МОДУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСТИРЕТИНА Российский патент 2016 года по МПК C12N15/113 A61K31/7115 A61K31/712 A61K31/7125 A61P3/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В данном документе представлены способы, соединения и композиции для снижения экспрессии мРНК и белка транстиретина у животного. Такие способы, соединения и композиции являются пригодными, например, для лечения, профилактики или облегчения транстиретинового амилоидоза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Транстиретин (TTR) (также известен как преальбумин, гипертироксинемия, диспреальбуминемия, тироксин; старческий системный амилоидоз, амилоидная полиневропатия, амилоидоз I, PALB; дистранстиретинемия, HST2651; ТВРА; диспреальбуминемичная эутиреоидная гипертироксинемия) представляет собой белок сыворотки/плазмы и спинномозговой жидкости, ответственный за транспорт тироксина и ретинола (Sakaki et al., Mol Biol Med. 1989, 6:161-8). Структурно, TTR представляет собой гомотетрамер; точечные мутации и нарушения укладки белка приводят к отложению амилоидных фибрилл и ассоциированы с расстройствами, такими как старческий системный амилоидоз (SSA), семейная амилоидная полиневропатия (FAP) и семейная амилоидная кардиопатия (FAC).

TTR синтезируется преимущественно печенью и сосудистым сплетением головного мозга и, в меньшей степени, сетчаткой у людей (Palha, Clin Chem Lab Med, 2002, 40, 1292-1300). Транстиретин, синтезируемый в печени, секретируется в кровь, тогда как Транстиретин из сосудистого сплетения поступает в спинномозговую жидкость (CSF). Синтез транстиретина в сосудистом сплетении составляет примерно 20% от общего синтеза местного белка и до 25% от общего количества белка CSF (Dickson et al., J Biol Chem, 1986, 261, 3475-3478).

В условиях доступности генетических и иммуногистохимических диагностических тестов, пациенты с транстиретиновым (TTR) амилоидозом были выявлены среди людей многих национальностей во всем мире. Недавние исследования показывают, что TTR-амилоидоз не является редким эндемическим заболеванием, как считалось ранее, и может поражать до 25% населения старших возрастных групп (Tanskanen et al, Ann Med. 2008; 40(3):232-9).

На биохимическом уровне, TTR был идентифицирован как основной белковый компонент амилоидных отложений у пациентов с FAP (Costa et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75:4499-4503), и позднее было обнаружено, что наиболее распространенным молекулярным дефектом, вызывающим заболевание, является замещение метионина на валин в положении 30 белка (Saraiva et al, J. Clin. Invest. 1984, 74: 104-119). При FAP наблюдается широко распространенное системное внеклеточное отложение агрегатов TTR и амилоидных фибрилл в соединительной ткани, особенно, в периферической нервной системе (Sousa and Saraiva, Prog. Neurobiol. 2003, 71: 385-400). После отложения TTR происходит дегенерация аксонов, начиная с немиелинизированных и миелинизированных волокон малого диаметра, в конечном счете приводящая к потере нейронов ганглиев.

Соединения и способы лечения, описанные тут, обеспечивают значительные преимущества по сравнению с возможностями доступных в настоящее время способов лечения расстройств, связанных с TTR. TTR-амилоидоз типично приводит к летальному исходу в течение десяти лет и, до недавнего времени, считался неизлечимым. Трансплантация печени является эффективным способом замены ассоциированного с заболеванием аллеля на аллель дикого типа (WT) в случае семейных заболеваний, потому что печень типично является источником амилоидогенного TTR. Хотя трансплантация печени эффективна как форма генной терапии, она не обходится без своих проблем. Трансплантация осложняется необходимостью инвазивной хирургии для реципиента и донора, долгосрочной посттрансплантационной иммуносупрессорной терапии, нехваткой доноров, высокой стоимостью и большим числом пациентов с TTR-амилоидозом, являющихся малопригодными кандидатами вследствие прогрессирования заболевания. К сожалению, амилоидоз сердца прогрессирует у некоторых пациентов с семейными заболеваниями даже после трансплантации печени, потому что отложение TTR дикого типа часто продолжается. Отложение TTR в центральной нервной системе (CNS) также не уменьшается после трансплантации вследствие его синтеза сосудистым сплетением. Трансплантация не является практически осуществимой возможностью при наиболее распространенном TTR-заболевании - старческом системном амилоидозе (SSA), поражающем приблизительно 25% лиц старше 80 лет вследствие отложения TTR дикого типа.

Находящаяся на стадии становления антисмысловая технология является эффективным средством снижения экспрессии специфических генных продуктов и может поэтому оказаться уникально пригодной в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских областей применения для модуляции экспрессии TTR (см. публикации патентов США №№2008/0039418 и 2007/0299027.

Настоящее изобретение предусматривает композиции и способы модуляции экспрессии транстиретина. Антисмысловые соединения для модуляции экспрессии транстиретина раскрыты в вышеупомянутых опубликованных патентных заявках. Однако, сохраняется потребность в дополнительных таких соединениях.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном описании предусматриваются способы, соединения и композиции для модуляции экспрессии мРНК и белка транстиретина (TTR). В определенных вариантах воплощения, соединения, пригодные для модуляции экспрессии мРНК и белка TTR, представляют собой антисмысловые соединения. В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды.

В определенных вариантах воплощения, модуляция может происходить в клетке или ткани. В определенных вариантах воплощения, клетка или ткань находятся в животном. В определенных вариантах воплощения, животное представляет собой человека. В определенных вариантах воплощения снижаются уровни мРНК TTR. В определенных вариантах воплощения снижаются уровни белка TTR. Такое снижение может происходить зависимым от времени образом или зависимым от дозы образом.

Данное описание предусматривает способы, соединения и композиции для модуляции экспрессии транстиретина, и лечение, предупреждение, задержку или облегчение транстиретинового амилоидоза и/или его симптома. В определенных вариантах воплощения предусматриваются способы, соединения и композиции для модуляции экспрессии транстиретина и лечение, предупреждение, задержка или облегчение транстиретинового амилоидного заболевания или транстиретинового амилоидоза или транстиретин-ассоциированного амилоидоза (например, наследственного TTR-амилоидоза, лептоменингеального амилоидоза, транстиретиновой амилоидной полиневропатии, семейной амилоидной полиневропатии, семейной амилоидной кардиомиопатии или старческого системного амилоидоза).

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 или 124.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранной из любой из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86 или 87.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с риском транстиретинового амилоидоза или с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нукпеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид на 100% комплементарен к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описываемой в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, указанную в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид на 100% комплементарен к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описываемой в SEQ ID NO:1; и где соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, указанную в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, животное с транстиретиновым амилоидозом лечат путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид на 100% комплементарен к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, описываемой в SEQ ID NO:1; где соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, указанную в SEQ ID NO:80; и где модифицированные олигонуклеотиды содержат гэп-сегмент из 10 связанных дезоксинуклеозидов, расположенный между двумя боковыми сегментами, независимо содержащими по 5 связанных модифицированных нуклеозидов. В определенных вариантах воплощения, один или несколько модифицированных нуклеозидов в боковом сегменте содержат модифицированный сахар. В определенных вариантах воплощения, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В определенных вариантах воплощения, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид.

В определенных вариантах воплощения, модуляция может происходить в клетке, ткани, органе или организме. В определенных вариантах воплощения, клетка, ткань или орган находятся в животном. В определенных вариантах воплощения, животное представляет собой человека. В определенных вариантах воплощения снижаются уровни мРНК транстиретина. В определенных вариантах воплощения снижаются уровни белка транстиретина. Такое снижение может происходить зависимым от времени образом или зависимым от дозы образом.

Также предусматриваются способы, соединения и композиции, пригодные для предотвращения, лечения и облегчения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с транстиретиновым амилоидозом. В определенных вариантах воплощения, такие заболевания, расстройства и состояния представляют собой заболевания, расстройства или состояния, связанные с транстиретиновым амилоидозом.

В определенных вариантах воплощения, способы лечения включают введение антисмыслового соединения TTR нуждающемуся в этом лицу. В определенных вариантах воплощения, способы лечения включают введение антисмыслового олигонуклеотида TTR нуждающемуся в этом лицу.

В определенных вариантах воплощения, способы лечения включают введение антисмыслового олигонуклеотида транстиретина и дополнительную терапию нуждающегося в этом лица.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание являются лишь примерными и пояснительными и не ограничивают заявляемое изобретение. В данном описании использование терминов в единственном числе включает множественное число, если конкретно не указано иное. В используемом тут значении, использование союза "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включая", а также других его форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Также, такие термины, как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну структурную единицу, так и элементы и компоненты, содержащие более одной субъединицы, если конкретно не указано иное.

Заголовки разделов, используемые тут, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описываемый объект. Все документы или части документов, упоминаемые в данной заявке, включая, без ограничений, патенты, патентные заявки, статьи, книги и учебные пособия, настоящим явным образом включены в качестве ссылок в отношении рассматриваемых тут частей документа, а также целиком.

Определения

Если не приведены конкретные определения, то номенклатура, используемая в связи с, и процедуры и методики аналитической химии, органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные тут, являются хорошо известными и общеупотребительными в данной области техники. Стандартные методики могут быть использованы для химического синтеза и химического анализа. Там, где это дозволено, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, Номера доступа GENBANK и ассоциированная с ними информация о последовательностях, которая может быть получена через базы данных, такие как Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI) и другие данные, упоминаемые в данном описании, включены в качестве ссылок в отношении рассматриваемых тут частей документов, а также целиком.

Если не указано иное, то следующие термины имеют такие значения:

"2'-O-метоксиэтил" (также 2'-МОЕ и 2'-O(СН₂)₂-ОСН₃) относится к O-метоксиэтильной модификации 2'-положения фурозильного кольца. Сахар, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом, представляет собой модифицированный сахар.

"2'-O-метоксиэтил-нуклеотид" означает нуклеотид, содержащий фрагмент сахара, модифицированного 2'-O-метоксиэтилом.

"5-Метилцитозин" означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5'-положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеооснование.

"Активный фармацевтический агент" означает вещество или вещества в фармацевтической композиции, которые обеспечивают терапевтически полезный эффект при введении индивиду. Например, в определенных вариантах воплощения, антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на транстиретин, является активным фармацевтическим агентом.

"Активный участок-мишень" или "целевой участок" означает участок, на который нацелены одно или несколько активных антисмысловых соединений. "Активные антисмысловые соединения" означают антисмысловые соединения, которые снижают уровни целевой нуклеиновой кислоты или уровни белка.

"Сопутствующее введение" относится к совместному введению двух агентов любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих проявляются у пациента одновременно. Сопутствующее введение не требует, чтобы оба агента вводились в одной фармацевтической композиции, в одной дозированной форме, или одним и тем же путем введения. Эффекты обоих агентов не должны обязательно проявляться одновременно. Эффекты только должны перекрываться на протяжении некоторого периода времени и не должны совпадать по протяженности.

"Введение" обозначает доставку фармацевтического агента индивиду и включает, без ограничения, введение специалистом-медиком и самостоятельное введение.

"Облегчение" относится к ослаблению, по меньшей мере, одного показателя, признака или симптома ассоциированного заболевания, расстройства или состояния. Тяжесть показателей может быть определена с помощью субъективных или объективных критериев, которые известны квалифицированным специалистам в данной области.

"Амилоидоз" представляет собой группу заболеваний или расстройств, вызванных аномальными отложениями белка (амилоид или амилоидные фибриллы) в различных тканях организма. Амилоидные белки могут откладываться в одной определенной области организма (локализованный амилоидоз) или они могут откладываться по всему организму (системный амилоидоз). Существует три типа системного амилоидоза: первичный (AL), вторичный (АА) и семейный (ATTR). Первичный амилоидоз не ассоциирован с какими-либо другими болезнями и считается самостоятельной нозологической единицей. Вторичный амилоидоз возникает в результате другого заболевания. Семейная средиземноморская лихорадка является формой семейного (наследственного) амилоидоза.

"Животное" относится к человеку или не принадлежащему к человеческому роду животному, включая, без ограничений, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов кроме человека, включая, без ограничений, обезьян и шимпанзе.

"Антисмысловая активность" означает любую детектируемую или измеримую активность, которая может быть отнесена к гибридизации антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В определенных вариантах воплощения, антисмысловая активность представляет собой снижение количества или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого такой целевой нуклеиновой кислотой.

"Антисмысловое соединение" означает олигомерное соединение, способное подвергаться гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой посредством образования водородной связи.

"Антисмысловое ингибирование" означает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты или уровней целевого белка в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного к целевой нуклеиновой кислоте по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты или уровнями целевого белка в отсутствие антисмыслового соединения.

"Антисмысловой олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеооснований, позволяющую протекание гибридизации с соответствующим участком или сегментом целевой нуклеиновой кислоты.

"Бициклический сахар" означает фурозильное кольцо, модифицированное путем образования мостиковой связи между двумя не-геминальными атомами кольца. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.

"Бициклическая нуклеиновая кислота" или "БНК" относится к нуклеозиду или нуклеотиду, в котором фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида включает мостиковую связь, соединяющую два атома углерода фуранозного кольца, с образованием в результате бициклической кольцевой системы.

"Кэп-структура" или "терминальный кэп-фрагмент" означает химические модификации, включенные на любом конце антисмыслового соединения.

"Центральная нервная система (ЦНС)" относится к нервной системе позвоночного животного, окруженной мозговыми оболочками. Она включает большую часть нервной системы и состоит из головного мозга (у позвоночных животных, имеющих головной мозг) и спинного мозга. ЦНС расположена в дорсальной полости, с головным мозгом в черепной полости и спинным мозгом в спинномозговом канале. Головной мозг также защищен черепом, и спинной мозг, у позвоночных животных, также защищен позвоночником.

"Химически отличный участок" относится к участку антисмыслового соединения, который некоторым образом химически отличается от другого участка этого же антисмыслового соединения. Например, участок, содержащий 2'-O-метоксиэтилированные нуклеотиды, химически отличается от участка, содержащего нуклеотиды без 2'-O-метоксиэтильных модификаций.

"Химерное антисмысловое соединение" означает антисмысловое соединение, содержащее, по меньшей мере, два химически отличных участка.

"Сосудистое сплетение" представляет собой область желудочков головного мозга, в которой вырабатывается спинномозговая жидкость (CSF).

"Совместное введение" означает введение индивиду двух или больше фармацевтических агентов. Два или больше фармацевтических агента могут находиться в одной фармацевтической композиции или могут находиться в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или больше фармацевтических агентов может быть введен одним и тем же или разными путями введения. Совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение.

"Комплементарность" означает способность к спариванию между нуклеооснованиями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

"Смежные нуклеооснования" означают нуклеооснования, непосредственно прилегающие друг к другу.

"Разбавитель" означает ингредиент композиции, не обладающий фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекции может быть жидкостью, например, солевым раствором.

"Доза" означает определенное количество фармацевтического агента, доставляемое при разовом введении или за определенный период времени. В определенных вариантах воплощения, доза может быть введена в виде одного, двух или нескольких болюсов, таблеток или инъекций. Например, в определенных вариантах воплощения, когда желательным является подкожное введение, желательная доза требует объема, который не может быть легко введен одной инъекцией, поэтому, две или больше инъекций могут быть использованы для достижения желательной дозы. В определенных вариантах воплощения, фармацевтический агент вводят путем инфузии на протяжении длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического агента в час, за сутки, неделю или месяц.

"Эффективное количество" означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для достижения желательного физиологического результата у лица, нуждающегося в таком агенте. Эффективное количество может различаться для разных лиц в зависимости от здоровья и физического состояния лица, лечение которого должно проводиться, таксономической группы лиц, лечение которых должно проводиться, состава композиции, оценки медицинского состояния лица, и других релевантных факторов.

"Семейный амилоидоз" или "наследственный амилоидоз" представляет собой форму наследственно передаваемого амилоидоза.

"Семейная амилоидная полиневропатия" или "FAP" представляет собой нейродегенеративное генетически передаваемое расстройство, характеризующееся системными отложениями амилоидных вариантов транстиретиновых белков, вызывающими прогрессирующую сенсорную и моторную полиневропатию.

"Полностью комплементарный" или "на 100% комплементарный" означает, что каждое нуклеооснование последовательности нуклеооснований первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеооснование во второй последовательности нуклеооснований второй нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение и целевая нуклеиновая кислота представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.

Тапмер" означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренний участок, содержащий множество нуклеозидов, поддерживающих расщепление РНКазой Н, расположен между внешними участками, содержащими один или несколько нуклеозидов, где нуклеозиды, составляющие внутренний участок, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние участки. Внутренний участок может быть назван "гэп-сегментом", и внешние участки могут быть названы "боковыми сегментами".

"Уширенный за счет гэпа" означает химерное антисмысловое соединение, содержащее гэп-сегмент из 12 или больше смежных 2'-дезоксирибонуклеозидов, расположенных между и непосредственно прилегающих к 5'- и 3'-боковым сегментам, содержащим от одного до шести нуклеозидов.

"Наследственный транстиретиновый (TTR) амилоидоз" представляет собой системное заболевание, вызываемое мутациями транстиретина, плазменного транспортного белка тироксина и витамина А. Он наиболее часто ассоциируется с периферической невропатией и рестриктивной кардиомиопатией, но амилоидные отложения в стенках кровеносных сосудов и структурах соединительных тканей по всему организму часто вызывают дисфункцию других систем органов. Эта болезнь обычно сопровождается аномалиями подвижности желудочно-кишечного тракта с запорами, диареей и преждевременным чувством насыщения вследствие замедленного опорожнения желудка. Отложения амилоида в соединительной ткани запястья может вызывать кистевой туннельный синдром. Амилоидные отложения в спинальных кровеносных сосудах и окружающих структурах вызывают спинальный стеноз с симптомами хромоты.

