СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2010 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к системе клеток и способу моделирования раковых клеток, скрининга лекарств против раковых клеток и ингибирования миграции раковых клеток.

Описание уровня техники

Рак трудно лечить вследствие разнородности тканей и неустойчивости генов. Как заболевание человека рак был описан в 1600 г. до н.э. в древнеегипетских документах. Гиппократ, древнегреческий врач, определил разницу между доброкачественными и недоброкачественными опухолями и дал название злокачественным опухолям "карциноз". В настоящее время рак является второй основной причиной смерти в развитых странах.

Обширные сведения о раке накоплены с тех пор, как Президент Соединенных Штатов Ричард Никсон объявил "войну против рака" в 1970-х г.г. В последние два столетия предлагалось множество гипотез о развитии рака. Ранние гипотезы включали воспалительную гипотезу, эмбриональную гипотезу и паразитарную гипотезу. Позже, при появлении экспериментальной онкологии были идентифицированы химические канцерогены. С помощью молекулярного анализа опухолей человека и экспериментальных животных было открыто множество онкогенов и генов- супрессоров опухолей. Эти исследования привели к появлению гипотезы генной мутации, которая является основной последние три десятилетия.

Несмотря на присущую ей ясность, современная гипотеза генной мутации не смогла объяснить многие важные признаки рака. Действительно, о недостатках гипотезы генной мутации подробно говорили многие исследователи.

Недавно развитие "теории канцерогенеза из стволовых клеток" ("стволовой" теории канцерогенеза) ускорилось, что вызвано представлениями, появившимися в результате изучения стволовых клеток и открытия "раковых стволовых клеток". "Стволовая" теория канцерогенеза наводит на мысль, что в стволовых клетках накапливаются генетические мутации, и они становятся злокачественными клетками. Однако, так как она по-прежнему полностью зависит от гипотезы генной мутации, "стволовая" теория не может четко назвать, что вызывает характерные признаки рака, такие как вовлечение в злокачественный процесс (прорастание опухолью) и метастазы.

Мутации являются редкими событиями. Математические модели наводят на мысль, что для злокачественной трансформации требуется более часто встречающееся событие. В качестве характерного признака рака была предложена геномная нестабильность. Так как фенотип геномной нестабильности, анеуплоидия, наблюдалась почти во всех случаях солидного рака у людей, это трудно объяснить с помощью гипотезы генной мутации. Было высказано предположение, что анеуплоидия отвечает за рак как автономный мутатор, но механизм, лежащий в основе анеуплоидии, остается неясным.

Таким образом, несмотря на значительный прогресс, происхождение рака остается загадочным. Так как современные модели канцерогенеза, основанные на гипотезе генной мутации, плохо объясняют многие аспекты рака, заявители выдвигают новую модель многостадийного канцерогенеза, в которой предполагается, что развитие рака включает генные мутации и слияния клеток. Конкретно, рак может возникать в результате слияния "измененной" предраковой клетки и стволовой клетки костного мозга (BMDSC). "Анеуплоидия", являющаяся отличительным признаком злокачественной опухоли, является прямым следствием этого слияния клеток. Модель "слияния стволовых клеток" объясняет заметные аналогии между злокачественными клетками и BMDSC. Эта модель также объясняет, почему немутагены могут быть канцерогенами, и почему немутагенные процессы, такие как заживление ран и хроническое воспаление, могут вызывать злокачественную трансформацию.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложен способ ингибирования миграции стволовой клетки, который включает контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством антитела против убиквитина. Предпочтительно, это антитело представляет собой MEL-14 [например, MEL-14-F(ab')2], антитело 14372 или антитело 10С2-2.

Способ по изобретению представляют новую и улучшенную модель для in vitro исследований с применением животных с пересаженным модифицированным геном-маркером костным мозгом, например, eGFP трансгенных животных. Дополнительные признаки и преимущества изобретения можно предполагать с учетом подробного описания некоторых конкретных вариантов изобретения в сочетании с прилагаемыми фигурами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА

На чертеже схематически иллюстрируется злокачественная трансформация, опосредованная слиянием стволовых клеток костного мозга и клеток "измененных" тканей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применяемый в данном описании термин "метастазы" означает распространение рака с одного участка тела на другой. Опухоль, образуемая клетками, которые перемещаются (распространяются), называется "метастатической опухолью" или "метастазами".

Термин "злокачественные" означает раковые, т.е. аномальные клетки, которые делятся бесконтрольно и которые могут поражать соседние ткани и распространяться по кровотоку и лимфатической системе на другие участки тела.

Термины "измененная клетка" или "генетически измененная клетка" определяются в данном описании как любая клетка с генетическими или эпигенетическими изменениями, достаточными для отклонения от нормального пути дифференцировки стволовой клетки костного мозга после слияния с BMDSC.

"Измененные" клетки включают так называемые "инициированные" (предраковые) клетки в модели многостадийного канцерогенеза.

Термин "слитая клетка" означает клетку, образующуюся при слиянии измененной клетки и стволовой клетки костного мозга.

Происхождение злокачественных новообразований все еще является спорным, в особенности в случае карцином, которые составляют более 90% злокачественных новообразований у человека. Модель канцерогенеза, предлагаемая заявителями, сосредотачивает внимание на связанном с развитием (эволюционном) происхождении высокозлокачественных карцином. Ключевым событием по этой модели является стадия слияния стволовых клеток костного мозга (BMDSC) и клеток "измененных" тканей (см.чертеж). Очищенную популяцию получают, выделяя все клетки костного мозга, которые экспрессируют маркеры клеточной поверхности дифференцированных клеток, на промышленных колонках. Клетки "негативной" линии дифференцировки, которые проходят через колонку, можно в дальнейшем обогатить стволовыми клетками позитивной селекцией на CD34 позитивные, CD 133 позитивные и SCA-1 позитивные клетки. Это работает как для мышиных, так и для человеческих BMDSC. Изобретение относится частично к установлению, узнаванию, что слияние "измененных" тканевых клеток с BMDSC может привести к злокачественной трансформации гибридных клеток. Поэтому так называемым "инициированным" клеткам в модели многостадийного канцерогенеза и доброкачественным опухолевым клеткам можно дать возможность перемещаться (мигрировать).

