 101 131 156 6 15,0 Cmax 324 366 450 524 592 Cmin 91 126 200 268 332 Диапазон Cmax (54-140%) 175-453 197-512 243-629 283-733 320-829 ^а Величины, выраженные в мкг/мл
^b Рассчитаны для величин, ожидаемых спустя 1 неделю после первой дозы.

На основании приведенной выше таблицы было предсказано, что конечный период полувыведения у людей при 15,0 мг/кг равен приблизительно 13 дням и является меньшим для более низких доз. Было предсказано, что накопление М200 в сыворотке является существенным при уровнях доз ≥5,0 мг/кг, причем концентрация стационарного состояния достигалась в пределах 4 недель для всех доз <10,0 мг/кг и в пределах 5 недель для доз ≥10,0 мг/кг.

3. Приготовление и введение М200

Биологическую массу М200 готовили в соответствии с существующим руководством Good Manufacturing Practices (cGMP). Состав препарата М200, используемого в данном исследовании, был 10 мг/мл М200, 25 мМ цитрата, 150 мМ хлорида натрия, 0,05% полисорбата (TWEEN®) 80, с рН 6,5. Этот препарат является стерильной, бесцветной, прозрачной, слегка опалесцирующей, не содержащей консервантов жидкостью для I.V. использования. Каждый флакон на 20 мл для одноразового применения наполняли для получения 15 мл М200 в дозе 10,0 мг/мл. Каждый флакон на 10 мл для одноразового применения наполняли для получения 10 мл М200 в дозе 10,0 мг/мл. Интактные флаконы хранили в холодильнике при 2-8°С (36-46°F) и держали без замораживания или встряхивания.

После приготовления М200 вводили в пределах 6 часов, если хранили при комнатной температуре (25°С), или 48 часов, если препараты охлаждались в холодильнике (между 2 и 8°С). После этого времени приготовленный раствор выбрасывали.

Подходящую дозу М200 для введения пациенту рассчитывали умножением массы пациента (кг) на подходящий уровень дозы (мг/кг) для пациента. Массу пациента перед введением дозы в день 1 исследования использовали для расчета дозы на протяжении данного исследования. Для пациентов, включенных в группы доз 0,5 мг/кг - 10,0 мг/кг, и для пациентов с массой ≤80 кг, включенных в группу дозы 15,0 мг/кг, эту дозу вводили в фиксированном общем объеме 120 мл на протяжении одного часа.

Хотя пациенту вводили 120 мл разведенного исследуемого лекарственного средства, готовили инфузионный мешок с общей емкостью 150 мл. Дополнительные 30 мл использовали для запуска инфузионной линии и не вводили пациенту. Таким образом, общая доза исследуемого лекарственного средства, помещенная в инфузионный мешок, была дозой пациента (т.е. масса пациента (кг) × уровень дозы [мг/кг], умноженная на 1,25). Общий объем в инфузионном мешке доводили до 150 мл добавлением хлорида натрия для инъекций, USP (0,9%).

Пациенты с массой >80 кг, зачисленные в группу с дозой 15,0 мг/кг, получали их дозу, вводимую в фиксированном общем объеме 180 мл на протяжении одного часа. Хотя пациенту вводили 180 мл разведенного исследуемого лекарственного средства, готовили инфузионный мешок с общей емкостью 210 мл. Дополнительные 30 мл использовали для запуска инфузионной линии и не вводили пациенту. Таким образом, общая доза исследуемого лекарственного средства, помещенная в инфузионный мешок, была дозой пациента (т.е. масса пациента (кг) × уровень дозы [мг/кг], умноженная на 1,167). Общий объем в инфузионном мешке доводили до 210 мл добавлением хлорида натрия для инъекций, USP (0,9%).

Предварительно заполненную инфузионную линию присоединяли к IV-доступу пациента (например, гепариновому стопору). Инфузат вводили при скорости 2 мл/мин (или 3 мл/мин для пациентов с массой >80 кг группы с дозой 15,0 мг/кг) на протяжении одного часа с использованием инфузионного насоса.