"Гибридизация" означает отжиг молекул комплементарной нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, молекулы комплементарной нуклеиновой кислоты включают антисмысловое соединение и целевую нуклеиновую кислоту.

"Непосредственно прилегающий" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно прилегающими элементами.

"Лицо, индивид" означает человека или не относящееся к человеческому роду животное, выбранное для проведения лечения или терапии.

"Интрацеребровентрикулярное введение" или "церебральное интравентрикулярное введение" или "церебрально-вентрикулярное введение" означает введение путем инъекции или инфузии в систему желудочка головного мозга.

"Интраперитонеальное введение" означает введение в полость брюшины.

"Интратекальное введение" означает введение путем инъекции или инфузии в спинномозговую жидкость, омывающую спинной мозг и головной мозг.

"Внутривенное введение" означает введение в вену.

"Интравентрикулярное введение" означает введение в желудочки головного мозга или сердца.

"Межнуклеозидная связь" относится к химической связи между нуклеозидами.

"Лептоменингеальный" означает имеющий отношение к мягкой и паутинной оболочкам мозга, двум внутренним слоям тканей, покрывающим головной мозг и спинной мозг."Лептоменингеальный амилоидоз" относится к амилоидозу мягкой и паутинной оболочек мозга в результате транстиретиновых амилоидных отложений в мягкой и паутинной оболочках мозга.

"Связанные нуклеозиды" означает прилегающие нуклеозиды, соединенные друг с другом.

"Неспаренное" или "некомплементарное нуклеооснование" относится к случаю, когда нуклеооснование первой нуклеиновой кислоты не способно к спариванию с соответствующим нуклеооснованием второй или целевой нуклеиновой кислоты.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" относится к замещению или любому изменению встречающейся в природе межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).

"Модифицированное нуклеооснование" относится к любому нуклеооснованию кроме аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. "Немодифицированное нуклеооснование" означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

"Модифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, содержащий, независимо, фрагмент модифицированного сахара, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеооснование. "Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий, независимо, фрагмент модифицированного сахара или модифицированное нуклеооснование.

"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, содержащий, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид.

"Модифицированный сахар" относится к замещению или изменению по сравнению с природным сахаром.

"Мотив" означает характерную структуру химически отличных участков антисмыслового соединения.

"Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь" означает фосфодиэфирную связь, направленную от 3'- к 5'-концу.

"Фрагмент природного сахара" означает сахар, присутствующий в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

"Нуклеиновая кислота" относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (siPHK) и микроРНК (miPHK). Нуклеиновая кислота может также включать комбинацию этих элементов в одной молекуле.

"Нуклеооснование" означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.

"Последовательность нуклеооснований" означает порядок расположения смежных нуклеооснований независимо от каких-либо модификаций сахара, связи или нуклеооснования.

"Нуклеозид" означает нуклеооснование, связанное с сахаром.

"Нуклеотид" означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.

"Олигомерное соединение" или "олигомер" означает полимер, состоящий из связанных мономерных субъединиц, способный гибридизироваться с, по меньшей мере, участком молекулы нуклеиновой кислоты.

"Олигонуклеотид" означает полимер, состоящий из связанных нуклеозидов, каждый из которых, независимо друг от друга, может быть модифицированным или немодифицированным.

"Парентеральное введение" означает введение путем инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, интраартериальное введение, интраперитонеальное введение или внутричерепное введение, например, внутримозговое введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, вентрикулярное введение, интрацеребровентрикулярное введение, церебральное интравентрикулярное введение или церебрально-вентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным или хроническим, или кратковременным, или прерывистым.

"Пептид" означает молекулу, образующуюся при соединении, по меньшей мере, двух аминокислот амидными связями. Пептид относится к полипептидам и белкам.

"Фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, пригодную для введения индивиду. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или несколько активных фармацевтических агентов и стерильный водный раствор.

"Фармацевтически приемлемые соли" означают физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е., соли, сохраняющие желательную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не создающие нежелательных токсикологических эффектов.

"Фосфоротиоатная связь" означает связь между нуклеозидами, при которой фосфодиэфирная связь модифицируется путем замены одного из немостиковых атомов кислорода на атом серы. Фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

"Участок" означает определенное число смежных (т.е. связанных) нуклеооснований нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, участок представляет собой определенное число смежных нуклеооснований целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, участок представляет собой определенное число смежных нуклеооснований антисмыслового соединения.

"Предотвращать" относится к задержке или предупреждению начала или развития заболевания, расстройства или состояния на период времени от минут до неограниченного. Предотвращать также означает снижать риск развития заболевания, расстройства или состояния.

"Пролекарство" означает терапевтический агент, приготовленный в неактивной форме, которая превращается в активную форму в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических соединений или условий.

"Побочные эффекты" означают физиологические ответы, которые могут быть отнесены к лечению, за исключением желательных эффектов. В определенных вариантах воплощения, побочные эффекты включают реакции места инъекции, аномалии теста функции печени, аномалии почечной функции, печеночную токсичность, почечную токсичность, аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на печеночную токсичность или аномалию функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на печеночную токсичность или аномалию функции печени.

"Одноцепочечный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, не гибридизированный с комплементарной нитью.

"Специфически гибридизуемый" относится к антисмысловому соединению, имеющему достаточную степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой для индуцирования желательного эффекта, при минимальных эффектах воздействия на нецелевые нуклеиновые кислоты или их отсутствии, при условиях, в которых желательно специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo анализов и терапевтического лечения.

"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу.

"Нацеливание" или "нацеленный" означает процесс конструирования и селекции антисмыслового соединения, которое бы специфически гибридизировалось с целевой нуклеиновой кислотой и индуцировало желательный эффект.

"Целевая нуклеиновая кислота", "целевая РНК" и "транскрипт целевой РНК" все относятся к нуклеиновой кислоте, способной быть мишенью для антисмысловых соединений.

"Целевой сегмент" означает последовательность нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено антисмысловое соединение. "5'-Концевой сайт мишени" относится к крайнему с 5'-конца нуклеотиду целевого сегмента. "3'-Концевой сайт мишени" относится к крайнему с 3'-конца нуклеотиду целевого сегмента.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество фармацевтического агента, обеспечивающее для индивида терапевтически полезный эффект.

"Транстиретин-специфический ингибитор" или "ингибитор транстиретина" означает любое соединение, способное снижать экспрессию мРНК или белка транстиретина. Примеры таких соединений включают нуклеиновую кислоту, пептид, антитело или ингибитор гистондеацетилазы.

"Транстиретин-специфический модулятор" или "модулятор транстиретина" означает любое соединение, способное повышать или снижать экспрессию мРНК или белка транстиретина.

"Транстиретин-ассоциированный амилоидоз" или "транстиретиновый амилоидоз" или "транстиретиновая амилоидная болезнь", в используемом тут значении, представляет собой любую патологию или болезнь, ассоциированную с дисфункцией или нарушением регуляции транстиретина, приводящим к образованию транстиретин-содержащих амилоидных фибрилл. Транстиретиновый амилоидоз включает, без ограничения, наследственный TTR-амилоидоз, лептоменингеальный амилоидоз, семейную амилоидную полиневропатию (FAP), семейную амилоидную кардиомиопатию, семейный окулолептоменингеальный амилоидоз, старческий амилоидоз сердца или старческий системный амилоидоз.

"Лечить" относится к введению фармацевтической композиции для того, чтобы вызвать изменение или улучшение заболевания, расстройства или состояния.

"Немодифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, состоящий из встречающихся в природе нуклеооснований, фрагментов Сахаров и межнуклеозидных связей. В определенных вариантах воплощения, немодифицированный нуклеотид представляет собой РНК-нуклеотид (т.е. β-D-рибонуклеозиды) или ДНК-нуклеотид (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозид).

Определенные варианты воплощения

Определенные варианты воплощения предусматривают способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии транстиретина.

Определенные варианты воплощения предусматривают антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту. В определенных вариантах воплощения, транстиретиновая нуклеиновая кислота представляет собой любую из последовательностей, описанных под №доступа GENBANK NM_000371.2 (включена сюда как SEQ ID NO:1), №доступа GENBANK NT_010966.10, укороченная форма от нуклеотидов 2009236-2017289 (включена сюда как SEQ ID NO:2); экзоны 1-4, выделенные из геномной последовательности макака-резуса, №доступа GENBANK NW_001105671.1, на основании сходства с экзонами человека; и №доступа GENBANK NW_001105671.1, укороченная форма от нуклеотидов 62800O-638000 (включена сюда как SEQ ID NO:4).

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120,122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120,122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120,122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86 и 87.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 50 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований последовательности, выбранной из последовательностей нуклеооснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 20 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18 или, по меньшей мере, 19 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, указанных в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 12O-139, 212-236, 226-245, 293-468, 293-326, 347-381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 50O-519, 501-535, 502-531, 505-524, 507-526, 508-527, 514-540, 514-539, 515-534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 58O-608, 58O-599, 584-606, 585-604, 587-606 или 597-617 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, область выбирают из 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, область выбирают из 501-535 или 58O-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, участок которых комплементарен с областью, описанной тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 501-535 или 58O-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный с областью, описанной тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 508-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный с областью, описанной тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 15 до 25 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный с областью, описанной тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 18 до 21 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный с областью, описанной тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный с областью, описанной тут. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид на 90%, 95%, 99% или 100% комплементарен к нуклеиновой кислоте, кодирующей транстиретин человека (TTR), например SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, в котором связанные нуклеозиды содержат участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 508-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид содержит участок из, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 13, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 17, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 19 или, по меньшей мере, 20 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 508-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид на 90%, 95%, 99% или 100% комплементарен к нуклеиновой кислоте, кодирующей транстиретин человека (TTR), например SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 60% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 70% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 80% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 90% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 95% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO; 1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 99% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 100% комплементарных с областью, выбранной из нуклеотидов 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 58O-599, 585-604, 587-606 и 589-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 60% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 70% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 80% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 90% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 95% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 99% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, на 100% комплементарных с нуклеотидами 508-527 SEQ ID NO:1.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение или модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, нацелены на следующие участки нуклеотидов SEQ ID NO:1: 12O-139, 212-236, 226-245, 293-468, 293-326, 347-381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 50O-519, 502-531, 507-526, 505-524, 508-527, 514-540, 514-539, 515-534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 58O-599, 584-606, 585-604, 587-606 или 597-617.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения или модифицированные олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты транстиретина. В определенных вариантах воплощения, такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты транстиретина, содержат участок смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины в области. Например, участок может представлять собой участок из, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку равной длины описанной тут области. В определенных вариантах воплощения, такие соединения или олигонуклеотид нацелены на следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1: 12O-139, 212-236, 226-245, 293-381, 293-366, 353-381, 293-468, 425-468, 425-467, 452-476, 461-481, 461-500, 50O-519, 461-519, 502-531, 502-539, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-540, 523-542, 544-606, 544-564, 544-583 или 597-617.

В определенных вариантах воплощения, такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты транстиретина, содержат участок смежных нуклеооснований, комплементарный к участку нуклеооснований равной длины области 501-535 или 58O-608 SEQ ID NO:1.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 60% ингибирования: 226-245, 293-366, 357-467, 452-474, 457-476, 459-478, 462-500, 50O-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-564, 564-583, 578-601, 584-606 или 597-617.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 65% ингибирования: 293-366, 357-376, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 50O-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-563, 564-583, 578-601, 585-606 или 597-617.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 70% ингибирования: 293-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 50O-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 564-583, 578-598, 581-600 или 597-617.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 75% ингибирования: 293-322, 347-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 50O-519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 578-598, 581-600 или 597-616.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 80% ингибирования: 303-322, 425-449, 432-460, 443-467, 452-473, 481-500, 50O-519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539, 579-598, 581-600 или 597-616.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 85% ингибирования: 427-449, 432-458, 441-460, 443-467, 452-473, 504-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539 или 581-600.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 90% ингибирования: 428-449, 432-456, 439-458, 441-460, 445-466, 452-473, 504-525, 508-527 или 515-536.

В определенных вариантах воплощения, следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:1, служащие мишенями антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют, по меньшей мере, 95% ингибирования: 434-453, 436-456, 441-460, 445-465, 505-524 или 516-535.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 60% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 420954, 420904, 304286, 420874, 420948, 420883, 420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893,420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 65% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 70% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897,420899,420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 75% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 420877, 420878, 420880, 304284, 304285, 420884, 420885, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 420899, 420900, 420901, 420902, 420906, 420908, 304296, 420909, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926, 304309, 420949, 420951 или 304311.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 80% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 85% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897,420899,420888,420895,420896,420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 90% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, следующие антисмысловые соединения нацелены на область SEQ ID NO:1, нуклеиновой кислоты, кодирующей транстиретин человека, и демонстрируют, по меньшей мере, 95% ингибирования мРНК транстиретина: №№ ISIS: 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890 или 420891.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 12O-139 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 12O-139 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:37. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 12O-139 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 420872.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 212-236 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 212-236 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:8 и 38. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 212-236 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420873 или 304267.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 226-245 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 226-245 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:39. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 226-245 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 420874.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 293-381 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 293-381 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:10, 42-48. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 293-381 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882 или 420883.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 293-366 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 293-366 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:42-45. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 293-366 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420877, 420878, 420879 или 420880.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 353-381 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 353-381 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:10, 46-48. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 353-381 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 304280, 420881, 420882 или 420883.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 293-468 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 293-468 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:1O-18, 42-63. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 293-468 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, 420883, 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898 или 304291.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 425-468 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 425-468 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:11-18, 49-63. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 425-468 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898 или 304291.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 425-467 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 425-468 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:11-17, 49-63. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 425-468 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897 или 420898.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 452-476 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 452-476 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:64-69. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 452-476 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 304291, 304292, 304293, 420899, 420900, 420901, 420902, 420903 или 420904.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 461-481 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 461-481 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:72-73. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 461-481 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420907 или 420908.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 461-500 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 461-500 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:22, 72 и 73. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 461-500 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420907, 420908 или 304296.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 50O-519 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 50O-519 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:74. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 50O-519 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 420909.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 461-519 SEQ ID NO; 1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 461-519 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:22, 23, 72-74. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 461-519 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420907, 420908, 304296 или 420909.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 502-531 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 502-531 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25, 75-84. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 502-531 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918 или 420919.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 502-539 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 502-539 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25, 26, 75-91. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 502-539 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925 или 420926.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 504-536 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 504-536 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25, 26, 77-88. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 504-536 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922 или 420923.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 505-535 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 505-535 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25, 26, 78-87. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 505-535 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921 или 420922.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 506-530 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 506-530 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25, 79-83. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 506-530 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918 или 420919.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 507-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 507-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:25 или 80. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 507-527 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 304299 или 420915.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 508-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 508-527 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:80. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 508-527 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 420915.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 514-540 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 514-540 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:85-92. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 514-540 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926 или 420927.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 523-542 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 523-542 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:94. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 523-542 SEQ ID NO:1, выбирают из № ISIS: 420929.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 544-606 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 544-606 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:3O-33, 112-122. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 544-606 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420947, 420948, 304304, 304307, 304308, 304309, 420949, 420950, 420951, 420952, 420953, 420954, 420955, 420956 или 420957.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 544-564 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 544-564 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:112-113. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 544-564 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420947 или 420948.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 544-583 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 544-583 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:30, 31, 112 и 113. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 544-583 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 420947, 420948, 304304 или 304307.

В определенных вариантах воплощения, участком-мишенью являются нуклеотиды 597-617 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение нацелено на нуклеотиды 597-617 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту транстиретина, содержит последовательность нуклеооснований, выбранную из SEQ ID NO:34-35. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеотиды 597-617 SEQ ID NO:1, выбирают из №№ ISIS: 304311 или 304312.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

В определенных вариантах воплощения, последовательность нуклеооснований модифицированного олигонуклеотида, по меньшей мере, на 90% комплементарна по ее полной длине последовательности нуклеооснований SEQ ID NO:1, 2 или 4. В определенных вариантах воплощения, последовательность нуклеооснований модифицированного олигонуклеотида, по меньшей мере, на 95% комплементарна по ее полной длине последовательности нуклеооснований SEQ ID NO:1, 2 или 4. В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид на, по меньшей мере, 99% комплементарен по его полной длине SEQ ID NO:1, 2 или 4. В определенных вариантах воплощения, последовательность нуклеооснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна по ее полной длине последовательности нуклеооснований SEQ ID NO:1, 2 или 4.

В определенных вариантах воплощения, соединение содержит, по меньшей мере, одну модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах воплощения, межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.

В определенных вариантах воплощения, соединение содержит, по меньшей мере, один нуклеозид, включающий модифицированный сахар. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один бициклический сахар содержит мостиковую связь 4'-СН(СН₃)-O-2'. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтил.

В определенных вариантах воплощения, соединение содержит по меньшей мере, один тетрагидропиран-модифицированный нуклеозид, в котором тетрагидропирановое кольцо замещает фуранозное кольцо. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один тетрагидропиран-модифицированный нуклеозид имеет структуру:

где Вх представляет собой необязательно защищенный фрагмент гетероциклического основания.

В определенных вариантах воплощения, соединение содержит, по меньшей мере, один нуклеозид, включающий модифицированное нуклеооснование. В определенных вариантах воплощения, модифицированное нуклеооснование представляет собой 5-метилцитозин.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом и где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит модифицированный сахар.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент непосредственно прилегает к, и расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом, где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из восьми связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из шести связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из шести связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент непосредственно прилегает к, и расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом, где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из восьми связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент непосредственно прилегает к, и расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом, где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент непосредственно прилегает к, и расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом, где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и где последовательность нуклеооснований включает, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, описанной в SEQ ID NO:80.