При слиянии нормальный путь дифференцировки BMDSC может быть нарушен вследствие имеющегося генетического и эпигенетического нарушения "измененных" тканевых клеток. Генетические нарушения могут представлять собой мутации, транслокации, делеции или амплификации, предполагаемые гипотезой генной мутации. Эпигенетические нарушения могут представлять собой любое изменение вне последовательностей ДНК, которые вызывают недостаточную регуляцию роста клеток и функции, такой как метилирование ДНК, модификация хроматина или измененная клеточная "сигнализация". Слияние может приводить к образованию дочерних клеток с фенотипом как измененных клеток, так и BMDSC. Другими словами, дочерние клетки могут приобрести способность самообновления, поражения тканей и перемещения из BMDSC, тем самым превращаясь в злокачественные клетки. Кроме того, процесс слияния, последующий митоз и утрата индивидуальных копий хромосом приводит к анеуплоидии. Анеуплоидия может стать движущей силой геномной нестабильности и прогрессирования рака. Согласно модели заявителя единичное событие слияния оказывает такой же эффект на превращение (из доброкачественной клетки в злокачественную), как и множество событий, участвующих в процессе классического многостадийного канцерогенеза.

На основании модели заявителя основная доля фенотипа рака, такая как прорастание опухолью и метастазы, идут от BMDSC. Слияние является естественным и сравнительно частым событием в процессе развития и поддержания многоклеточных организмов. Сравнивая относительную вероятность генной мутации и слияния стволовых клеток, можно рассматривать развитие нормальной клетки в полностью злокачественную как эволюционный процесс (процесс развития). Любой путь, который заменяет многие редкие события на частое событие, приводит к тому, что такой путь будет в подавляющем большинстве случаев предпочтительным в эволюции.

BMDSC являются высокопластичными клетками. Во многих исследованиях показано, что костный мозг не только содержит гемопоэтические стволовые клетки (HSC), но также содержит мезенхимные стволовые клетки (MSC), эндотелиальные клетки-предшественники и стволовые клетки эпителиальных тканей, которые могут дифференцироваться в эпителиальные клетки печени, легкого, кожи и желудочно-кишечного тракта. Эти BMDSC мигрируют в негемопоэтические ткани и могут участвовать в поддержании и репарации пораженной ткани. Имеется, как суммировано в Таблице 1, поразительное сходство между BMDSC и метастатическими раковыми клетками в том, что касается их биологической активности, а также молекулярных основ этой активности.

Таблица 1. Сходство между стволовыми клетками костного мозга и метастатическими раковыми клетками. Стволовые клетки костного мозга Метастатические раковые клетки Самообновляемые "Бессмертие" Рост в суспензии Свободный ("безъякорный") рост клеток Дифференцировка во многие линии клеток Служат источником различных типов раковых клеток Перемещение (миграция) Инвазия, метастазы Экстравазация Экстравазация Поверхностные маркеры, с-kit, CD34 и CD 133 Некоторые раковые клетки экспрессируют с-kit, CD34 и CD133 Рецепторы хемокинов, такие как CXCR4 CXCR4, экспрессируемый в метастатической опухоли Чувствительны к радиации Низкодифференцированный рак более чувствителен к лучевой терапии Экспрессируют теломеразу Поддержание теломер Частичная иммунная привилегия Wnt и Hedgehog сигнальная активность Иммунная нереактивность Wnt и Hedgehog сигнальная активность Опосредуют ангиогенез Опосредуют ангиогенез

BMDSC и метастатические раковые клетки способны к самообновлению (самоподдержанию), миграции и инвазии (прорастанию) в ткани. Некоторые раковые клетки экспрессируют маркеры предполагаемых (заявляемых) стволовых клеток. Например, с-kit энергично экспрессируется при серозном раке яичников, тестикулярном раке, злокачественной меланоме и мелкоклеточном раке. CD34 экспрессируется при дерматофибросаркоме, эпителиоидной саркоме и солитарных фиброзных опухолях. Кроме того, для всех типов раковых клеток требуется способность поддержания теломер, аналогично стволовым клеткам, которые являются теломераза-позитивными. BMDSC экспрессируют рецепторы конкретных хемокинов и достигают своей цели за счет взаимодействий хемокин-лиганд.

Интересно отметить, что одинаковые пары цитокин-лиганд участвуют в хоуминге BMDSC и метастазах злокачественных клеток. Хорошо известно, что низкодифференцированный рак обычно является высокометастическим (высокометастазирующим), но более чувствительным к лучевой терапии. Это явление недостаточно подробно рассматривается в литературе, но поразительно напоминает BMDSC, которые в высшей степени восприимчивы к лучевой терапии. На самом деле эта восприимчивость является основой клинической миелоабляции. Взятые в совокупности раковые клетки могут приобретать эти признаки от BMDSC. Действительно, последние данные показали, что клетки костного мозга могут вызывать рак желудка у мышей с хроническими инфекциями Helicobacter. Кроме того, имеется сообщение, что у реципиента трансплантата почки наблюдалось раковое заболевание кожи, вызванное клетками донора.