4. Первичные конечные точки и вредные события

Конечные точки исследования включали в себя максимальную переносимую дозу, ограничивающую дозу токсичность, профиль безопасности, иммуногенность, фармакокинетику (ФК), насыщение моноцитов (моноциты экспрессируют α5β1-рецептор) и реакцию опухоли на основе критериев Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) (см. Therasse P, et al., "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors," Journal of the National Cancer Institute, 92(3): 205-216 (2000), который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде).

Вредные события распределяли по категориям с использованием National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE), version 3.0. Ограничивающую дозу токсичность определяли как любое вредное событие категории-3 или категории-4, за исключением запланированных госпитализаций или не включенных в программу хирургических вмешательств. Вредные события Категории-3 или категории-4, которые, как считается, не связаны с М200, исключались, если это было необходимо, после совместного разбора с медицинскими контролирующими и регулирующими учреждениями.

Оценки пациентов во время этого исследования включают в себя следующее:

а. Скрининг (в пределах 14 дней вхождения в исследование): медицинской истории и физического обследования, состояния работоспособности ECOG, рутинной химической панели, анализа крови (СВС) с определением лейкоцитарной формулы и тромбоцитов, чувствительного С-реактивного белка (CRP), анализа мочи с использованием микроскопического анализа (UA/micro), электрокардиограммы (ECG), рентгеновского исследования грудной клетки (CXR), СТ или MRI тела, нацеленных на заболевание, анализа мочи на беременность в пределах 48 часов перед введением доз и исследований свертывания (протромбинового времени [РТ] и частичного тромбопластинового времени [РТТ]), антител против М200 (т.е. для детектирования перекрестно-реактивных НАМА или НАСА) для пациентов, которые ранее получали мышиные или химерные антитела, СТ головы для пациентов с опухолями, которые обычно метастазируют в головной мозг или ЦНС, и, в некоторых случаях, биопсии для оценки наличия кровеносных сосудов в опухоли.

b. Лабораторные оценки во время исследования: рутинная химическая панель, урат, сывороточная амилаза, СВС с лейкоцитарной формулой и тромбоцитами, UA/micro.

с. Рутинную нацеленную на заболевание рентгеновскую визуализацию (например, СТ-сканирование) перед лечением и после лечения М200 использовали для оценки реакции опухоли с использованием одномерных критериев RECIST. Повреждения-мишени отбирали на основе их размера (повреждения с самым длинным диаметром (LD)) и их пригодности для точных повторяющихся измерений (способами визуализации или клинически). Рассчитывали сумму LD для всех повреждений-мишеней и сообщали как фоновую сумму LD. Эту фоновую сумму LD использовали в качестве отсчета для характеристики объективной реакции опухоли. Следующие критерии реакции для повреждений-мишеней использовали для оценки наилучшей общей реакции.

- Полная реакция (CR): исчезновение всех повреждений-мишеней, подтверждаемых повторной визуализацией спустя 25-28 дней после впервые документированной CR.

- Частичная реакция (PR): по меньшей мере 30% уменьшение суммы LD повреждений-мишеней, взятой относительно фоновой суммы LD, подтверждаемая повторной визуализацией спустя 25-28 дней после впервые документированной PR.

- Стабильное заболевание (3D): ни достаточного сокращения для квалификации как PR, ни достаточного увеличения для квалификации как PD при рассмотрении относительно наименьшей суммы LD.

- Прогрессирующее заболевание (PD): по меньшей мере 20% увеличение суммы LD повреждений-мишеней, взятое относительно наименьшей суммы LD, зарегистрированной с начала лечения, или появление одного или нескольких новых повреждений.

d. Взятие крови для ФК-измерений сыворотки, анализов иммуногенности (антитела против М200), васкулярных факторов роста и измерения связанного и несвязанного α5β1 на моноцитах периферической крови.

е. Получали 3-мм-пункционную биопсию поверхностного метастазирования опухоли и замораживали после последнего введения М200 от пациентов, которые дали согласие на эту процедуру (необязательную для включения в исследование). Эта проба биопсии могла бы быть использована для оценки наличия кровеносных сосудов в опухоли после обработки М200.