В определенных вариантах воплощения, модифицированный олигонуклеотид соединения содержит:

(i) гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент непосредственно прилегает к, и расположен между 5'-боковым сегментом и 3'-боковым сегментом, где каждый нуклеозид каждого бокового сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и где последовательность нуклеооснований описана в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают композицию, содержащую соединение, описанное тут, или его соль, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В определенных вариантах воплощения, композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 12 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранных из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Определенные варианты воплощения предусматривают композицию, содержащую соединение, описанное тут, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В определенных вариантах воплощения, композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 12 смежных нуклеооснований из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:80, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Определенные варианты воплощения предусматривают композицию, содержащую соединение, описанное тут, где уровень вязкости составляет менее 40 сП. В определенных вариантах воплощения, композиция имеет уровень вязкости менее 15 сП. В определенных вариантах воплощения, композиция имеет уровень вязкости менее 12 сП. В определенных вариантах воплощения, композиция имеет уровень вязкости менееЮсП.

Определенные варианты воплощения предусматривают способы лечения, предотвращения или облегчения транстиретинового амилоидоза.

Определенные варианты воплощения предусматривают способы, включающие введение животному соединения, описанного тут.В определенных вариантах воплощения, способ включает введение животному модифицированного олигонуклеотида, состоящего из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранных из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120,122 и 124.

Определенные варианты воплощения предусматривают способы, включающие введение животному соединения, описанного тут.В определенных вариантах воплощения, способ включает введение животному соединения или модифицированного олигонуклеотида, состоящего из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где связанные нуклеозиды включают участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 501-535 или 58O-608 SEQ ID NO:1.

Определенные варианты воплощения предусматривают способы, включающие введение животному соединения, описанного тут.В определенных вариантах воплощения, способ включает введение животному модифицированного олигонуклеотида, состоящего из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, и имеющего последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, приведенной в SEQ ID NO:80.

Определенные варианты воплощения предусматривают способы, включающие введение животному соединения, описанного тут.В определенных вариантах воплощения, способ включает введение животному соединения или модифицированного олигонуклеотида, состоящего из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где связанные нуклеозиды включают участок из, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований, комплементарный к участку равной длины в области, выбранной из нуклеотидов 508-527 SEQ ID NO:1.

В определенных вариантах воплощения, животное представляет собой человека.

В определенных вариантах воплощения, введение предотвращает, лечит, облегчает или замедляет развитие транстиретинового амилоидоза, как описано тут.

В определенных вариантах воплощения, соединение вводится совместно со вторым агентом.

В определенных вариантах воплощения, соединение и второй агент вводятся совместно.

В определенных вариантах воплощения, введение представляет собой парентеральное введение. В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение представляет собой подкожное введение. В определенных вариантах воплощения, композиция для введения представляет собой соединение в солевом растворе. В определенных вариантах воплощения, соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 12 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, выбранных из последовательностей нуклеооснований, описанных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124, или его соль и солевой раствор. В определенных вариантах воплощения, композиция лекарственного средства не содержит каких-либо стабилизаторов или дополнительных стабилизаторов, включая липидные агенты.

В определенных вариантах воплощения, введение представляет собой парентеральное введение. В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение представляет собой внутричерепное введение. В определенных вариантах воплощения, внутричерепное введение представляет собой внутримозговое, интратекальное, интравентрикулярное, вентрикулярное, интрацеребровентрикулярное, церебральное интравентрикулярное или церебрально-вентрикулярное введение.

Определенные варианты воплощения дополнительно предусматривают способ снижения экспрессии мРНК или белка транстиретина у животного, включающий введение животному соединения или композиции, описанных тут, для снижения экспрессии мРНК или белка транстиретина у животного. В определенных вариантах воплощения, животное представляет собой человека. В определенных вариантах воплощения, снижение экспрессии мРНК или белка транстиретина предотвращает, лечит, облегчает или замедляет развитие транстиретинового амилоидоза.

Определенные варианты воплощения предусматривают способ лечения человека с транстиретин-ассоциированной болезнью, включающий идентификацию человека с болезнью и введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут. В определенных вариантах воплощения, лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из беспокойства, отсутствия координации, нистагма, спастического парапареза, отсутствия мышечной координации, нарушения зрения, бессонницы, необычных ощущений, миоклонуса, слепоты, потери речи, кистевого туннельного синдрома, эпилептических припадков, субарахноидальных кровоизлияний, инсульта и кровотечения в головном мозге, гидроцефалии, атаксии и спастического паралича, комы, сенсорной невропатии, паратезии, гипестезии, моторной невропатии, автономной невропатии, ортостатической гипотензии, циклического запора, циклической диареи, тошноты, рвоты, пониженного потения, импотенции, замедленного опорожнения желудка, задержки мочевыделения, недержания мочи, прогрессирующей кардиопатии, усталости, одышки, потери веса, отсутствия аппетита, онемения, ощущения покалывания, слабости, увеличенного языка, нефротического синдрома, застойной сердечной недостаточности, одышки при физической нагрузке, периферического отека, аритмий, учащенного сердцебиения, ощущения головокружения, обморока, постуральной гипотензии, проблемы периферических нервов, сенсорно-двигательной недостаточности, невропатии нижних конечностей, невропатии верхних конечностей, гиперальгезии, изменения восприятия температуры, слабости в нижних конечностях, кахексии, периферического отека, гепатомегалии, пурпуры, диастолической дисфункции, экстрасистолы желудочков, черепной невропатии, ослабления глубоких сухожильных рефлексов, амилоидных отложений в стекловидном теле, помутнения стекловидного тела, сухости глаз, глаукомы, зубчатого края зрачков, отечности ног вследствие удерживания воды. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой когнитивный симптом, выбранный из группы, состоящей из расстройства памяти, расстройства суждения и мышления, расстройства планирования, расстройства гибкости, расстройства абстрактного мышления, расстройства уяснения правил, расстройства инициирования адекватных действий, расстройства ингибирования неадекватных действий, расстройства кратковременной памяти, расстройства длительной памяти, паранойи, дезориентации, спутанности сознания, галлюцинаций и деменции. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой психиатрический симптом, выбранный из группы, состоящей из деменции; тревожного состояния, депрессии, притупленного аффекта, эгоцентризмов, агрессии, компульсивного поведения, раздражительности, изменений личности, включая расстройства памяти, суждения и мышления и суицидальное мышление.

Дополнительные варианты воплощения предусматривают способ лечения человека с транстиретиновым амилоидозом, приводящим к амилоидозу сердца, и введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут. В определенных вариантах воплощения, лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из застойной сердечной недостаточности, кардиомегалии, одышки при физической нагрузке, периферического отека, аритмий, учащенного сердцебиения, головокружения, обморока, отложения в субэндотелии периферической сосудистой сети могут приводить к тяжелой постуральной гипотензии, диастолической дисфункции, блокаде сердца, экстрасистолам желудочков и различным тахиаритмиям.

Дополнительные варианты воплощения предусматривают способ лечения человека с транстиретиновым амилоидозом, приводящим к периферическим невропатическим расстройствам, и введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут. В определенных вариантах воплощения, лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из проблем периферических нервов, сенсомоторных расстройств, невропатии нижних конечностей, невропатии верхних конечностей, гиперальгезии, изменения восприятия температуры, слабости в нижних конечностях, боли, дисфункции вегетативной системы, часто проявляющейся как сексуальная дисфункция или дисфункция мочевыводящей системы, симметричных сенсорных расстройств и слабости, ортостатической гипотензии, диареи и/или импотенции.

Дополнительные варианты воплощения предусматривают способ лечения человека с транстиретиновым амилоидозом, приводящим к желудочно-кишечным расстройствам, и введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут. В определенных вариантах воплощения, лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из диареи, запора, тошноты, рвоты и родственных расстройств почек и печени.

Дополнительно предусматривается способ ослабления или предотвращения транстиретинового амилоидоза, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут, тем самым снижая или предотвращая транстиретиновый амилоидоз.

Дополнительно предусматривается способ ослабления или предотвращения заболевания сердца, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут, тем самым ослабляя или предотвращая заболевание сердца. Дополнительно предусматривается способ ослабления или предотвращения невропатического заболевания, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут, тем самым ослабляя или предотвращая невропатическое заболевание. Дополнительно предусматривается способ ослабления или предотвращения желудочно-кишечного заболевания, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, описанных тут, тем самым ослабляя или предотвращая желудочно-кишечное заболевание.

Дополнительно предусматривается способ облегчения симптома транстиретинового амилоидоза, включающий введение нуждающемуся в этом человеку соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 4, тем самым облегчая симптом транстиретинового амилоидоза у человека.

Дополнительно предусматривается способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с транстиретиновым амилоидозом, включающий введение нуждающемуся в этом человеку соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 4, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома транстиретинового амилоидоза у человека.

Дополнительно предусматривается способ обращения дегенерации, определяемой по симптому, ассоциированному с транстиретиновым амилоидозом, включающий введение нуждающемуся в этом человеку соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 4, тем самым обращая дегенерацию, определяемую по симптому транстиретиновой амилоидной болезни у человека.

Дополнительно предусматривается способ облегчения симптома транстиретинового амилоидоза, включающий введение нуждающемуся в этом человеку соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, приведенной в SEQ ID NO:80, тем самым облегчая симптом транстиретинового амилоидоза у человека.

Дополнительные варианты воплощения предусматривают способ лечения человека с транстиретиновым амилоидозом, введение нуждающемуся в этом человеку соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую, по меньшей мере, 8 смежных нуклеооснований из последовательности нуклеооснований, приведенной в SEQ ID NO:80, тем самым осуществляя лечение транстиретинового амилоидоза у человека.

В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой физический, когнитивный, психиатрический или периферический симптом. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой физический симптом, выбранный из группы, состоящей из беспокойства, отсутствия координации, нистагма, спастического парапареза, отсутствия мышечной координации, нарушения зрения, бессонницы, необычных ощущений, миоклонуса, слепоты, потери речи, кистевого туннельного синдрома, эпилептических припадков, субарахноидальных кровоизлияний, инсульта и кровотечения в головном мозге, гидроцефалии, атаксии и спастического паралича, комы, сенсорной невропатии, паратезии, гипестезии, моторной невропатии, автономной невропатии, ортостатической гипотензии, циклического запора, циклической диареи, тошноты, рвоты, пониженного потения, импотенции, замедленного опорожнения желудка, задержки мочевыделения, недержания мочи, прогрессирующей кардиопатии, усталости, одышки, потери веса, отсутствия аппетита, онемения, ощущения покалывания, слабости, увеличенного языка, нефротического синдрома, застойной сердечной недостаточности, одышки при физической нагрузке, периферического отека, аритмий, учащенного сердцебиения, ощущения головокружения, обморока, постуральной гипотензии, проблемы периферических нервов, сенсорно-двигательной недостаточности, невропатии нижних конечностей, невропатии верхних конечностей, гиперальгезии, изменения восприятия температуры, слабости в нижних конечностях, кахексии, периферического отека, гепатомегалии, пурпуры, диастолической дисфункции, экстрасистолы желудочков, черепной невропатии, ослабления глубоких сухожильных рефлексов, амилоидных отложений в стекловидном теле, помутнения стекловидного тела, сухости глаз, глаукомы, зубчатого края зрачков, отечности ног вследствие удерживания воды.

В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой когнитивный симптом, выбранный из группы, состоящей из расстройства памяти, расстройства суждения и мышления, расстройства планирования, расстройства гибкости, расстройства абстрактного мышления, расстройства уяснения правил, расстройства инициирования адекватных действий, расстройства ингибирования неадекватных действий, расстройства кратковременной памяти, расстройства длительной памяти, паранойи, дезориентации, спутанности сознания, галлюцинаций и деменции. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой психиатрический симптом, выбранный из группы, состоящей из деменции; тревожного состояния, депрессии, притупленного аффекта, эгоцентризмов, агрессии, компульсивного поведения, раздражительности, изменений личности, включая расстройства памяти, суждения и мышления, и суицидальное мышление.

В определенных вариантах воплощения, симптом является, по меньшей мере, одним из, по меньшей мере, одного физического симптома, по меньшей мере, одного когнитивного симптома, по меньшей мере, одного психиатрического симптома и, по меньшей мере, одного периферического симптома.

В определенных вариантах воплощения, физический симптом выбирают из группы, состоящей из беспокойства, отсутствия координации, непреднамеренно инициируемых движений, непреднамеренно незавершенных движений, неустойчивой походки, хореи, ригидности, извивающихся движений, аномального положения тела, неустойчивости, аномального выражения лица, затрудненного жевания, затрудненного глотания, затрудненного разговора, эпилептического припадка и нарушений сна.

В определенных вариантах воплощения, когнитивный симптом выбирают из группы, состоящей из расстройства памяти, расстройства суждения и мышления, расстройства планирования, расстройства гибкости, расстройства абстрактного мышления, расстройства уяснения правил, расстройства инициирования адекватных действий, расстройства ингибирования неадекватных действий, расстройства кратковременной памяти, расстройства длительной памяти, паранойи, дезориентации, спутанности сознания, галлюцинаций и деменции.

В определенных вариантах воплощения, психиатрический симптом выбирают из группы, состоящей из деменции; тревожного состояния, депрессии, притупленного аффекта, эгоцентризмов, агрессии, компульсивного поведения, раздражительности, изменений личности, включая расстройства памяти, суждения и мышления и суицидальное мышление.

В определенных вариантах воплощения, периферический симптом выбирают из группы, состоящей из уменьшенной массы головного мозга, мышечной атрофии, сердечной недостаточности, нарушенной толерантности к глюкозе, потери веса, остеопороза и тестикулярной атрофии.

Также предусматриваются способы и соединения для изготовления лекарственного средства для лечения, предотвращения или облегчения болезни, связанной с центральной нервной системой.

Определенные варианты воплощения предусматривают использование соединения, описанного тут, в производстве лекарственного средства для лечения, облегчения или предотвращения транстиретинового амилоидоза.

Определенные варианты воплощения предусматривают соединение, описанное тут, для использования при лечении, предотвращении или облегчении транстиретинового амилоидоза, описанного тут, с помощью комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапией, описанными тут. Агенты или терапии могут использоваться путем совместного или сопутствующего введения.

Определенные варианты воплощения предусматривают использование соединения, описанного тут, в производстве лекарственного средства для лечения, предотвращения или облегчения транстиретинового амилоидоза, описанного тут, с помощью комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапией, описанными тут. Агенты или терапии могут использоваться путем совместного или сопутствующего введения.

Определенные варианты воплощения предусматривают использование соединения, описанного тут, в производстве лекарственного средства для лечения, предотвращения или облегчения транстиретинового амилоидоза, описанного тут, у пациента, которому впоследствии вводится дополнительный агент или проводится терапия, описанные тут.

Определенные варианты воплощения предусматривают набор для лечения, предотвращения или облегчения транстиретинового амилоидоза, описанного тут, включающий:

(i) соединение, описанное тут; и, альтернативно

(ii) дополнительный агент или терапию, описанные тут.

Набор, описанный тут, может дополнительно включать инструкции по использованию набора для лечения, предотвращения или облегчения транстиретинового амилоидоза, описанного тут, с помощью комбинированной терапии, описанной тут.

Антисмысловые соединения

Олигомерные соединения включают, без ограничений, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, олигонуклеотидные аналоги, олигонуклеотидные миметики, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и siPHK. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, что означает его способность к гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой посредством образования водородной связи.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение имеет последовательность нуклеооснований, которая, при записи в направлении от 5'- к 3'-концу, включает обратный комплемент сегмента-мишени целевой нуклеиновой кислоты, на которую оно нацелено. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловой олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, которая, при записи в направлении от 5'- к 3'-концу, включает обратный комплемент сегмента-мишени целевой нуклеиновой кислоты, на который он нацелен.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержит в длину от 12 до 30 нуклеотидов. Другими словами, антисмысловые соединения представляют собой от 12 до 30 связанных нуклеооснований. В других вариантах воплощения, антисмысловое соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из от 8 до 80, от 12 до 50, от 12 до 30, от 15 до 30, от 18 до 24, от 18 до 21, от 19 до 22 или 20 связанных нуклеооснований. В таких определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных нуклеооснований в длину, или интервала, образованного любыми двумя из вышеуказанных значений.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение содержит укороченный или усеченный модифицированный олигонуклеотид. Укороченный или усеченный модифицированный олигонуклеотид может иметь делецию одного нуклеозида на 5'-конце (5'-усеченный) или, альтернативно, на 3'-конце (3'-усеченный). Укороченный или усеченный олигонуклеотид может иметь делецию двух нуклеозидов на 5'-конце или, альтернативно, может иметь делецию двух субъединиц на 3'-конце.

Альтернативно, делеции нуклеозидов могут быть разбросаны по модифицированному олигонуклеотиду, например, в антисмысловом соединении, имеющем делецию одного нуклеозида на 5'-конце и делецию одного нуклеозида на 3'-конце.

В случае присутствия одного дополнительного нуклеозида в удлиненном олигонуклеотиде, дополнительный нуклеозид могут быть расположен на 5'- или 3'-конце олигонуклеотида. В случае присутствия двух или больше дополнительных нуклеозидов, добавленные нуклеозиды могут прилегать друг к другу, например, в олигонуклеотиде, имеющем два добавленных нуклеозида на 5'-конце (5'-аддиция) или, альтернативно, на 3'-конце (3'-аддиция) олигонуклеотида. Альтернативно, добавленные нуклеозиды могут быть разбросаны по антисмысловому соединению, например, в олигонуклеотиде, имеющем один добавленный нуклеозид на 5'-конце и одну добавленную субъединицу на 3'-конце.