Заявители ранее предположили, что событие слияния BMDSC и "измененных" клеток вызывает перемещение (миграцию) раковых клеток. Как указывалось выше, слияние представляет собой основополагающее событие в жизни многих организмов. Внутриклеточное слияние везикул является существенным для основной клеточной функции. Оболочечные вирусы доставляют вирусные капсиды в цитозоль путем слияния мембран. От дрожжей до человека жизнь начинается со слияния. Слияние клетка-клетка является частью обычных биологических процессов в ходе развития мышц, костей и плаценты. Уже в 1911 году было высказано предположение, что злокачественность может быть результатом гибридизации лейкоцитов с соматическими клетками. Исследования показали также, что онкогенная трансформация происходит, когда соматические клетки млекопитающих встречают (поглощают) сокультивированную сперму и/или при экспериментально индуцированном проникновении сперматозоида in situ. Долгое время существовала гипотеза, что гибридизация опухолевых клеток с лимфоцитами дает метастатические клетки. Однако известно, что до данного изобретения никто не описал или не предположил, что злокачественное преобразование (трансформация) является результатом слияния BMDSC и "измененных" предраковых тканевых клеток.

Стволовые клетки способны принимать фенотип других клеток при спонтанном слиянии клеток. В некоторых исследованиях показано, что BMDSC сливаются с различными клетками-мишенями. Используя метод Cre/lox рекомбинации для обнаружения событий слияния клеток, Alvarez-Dorado et al. (Nature 425, 968-973 [2003]) показали, что клетки костного мозга сливаются in vivo с печеночными клетками-гепатоцитами, нейронами Пуркинье в головном мозге и клетками сердечной мышцы в сердце, что приводит к образованию многоядерных клеток. Серийной трансплантацией гепатоцитов, полученных при использовании стволовых клеток костного мозга, Wang et al (Nature 422, 897-901 [2003]) показали, что слияние клеток является основным источником гепатоцитов, образующихся при использовании стволовых клеток костного мозга. Цитогенетический анализ гепатоцитов, трансплантированных от самок мышей-доноров самцам-реципиентам, показал кариотипы, полученные в результате слияний диплоид-диплоид (80, XXXY) и диплоид-тетраплоид (120, XXXXYY). Теоретически слияние может происходить много раз между нормальными, предраковыми и раковыми клетками; однако изобретение конкретно включает слияние между "измененными" предраковыми тканевыми клетками и BMDSC как решающую стадию канцерогенеза. Может происходить множество слияний с BMDSC, после слияния приводящее тем самым, по меньшей мере, к тетраплоидному кариотипу.

После слияния с измененными тканевыми клетками полагают, что нормальное самообновление и нормальная дифференцировка стволовых клеток нарушаются вследствие аномального сигнала измененных клеток. В отличие от других моделей канцерогенеза из слияния стволовых клеток, которые предполагают, что стволовые клетки аккумулируют мутации и становятся трансформированными, данное изобретение не противоречит исследованиям, в которых показано, что стволовые клетки менее толерантны к поражению ДНК, чем дифференцированные клетки. Стволовые клетки должны быть более восприимчивы к поражению ДНК для сохранения потенциала "мультипотентной дифференцировки". Нет сомнения, что BMDSC более чувствительны к радиации (облучению), чем зрелые клетки. Этот факт лежит в основе клинической миелоабляции. Также имеются наблюдения, что тканевые стволовые клетки более чувствительны к Киллингу ДНК-поражающими агентами. Уровни апоптоза стволовых клеток кишечной полости заметно повышаются при облучении или при экспозиции с цитотоксическими агентами. Следовательно, более вероятно, что скорее тканевые клетки, нежели стволовые клетки, аккумулируют генетические и эпигенетические нарушения. После слияния с BMDSC дочерние клетки трансформируются и дают толчок развитию злокачественных опухолей.

Хромосомные аномалии определяли как один из характерных патологических признаков рака в течение более 100 лет. Анеуплоидия наблюдалась почти при всех солидных раках у человека. Кроме того, клинические данные наводят на мысль, что степень анеуплоидии коррелирует с тяжестью заболеваний. Гипотеза, согласно которой рак является следствием анеуплоидии, подчеркивает важность анеуплоидии в канцерогенезе, но механизм, лежащий в основе анеуплоидии, остается неясным. В модели канцерогенеза из стволовых клеток по данному описанию анеуплоидия является неизбежным следствием слияния клеток, приводя к утрате копий индивидуальных хромосом. В более ранней заявке, относящейся к предлагаемой модели канцерогенеза из слияния стволовых клеток, исследования продемонстрировали, что гиперхромазия в клетках рака простаты может быть следствием предполагаемого слияния внедренного сперматозоида с нормальными эпителиальными клетками простаты. Кроме того, в некоторых предраковых поражениях у человека наблюдается повышенная частота тетраплоидных клеток, таких как пищевод Баррета, язвенный колит и HPV-позитивные атипические цервикальные плоские клетки. Анализ плоидии ДНК показывает, что большинство анеуплоидных раков простаты человека является тетраплоидными. Этот факт наводит на мысль, что анеуплоидия рака возникает в результате события тетраплоидизации (т.е. слияния).

В течение длительного времени наблюдали связь между хроническим поражением тканей, воспалением и раком. Имеется много отличных исследований и обзоров, относящихся к молекулярному и клеточному механизмам, лежащим в основе этой связи. Интерпретация взаимоотношения между репарацией тканей и канцерогенезом, предлагаемая заявителем, суть следующая. Хроническое поражение ткани, воспаление и последующая репарация ткани истощают, исчерпывают регенеративную способность локальных тканевых стволовых клеток. После этого микроокружение локального воспаления благоприятствует хоумингу BMDSC и их включению в репарацию тканей. Случайно BMDSC сливаются с "измененными" тканевыми клетками и вызывают злокачественную трансформацию.