5. Фармакокинетические измерения

Первые ФК-данные человека при низких дозах использовали для предсказания сывороточных уровней человека при более высоких дозах (как описано выше). Сыворотку для измерения концентраций М200 получали непосредственно перед первой дозой и после первой дозы и при 4, 24, 48 и 168 часах после завершения введения первой дозы. Пробы сыворотки для измерения концентраций М200 брали также немедленно перед завершением каждой последующей инфузии, в конце и 4 часа спустя после завершения каждой последующей инфузии. Эти пробы разделяли и анализировали аликвоты перед введением следующей дозы и опять в конце этого исследования: в конце введения 1-й дозы, спустя 168 часов после введения 1-й дозы, немедленно перед дозой (минимум) и немедленно после дозы (максимум) для 2-й, 3-й, 4-й и 5-й доз. Сывороточные уровни М200 измеряли при помощи ELISA.

Данные зависимости концентрации М200 в плазме от времени от каждого пациента подвергали ФК-анализу. В расчеты включали следующие параметры: уровни максимума (пика) (Сmах) и минимума (провала) (Cmin), период полувыведения терминальной фазы (T_1/2β), площадь под кривой зависимости концентрации от времени (AUC), элиминирующий клиренс (CL) и объем распределения (V). Суммарные параметры вычисляли с использованием компьютера у всех пациентов каждой группы лечения. Также оценивали изменения ФК-параметров в зависимости от дозы и времени.

6. Иммуногенность

Иммуногенность М200 определяли при помощи ELISA с двойным мостиковым конъюгированием антигенов. Пробы сывороток для антител против М200 получали от пациентов перед лечением, перед второй дозой и при выходе из исследования, спустя 45 дней после последней дозы М200. Кроме того, брали сыворотку для антител против М200, если интервал между дозами был ≥2 недель. Пробы хранили и оценивали в конце этого исследования. Пробы, которые оказывались положительными в отношении антител к М200, повторно анализировали на нейтрализующие антитела к М200. Пациентов, о которых было известно, что они подвергались действию мышиных или химерных моноклональных антител, подвергали скринингу на присутствие антител против М200 перед получением ими первой дозы М200.

7. Проточно-цитометрический анализ

α5β1-интегрин экспрессируется также на моноцитах периферической крови. Для определения дозы, при которой сайты α5β1 на этих циркулирующих клетках насыщаются М200, брали пробы периферической крови перед первой дозой в день 1 исследования, дни 2 и 8 исследования, непосредственно перед каждой последующей дозой, и в день исследования 43. Насыщение сайтов α5β1 на моноцитах определяли проточной цитометрией. Моноциты идентифицировали с использованием антител к CD14. Связанный М200 на поверхности моноцитов детектировали добавлением меченого антитела против IgG4 человека. Незанятый (свободный) α5β1 на этих клетках детектировали добавлением меченого IIA1. Оценивали также процент моноцитов и лимфоцитов, экспрессирующих α5β1.

С. Результаты - Исследование с эскалацией дозы

М200 хорошо переносился пациентами при дозах до 15 мг/кг, и не наблюдали ограничивающих дозу токсичностей М200. Общий результат реакции для этого исследования был следующим: стабильное заболевание (3D) у 11 пациентов и прогрессирующее заболевание (PD) у 10 пациентов. Таблица 4 показывает распределение результата реакции по дозе и типу опухоли пациентов.

Таблица 4 Результаты реакции по дозе и типу опухоли 0,5 мг/кг 1,0 мг/кг 2,5 мг/кг 5,0 мг/кг 10,0 мг/кг 15,0 мг/кг CRC (PD) HCC (SD) CRC (PD) HCC (SD) CRS (SD) ЕС (PD)   PC (SD) NSCLC (SD) ЕС (PD) CRC (SD) RCC (SD)     MEL глазная (PD) THY (PD) PARO (SD) PRO (PD)         ВС (SD) MEL (PD)         RCC (SD) MEL (SD)         MEL (PD) RCC (PD)

Аббревиатуры: CRC = колоректальная; MEL = меланома; RCC = почечная; ЕС = эзофогеальная; НСС = печеночно-клеточная; NSCLC = легочная; PRO = предстательной железы; THY = щитовидной железы; PC = поджелудочной железы; PARO = околоушной железы; ВС = молочной железы; SD = стабильное заболевание; PD = прогрессирующее заболевание