Возможно увеличение или уменьшение длины антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или введение неспаривающихся оснований без потери активности. Например, в работе Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), ряд антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеооснований были протестированы на их способность индуцирования расщепления РНК-мишени в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеооснований с 8 или 11 неспаривающимися основаниями возле концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны управлять специфическим расщеплением РНК-мишени, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие неспаривающихся оснований. Аналогично, специфическое расщепление мишени достигалось при использовании антисмысловых олигонуклеотидов из 13 нуклеооснований, включая содержащие 1 или 3 неспаривающихся оснований.

Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, имеющего 100% комплементарности к мРНК bcl-2 и 3 неспаривающихся основания с мРНК bcl-xL, к снижению экспрессии как bcl-2, так и bcl-xL, in vitro и in vivo. Кроме того, этот олигонуклеотид продемонстрировал высокую противоопухолевую активность in vivo.

Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) провели испытания ряда тандемных антисмысловых олигонуклеотидов с 14 нуклеооснованиями и антисмысловых олигонуклеотидов из 28 и 42 нуклеооснований, состоящих из последовательности двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность останавливать трансляцию человеческой DHFR (дигидрофолатредуктаза) в анализе с использованием ретикулоцитов кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов с 14 нуклеооснованиями был способен сам ингибировать трансляцию, хотя и на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды с 28 или 42 нуклеооснованиями.

Мотивы антисмысловых соединений

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат химически модифицированные субъединицы, организованные в наборы или мотивы, для придания антисмысловому соединению таких свойств, как повышенная ингибирующая активность, повышенная афинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой или устойчивость к деградации in vivo нуклеазами.

Химерные антисмысловые соединения типично содержат, по меньшей мере, один участок, модифицированный таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к деградации нуклеазой, повышенное поглощение клетками, повышенную афинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой и/или повышенную ингибирующую активность. Второй участок химерного антисмыслового соединения может, необязательно, служить субстратом РНКазы Н клеточной эндонуклеазы, которая отщепляет нить РНК дуплекса РНК:ДНК.

Антисмысловые соединения, содержащие мотив гапмера, считаются химерными антисмысловыми соединениями. В гапмере внутренний участок, имеющий множество нуклеотидов или связанных нуклеозидов, поддерживающих расщепление РНКазой Н, расположен между внешними участками, содержащими множество нуклеотидов или связанных нуклеозидов, химически отличающихся от нуклеотидов или связанных нуклеозидов внутреннего участка. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего мотив гапмера, гэп-сегмент обычно служит субстратом эндонуклеазного расщепления, в то время как боковые сегменты содержат модифицированные нуклеозиды. В определенных вариантах воплощения, области гапмера дифференцируются по типам фрагментов Сахаров, составляющих каждый отличающийся участок. Типы фрагментов Сахаров, используемые для дифференциации областей гапмера, могут в некоторых вариантах воплощения включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать 2'-МОЕ и 2'-O-СН₃, наряду с другими) и модифицированные нуклеозиды с бициклическими сахарами (такие нуклеозиды, модифицированные бициклическими сахарами, могут включать вещества, имеющие мостик 4'-(СН₂)_n-O-2', где n=1 или n=2). Предпочтительно, каждый отличный участок содержит однотипные фрагменты Сахаров. Мотив "боковой фрагмент-гэп-сегмент-боковой фрагмент" часто описывают как "X-Y-Z", где "X" обозначает длину 5'-бокового участка, "Y" обозначает длину гэп-сегмента и "Z" обозначает длину 3'-бокового участка. В используемом тут значении, гапмер, описанный как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, чтобы гэп-сегмент непосредственно прилегал к каждому из 5'-бокового сегмента и 3'-бокового сегмента. Таким образом, отсутствуют промежуточные нуклеотиды между 5'-боковым сегментом и гэп-сегментом или гэп-сегментом и 3'-боковым сегментом. Любые антисмысловые соединения, описанные тут, могут содержать мотив гапмера. В некоторых вариантах воплощения, Х и Z являются одинаковыми, в других вариантах воплощения они различаются. В предпочтительном варианте воплощения, Y составляет от 8 до 15 нуклеотидов. X, Y или Z могут иметь любое значение из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или больше нуклеотидов. Таким образом, гапмеры включают, без ограничений, например, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6 или 5-8-5.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение представляет собой мотив "вингмер", имеющий конфигурацию "боковой фрагмент-гэп-сегмент" или "гэп-сегмент-боковой фрагмент", т.е. конфигурацию X-Y или Y-Z, как описано выше для конфигурации гапмера. Таким образом, конфигурации типа вингмер включают, без ограничений, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 1O-3, 2-10, 1-10,8-2, 2-13 или 5-13.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат мотив гапмера 5-10-5.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат мотив гапмера 6-8-6.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат мотив гапмера 5-8-5.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение, нацеленное на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержит "расширенный за счет гэпа" мотив.

В определенных вариантах воплощения, расширенный за счет гэпа антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, имеет гэп-сегмент из десяти 2'-дезоксирибонуклеотидов, непосредственно прилегающий к и расположенный между боковыми сегментами из пяти химически модифицированных нуклеозидов. В определенных вариантах воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-сахара. В другом варианте воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-МОЕ сахара.

В определенных вариантах воплощения, расширенный за счет гэпа антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, имеет гэп-сегмент из восьми 2'-дезоксирибонуклеотидов, непосредственно прилегающий к и расположенный между боковыми сегментами из пяти химически модифицированных нуклеозидов. В определенных вариантах воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-сахара. В другом варианте воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-МОЕ сахара.

В определенных вариантах воплощения, расширенный за счет гэпа антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, имеет гэп-сегмент из восьми 2'-дезоксирибонуклеотидов, непосредственно прилегающий к и расположенный между боковыми сегментами из шести химически модифицированных нуклеозидов. В определенных вариантах воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-сахара. В другом варианте воплощения, химическая модификация включает модификацию 2'-МОЕ сахара.

Целевые нуклеиновые кислоты, участки и нуклеотидные последовательности-мишени

В определенных вариантах воплощения, транстиретиновая нуклеиновая кислота представляет собой любую из последовательностей, описанных в № доступа GENBANK^® NM_000371.2, впервые депонированных в GENBANK^® 13 февраля 2008 года (включена сюда как SEQ ID NO:1), №доступа GENBANK^® NT_010966.10, усеченная от нуклеотидов 2009236-2017289, впервые депонированная в GENBANK^® 1 августа 2002 года (включена сюда как SEQ ID NO:2); экзоны 1-4, выделенные из геномной последовательности макака-резуса №доступа GENBANK^® NW_001105671.1, на основании сходства с экзонами человека; и № доступа GENBANK^® NW_001105671.1, усеченная от нуклеотидов 62800O-638000 (включена сюда как SEQ ID NO:4), впервые депонированная в GENBANK^® 28 марта 2006 года.

Подразумевается, что последовательности, описанные в каждом SEQ ID NO в приведенных тут Примерах, являются независимыми от любых модификаций фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеооснования. Фактически, антисмысловые соединения, определенные SEQ ID NO, могут содержать, независимо, одну или несколько модификаций фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеооснования. Антисмысловые соединения, описанные по Номерам Isis (Isis No) или № ISIS, указывают комбинацию последовательности нуклеооснований и мотива.

В определенных вариантах воплощения, участок-мишень представляет собой структурно определенную область целевой нуклеиновой кислоты. Например, участок-мишень может охватывать 3'-UTR (нетранслируемая область), 5'-UTR, экзон, интрон, сочленение экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области транстиретина могут быть получены по номерам доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена сюда в качестве ссылок. В определенных вариантах воплощения, участок-мишень может охватывать последовательность от 5'-концевого сайта-мишени одного целевого сегмента участка-мишени до 3'-концевого сайта-мишени другого целевого сегмента участка-мишени.

Нацеливание включает определение, по меньшей мере, одного целевого сегмента, с которым гибридизуется антисмысловое соединение с возникновением желательного эффекта. В определенных вариантах воплощения, желательный эффект представляет собой снижение уровней мРНК целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, желательный эффект представляет собой снижение уровней белка, кодируемого целевой нуклеиновой кислотой, или фенотипическое изменение, ассоциированное с целевой нуклеиновой кислотой.

Участок-мишень может содержать один или несколько целевых сегментов. Множество целевых сегментов участка-мишени могут быть перекрывающимися. Альтернативно, они могут быть неперекрывающимися. В определенных вариантах воплощения, целевые сегменты участка-мишени разделены не более чем примерно 300 нуклеотидами. В определенных вариантах воплощения, целевые сегменты участка-мишени разделены числом нуклеотидов, составляющим, составляющим примерно, составляющим не более чем, составляющим не более чем примерно, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, или представляющим собой интервал, определенный любыми двумя из предшествующих значений. В определенных вариантах воплощения, целевые сегменты участка-мишени разделены не более чем, или не более чем примерно, 5 нуклеотидами целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах воплощения, целевые сегменты являются смежными. Предусматриваются участки-мишени, определенные интервалом, имеющим в качестве начальной нуклеиновой кислоты любую из 5'-концевых сайтов-мишеней или 3'-концевых сайтов-мишеней, указанных тут.

Пригодные целевые сегменты могут присутствовать в 5'-UTR, кодирующей области, 3'-UTR, интроне, экзоне или сочленении экзон/интрон. Целевые сегменты, содержащие инициирующий кодон или терминирующий кодон, также являются пригодными целевыми сегментами. Пригодный целевой сегмент может специфически исключать определенную структурно определенную область, такую как инициирующий кодон или терминирующий кодон.

Определение пригодных целевых сегментов может включать сравнение последовательности целевой нуклеиновой кислоты с другими последовательностями генома. Например, алгоритм BLAST может быть использован для идентификации областей подобия в разных нуклеиновых кислотах. Это сравнение может предотвратить выбор последовательностей антисмыслового соединения, которые могут неспецифично гибридизоваться с последовательностями, отличными от выбранной целевой нуклеиновой кислоты (т.е., нецелевыми или не являющимися мишенями последовательностями).

Могут наблюдаться изменения активности (например, определяемой по проценту снижения уровней целевой нуклеиновой кислоты) антисмысловых соединений в активном участке-мишени. В определенных вариантах воплощения, снижения уровней мРНК транстиретина указывают на ингибирование экспрессии транстиретина. Снижение уровней белка транстиретина также указывает на ингибирование экспрессии мРНК-мишени. Кроме того, фенотипические изменения указывают на ингибирование экспрессии транстиретина. Например, могут проводиться анализы для определения увеличения размера головного мозга до нормального, улучшения координации движений, уменьшения постоянных мышечных спазмов (дистонии), снижения раздражительности и/или тревожного состояния, улучшения памяти или увеличения активности, в числе других фенотипических изменений. Другие фенотипические показатели, например, симптомы, ассоциированные с транстиретиновым амилоидозом, также могут быть определены, как описано ниже.

Гибридизация

В некоторых вариантах воплощения, происходит гибридизация между антисмысловым соединением, раскрытым тут, и транстиретиновой нуклеиновой кислотой. Наиболее распространенный механизм гибридизации включает водородные связи (например, Уотсона-Крика, Хугстиновские или обращенные Хугстиновские водородные связи) между комплементарными нуклеооснованиями молекул нуклеиновой кислоты.

Гибридизация может протекать при различных условиях. Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновой кислоты, подлежащих гибридизации.

Способы определения того, является ли последовательность специфически гибридизуемой с целевой нуклеиновой кислотой, хорошо известны специалистам. В определенных вариантах воплощения, предусматриваемые тут антисмысловые соединения являются специфически гибридизующимися с транстиретиновой нуклеиновой кислотой.

Комплементарность

Антисмысловое соединение и целевая нуклеиновая кислота являются комплементарными друг к другу, если достаточное число нуклеооснований антисмыслового соединения могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеооснованиями целевой нуклеиновой кислоты, так чтобы достигался желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование целевой нуклеиновой кислоты, такой как транстиретиновая нуклеиновая кислота).

Антисмысловое соединение может гибридизироваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты транстиретина таким образом, что промежуточные или прилегающие сегменты не будут принимать участия в событии гибридизации (например, структура петли, дефект спаривания или структура шпильки).

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, предусматриваемые тут, или их определенный участок, являются комплементарными или, по меньшей мере, на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарными к транстиретиновой нуклеиновой кислоте, участку-мишени, целевому сегменту или их определенному участку. Процент комплементарности антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой может быть определен с использованием обычных способов.

Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеооснований антисмыслового соединения являются комплементарными к участку-мишени и будут поэтому специфически гибрид изоваться, будут составлять 90 процентов комплементарности. В этом примере, остальные некомплементарные нуклеооснования могут быть сгруппированы или перемежаться с комплементарными нуклеооснованиями и не должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеооснованиями. Фактически, антисмысловое соединение, имеющее 18 нуклеооснований в длину и 4 (четыре) некомплементарных нуклеооснования, фланкируемых двумя участками полной комплементарности с целевой нуклеиновой кислотой, будет иметь 77,8% общей комплементарности с целевой нуклеиновой кислотой и, таким образом, будет входить в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью целевой нуклеиновой кислоты может быть определен в установленном порядке с использованием программ BLAST (от английского "basic local alignment search tools" - инструмент поиска базового локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных специалистам (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность или комплементарность последовательностей, могут быть определены, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием параметров по умолчанию, которая использует алгоритм Смита-Уотермана (Smith and Waterman) (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, предусматриваемые тут, или их определенные участки, являются полностью комплементарными (т.е. 100% комплементарными) к целевой нуклеиновой кислоте, или их определенному участку. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным к транстиретиновой нуклеиновой кислоте или участку-мишени или целевому сегменту или его последовательности-мишени. В используемом тут значении, "полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеооснование антисмыслового соединения способно к точному спариванию с соответствующими нуклеооснованиями целевой нуклеиновой кислоты. Например, антисмысловое соединение из 20 нуклеооснований является полностью комплементарным к последовательности-мишени длиной 400 нуклеооснований, если существует соответствующий участок из 20 нуклеооснований целевой нуклеиновой кислоты, полностью комплементарный к антисмысловому соединению. Полностью комплементарный также может использоваться по отношению к определенному участку первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, участок из 20 нуклеооснований антисмыслового соединения, состоящего из 30 нуклеооснований, может быть "полностью комплементарным" к целевой последовательности длиной 400 нуклеооснований. Участок из 20 нуклеооснований олигонукпеотида, содержащего 30 нуклеооснований, является полностью комплементарным к целевой последовательности, если целевая последовательность содержит соответствующий участок из 20 нуклеооснований, в котором каждое нуклеооснование является комплементарным к участку из 20 нуклеооснований антисмыслового соединения. Одновременно, антисмысловое соединение в целом, содержащее 30 нуклеооснований, может быть или не быть полностью комплементарным к целевой последовательности, в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеооснований антисмыслового соединения также комплементарными к целевой последовательности.

Некомплементарное нуклеооснование может находиться на 5'-конце или 3'-конце антисмыслового соединения. Альтернативно, некомплементарное нуклеооснование или нуклеооснования могут быть расположены во внутренней части антисмыслового соединения. В случае присутствия двух или больше некомплементарных нуклеооснований, они могут быть смежными (т.е. связанными) или несмежными. В одном варианте воплощения, некомплементарное нуклеооснование расположено в боковом сегменте гапмера антисмыслового олигонуклеотида.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, имеющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеооснований или значения до указанных, содержат не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 некомплементарное нуклеооснование (нуклеооснования) по сравнению с целевой нуклеиновой кислотой, такой как транстиретиновая нуклеиновая кислота или ее определенный участок.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, имеющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеооснований или значения до указанных, содержат не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 некомплементарное нуклеооснование (нуклеооснования) по сравнению с целевой нуклеиновой кислотой, такой как транстиретиновая нуклеиновая кислота или ее определенный участок.

Антисмысловые соединения, предусматриваемые тут, также включают соединения, которые являются комплементарными к участку целевой нуклеиновой кислоты. В используемом тут значении, "участок" относится к определенному числу смежных (т.е. связанных) нуклеооснований внутри области или сегмента целевой нуклеиновой кислоты. "Участок" может также относиться к определенному числу смежных нуклеооснований антисмыслового соединения. В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения являются комплементарными к состоящему из, по меньшей мере, 8 нуклеооснований участку целевого сегмента. В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения являются комплементарными к состоящему из, по меньшей мере, 12 нуклеооснований участку целевого сегмента. В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения являются комплементарными к состоящему из, по меньшей мере, 15 нуклеооснований участку целевого сегмента. Также предусматриваются антисмысловые соединения, которые являются комплементарными к участку целевого сегмента, состоящему из, по меньшей мере, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше нуклеооснований, или величины, находящейся в интервале, определенном любыми двумя из этих значений.

Идентичность

Антисмысловые соединения, предусматриваемые тут, могут также иметь определенный процент идентичности с конкретной нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO или соединением, представленным определенным номером Isis, или его участком. В используемом тут значении, антисмысловое соединение является идентичным с последовательностью, раскрытой тут, если оно обладает такой же способностью к спариванию нуклеооснований. Например, РНК, содержащая урацил вместо тимидина в раскрытой последовательности ДНК, будет считаться идентичной с последовательностью ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин спариваются с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, описанные тут, а также соединения, содержащие неидентичные основания по сравнению с антисмысловыми соединениями, предусматриваемыми тут. Неидентичные основания могут прилегать друг к другу или быть разбросаны по антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают по числу оснований, демонстрирующих идентичное спаривание оснований по сравнению с последовательностью, с которой оно сравнивается.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения или их участки являются, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными с одним или несколькими антисмысловыми соединениями или SEQ ID NO или их участками, раскрытыми тут.