Предполагается, что в тканях, которые обычно быстро обновляются, рак встречается чаще, так как высокая скорость обновления должна привести к истощению локальных тканевых стволовых клеток и инфильтрации BMDSC. Действительно, эпителий кожи, легких и желудочно-кишечного тракта, который непрерывно находится под повреждающим воздействием окружения и постоянно обновляется, - это ткани, в которых очень часто встречается рак. Повышенная приживляемость кератиноцитов костного мозга при заживлении ран продемонстрирована при трансплантации костного мозга у разнополых мышей, впрочем то же самое исследование исключило наличие слияния между клетками костного мозга и эпителиальными клетками кожи при остром поражении. Инфекция Helicobacter представляет собой основной атрибутируемый фактор развития рака желудка. Хроническое поражение ткани и непрерывная репарация ткани вызывают дисбаланс между пролиферацией и апоптозом эпителиальных клеток в желудке. На самом деле недавно сообщалось, что клетки костного мозга являются источником рака желудка у мышей, инфицированных Helicobacter.

Старение является одним из наиважнейших факторов риска заболевания раком. Анализ распределения рака по возрасту привел к ранней теории многостадийного канцерогенеза. Позже в гипотезе генной мутации было высказано предположение, что распределения рака по возрасту отражает время, которое требуется для того, чтобы накопить достаточное количество множественных мутаций для развития рака. Однако альтернативным объяснением может быть то, что механизмы, отвечающие за старение, также оказывают влияние на функцию стволовых клеток. Окислительное поражение и старение клеток могут повысить частоту некорректного слияния клетка- клетка и частоту заболевания раком. Например, стареющие клетки подвергают риску обновление или репарацию ткани, секретируют факторы, которые могут изменять микроокружение ткани и, в свою очередь, могут изменять активность стволовых клеток. Кроме того, стволовые клетки сами по себе также являются непосредственной мишенью связанного с возрастом поражения. Было показано, что поседение волос вызывается дефектным самообновлением стволовых клеток меланоцитов. Было показано, что эпителиальные стволовые клетки кишечных трубок страдают серьезной функциональной недостаточностью. Старение и функциональная недостаточность HSC могут создать условия, способствующие развитию лейкемии. Следовательно, хронологическая кинетика канцерогенеза может отражать клеточно-клеточные взаимодействия в процессе старения.

Другие условия могут промотировать слияние клеток и, следовательно, повышать заболеваемость раком, в том числе ремоделирование (реструктурирование) ткани и вирусную инфекцию. Высокая заболеваемость раком молочной железы и яичника у женщин и печеночно-клеточным раком после хронического гепатита может служить примером того, как реструктурирование ткани инициирует злокачественную трансформацию. Показано, что вирус Эпштейна- Барр (EBV) связан с широким рядом раковых заболеваний, включая лимфому Беркитта, неходжкинскую лимфому, болезнь Ходжкина, назофарингеальный рак, аденокарциному желудка и рак молочной железы. В более ранних исследованиях было показано, что EBV индуцирует слияние клеток, особенно при использовании вируса, выделенного из опухолей. В сочетании с этими данными предложенная заявителем модель канцерогенеза из слияния стволовых клеток могла бы объяснить, почему инфекция EBV ассоциируется со столь многими раковыми заболеваниями.

Модель канцерогенеза из слияния стволовых клеток, представленная в данном описании, легко проверяется. Так, заявителями было проведено несколько экспериментов. Слияние доброкачественных опухолевых клеток и BMDSC проводили in vitro. После слияния in vitro и in vivo определяли морфологию и способность к метастазам и вовлечению в злокачественный процесс. Доказательство слияния можно увидеть при тщательном исследовании спонтанных солидных опухолей, развивающихся у мышей, получающих костный мозг от мышей другого пола или трансгенный костный мозг. Однако, так как избыточная половая хромосома часто утрачивается в дочерних клетках, когда происходит слияние, широко распространенный метод обнаружения половой хромосомы, такой как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), может быть неподходящим. Действительно, значительное число злокачественных опухолей, которые развиваются в нормальных особях женского пола, становятся негативными в отношении полового хроматина, это наводит на мысль об утрате избыточной второй Х хромосомы. Могут пригодиться способы обнаружения присутствия частиц трансдуцированной ДНК или митохондриальной ДНК донора. Наконец, можно провести ретроспективное исследование, изучая образцы реципиентов, которым ранее была сделана пересадка костного мозга, а позднее обнаружена карцинома (рак). Методы, такие как обнаружение митохондриальной ДНК донора, могут быть более информативными, нежели FISH обнаружение половой хромосомы.

Модель рака, в особенности карциномы, из слияния стволовых клеток имеет значительные последствия для изучения рака и создания лекарств, а также для терапевтического применения стволовых клеток. Злокачественные клетки могут быть чувствительны к терапевтическим средствам, которые индуцируют дифференцировку. Дифференцировка может выключать активность самообновления и понижать способность злокачественных клеток метастазировать и прорастать в ткани (инвазия). Действительно, некоторые агенты, индуцирующие дифференцировку, такие как ретиноевая кислота или агонисты гамма-рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом (PPARγ), использовали для успешного лечения острого миелоидного лейкоза или липосаркомы, соответственно. Метод введения сигнала дифференцировки в злокачественные клетки с помощью генного переноса мог бы явиться новым конкурентным (практически осуществимым) методом терапии рака. Кроме того, метастатические клетки могли бы иметь паттерн хоуминга, аналогичный BMDSC; следовательно, для ингибирования метастазов рака можно было бы использовать способы блокады хоуминга BMDSC. В соответствии с этим недавнее исследование показало, что сайленсинг CXCR4 рецептора хемокина за счет РНК-интерференции блокирует метастазы рака молочной железы у мышей. Рак трудно контролировать, так как его генетика слишком беспорядочна. Однако полученные от BMDSC характеристики раковых клеток могли бы представлять консервативную (сохранившуюся) цель для дизайна новых терапевтических веществ.