Вредные события были обычно мягко-умеренными по интенсивности и включали в себя усталость, тошноту, констипацию, головную боль и анорексию. Не было тяжелых или серьезных вредных событий, которые были ограничивающими дозу или, по мнению исследователей, были связаны с М200. Три пациента при уровнях доз 0,5, мг/кг и 1,0 мг/кг были тестированы как положительные на антитела против М200, но видимых ассоциированных вредных событий при этом не наблюдали. Не было пациентов в группах с более высокими дозами, дающих положительную реакцию при тестировании на антитела против М200. Один пациент, который получал 0,5 мг/кг, имел лихорадочное состояние после первой дозы, которое было зарегистрировано как реакция на инфузию. Однако этот пациент действительно завершил все 5 доз М200 без последующих приступов лихорадки или других симптомов реакции на инфузию.

Результаты этого исследования показали, что М200 обнаруживает нелинейную фармакокинетику. Более медленный клиренс наблюдали при более высоких концентрациях с T_1/2=15,7 дней при уровне дозы 10 мг/кг. Кроме того, доза 10 мг/кг приводила к насыщению моноцитов и имела средний минимальный уровень 82 мкг/мл спустя две недели после 1-й дозы, что выше минимальной эффективной концентрации in vitro 2-3 мкг/мл.

D. Расширенное исследование

Шесть из 11 пациентов, обнаруживающие реакцию стабильного заболевания или лучшую реакцию, вступали в расширенное исследование и продолжали введение доз. Как показано в таблице 5 ниже, 5 из 6 пациентов обнаруживали стабильное заболевание (SD) или лучшую реакцию. Один из этих пациентов с раком почек (RCC) в группе с дозой 15,0 мг/кг достигал частичной реакции.

Таблица 5 Результаты расширенного исследования Доза группы (количество пациентов; тип опухоли) Наилучший результат реакции Время до прогрессирования* (дни) 2,5 мг/кг (1; NSCLC) SD 129 5 мг/кг (1; НСС) SD 122 10 мг/кг (1; CRC) PD 70 10 мг/кг (1; PARO) SD 143 15 мг/кг (1; RCC) PR 214 15 мг/кг (1; MEL) SD 172 + (в исследовании) * включает в себя 43 дня в исследовании с эскалацией дозы плюс дни расширенного исследования.
SD определяется как стабилизация в течение ≥16 недель (112 дней)

Пример 9

Открытое исследование фазы II М200 у пациентов-людей с метастатическим почечно-клеточным раком

А. Обзор

На основании эффективности М200, продемонстрированной исследованием фазы I примера 8, было предпринято открытое, многоцентровое, одностороннее, 2-стадийное исследование М200 фазы II для лечения пациентов-людей. Первичной целью этого исследования является оценка эффективности (реакции опухоли) М200 у пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком (RCC), определяемой с использованием Response Criteria for Solid Tumors (см. RECIST, пример 8 выше). Второй целью по настоящему изобретению является также оценка других критериев эффективности (а именно времени прогрессирования заболевания и продолжительности реакции) и дополнительная оценка безопасности, иммуногенности и ФК-параметров М200, которые были первоначально оценены в исследовании фазы I примера 8. Дополнительной целью исследования является измерение биологических маркеров в сыворотке и плазме. Это исследование должно внести в список до 40 пациентов в восьми исследовательских центрах. Двадцать пациентов должны быть включены в стадию 1 этого исследования. Если одна подтверждаемая полная реакция (CR) или частичная реакция (PR) наблюдается при 4 месяцах (16 неделях) или если одно стабильное заболевание (3D) наблюдается при 4 месяцах, то должны быть завербованы дополнительные 20 пациентов (стадия 2). Все пациенты будут получать М200 (10 мг/кг) в виде внутривенной инфузии на протяжении 30 минут один раз каждую вторую неделю до 52 недель или пока не будет прогрессирования заболевания, независимо от того, что будет первым. Визит для выхода из исследования будет иметь место при 45 днях после последней дозы или в момент ранней терминации, если пациент неспособен вернуться. Визит для последующего наблюдения будет иметь место при 3 месяцах после последней дозы. Если визит невозможен, последующее наблюдение должно проводиться по телефону. Долгосрочное последующее наблюдение будет проводиться по телефону при 6 месяцах после последней дозы.