Модификации

Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Часть нуклеозида, представляющая собой нуклеооснование (также называемое основанием), обычно является фрагментом гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, дополнительно включающие фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. В случае нуклеозидов, включающих пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильной группой сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством образования ковалентной связи прилегающих нуклеозидов друг с другом, с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. Обычно говорят, что, в структуре олигонуклеотида, фосфатные группы образуют межнуклеозидные связи олигонуклеотида.

Модификации антисмыслового соединения охватывают замещения или изменения межнуклеозидных связей, фрагментов Сахаров или нуклеооснований. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются предпочтительными по сравнению с нативными формами вследствие таких желательных свойств, как, например, повышенное поглощение клетками, повышенная афинность к целевой нуклеиновой кислоте, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.

Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для повышения афинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его целевой нуклеиновой кислотой. Вследствие этого, сравнимые результаты часто могут быть получены при использовании более коротких антисмысловых соединений, содержащих такие химически модифицированные нуклеозиды.

Модифицированные межнуклеозидные связи

Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой фосфодиэфирную связь 3'- и 5'-концов. Антисмысловые соединения, содержащие одну или несколько модифицированных, т.е. не встречающихся в природе, межнуклеозидных связей, часто выбирают как предпочтительные по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими встречающиеся в природе межнуклеозидные связи вследствие таких желательных свойств, как, например, повышенное поглощение клетками, повышенная афинность к целевым нуклеиновым кислотам и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, сохраняющие атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, не содержащие атом фосфора. Типичные примеры фосфорсодержащих межнуклеозидных связей включают, без ограничений, фосфодиэфирные, фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные и фосфоротиоатные. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфора связей хорошо известны.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах воплощения, модифицированные межнуклеозидные связи являются фосфоротиоатными связями. В определенных вариантах воплощения, все межнуклеозидные связи антисмыслового соединения представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Модифицированные фрагменты сахаров

Антисмысловые соединения по изобретению могут необязательно содержать один или несколько нуклеозидов с модифицированной сахарной группой. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут обеспечивать повышенную устойчивость к действию нуклеазы, повышенную афинность связывания или некоторые другие благоприятные биологические свойства антисмысловых соединений. В определенных вариантах воплощения, нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозных колец. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничений, добавление групп заместителей (включая замещающие группы в 5'- и 2'-положениях), образование мостиковых связей между негеминальными атомами кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БНК), замещение атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R₁)(R₂) (R, R₁ и R₂ каждый независимо обозначают Н, C₁-C₁₂ алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных Сахаров включают 2'-F-5'-метилзамещенный нуклеозид (см. Международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где раскрыты другие 5',2'-бисзамещенные нуклеозиды), или замещение атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную Патентную заявку США US2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, альтернативно, 5'-замещение БНК (см. Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой LNA (замкнутая нуклеиновая кислота) замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).

Примеры нуклеозидов, содержащих модифицированные фрагменты Сахаров, включают без ограничений, нуклеозиды, включающие 5'-винильные, 5'-метильные (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН₃, 2'-ОСН₂СН₃, 2'-OCH₂CH₂F и 2'-O(СН₂)₂OCH₃ замещающие группы. Заместитель в 2'-положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C₁-С₁₀ алкила, OCF₃, OCH₂F, O(СН₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n) и O-CH₂-C(=O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n), где каждый из R_l, R_m и R_n, независимо, обозначает Н или замещенный или незамещенный C₁-C₁₀ алкил.

В используемом тут значении, "бициклические нуклеозиды" относятся к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический фрагмент сахара. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничений, нуклеозиды, имеющие мостиковую связь между 4'- и 2'-атомами рибозильного кольца. В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, предусматриваемые тут, включают один или несколько бициклических нуклеозидов, содержащих 4'-2'-мостиковую связь. Примеры таких 4'-2' связанных бициклических нуклеозидов включают, без ограничений, одну из следующих формул: 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(CH₂)₂-O-2' (ENA (бициклические нуклеиновые кислоты с оксиэтиленовой связью)); 4'-СН(СН₃)-O-2' и 4'-СН(CH₂OCH₃)-O-2' (и их аналоги, см. Патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН₃)(СН₃)-O-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO/2009/006478, опубликованную 8 января 2009 года); 4'-СН₂-N(ОСН₃)-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO/2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 года); 4'-СН₂-O-N(СН₃)-2' (см. опубликованную Патентную заявку США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-CH₂-N(R)-O-2', где R обозначает Н, C₁-C₁₂ алкил или защитную группу (см. Патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-СН₂-С(Н)(СН₃)-2' (см. Chattopadhyaya et a/, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН₂-С(=СН₂)-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 года).

Дополнительные описания, касающиеся бициклических нуклеозидов, также можно найти в опубликованной литературе (см., например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; и Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Патенты США №№6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 7034133; 7053207; 7399845; 7547684; и 7696345; Публикации патентов США №US2008-0039618; US2009-0012281; Патенты США серийные №№60/989574; 61/026995; 61/026998; 61/056564; 61/086231; 61/097787; и 61/099844; опубликованные Международные заявки РСТ WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; и WO 2009/006478. Каждый из вышеупомянутых бициклических нуклеозидов может быть получен с одной или несколькими стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку РСТ PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).

В определенных вариантах воплощения, бициклические фрагменты Сахаров БНК-нуклеозидов включают, без ограничений, соединения, содержащие, по меньшей мере, одну мостиковую связь между 4'- и 2'-положениями пентофуранозильного фрагмента сахара, где такие мостиковые связи независимо включают 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -С(=Щ)-, -C(=NR_a)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- и -N(R_a)-;

где:

x равен О, 1 или 2;

n равен 1, 2, 3 или 4;

каждый из Ra и Rb, независимо, представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₅-C₂₀ арил, замещенный C₅-C₂₀ арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С₅-С₇ алициклический радикал, замещенный C₅-C₇ алициклический радикал, галоген, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)₂-J₁) или сульфоксил (S(=O)-J₁); и

каждый из J₁ и J₂, независимо, обозначает Н, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, С₅-С₂₀ арил, замещенный C₅-C₂₀ арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C₁-C₁₂ аминоалкил, замещенный C₁-C₁₂ аминоалкил или защитную группу.

В определенных вариантах воплощения, мостиковая связь бициклического фрагмента сахара представляет собой -[C(R_a)(R_b)]_n-, -[C(R_a)(R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-. В определенных вариантах воплощения, мостиковая связь представляет собой 4'-СН₂-2', 4'-(СН₂)₂-2', 4'-(СН₂)₂-2', 4'-СН₂-O-2', 4'-(СН₂)₂-O-2', 4'-СН₂-O-N(R)-2' и 4'-CH₂-N(R)-O-2'-, где каждый R, независимо, обозначает Н, защитную группу или C₁-C₁₂ алкил.

В определенных вариантах воплощения, бициклические нуклеозиды дополнительно определяются с помощью изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий 4'-2' оксиметиленовую мостиковую связь, может находиться в α-L-конфигурации или в β-D-конфигурации. Ранее, α-L-метиленоксидные (4'-СН₂-O-2') БНК были включены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые продемонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

В определенных вариантах воплощения, бициклические нуклеозиды включают, без ограничений, (А) α-L-метиленокси (4'-СН₂-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН₂-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(СН2)2-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-CH₂-O-N(R)-2') БНК, (Е) оксиамино (4'-CH₂-N(R)-O-2') БНК и (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН₃)-O-2') БНК, (G) метилентио (4'-CH₂-S-2') БНК, (Н) метиленамино (4'-CH₂-N(R)-2') БНК, (I) метилкарбоциклическую (4'-СН₂-СН(СН₃)-2') БНК и (J) пропилен-карбоциклическую (4'-(СН₂)₃-2') БНК, как изображено ниже.

где Вх обозначает фрагмент основания и R независимо обозначает Н, защитную группу или C₁-C₁₂ алкил.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу I:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

-Q_a-Q_b-Q_c- обозначает -CH₂-N(R_c)-CH₂-, -C(=O)-N(R_c)-CH₂-, -CH₂-O-N(R_c)-, -СН₂-N(R_c)-O- или -N(R_c)-O-CH₂;

R_c обозначает C₁-C₁₂ алкил или защиту аминогруппы; и

Т_а и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу II:

в которой:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой;

Z_a обозначает C₁-C₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, С₂-С₆ алкинил, замещенный C₁-C₆ алкил, замещенный C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тио.

В одном варианте воплощения, каждая из замещенных групп, независимо, является моно- или полизамещенной замещающими группами, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ_c, NJ_cJ_d, SJ_c, N₃, OC(=X)J_c и NJ_eC(=X)NJ_cJ_d, где каждый из J_c, J_d и J_e, независимо, обозначает Н, C₁-C₆ алкил или замещенный C₁-C₆ алкил, и Х обозначает О или NJ_c.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу III:

в которой:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой;

Z_b обозначает C₁-C₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, С₂-С₆ алкинил, замещенный C₁-C₆ алкил, замещенный C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу IV:

в которой:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой;

R_d обозначает C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный С₂-С₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный С₂-С₆ алкинил;

каждый из q_a, q_b, q_c и q_d, независимо, обозначает Н, галоген, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил, C₁-C₆ алкоксил, замещенный C₁-C₆ алкоксил, ацил, замещенный ацил, C₁-C₆ аминоалкил или замещенный C₁-C₆ аминоалкил;

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу V:

в которой:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой;

q_a, q_b, q_e и q_f каждый независимо обозначают водород, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкокси, замещенный C₁-C₁₂ алкокси, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k;

или q_e и q_f вместе обозначают=C(q_g)(q_h);

q_g и q_h каждый независимо обозначают Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

Синтез и получение мономеров метиленокси (4'-СН₂-O-2') БНК аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила, вместе с их олигомеризацией и способностью распознавания нуклеиновой кислоты были описаны (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). БНК и их получение также описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.

Были получены аналоги метиленокси (4'-CH₂-O-2') БНК и 2'-тио-БНК (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Получение замкнутых нуклеозидных аналогов, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы как субстраты полимераз нуклеиновой кислоты также было описано (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, синтез 2'-амино-БНК, нового конформационно ограниченного высокоафинного олигонуклеотидного аналога, был описан в литературе (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Дополнительно, были получены 2'-амино- и 2'-метиламино-БНК и термическая стабильность их дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК были ранее описаны.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу VI:

в которой:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

T_a и T_b каждый независимо обозначают Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, группу с реакционноспособным фосфором, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентную связь с подложкой;

каждый из q_i, q_j, q_k и q_l, независимо, обозначает Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкоксил, замещенный C₁-C₁₂ алкоксил, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k; и

q_i и q_j или q_l и q_k вместе обозначают=C(q_g)(q_h), где q_g и q_h каждый независимо обозначают Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

Был описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, содержащий 4'-(СН₂)₃-2' мостиковую связь и алкенильный аналог мостиковой связи 4'-СН=СН-СН₂-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Был также описан синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).

В используемом тут значении, "4'-2' бициклический нуклеозид" или "от 4' до 2' бициклический нуклеозид" относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, включающее мостиковую связь, соединяющую два атома углерода фуранозного кольца - соединяющую 2'-атом углерода и 4'-атом углерода сахарного кольца.

В используемом тут значении, "моноциклические нуклеозиды" относятся к нуклеозидам, содержащим модифицированные фрагменты Сахаров, которые не являются бициклическими фрагментами Сахаров. В определенных вариантах воплощения, фрагмент сахара или аналог фрагмента сахара, нуклеозида может быть модифицированным или замещенным в любом положении.

В используемом тут значении, "2'-модифицированный сахар" означает фуранозильный сахар, модифицированный в 2'-положении. В определенных вариантах воплощения, такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенида, включая, без ограничений, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В определенных вариантах воплощения, 2'-модификации выбирают из заместителей, включая, без ограничений: O[(СН₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(СН₂)_nCH₃, O(CH₂)_nF, O(CH₂)_nONH₂, ОСН₂С(=O)N(Н)СН₃ и O(СН₂)_nON[(СН₂)_nCH₃]₂, где n и m имеют значения от 1 до примерно 10. Другие 2'-замещающие группы также могут быть выбраны из: C₁-C₁₂ алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила или O-аралкила, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, F, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, группы, расщепляющей РНК, репортерной группы, интеркалятора, группы, улучшающей фармакокинетические свойства, или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и другие заместители, имеющие подобные свойства. В определенных вариантах воплощения, модифицированные нуклеозиды содержат 2'-МОЕ боковую цепь (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такое 2'-МОЕ замещение было описано как обладающее улучшенной афинностью связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Было также продемонстрировано, что олигонуклеотиды, содержащие 2'-МОЕ заместитель, являются антисмысловыми ингибиторами генной экспрессии с характеристиками, перспективными для использования in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 63O-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

В используемом тут значении, "модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид" или "модифицированный ТНР нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый "сахар", замещенный на пентофуранозильный остаток в нормальных нуклеозидах (суррогатный сахар). Модифицированные ТНР нуклеозиды включают, без ограничений, материалы, известные специалистам как гексит-нуклеиновая кислота (HNA), анитол-нуклеиновая кислота (ANA), маннит-нуклеиновая кислота (MNA) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), фтор-HNA (F-HNA) или соединения, имеющие Формулу VII:

в которой, независимо для каждого из указанных, по меньшей мере, одного тетрагидропиранового нуклеозидного аналога Формулы VII:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b каждый независимо обозначают межнуклеозидную связующую группу, соединяющую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т_а и T_b представляет собой межнуклеозидную связующую группу, соединяющую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, и другой из Т_а и T_b обозначает Н, защитную группу гидроксила, связанную группу с сопряженными связями или 5'- или 3'-терминальную группу;

q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ каждый независимо обозначают Н, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, замещенный С₂-С₆ алкенил, С₂-С₆ алкинил или замещенный С₂-С₆ алкинил; и каждый из R₁ и R₂, выбирают из водорода, гидроксила, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN, где Х обозначает О, S или NJ₁ и каждый из J₁, J₂ и J₃, независимо, обозначают Н или C₁-C₆ алкил.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются модифицированные ТНР нуклеозиды Формулы VII, в которой q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ все обозначают Н. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ отличается от Н. В определенных вариантах воплощения, по меньшей мере, один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ является метилом. В определенных вариантах воплощения, предусматриваются ТНР нуклеозиды Формулы VII, в которой один из R₁ и R₂ представляет собой фтор. В определенных вариантах воплощения, R₁ обозначает фтор и R₂ обозначает Н; R₁ обозначает метокси и R₂ обозначает Н и R₁ обозначает Н и R₂ обозначает метоксиэтокси.

В используемом тут значении, "2'-модифицированный" или "2'-замещенный" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, имеющий в 2'-положении заместитель, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды, включают, без ограничений, бициклические нуклеозиды, в которых мостиковая связь, соединяющая два атома углерода кольца сахара, соединяет 2'-углерод с другим атомом углерода кольца сахара; и нуклеозиды с немостиковыми 2'-заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, O-аллил, O-C₁-C₁₀ алкил, -OCF₃, O-(СН₂)₂-O-СН₃, 2'-O(СН₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) или O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый из R_m и R_n независимо обозначает Н или замещенный или незамещенный C₁-C₁₀ алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, в других положениях сахара и/или в нуклеоосновании.

В используемом тут значении, "2'-F" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, имеющий группу фтора в 2'-положении.

В используемом тут значении, "2'-ОМе" или "2'-ОСН₃" или "2'-O-метил" все относятся к нуклеозиду, содержащему сахар, включающий группу -ОСН₃ в 2'-положении кольца сахара.

В используемом тут значении, "МОЕ" или "2'-МОЕ" или "2'-OCH₂CH₂OCH₃" или "2'-O-метоксиэтил" относятся все к нуклеозиду, содержащему сахар, имеющий группу -OCH₂CH₂OCH₃ в 2'-положении кольца сахара.

В используемом тут значении, "олигонуклеотид" относится к соединению, включающему множество связанных нуклеозидов. В определенных вариантах воплощения, один или несколько из множества нуклеозидов являются модифицированными. В определенных вариантах воплощения, олигонуклеотид включает один или несколько рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).

Специалистам также известны многие другие системы бицикло и трицикло суррогатных колец сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для включения в антисмысловые соединения (см., например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).

Такие кольцевые системы могут подвергаться различным дополнительным замещениям для увеличения активности.

Способы получения модифицированных Сахаров хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области.

В нуклеотидах, включающих модифицированные фрагменты Сахаров, фрагменты нуклеооснований (природных, модифицированных или их комбинаций) сохраняются для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения включают один или несколько нуклеозидов, имеющих модифицированные фрагменты Сахаров. В определенных вариантах воплощения, фрагмент модифицированного сахара представляет собой 2'-МОЕ. В определенных вариантах воплощения, модифицированные 2'-МОЕ нуклеозиды расположены в мотиве гапмера. В определенных вариантах воплощения, фрагмент модифицированного сахара представляет собой бициклический нуклеозид, содержащий (4'-СН(СН₃)-O-2')-мостиковую группу. В определенных вариантах воплощения, (4'-СН(СН₃)-O-2')-модифицированные нуклеозиды расположены в боковых сегментах мотива гапмера.

Модифицированные нуклеооснования

Модификации или замещения нуклеооснований (или оснований) являются структурно отличными от, но функционально взаимозаменяемыми с встречающимися в природе или синтетическими немодифицированными нуклеооснованиями. Как природные, так и модифицированные нуклеооснования способны участвовать в водородной связи. Такие модификации нуклеооснований могут придавать антисмысловым соединениям устойчивость к нуклеазам, афинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. Модифицированные нуклеооснования включают синтетические и природные нуклеооснования, такие как, например, 5-метилцитозин (5-Ме-С). Определенные замещения нуклеооснований, включая 5-метилцитозиновые замещения, являются особенно пригодными для повышения афинности связывания антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой. Например, было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278).