Таким образом, метастазы рака используют те же самые консервативные молекулярные механизмы, что и BMDSC и их потомство, которое включает нейтрофилы, лимфоциты и другие лейкоциты. Поэтому заявители исследовали, действительно ли антитела к убиквитину, которые могут блокировать подвижность и экстравазацию in vivo нейтрофилов, лимфоцитов и других лейкоцитов, будут блокировать подвижность и экстравазацию раковых клеток и, следовательно, блокировать метастазы. Кроме того, обнаружение слияние BMDSC/измененной клетки в опухолях может служить сигналом для исследователей о возможных непредполагаемых последствиях лечения стволовыми клетками (т.е. некорректное применение стволовых клеток может действительно повысить заболеваемость злокачественными заболеваниями).

Хроническое поражение ткани и последующая репарация истощает стволовые клетки и рекрутирует BMDSC, следовательно, повышает возможность слияния BMDSC с тканевыми клетками. Другие факторы, такие как старение, вирусная инфекция и ремоделирование ткани, также повышают частоту слияния клеток. Важно отметить, что только стадия слияния может сообщить множество "злокачественных" признаков, чтобы трансформировать "измененную" клетку в отсутствие множества мутаций (не требуя множества мутаций).

Хотя проведены сотни исследований слияния опухолевых клеток и неопухолевых клеток и действия на онкогенность, в научной литературе не было найдено ни одного исследования слияния стволовых клеток костного мозга и опухолевых клеток, проведенного до настоящего исследования.

Итак, в первом варианте изобретения способ моделирования миграции раковых клеток включает стадии: (а) получение стволовых клеток из костного мозга; (б) получение генетически измененной клетки; (в) слияние стволовой клетки костного мозга с генетически измененной клеткой, при этом образуется слитая клетка; (г) измерение индикатора (определителя, показателя) миграции слитой клетки. Как BMDSC, так и генетически измененные клетки легкодоступны из промышленных и академических источников тканевых культур и живых организмов. Также слияние клеток является обычной процедурой, и существует много доступных протоколов (см., например, протоколы гибридом на сайте protocol-online.org.). Измерение индикатора миграции для слитой клетки (и ее потомства) можно проводить in vitro "анализом царапин (насечек, штрихов)" (см., например, Lal A, Glazer CA, Martinson HM, et al. Cancer Res 2002, 62: 3335-3340) или исследованиями на животных in vivo (например, инъекция опухолевых клеток, включающих одну или более слитых клеток, и мониторинг метастаз, описанный ниже, в примерах).

Кроме того, изобретение включает способ скрининга действия биологического или химического агента на миграцию опухолевых клеток in vitro in или vivo. Способ включает получение слитой клетки, образующейся при слиянии стволовой клетки костного мозга с генетически измененной клеткой; контактирование слитой клетки с биологическим или химическим агентом; определение, стимулируется ли, ингибируется ли или не изменяется миграция опухолевой клетки. Консервативные белки были бы особенно хорошей мишенью для скрининга действия агентов на миграцию.

Убиквитин(ub) представляет собой наиболее консервативный белок, обнаруженный в природе. Наблюдается полная гомология его последовательности из 76 аминокислот у видов, ставших столь отличными в результате эволюции, таких как насекомые, лосось и человек. Убиквитин составляет часть доменов внешней поверхности некоторых других мембранных рецепторов. В случае лимфоцитарных рецепторов хоуминга (LHR) присутствие ub хорошо коррелирует с LHR функцией по содействию связывания и миграции лимфоцитов через лимфатические узлы. Известно, что все рецепторы, которые, как было показано, связываются с ub, также опосредуют клеточную подвижность. Возможное объяснение этих наблюдений заключается в том, что ub участвует в опосредовании клеточной подвижности через внеклеточный матрикс. Эта вероятная функция ub имеет важное значение в исследованиях многих процессов в клетках эукариот, таких как дифференцировка клеток, паразитарная инфекция, прорастание опухоли и метастазы опухолевых клеток.

Например, биологический или химический агент представляет собой антитело против убиквитина, такое как MEL-14 (CD62L) (получают через фирму Abeam Plc., Zymed Laboratories, et al.; см. на abeam.com относительно 21различного антитела к убиквитину). Клетки, контактировавшие с этим антителом, изучали анализом царапин или использовали в экспериментах на животных для определения действия антитела на миграцию клеток, как описано ниже.

В другом варианте изобретения описан метод ингибирования миграции опухолевых клеток, включающий контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством антитела против убиквитина. Предпочтительно, данное изобретение включает стадию подтверждения присутствия слитой клетки в опухолевых клетках до контактирования опухолевых клеток с антителом с тем, чтобы такое ингибирование было нацелено на опухоли с более высоким злокачественным потенциалом.

Можно определить, действительно ли образец опухолевых клеток содержит клетку, по меньшей мере, с тетраплоидной ДНК и, по меньшей мере, один маркер клеточной поверхности, специфический к стволовой клетке костного мозга. Такие маркеры клеточной поверхности включают с-kit, CD34 и CD 133 и рецепторы хемокинов, такие как CXCR4. Можно также включить использование рекомбинации Cre/lox для обнаружения слияния стволовой клетки костного мозга и клетки, отличной от стволовой.

Примеры

Экспериментальные методы, используемые в этих исследованиях, являются традиционными и общепринятыми.

Целью данного первого исследования является проверка ранее предложенной гипотезы канцерогенеза, по которой взаимодействие стволовых клеток костного мозга и трансформированных клеток может изменять развитие рака. Можно проводить два вида экспериментов. В первой группе экспериментов клетки костного мозга мышей выделяют из мозга мышей, которые трансгенно экспрессируют eGFP, и соединяют с транзиторно транфецированными трансформированными человеческими или мышиными клетками, меченными красным флуоресцентным белком фирмы Clontech, в условиях, которые способствуют образованию гибридных клеток. Эти гибридные клетки затем инъецируют мышам, подходящим для тестирования на подходящую клеточную линию.