В. Параметры и протоколы исследования

Исследование фазы II проводится в соответствии с параметрами и протоколами, описанными в таблице 6 ниже.

Таблица 6 Параметры исследования фазы II у пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком Популяция исследования: Мужчины и женщины в возрасте по меньшей мере 18 лет с метастатическим RCC ясной клеточной гистологии Основные критерии включения/исключения пациента: Включение: мужчины и женщины в возрасте по меньшей мере 18 лет с метастатическим RCC преимущественно ясной клеточной гистологии, которые получали 0-2 предыдущие схемы лечения в отношении метастатического заболевания; измеряемое заболевание в соответствии с Response Criteria for Solid Tumors (RECIST); статус работоспособности западной кооперативной онкологической группы (ECOG) ≤1; отрицательный тест на беременность (только женщины с потенциалом деторождения); лабораторные уровни перед лечением, которые удовлетворяют конкретным критериям; и подписанное информированное согласие, в том числе разрешение использовать защищенную информацию о здоровье (PHI). Исключение: любая из следующих гистологии RCC: папиллярная, хромофобная, прямой почечный проток или неклассифицированная; известная чувствительность к мышиным белкам или химерным антителам или другим компонентам этого продукта; применение любого исследуемого лекарственного средства в пределах 4 недель перед скрининговым опросом или 5 периодов полувыведения исследуемого лекарственного средства (в зависимости от того, какой из этих периодов, является более продолжительным); системная химиотерапия, иммунотерапия, лучевая терапия или терапия с использованием моноклональных антител в пределах 4 недель введения М200; документированная опухоль ЦНС или метастазирование в ЦНС; история тромбоэмболических событий и нарушений кровообращения в пределах прошлого года и медицинские состояния, которые могут обостряться кровотечением. Размер выборки: В список могут быть включены до 40 пациентов. Двадцать пациентов будут включены в стадию один. Если одна подтверждаемая полная реакция (CR) или частичная реакция (PR) наблюдается при 4 месяцах (16 неделях) или если одно стабильное заболевание (SD) наблюдается при 4 месяцах, в список будут вноситься 20 дополнительных пациентов (стадия 2). Дозированная форма и концентрация/приготовление: М200 является стерильной, бесцветной, прозрачной - слегка опалесцирующей, не содержащей консервантов жидкостью для внутривенного (IV) использования. Каждый флакон на 10 мл для одноразового применения заполняют для доставки 10 мл М200 при 10 мг/мл. Состав каждого флакона: 10 мг/мл М200, 25 мМ цитрата, 150 мМ хлорида натрия и 0,05% Полисорбата (Tween®) 80, с рН 6,5. Хранение и фильтрование: Интактные флаконы хранят в холодильнике при 2-8°С (36-46°F). Не замораживать и не встряхивать. М200 должен быть введен в пределах 6 часов, если он хранится при комнатной температуре (25°С), или 48 часов, если он находится в холодильнике (2-8°С). После этого времени приготовленный раствор должен быть выброшен. Схема введения доз/способ введения: Все выбранные пациенты будут получать 10 мг/кг М200 внутривенной (IV) инфузией на протяжении 30 минут каждую вторую неделю в течение периода до 52 недель или пока не наступит прогрессирование заболевания, в зависимости от того, что будет иметь место первым. Вводимая пациенту доза М200 будет рассчитана умножением массы пациента (кг) на уровень дозы (10 мг/кг). Масса пациента перед введением дозы в день 0 исследования будет использована для расчета дозы на протяжении этого исследования, при условии, что эта масса не изменяется более чем на 10%. Подходящий объем композиции М200 10 мг/мл будет извлекаться и разбавляться 0,9% хлоридом натрия до конечного объема 120 мл для IV-инфузии пациенту на протяжении периода 30 минут. Продолжительность лечения и последующего наблюдения: Все пациенты будут получать М200 (10 мг/кг) внутривенно один раз каждую вторую неделю в течение периода до 52 недель или пока не наступит прогрессирование