Дополнительные немодифицированные нуклеооснования включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил (-С=С-СН₃) урацил и цитозин, и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, особенно, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Р-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-дезазагуанин и 7-дезазааденин и 3-дезазагуанин и 3-дезазааденин.

Фрагменты гетероциклического основания могут также включать материалы, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено другими гетероциклами, например, 7-дезазааденин, 7-дезазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Нуклеооснования, являюициеся особенно пригодными для повышения афинности связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.

В определенных вариантах воплощения, антисмысловые соединения, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, включают одно или несколько модифицированных нуклеооснований. В определенных вариантах воплощения, расширенные за счет гэпа антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, содержат одно или несколько модифицированных нуклеооснований. В определенных вариантах воплощения, модифицированное нуклеооснование представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах воплощения, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

Композиции и способы приготовления фармацевтических композиций

Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым активным или инертным веществом для приготовления фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, включая, без ограничений, путь введения, степень развития болезни или доза, которая должна быть введена.

Антисмысловое соединение, нацеленное на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, может быть использовано в фармацевтической композиции путем объединения антисмыслового соединения с пригодным фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буфер (PBS). PBS представляет собой разбавитель, пригодный для использования в композициях для парентеральной доставки. Соответственно, в одном варианте воплощения, в описанных тут способах используется фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловое соединение, нацеленное на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В определенных вариантах воплощения, фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS. В определенных вариантах воплощения, антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом.

Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, который, при введении животному, включая человека, способен обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, изобретение охватывает фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Пригодные фармацевтически приемлемые соли включают, без ограничений, соли натрия и калия.

Пролекарство может включать введение дополнительных нуклеозидов на одном или на обоих концах антисмыслового соединения, которые отщепляются эндогенными нуклеазами в организме, с образованием активного антисмыслового соединения.

Конъюгированные антисмысловые соединения

Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или несколькими фрагментами или конъюгатами, которые увеличивают активность, распределение в клетках или поглощение клетками образующихся антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные конъюгированные группы включают холестериновые фрагменты и липидные фрагменты. Дополнительные конъюгированные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеин, родамины, кумарины и красители.

Антисмысловые соединения также могут быть модифицированы таким образом, чтобы они содержали одну или несколько стабилизирующих групп, обычно присоединенных к одному или к обоим концам антисмысловых соединений для усиления таких свойств, как, например, устойчивость к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэп-структуры. Такие терминальные модификации защищают антисмысловое соединение, содержащее терминальную нуклеиновую кислоту, от деградации экзонуклеазой и могут способствовать доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп) или может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны специалистам и включают, например, лишенные оснований инвертированные дезокси-кэпы. Дополнительные 3'- и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы в качестве кэпов на одном или обоих концах антисмыслового соединения для придания устойчивости к нуклеазам, включают раскрытые в WO 03/004602, опубликованном 16 января 2003 года.

Культуры клеток и обработка антисмысловыми соединениями

Эффекты антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию транстиретиновых нуклеиновых кислот могут быть определены in vitro для различных типов клеток. Типы клеток, используемые для таких анализов, являются доступными от коммерческих поставщиков (например, Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection), Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) и клетки культивируют в соответствии с инструкциями поставщика с использованием коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Иллюстративные примеры типов клеток включают, без ограничений, клетки HepG2, клетки НерЗВ, первичные гепатоциты, клетки А549, фибробласты GM04281 и клетки LLC-MK2.

Испытания антисмысловых олигонуклеотидов in vitro

В данном изобретении описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть соответствующим образом модифицированы для обработки другими антисмысловыми соединениями.

В общем, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают степени слияния приблизительно 60-80% в культуре.

Один из реагентов, обычно используемых для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает реагент для трансфекции катионными липидами LIPOFECTIN^® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN^® в OPTI-MEM^® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желательной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN^®, типично оставляющей от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает LIPOFECTAMINE 2000^® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000^® в среде OPTI-MEM^® 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE^®, типично составляющей от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает Cytofectin^® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Cytofectin^® в среде OPTI-MEM^® 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации Cytofectin^®, типично составляющей от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другая методика, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию.

Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами обычными способами. Клетки типично собирают через 16-24 часов после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, измеряя в это время уровни РНК или белка целевых нуклеиновых кислот способами, известными специалистам и описанными тут.Обычно, если обработка проводится с множеством параллельных экспериментов, данные представляют в виде среднего для параллельных экспериментов.

Используемая концентрация антисмыслового олигонуклеотида отличается для разных клеточных линий. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной клеточной линии хорошо известны специалистам. Антисмысловые олигонуклеотиды типично используются в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ при трансфекции с помощью LIPOFECTAMINE2000^®, Lipofectin или Cytofectin. Антисмысловые олигонуклеотиды используются в более высоких концентрациях, составляющих от 625 до 20000 нМ при трансфекции способом электропорации.

Выделение РНК

Анализ РНК может быть проведен для полной клеточной РНК или поли(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны специалистам. РНК готовят способами, хорошо известными специалистам, например, с использованием реагента TRIZOL^® (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с рекомендованными производителем протоколами.

Анализ ингибирования целевых уровней или экспрессии

Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты транстиретина можно оценить различными способами, известными специалистам. Например, уровни целевой нуклеиновой кислоты могут быть количественно определены, например, способом нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Анализ РНК может быть проведен на полной клеточной РНК или поли(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны специалистам. Нозерн-блоттинг также является обычной методикой в данной области техники. Количественная ПЦР в реальном масштабе времени может быть удобно проведена с использованием коммерчески доступной Системы детектирования последовательностей ABI PRIS М^® 7600, 7700 или 7900, поставляемой фирмой РЕ-Applied Biosystems, Foster City, CA в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ уровней РНК-мишени способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени

Количественное определение уровней РНК-мишеней может быть осуществлено способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени с использованием Системы детектирования последовательностей ABI PRISM^® 7600, 7700 или 7900 (РЕ-Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Способы количественной ПЦР в реальном масштабе времени хорошо известны специалистам.

Перед ПЦР в реальном масштабе времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (RT), в результате которой получают комплементарную ДНК (кДНК), используемую затем в качестве субстрата при амплификации в ходе ПЦР в реальном масштабе времени. Реакции с RT и ПЦР в реальном масштабе времени проводят последовательно в одной и той же лунке для образца. Реагенты RT и ПЦР в реальном масштабе времени были получены от фирмы Invitrogen (Carlsbad, CA). Реакции RT, ПЦР в реальном масштабе времени проводят способами, хорошо известными квалифицированным специалистам в данной области.

Количества гена (или РНК)-мишени, полученные в результате ПЦР в реальном масштабе времени нормируют или по уровню экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклофилин А, или путем количественного определения общей РНК с использованием RIBOGREEN^® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Экспрессию циклофилина А количественно определяют способом ПЦР в реальном масштабе времени, которую проводят одновременно с мишенью, с разделением каналов или отдельно. Общую РНК количественно определяют с помощью реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN^® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Способы количественного определения РНК с помощью RIBOGREEN^® описаны в Jones, L.J., et al, (Analitycal Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN^® используется инструмент CYTOFLUOR^® 4000 (РЕ Applied Biosystems).

Зонды и праймеры конструируются для гибридизации с транстиретиновой нуклеиновой кислотой. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном масштабе времени хорошо известны специалистам и могут включать использование программного обеспечения, такого как PRIMER EXPRESS^® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Анализ уровней белка

Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот транстиретина может быть оценено путем измерения уровней белка транстиретина. Уровни белка транстиретина можно оценить или количественно определить различными способами, хорошо известными специалистам, такими как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), количественные анализы белка, анализы белковой активности (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или активируемая флуоресценцией сортировка клеток (FACS). Антитела, нацеленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, Ml), или могут быть приготовлены обычными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известными специалистам. Антитела, пригодные для детектирования человеческого и крысиного транстиретина, являются коммерчески доступными.

Тестирование антисмысловых соединений In vivo

Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, испытывают на животных для оценки их способности ингибировать экспрессию транстиретина и продуцировать фенотипические изменения. Испытания могут проводиться на нормальных животных или на экспериментальных моделях болезней. Для введения животным, готовят композиции антисмысловых олигонуклеотидов в фармацевтически приемлемом разбавителе, таком как фосфатно-солевой буфер. Введение включает парентеральные пути введения. После периода лечения антисмысловыми олигонуклеотидами, выделяют РНК из ткани и измеряют изменения экспрессии транстиретиновой нуклеиновой кислоты. Также измеряют изменения уровней белка транстиретина.

Определенные соединения

Были проведены испытания приблизительно двухсот сорока шести заново разработанных антисмысловых соединений с различной длиной, мотивами и составом основной цепи с целью определения из влияния на мРНК транстиретина человека in vitro в нескольких типах клеток. Новые соединения сравнивали с примерно семьюдесятью девятью ранее сконструированными соединениями, включая ISIS №№304267, 304268, 304280, 304284, 304285, 304286, 304287, 304288, 304289, 304290, 304291, 304292, 304293, 304294, 304296, 304297, 304298, 304299, 304300, 304301, 304302, 304303, 304304, 304307, 304308, 304309, 304311 и 304312, которые были ранее определены как относящиеся к наиболее сильнодействующим антисмысловым соединениям in vitro (см., например, Публикации патентов США №№US2005/0244869 и US2009/0082300). Из примерно трехсот двадцати пяти заново разработанных и ранее сконструированных антисмысловых соединений, примерно пятнадцать соединений были выбраны для дальнейших исследований на основании их активности in vitro. Выбранные соединения испытывали на активность in vivo и переносимость в модели трансгенных мышей (см. Пример 10). Из пятнадцати испытанных соединений, одиннадцать были выбраны и подвергнуты испытаниям на системную переносимость (см. Пример 11) и измерения периода полувыведения в печени (см. Пример 12) у CD1 мышей, а также на системную переносимость (см. Пример 13) и фармакокинетическим исследованиям концентрации олигонуклеотида в печени (см. Пример 14) крыс Sprague-Dawley. По результатам этих исследований, семь соединений были подвергнуты испытаниям на доза-зависимое ингибирование и переносимость у трансгенных мышей (см. Пример 15). Кроме того, пятнадцать дополнительных соединений были выбраны из Таблицы 1 и были сконструированы шесть дополнительных соединений с различными мотивами с последовательностями, перекрывающимися с ISIS 420951, который демонстрировал высокую активность и переносимость в вышеописанных анализах. Эти дополнительные соединения сравнивали с ISIS 420951 по активности и переносимости у трансгенных мышей (см. Пример 16). На основании всех этих исследований (Примеры 10-16), было выбрано двадцать два соединения и подвергнуто испытаниям на системную переносимость у CD1 мышей (см. Пример 17). Семь соединений были признаны переносимыми в мышиной модели и дополнительно испытаны на системную переносимость у крыс Sprague-Dawley (см. Пример 18) и для проведения фармакокинетических исследований концентрации олигонуклеотида в печени и почке (см. Пример 19). Семь соединений также были испытаны на дозазависимую активность у трансгенных мышей (см. Пример 20).

Окончательный анализ этих исследований (Примеры 16-20) привел к выбору девяти соединений, имеющих последовательности нуклеооснований, соответствующие последовательностям, указанным в SEQ ID NO:25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. Благодаря комплементарности их последовательностей, соединения являются комплементарными к областям 505-524, 507-526, 508-527, 513-532, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 или 589-608 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, соединения, нацеленные на перечисленные области, как дополнительно описано тут, содержат модифицированный олигонуклеотид, включающий некоторую часть последовательности нуклеооснований, приведенной в SEQ ID NO, как дополнительно описано тут.В определенных вариантах воплощения, соединения, нацеленные на перечисленные области или включающие часть последовательности нуклеооснований, приведенной в перечисленных SEQ ID NO, могут иметь разную длину, как дополнительно описано тут, и могут иметь один из различных мотивов, как дополнительно описано тут. В определенных вариантах воплощения, соединение, нацеленное на область или включающее часть последовательности нуклеооснований, приведенной в перечисленных SEQ ID NO, имеет определенную длину и мотив, указанные номерами ISIS: ISIS 304299, ISIS 420913, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 или ISIS 420959.

Девять соединений, включающие последовательность нуклеооснований из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124, были подвергнуты дополнительным испытаниям на дозазависимое ингибирование в первичных гепатоцитах яванского макака (см. Пример 21). Эти соединения также были испытаны на оптимальную вязкость (Пример 22). Также оценили период полувыведения в печени CD1 мышей семи из соединений, включающих последовательность нуклеооснований из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:78, 86, 87, 115, 120 и 124 (Пример 23).

Окончательный анализ этих исследований (Примеры 1-23), привел к выбору восьми соединений, включающих последовательность нуклеооснований из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124. Вследствие комплементарности их последовательностей, соединения являются комплементарными к областям 504-523, 505-524, 512-531, 513-532, 577-596, 582-601, 584-603 и 586-605 SEQ ID NO:1. В определенных вариантах воплощения, соединения, нацеленные на перечисленные области, как дополнительно описано тут, содержат модифицированный олигонуклеотид, включающий некоторую часть последовательности нуклеооснований, приведенной в SEQ ID NO, как дополнительно описано тут, В определенных вариантах воплощения, соединения, нацеленные на перечисленные области или включающие часть последовательности нуклеооснований, приведенной в перечисленных SEQ ID NO, могут иметь разную длину, как дополнительно описано тут, и могут иметь один из различных мотивов, как дополнительно описано тут.В определенных вариантах воплощения, соединение, нацеленное на область или включающее часть последовательности нуклеооснований, приведенной в перечисленных SEQ ID NO, имеет конкретную длину и мотив, указанные номерами ISIS; ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 или ISIS 420959.

Эти восемь соединений были подвергнуты испытаниям на эффективность, фармакокинетический профиль и переносимость у яванского макака (Пример 24). Исследования ингибирования у этих обезьян показали, что лечение некоторыми из этих соединений вызывало высокую степень ингибирования mphkttr в печени. Конкретнее, лечение с использованием ISIS 420950, ISIS 420955 и ISIS 420915 вызывало 91%, 79% и 78% ингибирования, соответственно, по сравнению с контролем PBS. Было отмечено, что ISIS 420915 вызывал более сильное ингибирование мРНК TTR (78%) по сравнению с ISIS 304299 (59%), несмотря на то, что эти два олигонуклеотида отличаются друг от друга смещением на одну пару оснований их участка-мишени в SEQ ID NO:1. Анализ белка также дополнил результаты анализа рНК, причем лечение с использованием ISIS 420915 вызывало 76% ингибирования и лечение с использованием ISIS 304299 вызывало 47% ингибирования белка TTR по сравнению с контролем. Как ожидалось, уровни белка RBP4, как белка, ассоциированного с транстиретином, также должны снижаться после введения антисмысловых соединений. Уровни белка RBP4 снижались на 63% после введения ISIS 420915. Введение ISIS 304299 снижало уровни белка RBP4 на 19%. Дополнительно, ISIS 420915 имел лучшую переносимость, чем ISIS 304299, как показали исследования на обезьянах (Пример 24). Уровни трансаминазы у обезьян, получавших ISIS 304299 (ALT 81 IU/л и AST 101 IU/л), были выше, чем у получавших ISIS 420915 (ALT 68 IU/л и AST 62 IU/л). Уровни СЗ комплемента обезьян, получавших ISIS 304299 (96 мг/дл), были ниже, чем у обезьян, получавших ISIS 420915 (104 мг/дл).

Соответственно, предусматриваются антисмысловые соединения с любой одной или несколькими улучшенными характеристиками. В определенных вариантах воплощения предусматриваются соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, как дополнительно описано тут, нацеленный на или специфически гибридизуемый с областью нуклеотидов SEQ ID NO:1.

Соответственно, предусматриваются антисмысловые соединения с любой одной или несколькими улучшенными характеристиками. В определенных вариантах воплощения предусматриваются соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, как дополнительно описано тут, нацеленный на или специфически гибридизуемый с областью нуклеотидов SEQ ID NO:2.

Соответственно, предусматриваются антисмысловые соединения с любой одной или несколькими улучшенными характеристиками. В определенных вариантах воплощения предусматриваются соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, как дополнительно описано тут, нацеленный на или специфически гибридизуемый с областью нуклеотидов SEQ ID NO:4.

В определенных вариантах воплощения, соединения, описанные тут, являются эффективными, поскольку имеют значение, по меньшей мере, одного из in vitro ICao, равное менее 2,9 мкМ, менее 2,2 мкМ, менее 2,0 мкМ, менее 1,5 мкМ, менее 1,4 мкМ, менее 1,3 мкМ, менее 1,0 мкМ, менее 0,7 мкМ, менее 0,6 мкМ, при введении в клеточную линию гепатоцитов яванского макака с помощью электропорации, как описано в Примере 67. В определенных вариантах воплощения, соединения, описанные тут, имеют высокую степень переносимости, что видно по увеличению, по меньшей мере, одного из значений ALT или AST не более чем в 4 раза, в 3 раза или в 2 раза по сравнению с животными, получавшими солевой раствор; или по увеличению веса печени, селезенки или почки не более чем на 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% или 2%.

Некоторые показания

В определенных вариантах воплощения предусматриваются способы лечения индивида, включающие введение одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных тут. В определенных вариантах воплощения, индивид имеет болезнь, связанную с центральной нервной системой.