Изменение роста первичной или метастатической опухоли проверяют мониторингом функции во времени. Два основных вопроса решаются в этом исследовании: модулируется ли прогрессирование опухоли с помощью слияния стволовых клеток костного мозга на различных стадиях трансформации, и изменяет ли обработка человеческих или мышиных ксенотрансплантатов антителами к рецептору метастатические фенотипы чужеродных трансплантируемых опухолей. Репрезентативный рецептор, который служит в качестве модели для проверки этих гипотез, представляет собой CXCR4, который экспрессируется метастатическими опухолевыми клетками.

Следует использовать общепринятые модели роста и прогрессирования опухолей в виде ксенотрансплантатов у голых бестимусных мышей Balb/c или SCID с тем, чтобы иммунный ответ хозяина на введение трансформированных мышиных (308, 308 10Gy5 или 4Т1) и человеческих (DU145 или PC-3 M) линий клеток, традиционных модельных систем рака молочной железы, кожи и простаты был бы минимальным. Для введения мышиных клеточных линий голым бестимусным мышам применяют подкожную инокуляцию или инъекцию в хвостовую вену. Линии клеток человека вводят мышам SCID. Аликвоту, содержащую линии клеток, индивидуально или в комбинации вводят в виде инъекции в день 0 и следят за ростом опухоли максимум в течение 40 дней. Затем мышей умерщвляют, ткани удаляют и количественно определяют объем опухоли и относительные уровни легочных метастазов.

Эксперимент 1

Группа А: 8 трансгенных мышей

Гетерозиготных трансгенных eGFP мышей [C57BL/6-TgN (ACTbEGFP) 1Osb] (Jackson Laboratory) используют в качестве источника меченных GFP клеток костного мозга. GFP мышей идентифицируют по появлению зеленой флуоресценции в УФ-свете. 2-4-месячных самок гетерозиготных мышей используют в качестве доноров для ВМТ. Пол донора и пол реципиента - хозяина различны.

Клетки костного мозга получают от гетерозиготных GFP мышей, промывая бедренную и большеберцовую кость сильной струей сбалансированного раствора Хенкса (Хэнкса). Для получения гибридов соматических клеток 10⁶ клеток костного мозга и 10⁶ опухолевых клеток помещают в плашки 60 мм за 24 часа до обработки полиэтиленгликолем (ПЭГ). Готовят 5 г ПЭГ с молекулярной массой 3000-3700, выдерживая 5 минут в автоклаве при 121°С. После выдерживания ПЭГ в автоклаве его объединяют с 5 мл 2- стерильной бессывороточной среды, предварительно нагретой до 37°С, чтобы приготовить 50% раствор. Затем в каждую плашку к сокультивируемым клеткам медленно добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ и клетки инкубируют 1 минуту при 37°С.

Затем добавляют один мл бессывороточной среды и продолжают инкубировать еще в течение 1 минуты. Затем добавляют два мл и продолжают инкубацию еще в течение 2 минут. Добавляют четыре мл бессывороточной среды и продолжают инкубацию еще в течение 4 минут. Затем в каждую плашку добавляют среду, содержащую сыворотку, и продолжают инкубацию в течение 48 часов при 37°С. Через два дня в каждой плашке проводят пассаж с трипсином и переносят в плашки 100 мм для селекции. Клетки, экспрессирующие маркерные характеристики обеих сокультивируемых клеток, отбирают и выращивают до 90% монослоя и используют в последующих экспериментах.

Эксперимент 2: Измененная онкогенность и прогрессирование доброкачественных опухолевых клеток мышей и человека.

Мышам инокулируют меченные GFP клетки костного мозга индивидуально или в сочетании с трансформированными доброкачественными человеческими или мышиными клетками.

Группа А: 72 мыши. Голые бестимусные мыши для клеток 308; SCID для DU145 или PC-3 M опухолей (Боль категории D). Всего требуется мышей: (4 мыши/опыт)(6 опытов)(3 эксперимента) = 72 мыши.

Мышам инокулируют меченные GFP клетки костного мозга (ВМ) и/или в сочетании с трансформированными доброкачественными человеческими или мышиными клетками. Инокуляции опухоли проводят на мышах после анестезии изофлуораном под стеклянным колпаком. Мышей помещают под колпак, где в полипропиленовой центрифужной пробирке находятся обработанные изофлуораном ватные шарики. Во время этой процедуры мышей контролируют, наблюдая за частотой дыхания, движением, мышечной релаксацией и отсутствием направленного движения. После инокуляции мышей возвращают в их клетки и продолжают контролировать до тех пор, пока они полностью не придут в сознание.

Каждой мыши вводят 100 мкл PBS, содержащий 5×10⁵ клеток. Голые бестимусные мыши получают 308 клетки, ВМ клетки или обработанную ПЭГ смесь клеток ВМ и клеток 308. SCID мыши получают клетки DU145, клетки ВМ или обработанную ПЭГ смесь клеток ВМ и клеток DU145. Инокуляты вводят подкожно или в виде инъекции в хвостовую вену. Мышей, получающих инъекции в хвостовую вену, помещают в ограничивающий ящик. После дезинфекции хвоста спиртом в качестве местного анестетика применяют 2% ксилокаин. С помощью иглы размера 25-30 каждой мыши вводят не более 200 мкл раствора. Если инъекции вызывают некроз, хвосты опрыскивают этилхлоридом (спрей), погружают их в бетадин и стерильными ножницами удаляют участок чуть выше поверхности некротического поражения. Затем хвост прижигают нитратом серебра, чтобы остановить кровотечение.

За ростом опухоли наблюдают, измеряя калипером размеры опухоли дважды в неделю и вычисляя объем по формуле: Объем =+1/2(длинa)(длинa²). Животных умерщвляют на 2, 3 и 4 неделе для мониторинга степени метастазирования и достигнутого объема опухоли.