заболевания, в зависимости от того, что будет иметь место первым. Визит для выхода из исследования будет иметь место спустя 45 дней после последней дозы или в момент ранней терминации, если этот пациент будет не способен вернуться. Визит последующего наблюдения будет иметь место при 3 месяцах после последней дозы. Если этот визит невозможен, последующее наблюдение будет проводиться по телефону. Долгосрочное последующее наблюдение будет проводиться по телефону при 6 месяцах после последней дозы. Конечные точки: Первичной конечной точкой этого исследования является часть пациентов с подтвержденной реакцией опухоли в любой момент во время этого исследования. Вторичные конечные точки являются следующими: (1) время до прогрессирования заболевания; (2) продолжительность реакции опухоли; (3) ФК М200 и (4) иммуногенность. Диагностической конечной точкой является измерение детектируемых биомаркеров в сыворотке в плазме. Измерения эффективности: Нацеленная на заболевание радиографическая визуализация каждые 8 недель (2 месяца) для оценки реакции опухоли с использованием одноразмерного RECIST. На экране будут получены СТ или MRI головы, грудной клетки, живота и таза. Каждые 8 недель будет выполняться полное физическое обследование и будут получены сканы изображений всех повреждений, присутствующих на экране, плюс всех нацеленных на заболевание анатомических повреждений. Для каждой реакции PR или CR подтверждающая радиографическая томография будет повторена спустя один месяц (28-35 дней) после PR или CR. Все измеримые повреждения до 5 повреждений максимально на орган и в целом 10 повреждений, репрезентативных для всех включенных органов, должны быть идентифицированы в качестве повреждений-мишеней и зарегистрированы и измерены при базовой линии (фоне). Измеримые повреждения определяют следующим образом: 2,0 см в одном направлении с использованием обычных CT/MRI и 1,0 см в одном направлении с использованием спиральной СТ. Рассчитывают сумму самого длинного диаметра (LD) для всех повреждений-мишеней и сообщают как фоновую сумму LD. Эту фоновую сумму LD используют затем в качестве базиса отсвета (фона), при помощи которого будет характеризоваться целевая реакция опухоли. Измерения безопасности: Будет проводиться мониторинг следующих измерений безопасности: вредные события (АЕ); серьезные вредные события (SAE); результаты физического обследования; признаки жизни и отклоняющиеся от нормы лабораторные показатели. Фармакокинетические измерения: Фармакокинетические (ФК) измерения будут выполняться у всех пациентов при начале введения доз (в пределах 15 минут перед введением дозы) и после введения доз (в пределах одного часа после окончания инфузии): день 0, недели 2, 4 и 6, один раз в каждом втором месяце (недели 8, 16, 24, 32, 40, 48), неделя 52, визит для выхода из исследования и 3-месячное последующее наблюдение (если оно возможно). Пробы, полученные для РК, могут быть использованы для анализов против Аb, если это необходимо. Иммуногенность: Анализы против Аb будут выполняться у всех пациентов в пределах 15 минут перед введением доз в день 0, неделю 8, при визите для выхода из исследования и в 3-месячном последующем наблюдении (если это возможно). Пробы, полученные для РК, могут быть использованы для анализов против Аb, если это необходимо. Другие измерения: Диагностический анализ будет оценивать присутствие биомаркеров в сыворотке и плазме. В этот анализ включены следующие маркеры рака: СЕА (карциноэмбриональный антиген), СА 19-9, Синдекан, IGFBP-2 и LFL2. Включены следующие цитокины/факторы роста: MIA, IL-6, TNF-α, PGF, VEGF, EGF и bFGF. Статистические способы: Это построение исследования будет обеспечивать мощность по меньшей мере 79,5% для детектирования общей степени реакции ≥20%, когда до 20% респондеров проявляют стабильное заболевание (SD). Суммарные статистические данные и доверительные интервалы 95% будут обеспечены для дихотомических конечных точек. Для суммирования временных переменных будут использованы способы Каплана-Майера.