Как показано в примерах ниже, было продемонстрировано, что соединения, нацеленные на транстиретин, описанные тут, снижают тяжесть физиологических симптомов болезней, связанных с центральной нервной системой. В определенных экспериментах, соединения снижали скорость образования амилоидных бляшек, например, животные продолжали испытывать симптомы, но симптомы были менее тяжелыми по сравнению с животными, не получавшими лечения. В других экспериментах, однако, соединения, по-видимому, приводили к регенерации функции со временем; например, животные, получавшие лечение на протяжении более длительного периода времени, испытывали менее тяжелые симптомы, чем те, которым соединения вводились на протяжении более короткого периода времени. Способность соединений, указанных ниже, восстанавливать функцию, демонстрирует, таким образом, что симптомы болезни могут быть обращены с помощью лечения соединением, описанным тут.

Соответственно, предусматриваются способы облегчения симптома, ассоциированного с болезнью, связанной с центральной нервной системой, сердечной, невропатологической или желудочно-кишечной у нуждающегося в этом субъекта. В определенных вариантах воплощения предусматривается способ снижения частоты возникновения симптома, ассоциированного с болезнью, связанной с центральной нервной системой, сердечной, невропатологической или желудочно-кишечной. В определенных вариантах воплощения предусматривается способ снижения тяжести симптома, ассоциированного с болезнью, связанной с центральной нервной системой, сердечной, невропатологической или желудочно-кишечной. В таких вариантах воплощения, способы включают введение нуждающемуся в этом лицу терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на транстиретиновую нуклеиновую кислоту.

Транстиретиновый амилоидоз характеризуется многочисленными физическими, неврологическими, психиатрическими и/или периферическими симптомами. Любой симптом, который, как известно квалифицированному специалисту, ассоциирован с транстиретиновым амилоидозом, может быть облегчен или иным образом модулирован, как изложено выше в описанных выше способах. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой физический, когнитивный, психиатрический или периферический симптом. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой физический симптом, выбранный из группы, состоящей из беспокойства, отсутствия координации, нистагма, спастического парапареза, отсутствия мышечной координации, нарушения зрения, бессонницы, необычных ощущений, миоклонуса, слепоты, потери речи, кистевого туннельного синдрома, эпилептических припадков, субарахноидальных кровоизлияний, инсульта и кровотечения в головном мозге, гидроцефалии, атаксии и спастического паралича, комы, сенсорной невропатии, паратезии, гипестезии, моторной невропатии, автономной невропатии, ортостатической гипотензии, циклического запора, циклической диареи, тошноты, рвоты, пониженного потения, импотенции, замедленного опорожнения желудка, задержки мочевыделения, недержания мочи, прогрессирующей кардиопатии, усталости, одышки, потери веса, отсутствия аппетита, онемения, ощущения покалывания, слабости, увеличенного языка, нефротического синдрома, застойной сердечной недостаточности, одышки при физической нагрузке, периферического отека, аритмий, учащенного сердцебиения, ощущения головокружения, обморока, постуральной гипотензии, проблемы периферических нервов, сенсорно-двигательной недостаточности, невропатии нижних конечностей, невропатии верхних конечностей, гиперальгезии, изменения восприятия температуры, слабости в нижних конечностях, кахексии, периферического отека, гепатомегалии, пурпуры, диастолической дисфункции, экстрасистолы желудочков, черепной невропатии, ослабления глубоких сухожильных рефлексов, амилоидных отложений в стекловидном теле, помутнения стекловидного тела, сухости глаз, глаукомы, зубчатого края зрачков, отечности ног вследствие удерживания воды. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой когнитивный симптом, выбранный из группы, состоящей из расстройства памяти, расстройства суждения и мышления, расстройства планирования, расстройства гибкости, расстройства абстрактного мышления, расстройства уяснения правил, расстройства инициирования адекватных действий, расстройства ингибирования неадекватных действий, расстройства кратковременной памяти, расстройства длительной памяти, паранойи, дезориентации, спутанности сознания, галлюцинаций и деменции. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой психиатрический симптом, выбранный из группы, состоящей из деменции; тревожного состояния, депрессии, притупленного аффекта, эгоцентризмов, агрессии, компульсивного поведения, раздражительности, изменений личности, включая расстройства памяти, суждения и мышления и суицидальное мышление.

В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой беспокойство. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой отсутствие координации. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой нистагм. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой спастический парапарез. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой отсутствие мышечной координации. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой нарушение зрения. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой бессонницу. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой необычные ощущения. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой миоклонус.В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой слепоту. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой потерю речи. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой кистевой туннельный синдром. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой эпилептические припадки. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой субарахноидальные кровоизлияния. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой инсульт. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой кровотечение в головном мозге. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой гидроцефалию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой атаксию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой спастический паралич. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой кому. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой сенсорную невропатию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой паратезию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой гипестезию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой моторную невропатию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой автономную невропатию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ортостатическую гипотензию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой циклический запор. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой циклическую диарею. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой тошноту. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой рвоту. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой пониженное потение. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой импотенцию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой замедленное опорожнение желудка. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой задержку мочевыделения. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой недержание мочи. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой прогрессирующую кардиопатию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ощущение усталости. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой одышку. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой потерю веса. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой онемение. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ощущение покалывания. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ощущение слабости. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой увеличенный язык. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой нефротический синдром. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой застойную сердечную недостаточность. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой одышку при нагрузке. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой периферический отек. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой аритмии. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой учащенное сердцебиение. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ощущение головокружения. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой обморок. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой постуральную гипотензию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой проблему периферических нервов. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой сенсорно-двигательную недостаточность. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой невропатию нижних конечностей. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой невропатию верхних конечностей. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой гиперальгезию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой изменение восприятия температуры. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой слабость в нижних конечностях. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой кахексию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой отек. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой гепатомегалию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой пурпуру. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой диастолическую дисфункцию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой экстрасистолу желудочков. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой черепную невропатию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой ослабление глубоких сухожильных рефлексов. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой амилоидные отложения в стекловидном теле. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой помутнение стекловидного тела. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой сухость глаз. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой глаукому. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой зубчатый край зрачков. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой отечность ног вследствие удерживания воды.

В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство памяти. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство суждения и мышления. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство планирования. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство гибкости. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство абстрактного мышления. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство уяснения правил. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство инициирования адекватных действий. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство ингибирования неадекватных действий. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство кратковременной памяти. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой расстройство длительной памяти. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой паранойю. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой дезориентацию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой спутанность сознания. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой галлюцинации. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой деменцию.

В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой деменцию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой тревожное состояние. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой депрессию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой притупленный аффект.В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой эгоцентризмы. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой агрессию. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой компульсивное поведение. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой раздражительность. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой изменения личности. В определенных вариантах воплощения, симптом представляет собой суицидальное мышление.

В определенных вариантах воплощения, предусматриваются способы лечения индивида, включающие введение одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных тут.В определенных вариантах воплощения, индивид имеет болезнь, связанную с центральной нервной системой.

В определенных вариантах воплощения, введение антисмыслового соединения, нацеленного на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, приводит к снижению экспрессии транстиретина на, по меньшей мере, примерно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений.

В определенных вариантах воплощения, фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, нацеленное на транстиретин, используются для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от или восприимчивого к болезни, связанной с центральной нервной системой.

В определенных вариантах воплощения, способы, описанные тут, включают введение соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, содержащий участок смежных нуклеооснований, как описано тут, из последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 и 124.

Введение

В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции, описанные тут, могут быть введены рядом способов, в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от участка, лечение которого должно проводиться. Введение может быть местным, легочным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая с помощью распылителя; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Соединения и композиции, описанные тут, могут быть введены таким образом, чтобы они были нацелены на определенную ткань, такую как печень или головной мозг.

В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции, описанные тут, вводятся парентерально. "Парентеральное введение" означает введение путем инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, интраартериальное введение, интраперитонеальное введение или внутричерепное введение, например, внутримозговое введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, вентрикулярное введение, интрацеребровентрикулярное введение, церебральное интравентрикулярное введение или церебрально-вентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным или хроническим или кратковременным или прерывистым.

В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение осуществляется путем инфузии. Инфузия может быть хронической или непрерывной или кратковременной или прерывистой. В определенных вариантах воплощения, вливаемые фармацевтические агенты доставляются с помощью насоса. В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение осуществляется путем инъекции.

В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение является подкожным.

В дополнительных вариантах воплощения, композиция для введения представляет собой соединения, описанные тут, и солевой раствор.

В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции доставляются в ЦНС. В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции доставляются в спинномозговую жидкость. В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции вводятся в паренхиму головного мозга. В определенных вариантах воплощения, соединения и композиции доставляются животному во множество областей центральной нервной системы (например, во множество областей головного мозга и/или в спинной мозг) путем интратекального введения или интрацеребровентрикулярного введения. Широкое распределение соединений и композиций, описанных тут, в центральной нервной системе может быть достигнуто при интрапаренхимальном введении, интратекальном введении или интрацеребровентрикулярном введении.

В определенных вариантах воплощения, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, которые могут быть введены путем инъекции непосредственно в головной мозг.Инъекция может быть стереотактической инъекцией в определенную область головного мозга (например, черное вещество, сосудистое сплетение, кора головного мозга, гиппокамп, полосатое тело, сосудистое сплетение или бледный шар). Соединение также может быть введено в диффузные области головного мозга (например, диффузная доставка в кору головного мозга).

В определенных вариантах воплощения, парентеральное введение осуществляется путем инъекции. Инъекция может быть введена с помощью шприца или насоса. В определенных вариантах воплощения, инъекция представляет собой болюсную инъекцию. В определенных вариантах воплощения, инъекция вводится непосредственно в ткань, такую как полосатое тело, хвостатое ядро, кора головного мозга, гиппокамп и мозжечок.

В определенных вариантах воплощения, доставка соединения или композиции, описанных тут, может повлиять на фармакокинетический профиль соединения или композиции. В определенных вариантах воплощения, инъекция соединения или композиции, описанных тут, в ткань-мишень улучшает фармакокинетический профиль соединения или композиции по сравнению с инфузией соединения или композиции. В определенном варианте воплощения, инъекция соединения или композиция улучшает действенность по сравнению с обширной диффузией, требуя меньшего количества соединения или композиции для достижения аналогичной фармакологии. В определенных вариантах воплощения, аналогичная фармакология относится к периоду времени, на протяжении которого РНК-мишень и/или белок-мишень подвергается понижающей регуляции (например, длительность действия). В определенных вариантах воплощения, способы специфической локализации фармацевтического агента, такие как с помощью болюсной инъекции, снижают медианную эффективную концентрацию (ЕС50) примерно в 50 раз (например, в 50 раз меньшая концентрация в ткани требуется для достижения такого же или аналогичного фармакодинамического эффекта). В определенных вариантах воплощения, способы специфической локализации фармацевтического агента, такие как с помощью болюсной инъекции, снижают медианную эффективную концентрацию (ЕС50) в 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 раз. В определенных вариантах воплощения, фармацевтический агент представляет собой антисмысловое соединение, как дополнительно описано тут.В определенных вариантах воплощения, ткань-мишень представляет собой ткань головного мозга. В определенных вариантах воплощения, ткань-мишень представляет собой стриарную ткань. В определенных вариантах воплощения, снижение ЕС50 является желательным, поскольку уменьшает дозу, необходимую для достижения фармакологического результата у нуждающегося в этом пациента.

Период полувыведения олигонуклеотидов МОЕ-гапмера в ткани печени CD1 мышей составляет примерно 21 день (см. Примеры 12).

В определенных вариантах воплощения, антисмысловой олигонуклеотид вводится инъекцией или инфузией раз в месяц, раз в два месяца, раз в 90 дней, раз в 3 месяца, раз в 6 месяцев, два раза в год или раз в год.

Некоторые комбинированные терапии

В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению вводятся совместно с одним или несколькими другими фармацевтическими агентами. В определенных вариантах воплощения, такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения той же болезни, расстройства или состояния, что и одна или несколько фармацевтических композиций, описанных тут.В определенных вариантах воплощения, такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения болезни, расстройства или состояния, отличных от одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных тут.В определенных вариантах воплощения, такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения нежелательных побочных эффектов одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных тут.В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций вводятся совместно с другим фармацевтическим агентом для лечения нежелательного эффекта этого другого фармацевтического агента. В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций вводятся совместно с другим фармацевтическим агентом для создания комбинированного эффекта. В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций вводятся совместно с другим фармацевтическим агентом для создания синергического эффекта.

В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций и один или несколько других фармацевтических агентов вводятся одновременно. В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций и один или несколько других фармацевтических агентов вводятся в разное время. В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций и один или несколько других фармацевтических агентов готовятся вместе в одной рецептуре. В определенных вариантах воплощения, одна или несколько фармацевтических композиций и один или несколько других фармацевтических агентов готовятся отдельно.

В определенных вариантах воплощения, второе соединение вводится перед введением фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В определенных вариантах воплощения, второе соединение вводится после введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В определенных вариантах воплощения, второе соединение вводится одновременно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. В определенных вариантах воплощения, доза совместно вводимого второго соединения будет такой же, как и доза, которая использовалась бы при введении одного лишь второго соединения. В определенных вариантах воплощения, доза совместно вводимого второго соединения будет ниже, чем доза, которая использовалась бы при введении одного лишь второго соединения. В определенных вариантах воплощения, доза совместно вводимого второго соединения будет выше, чем доза, которая использовалась бы при введении одного лишь второго соединения.

В определенных вариантах воплощения, совместное введение второго соединения усиливает эффект первого соединения, так чтобы совместное введение соединений приводило к эффекту, превышающему эффект от введения одного лишь первого соединения. В определенных вариантах воплощения, совместное введение приводит к эффектам, являющимся аддитивными для эффектов соединений при их введении по одному. В определенных вариантах воплощения, совместное введение приводит к эффектам, превышающим аддитивные эффекты соединений при их введении по одному. В определенных вариантах воплощения, первое соединение представляет собой антисмысловое соединение. В определенных вариантах воплощения, второе соединение представляет собой антисмысловое соединение.

В определенных вариантах воплощения, фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включают антипсихотические агенты, такие как, например, галоперидол, хлорпромазин, клозапин, кветапин и оланзапин; антидепрессивные агенты, такие как, например, флуоксетин, сертралина гидрохлорид, венлафаксин и нортриптилин; транквилизирующие агенты, такие как, например, бензодиазепины, клоназепам, пароксетин, венлафаксин и бета-блокаторы; агенты, стабилизирующие настроение, такие как, например, литий, валпроат, ламотригин и карбамазепин; паралитические агенты, такие как, например, ботулотоксин; и/или другие экспериментальные агенты, включая, без ограничений, тетрабеназин (ксеназин), креатин, коэнзим Q10, трегалозу, докозагексановые кислоты, ACR16, этил-ЕРА, атомоксетин, циталопрам, димебон, мемантин, натрия фенилбутират, рамелтеон, урсодиол, зипрекса, ксеназин, тиаприд, рилузол, амантадин, [123I]MNI-420, атомоксетин, тетрабеназин, дигоксин, детрометорфан, варфарин, алпрозам, кетоконазол, омепразол и миноциклин.

В определенных вариантах воплощения, фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включают анальгетики, такие как парацетамол (ацетаминофен); нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (NSAID), такие как салицилаты; наркотические лекарственные препараты, такие как морфин, и синтетические лекарственные препараты с наркотическими свойствами, такие как трамадол.

В определенных вариантах воплощения, фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включают миорелаксанты, такие как бензодиазепины и метокарбамол.

Рецептуры композиций

Соединения по изобретению также могут быть смешаны, конъюгированы или иным образом ассоциированы с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, такими как, например, липосомы, нацеленные на рецептор молекулы или другие рецептуры композиций, для улучшения поглощения, распределения и/или всасывания. Типичные примеры патентов США, описывающих приготовление таких улучшающих поглощение, распределение и/или всасывание рецептур композиций, включают, без ограничений, документы US: 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543158; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

Антисмысловые соединения по изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любые другие соединения, которые, при введении животному, включая человека, способны обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений по изобретению: т.е. солям, которые сохраняют желательную биологическую активность исходного соединения и не придают ему нежелательных токсикологических эффектов. Для олигонуклеотидов, предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей и их применение дополнительно описаны в Патенте США 6287860, который целиком включен сюда. Было показано, что пригодными формами олигонуклеотидных лекарственных препаратов являются соли натрия.

Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и рецептуры, которые включают антисмысловые соединения по изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены рядом способов в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от того, какая область требует лечения. Введение может быть парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, интраартериальную, подкожную, интраперитонеальную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, внутримозговое введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, вентрикулярное введение, интрацеребровентрикулярное введение, церебральное интравентрикулярное введение или церебрально-вентрикулярное введение.

Введение интравентрикулярно является предпочтительным для воздействия на экспрессию транстиретина в сосудистом сплетении. Олигонуклеотиды с, по меньшей мере, одной 2'-O-метоксиэтильной модификацией считаются особенно пригодными для перорального введения. Фармацевтические композиции и рецептуры для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, жидкие мази, примочки, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкие средства и порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными. Также могут быть пригодными презервативы, перчатки с нанесенным покрытием и т.п..

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые удобно могут быть выполнены в виде стандартных дозированных форм, могут быть приготовлены в соответствии с обычными методиками, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию введения в контакт активных ингредиентов с фармацевтическим(и) носителем (носителями) или эксципиентом (эксципиентами). В общем, композиции лекарственных средств готовят путем равномерного и тщательного введения в контакт активных ингредиентов с жидкими носителями, или тонкоизмельченными твердыми носителями, или обоими, и затем, при необходимости, формования продукта.