Животных умерщвляют, используя асфиксию под действием диоксида углерода в герметической камере, собирают опухоли и органы. Это традиционно применяемая методика эвтаназии мышей, при которой страдания сводятся к минимуму, эта методика рекомендуется Комиссией по Эвтаназии AVMA (Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации).

Краткая схема операции

1. Введите смесь доброкачественных трансформированных клеток и стволовых клеток для создания ксенотрансплантатов 308 и DU145 подкожной инъекцией или инъекцией в хвостовую вену.

2. Опытные группы для каждого способа инъецирования - (6): 308 клетки; ВМ клетки; обработанная ПЭГ смесь ВМ клеток +308 клеток; DU145; ВМ клетки, обработанная ПЭГ смесь DU 145 и ВМ клеток.

3. Первичные опухоли и органы с развившимися метастазами удалите после асфиксии мышей под действием СО₂.

4. Сдайте образцы опухолей на гистопатологический анализ для обнаружения изменений в развитии (прогрессировании) или способности к метастазированию, ассоциированных с событием слияния. Гистопатологический анализ должен включать сравнение роста опухоли во времени, относительное число и размеры метастаз, гистологическую характеристику опухоли.

Эксперимент 3: Ингибирование опухолегенности или прогрессирования.

Мышам инокулируют метастатические трансформированные человеческие (РС3-М) или мышиные (308 10Gy5 или 4Т1) клетки и ингибиторы CRCX4 рецептора. Всего необходимо мышей: (4 мыши/опыт) (3 опыта) (3 временные точки введения) (3 эксперимента) = 108 мышей.

Инокуляции опухолей осуществляют мышам после анестезии изофлуораном под стеклянным колпаком. Мышей помещают под стеклянным колпаком. Мышей помещают под колпак, где в полипропиленовой центрифужной пробирке находятся обработанные изофлуораном ватные шарики. Во время этой процедуры мышей контролируют, наблюдая частоту дыхания, движение, мышечную релаксацию и отсутствие направленного движения. После инокуляции мышей возвращают в их клетки и продолжают контролировать до тех пор, пока они полностью не придут в сознание.

В жировую ткань молочной железы мышей 4 Balb/c вводят по 100 мкл PBS, содержащего 10⁴ клеток 4Т1. Голые бестимусные мыши получают 100 мкл PBS, содержащего 1×10⁶ 308 10Gy5 клеток. SCID мыши получают клетки 100 мкл PBS, содержащего 1×10⁶ PC-3M клеток. Эксперимент осуществляют, вводя антитело к CRCX4 рецептору перед инокуляцией, одновременно с инокуляцией и после инокуляции опухолевых клеток. Клетки 4Т1 инъецируют в жировую ткань молочной железы мышей 4 Balb/c. Клетки 308 10Gy5 вводят в виде инъекции в хвостовую вену голых мышей, а клетки PC-3 инъецируют в хвостовую вену мышей SCED. Мышей, получающих инъекции в хвостовую вену, на время инъекции помещают в ограничивающий ящик. После дезинфекции хвоста спиртом и нанесения 2% ксилокаина в качестве местного анестетика каждой мыши вводят не более 200 мкл раствора с помощью иглы размера 25-30. Если инъекции вызывают некроз, хвосты опрыскивают этилхлоридом (спрей), погружают их в бетадин и стерильными ножницами удаляют участок чуть выше поверхности некротического поражения. Затем хвост прижигают нитратом серебра, чтобы остановить кровотечение.

За ростом опухоли наблюдают, измеряя калипером размеры опухоли дважды в неделю и вычисляя объем по формуле: объем =+¹/₂(длинa)(длинa²). Животных умерщвляют на 10, 15 и 20 день для мониторинга метастаз в легком и объема опухоли.

Животных проверяют до и после инокуляции потенциального ингибитора метастазирования и анализируют изменения апоптоза опухолевых клеток, дифференцировки, ингибирования метастаз.

Первичные опухоли и метастазы, которые образуются у мышей - хозяев, удаляют после асфиксии мышей под действием СО₂.

Образцы ткани подвергают гистопатологическому анализу для обнаружения изменений в развитии (прогрессировании) или метастазирования, ассоциированных с обработкой. Гистопатологический анализ должен включать сравнение роста опухоли во времени, относительное число и размеры метастаз, гистологическую характеристику опухолевой ткани.

In vitro анализ ингибирования миграции раковой клетки/слитой клетки:

Клетки: Две метастатических линии раковых клеток используют для проверки способности антител к убиквитину ингибировать подвижность клеток. PC-3М представляет собой линию человеческих клеток рака простаты. 4Т1 представляет собой линию мышиных клеток рака молочной железы. И те, и другие клетки хранят в среде DMEM, дополненной 10% FBS и Глютамаксом 1 (среда DMEM).

Антитела: Используют три антитела к убиквитину. 14372 является поликлональным антителом к убиквитину. 10С2-2 и Меl-14, оба являются моноклональными антителами к убиквитину.

Метод (1): В 6-луночные планшеты со стерильным покровным стеклом в каждой лунке засевают при плотности 1×10⁶ клеток/лунка в среде DMEM и инкубируют в течение ночи при 37°С и 5% СО₂ в увлажненной атмосфере (стандартные условия).

На следующий день в слившемся монослое на покровном стекле один раз наносят царапину наконечником пипетки. Среду отсасывают и лунки промывают 1 мл среды DMEM. Каждую линию клеток обрабатывают каждым антителом в трех различных концентрациях: 5 мкг/мл/10⁶ клеток, 25 мкг/мл/10⁶ клеток и 100 мкг/мл/10⁶ клеток. Планшеты с клетками инкубируют в течение 11 часов. Контрольные клетки обрабатывают DPBS.

После инкубации оценивают закрытие (смыкание) царапин на покровных стеклах в результате миграции клеток. Покровные стекла фиксируют и окрашивают смесью метанол: ацетон в соотношении 1:1 в течение 5 минут при - 20°С, а затем промывают с помощью DPBS. Покровные стекла помещают на стеклянные пластины. Изображения получают с помощью программы Metacam, дисплейный терминал состоит из микроскопа Nikon TE2000 с увеличением 4Х.