Должно быть понятно, что описанные выше примеры никоим образом не служат для ограничения истинного объема по настоящему изобретению, а представлены для иллюстративных целей. Все публикации, последовательности номеров доступа и заявки на патенты, цитируемые в данном описании, включены здесь в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была индивидуально указана как включенная в качестве ссылки.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения рака, экспрессирующего интергрин α5β1. Способы по изобретению включают введение пациенту жидкой фармацевтической композиции, содержащей 0,1-15 мг/мл антитела против α5β1. Изобретение позволяет подавлять пролиферацию и предотвращать распространение опухоли за счет прямого лизиса раковых клеток при связывании антителом интергрина α5β1 на их поверхности. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

1. Способ ингибирования пролиферации раковых клеток у пациента, где раковые клетки экспрессируют на своей поверхности α5β1-интегрин, где способ предусматривает введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей жидкий состав, содержащий:
приблизительно от 1,0 до 15 мг/мл антитела против α5β1;
приблизительно от 22 до 27 мМ цитрата;
приблизительно от 145 до 165 мМ хлорида натрия;
приблизительно от 0,04 до 0,06% полисорбата (TWEEN®) 80;
и рН которого составляет приблизительно от 5,5 до 7,5.

2. Способ по п.1, где антитело нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность α5β1-интегрина.

3. Способ по п.1, где это антитело против α5β1 связывается с тем же самым эпитопом α5β1-интегрина, что и антитело М200.

4. Способ по п.1, где антитело против α5β1 конкурентно ингибирует связывание М200 с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности клетки.

5. Способ по п.1, где антитело против α5β1 выбрано из группы, состоящей из М200, F200 и IIА1.

6. Способ по п.1, где антитело конкурентно ингибирует связывание второго антитела с α5β1-интегрином на поверхности раковой клетки, где второе антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8.

7. Способ по п.1, где терапевтически эффективная доза приблизительно равна 10 мг/кг.

8. Способ по п.1, где раковая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки рака молочной железы, клетки рака легкого, клетки метастатической меланомы, клетки рака поджелудочной железы и клетки рака почки.

9. Способ по п.1, где раком является рак почки или метастатическая меланома.

10. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий введение пациенту химиотерапевтического агента либо последовательно, либо в комбинации с антителом.

11. Способ лечения рака, который экспрессирует α5β1, у индивидуума, у которого опухоль еще не распространилась, предусматривающий введение индивидууму терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей жидкий состав, содержащий:
приблизительно от 1,0 до 15 мг/мл антитела против α5β1;
приблизительно от 22 до 27 мМ цитрата;
приблизительно от 145 до 165 мМ хлорида натрия;
приблизительно от 0,04 до 0,06% полисорбата (TWEEN®) 80;
и рН которого составляет приблизительно от 5,5 до 7,5.

12. Способ по п.11, где антитело связывается с тем же самым эпитопом α5β1-интегрина, что и антитело М200.

13. Способ по п.11, где антитело конкурентно ингибирует связывание М200 с α5β1-интегрином, экспрессируемым на поверхности раковой клетки.

14. Способ по п.11, где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной железы, фибросаркомы, рака легкого, метастатической меланомы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки и рака селезенки.

15. Способ по п.11, где раком является рак почки или метастатическая меланома.

16. Способ по п.11, где терапевтически эффективная доза составляет приблизительно 10 мг/кг.

17. Способ по п.11, дополнительно предусматривающий введение пациенту химиотерапевтического агента либо последовательно, либо в комбинации с антителом.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая жидкий состав, содержащий:
приблизительно от 1,0 до 15 мг/мл антитела против α5β1;
приблизительно от 22 до 27 мМ цитрата;
приблизительно от 145 до 165 мМ хлорида натрия;
приблизительно от 0,04 до 0,06% полисорбата (TWEEN®) 80;
и рН которого составляет приблизительно от 5,5 до 7,5.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, где концентрация антитела против α5β1 составляет приблизительно 10 мг/мл.

20. Фармацевтическая композиция по п.18, где антитело против α5β1 выбрано из группы, состоящей из М200, F200 и IIA1.

21. Фармацевтическая композиция по п.18, где антителом против α5β1 является М200.

22. Фармацевтическая композиция по п.18, где композиция дополнительно содержит химиотерапевтический агент.