In vivo анализ ингибирования метастазов раковой клетки/слитой клетки:

Клетки: Линию клеток метастатического рака молочной железы мышей, 4Т1, используют для проверки способности антитела к убиквитину ингибировать метастазы. Клетки сохраняют в среде DMEM в условиях для культур, описанных в предыдущем протоколе.

Антитела: Используют моноклональное антитело к убиквитину, Меl-14.

Метод: Клетки 4Т1 транзиторно трансфецируют при использовании вектора для экспрессии улучшенной версии зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Клетки собирают через 48 часов после трансфекции и инкубируют либо с антителом к убиквитину, Меl-14, либо с контрольным антителом. Rat IgG2A, в концентрации 180 мкг на 10⁶ клеток в DPBS в течение одного часа. После инкубации 250000 клеток инъецируют в хвостовую вену мышей SCID в общем объеме 50 мкл. Через одну неделю мышей умерщвляют, их легкие извлекают и фиксируют в 4% формалине. Исследование с целью определения присутствия метастатических колоний проводят на цельных уплощенных легких под микроскопом Nikon Eclipse 600 при увеличении 10Х. Присутствие EGFP- позитивных клеток в легком указывает на то, что имеют место метастазы.

Результаты:

Таблица 2 Степень ингибирования миграции клеток РСЗМ in vitro с помощью антител к убиквитину при различных концентрациях. (++++= полное ингибирование; -= отсутствие ингибирования) Конц. 5 мкг/мл/10⁶ 25 мкг/мл/10⁶ 100 мкг/мл/10⁶ антитела       14372 ++++ ++++ ++++ 10С2-2 ++++ ++++ ++++ Меl - 14 ++++ ++++ ++++ DPBS только - - -

Таблица 3 Степень ингибирования миграции клеток 4Т1 in vitro с помощью антител к убиквитину при различных концентрациях. (++++=полное ингибирование; -= отсутствие ингибирования)   Конц. 5 25 100 мкг/мл/миллион     мкг/мл/миллион мкг/мл/миллион   антитела         14372   ++++ ++++ ++++ 10С2-2   ++++ ++++ ++++ Ме1-14
    ++++ ++++ ++++ DPBS только   - - -

Таблица 4 Степень ингибирования in vivo метастазов клеток 4Т1 с помощью антитела к убиквитину, Меl-14. (++++= полное ингибирование; -= отсутствие ингибирования) Конц. 5 мкг/мл/миллион антитела   Меl-14 ++++ контрольное антитело ^- Ссылка:
1. Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kubal L, Akhtar N. "Angiogenesis Assays: A Critical Overview" Clinical Chemistry 49 (1), 1 Jan. 2003: 32-40.

Как показано в вышеприведенных таблицах, антитела против убиквитина ингибируют миграцию опухолевых клеток.

Терапевтические методы

Способы по изобретению можно использовать для ингибирования миграции опухоли у субъекта. Позвоночному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, вводят количество соединения, эффективно ингибирующее миграцию опухолевых клеток. Соединение или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно, вводят в форме фармацевтической композиции.

Дозы соединений, предпочтительно, включают фармацевтические лекарственные дозы, содержащие эффективное количество антитела или другого агента. Под эффективным количеством понимают количество, достаточное для достижения стабильной (равновесной) концентрации in vivo, которая приводит к измеримому (заметному) снижению какого-либо релевантного показателя заболевания.

В настоящее время моноклональные антитела обычно применяют для терапии с помощью инфузии непосредственно пациенту. Антитело может быть лиофилизированным и храниться до момента реконституции либо водой, либо солевым физиологическим раствором. Доза 4 мг/кг массы тела является обычной и безопасной для человека дозой лекарственных препаратов антител. Например, она является эффективной дозой лекарственного антитела герцептина при лечении рака молочной железы. Так, в одном варианте изобретения человеку дают дозу 4 мг антитела к убиквитину на кг массы тела, которую вводят внутривенно.

Количество вводимого активного соединения зависит от определенного биологического или химического агента, заболевания или состояния, способа введения, состояния здоровья и массы реципиента, наличия другого одновременного лечения, если таковое проводится, частоты лечения, характера нужного эффекта, например ингибирование метастазов опухоли, и мнения опытного практического врача.

Вышеприведенные композиции и способы лечения применимы для ингибирования миграции клеток (например, инвазии (прорастания) или метастазов) у субъекта, страдающего любым заболеванием или состоянием, ассоциированным с нежелательной инвазией, пролиферацией, метастазами.

Возможны различные модификации, соответствующие сущности изобретения и в пределах формулы изобретения.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для ингибирования миграции раковых клеток. Способ заключается в обеспечении контактирования опухолевой клетки нелимфоцитарной природы с эффективным количеством антитела против убиквитина. Использование изобретения позволяет препятствовать развитию метастазов за счет блокирования подвижности и экстравазации раковых клеток под действием антител к убиквитину. 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

1. Способ ингибирования миграции опухолевых клеток нелимфоцитарной природы, заключающийся в контактировании опухолевой клетки нелимфоцитарной природы с эффективным количеством антитела против убиквитина.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию подтверждения присутствия слитых клеток в указанной нелимфоцитарной опухоли перед указанным контактированием.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное антитело представляет собой MEL-14.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное антитело выбирают из группы, состоящей из антител 14372 и 10С2-2.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное контактирование проводят in vitro.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная опухолевая клетка нелимфоцитарной природы происходит из карциномы или карциномной клеточной линии.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная карциномная клетка является клеткой человеческого происхождения.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанную карциномную клетку выбирают из группы, состоящей из клеток молочной железы, предстательной железы и кожи.