Композиции по настоящему изобретению может быть изготовлены в виде любой из множества возможных дозированных форм, таких как, без ограничений, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции по настоящему изобретению также могут быть приготовлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, без ограничений, растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы композиции. Фармацевтические композиции и рецептуры по настоящему изобретению могут содержать одно или несколько средств, усиливающих проницаемость, носителей, эксципиентов или других активных или неактивных ингредиентов.

Эмульсии типично представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, обычно, с диаметром более 0,1 мкм. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты в дополнение к диспергированным фазам и активному лекарственному средству, которое может иметь форму раствора в водной фазе, масляной фазе или представлять собой отдельную фазу. Микроэмульсии включены в вариант воплощения настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны специалистам и дополнительно описаны в патенте США 6287860, который целиком включен сюда.

Рецептуры композиций по настоящему изобретению включают липосомальные композиции. При использовании в настоящем изобретении, термин "липосома" означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, организованных в сферический бислой или бислой. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, сформированную из липофильного материала и водную внутреннюю часть, содержащую композицию, которая должна быть доставлена. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые, как считается, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Считается, что липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают ДНК, а не образуют с ней комплекс. Как катионные, так и некатионные липосомы использовались для доставки ДНК в клетки.

Липосомы также включают "стерически стабилизированные" липосомы, причем этот термин, в используемом тут значении, относится к липосомам, включающим один или несколько специализированных липидов, которые, при включении в липосомы, приводят к увеличению продолжительности нахождения в циркуляции по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Липосомы и их применение дополнительно описаны в Патенте США 6287860, который целиком включен сюда.

В другом варианте воплощения изобретения, рецептуры композиций по настоящему изобретению включают рецептуры композиций в солевом растворе. В определенном варианте воплощения изобретения, композиция состоит из соединений, описанных тут, и солевого раствора. В определенных вариантах воплощения, композиция состоит по существу из соединений, описанных тут, и солевого раствора. В определенных вариантах воплощения, солевой раствор представляет собой фармацевтически приемлемый солевой раствор. В определенных вариантах воплощения, солевой раствор представляет собой забуференный солевой раствор. В определенных вариантах воплощения, солевой раствор представляет собой фосфатно-солевой буфер (PBS).

В определенных вариантах воплощения, рецептура композиции исключает липосомы. В определенных вариантах воплощения, композиция лекарственного средства исключает стерически стабилизированные липосомы. В определенных вариантах воплощения, рецептура композиции исключает фосфолипиды. В определенных вариантах воплощения, композиция лекарственного средства состоит по существу из соединений, описанных тут, и солевого раствора, и исключает липосомы.

Фармацевтические рецептуры и композиции по настоящему изобретению могут также включать поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества и их применение дополнительно описаны в Патенте США 6287860, который целиком включен сюда.

В одном варианте воплощения, настоящее изобретение использует различные средства, усиливающие проницаемость, для обеспечения эффективной доставки нуклеиновых кислот, особенно олигонуклеотидов. Средства, усиливающие проницаемость, и их применение дополнительно описаны в Патенте США 6287860, который целиком включен в данное описание.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что рецептуры композиций обычно составляются в соответствии с их предполагаемым применением, т.е. путем введения.

Предпочтительные композиции для местного введения включают такие, в которых олигонуклеотиды по изобретению находятся в смеси с агентом для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG)), и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOTMA)).

Композиции и рецептуры для парентерального введения, включая внутривенные, интраартериальные, подкожные, интраперитонеальные, внутримышечные инъекции или инфузии, или внутричерепные, могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие пригодные добавки, такие как, без ограничений, средства, усиливающие проницаемость, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.

Определенные варианты воплощения данного изобретения предусматривают фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько олигомерных соединений и один или несколько других химиотерапевтических агентов, действующих по не-антисмысловому механизму. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, без ограничений, противораковые химиотерапевтические лекарственные препараты, такие как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эсорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозинарабинозид, бис-хлорэтилнитрозомочевину, бусулфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевину, азотистые аналоги горчичного газа, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстилбестрол (DES). При использовании с соединениями по изобретению, такие химиотерапевтические агенты могут использоваться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение определенного периода времени, а затем МТХ и олигонуклеотид) или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид или 5-FU, радиотерапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные препараты, включая, без ограничений нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты и кортикостероиды, и антивирусные лекарственные препараты, включая, без ограничений, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, также могут быть объединены в композициях по изобретению. Комбинации антисмысловых соединений и других не-антисмысловых лекарственных препаратов также входят в объем настоящего изобретения. Комбинации двух или больше соединений могут быть использованы вместе или последовательно.

В другом родственном варианте воплощения, композиции по изобретению могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотиды, нацеленные на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Альтернативно, композиции по изобретению могут содержать два или больше антисмысловых соединений, нацеленных на разные участки одной и той же нуклеиновой кислоты-мишени. Многочисленные примеры антисмысловых соединений известны специалистам. Комбинации двух или больше соединений могут быть использованы вместе или последовательно.

Дозирование

Составление рецептуры терапевтических композиций и их последующее введение (дозирование) считается доступным специалистам в данной области. Дозирование зависит от тяжести и восприимчивости болезненного состояния, нуждающегося в лечении, при продолжительности курса лечения от нескольких дней до нескольких месяцев или до исцеления или до достижения ослабления болезненного состояния. Оптимальные схемы дозирования могут быть рассчитаны по результатам измерений накопления лекарственного средства в организме пациента. Оптимальные дозы могут меняться в зависимости от относительной действенности отдельных олигонуклеотидов и в общем могут быть оценены по значениям ЕСао, определенным как эффективные в in vitro и in vivo животных моделях. В общем, доза составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг веса тела и может вводиться один или несколько раз в день, неделю, месяц или год или с желательными интервалами. После успешного лечения, может быть желательным проводить поддерживающую терапию пациента для предотвращения рецидивирования болезненного состояния, при которой олигонуклеотид вводится в поддерживающих дозах, составляющих от 0,01 мкг до 100 г на кг веса тела, один или несколько раз в день.

Хотя настоящее изобретение было описано более конкретно для определенных предпочтительных вариантов воплощения, следующие примеры служат только для иллюстрации изобретения и не предназначены для его ограничения. Все ссылки, номера доступа GenBank и т.п., указанные в настоящей заявке, целиком включены сюда в качестве ссылок.

ПРИМЕРЫ

Неограничивающее раскрытие и включение в качестве ссылок

Хотя определенные соединения, композиции и способы, описанные тут, были изложены более конкретно в соответствии с определенными вариантами воплощения, следующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных тут, и не предназначены для его ограничения. Все ссылки, указанные в настоящей заявке, целиком включены сюда в качестве ссылок.

Пример 1: Антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2

Были сконструированы антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на транстиретиновую нуклеиновую кислоту, и подвергнуты испытаниям с целью определения их влияния на мРНК транстиретина in vitro. Культивируемые клетки HepG2 при плотности 10000 клеток на лунку трансфицируют с использованием реагента липофектина с 50 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймеров и зонда человека RTS1396 (прямая последовательность CCCTGCTGAGCCCCTACTC, обозначенная тут как SEQ ID NO:5; обратная последовательность TCCCTCATTCCTTGGGATTG, обозначенная тут как SEQ ID NO:6; последовательность зонда ATTCCACCACGGCTGTCGTCAX, обозначенная тут как SEQ ID NO:7). Уровни мРНК транстиретина устанавливали в соответствии с содержанием общей РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина, по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах 1 и 2 были сконструированы в виде гапмеров 5-10-5 МОЕ. Гапмеры имеют 20 нуклеотидов в длину, причем центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкируется с обеих сторон (в 5'- и 3'-направлениях) боковыми сегментами, содержащими каждый по пять нуклеотидов. Каждый нуклеотид в 5'-боковом сегменте и каждый нуклеотид в 3'-боковом сегменте содержит 2'-МОЕ модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом гапмере представляют собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гапмере представляют собой 5-метилцитидины. "Целевой инициирующий сайт человека" указывает крайний с 5'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер в генной последовательности человека. "Целевой терминирующий сайт человека" указывает крайний с 3'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер в генной последовательности человека. Каждый гапмер, указанный в Таблице 1, нацелен на мРНК транстиретина человека, обозначенную тут как SEQ ID NO:1 (№Доступа GENBANK NM_300371.2). Были также сконструированы определенные гапмеры, нацеленные на интронные последовательности или интрон-экзонные сочленения геномной последовательности транстиретина человека, обозначенной тут как SEQ ID NO:2 (№Доступа GENBANK NT_010966.10, укороченный из нуклеотидов 2009236-2017289), приведенные в Таблице 2.

Человеческие олигонуклеотиды в Таблицах 1 и 2 также являются перекрестно реактивными с генными последовательностями макака-резуса. "Неспаривающиеся основания" указывают число нуклеооснований, по которым олигонуклеотид человека не спаривается с генной последовательностью макака-резуса. Чем выше комплементарность между олигонуклеотидом человека и последовательностью макака-резуса, тем больше вероятность того, что олигонуклеотид человека может перекрестно реагировать с последовательностью макака-резуса. Человеческие олигонуклеотиды в Таблице 1 сравнивают с экзонами 1-4, выделенными из геномной последовательности макака-резуса №Доступа GENBANK NW_001105671.1, на основании сходства с экзонами человека. Человеческие олигонуклеотиды в Таблице 2 сравнивают с геномной последовательностью макака-резуса, обозначенной тут как SEQ ID NO:4 (№Доступа GENBANK NW_001105671.1 укороченный из нуклеотидов 62800O-638000). "Целевой инициирующий сайт макака-резуса" указывает крайний с 5'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер, в генной последовательности макака-резуса. "Целевой терминирующий сайт макака-резуса" указывает крайний с 3'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер генной последовательности макака-резуса.

Таблица 1 Ингибирование уровней мРНК транстиретина человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, имеющими 5-105 МОЕ-боковые сегменты и дезокси-гэп, нацеленными на SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:4 № ISIS Иниц. сайт человека Терм. сайт человека Область Последовательность % ингибирования Иниц. сайт макака-резуса Терм. сайт макака-резуса Неспар. основания SEQ ID NO 304267 217 236 кодиру ACTGGTTTTCC 53 217 236 0 8

      ющая CAGAGGCAA           304268 222 241 кодиру ющая GACTCACTGGT TTTCCCAGA 16 222 241 0 9 304280 353 372 кодиру ющая TGAATACCACC TCTGCATGC 51 353 372 0 10 304284 425 444 кодиру ющая CCGTGGTGGAA TAGGAGTAG 82 425 444 0 11 304285 427 446 кодиру ющая AGCCGTGGTGG AATAGGAGT 89 427 446 0 12 304286 431 450 кодиру ющая CGACAGCCGTG GTGGAATAG 63 431 450 0 13 304287 438 457 кодиру ющая TTGGTGACGAC AGCCGTGGT 88 438 457 0 14 304288 440 459 кодиру ющая GATTGGTGACG ACAGCCGTG 82 440 459 0 15 304289 442 461 кодиру ющая GGGATTGGTGA CGACAGCCG 78 442 461 0 16 304290 443 462 кодиру ющая TGGGATTGGTG ACGACAGCC 85 443 462 0 17 304291 449 468 кодиру ющая-терм. кодом ATTCCTTGGGA TTGGTGACG 52 449 468 0 18 304292 450 469 кодиру ющая-терм. кодом CATTCCTTGGG ATTGGTGAC 34 450 469 0 19 304293 451 470 кодиру ющая-терм. кодом TCATTCCTTGG GATTGGTGA 29 451 470 0 20 304294 460 479 кодиру ющая-терм. кодом-3'UTR AGAAGTCCCTC ATTCCTTGG 32 460 479 0 21

304296 481 500 3'-UTR GTCCTTCAGGT CCACTGGAG 84 478 497 2 22 304297 489 508 3'-UTR CATCCCTCGTC CTTCAGGTC 0 486 505 1 23 304298 501 520 3'-UTR TACATGAAATC ССАТСССТС 26 498 517 0 24 304299 507 526 3'-UTR CTTGGTTACAT GAAATCCCA 85 504 523 0 25 304300 513 532 3'-UTR AATACTCTTGG TTACATGAA 49 510 529 0 26 304301 526 545 3'UTR TTAGTAAAAATG GAATACTC 0 523 542 0 27 304302 532 551 3'UTR ACTGCTTTAGT AAAAATGGA 42 529 548 0 28 304303 539 558 3'UTR TGAAAACACTG CTTTAGTAA 41 536 555 0 29 304304 546 565 3'UTR TATGAGGTGAA AACACTGCT 49 543 562 0 30 304307 564 583 3'UTR TGGACTTCTAA CATAGCATA 73 561 580 2 31 304308 572 591 3'UTR TCTCTGCCTGG АСТТСТААС 55 569 588 1 32 304309 578 597 3'-UTR TTATTGTCTCTG CCTGGACT 77 575 594 0 33 304311 597 616 3'-UTR TGCCTTTCACA GGAATGTTT 80 594 613 0 34 304312 598 617 3'-UTR GTGCCTTTCAC AGGAATGTT 71 595 614 0 35 420871 36 55 кодиру ющая CAGAGGAGGA GCAGACGATG 48 36 55 0 36 420872 120 139 кодиру ющая TCTAGAACTTT GACCATCAG 55 120 139 0 37 420873 212 231 кодиру ющая TTTTCCCAGAG GCAAATGGC 54 212 231 0 38 420874 226 245 кодиру ющая TCCAGACTCAC TGGTTTTCC 63 226 245 0 39

420875 271 290 кодиру ющая ТАТСССТТСТАС АААТТССТ 40 271 290 0 40 420876 285 304 кодиру ющая ATTTCCACTTTG ТАТАТССС 42 285 304 0 41 420877 293 312 кодиру ющая TGGTGTCTATTT CCACTTTG 76 293 312 0 42 420878 303 322 кодиру ющая CAGTAAGATTT GGTGTCTAT 80 303 322 0 43 420879 307 326 кодиру ющая CTTCCAGTAAG ATTTGGTGT 73 307 326 0 44 420880 347 366 кодиру ющая CCACCTCTGCA TGCTCATGG 76 347 366 0 45 420881 355 374 кодиру ющая TGTGAATACCA CCTCTGCAT 58 355 374 0 46 420882 357 376 кодиру ющая GCTGTGAATAC CACCTCTGC 69 357 376 0 47 420883 362 381 кодиру ющая CGTTGGCTGTG ААТАССАСС 64 362 381 0 48 420884 428 447 кодиру ющая CAGCCGTGGTG GAATAGGAG 93 428 447 0 49 420885 430 449 кодиру ющая GACAGCCGTGG TGGAATAGG 93 430 449 0 50 420886 432 451 кодиру ющая ACGACAGCCGT GGTGGAATA 92 432 451 0 51 420887 433 452 кодиру ющая GACGACAGCCG TGGTGGAAT 93 433 452 0 52 420888 434 453 кодиру ющая TGACGACAGCC GTGGTGGAA 95 434 453 0 53 420889 435 454 кодиру ющая GTGACGACAGC CGTGGTGGA 93 435 454 0 54 420890 436 455 кодиру ющая GGTGACGACAG CCGTGGTGG 97 436 455 0 55 420891 437 456 кодиру ющая TGGTGACGACA GCCGTGGTG 97 437 456 0 56 420892 439 458 кодиру ющая ATTGGTGACGA CAGCCGTGG 93 439 458 0 57

420893 441 460 кодиру ющая GGATTGGTGAC GACAGCCGT 96 441 460 0 58 420894 444 463 кодиру ющая TTGGGATTGGT GACGACAGC 88 444 463 0 59 420895 445 464 кодиру ющая CTTGGGATTGG TGACGACAG 95 445 464 0 60 420896 446 465 кодиру ющая CCTTGGGATTG GTGACGACA 95 446 465 0 61 420897 447 466 кодиру ющая TCCTTGGGATT GGTGACGAC 94 447 466 0 62 420898 448 467 кодиру ющая-терм. кодом TTCCTTGGGAT TGGTGACGA 86 448 467 0 63 420899 452 471 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR CTCATTCCTTG GGATTGGTG 94 452 471 0 64 420900 453 472 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR ССТСАТТССТТ GGGATTGGT 92 453 472 0 65 420901 454 473 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR СССТСАТТССТ TGGGATTGG 93 454 473 0 66 420902 455 474 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR ТСССТСАТТСС TTGGGATTG 75 455 474 0 67 420903 456 475 кодиру ющая- GTCCCTCATTC CTTGGGATT 57 456 475 0 68

      терм. кодон-3'UTR             420904 457 476 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR AGTCCCTCATT CCTTGGGAT 62 457 476 0 69 420905 458 477 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR AAGTCCCTCAT TCCTTGGGA 58 458 477 0 70 420906 459 478 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR GAAGTCCCTCA TTCCTTGGG 79 459 478 0 71 420907 461 480 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR GAGAAGTCCCT CATTCCTTG 59 461 480 0 72 420908 462 481 кодиру ющая-терм. кодон-3'UTR GGAGAAGTCCC TCATTCCTT 75 462 481 0 73 420909 500 519 3'UTR ACATGAAATCC CATCCCTCG 82 497 516 0 74 420910 502 521 3'UTR TTACATGAAATC CCATCCCT 74 499 518 0 75 420911 503 522 3'UTR GTTACATGAAA TCCCATCCC 81 500 519 0 76 420912 504 523 3'UTR GGTTACATGAA ATCCCATCC 92 501 520 0 77

420913 505 524 3'UTR TGGTTACATGA AATCCCATC 95 502 521 0 78 420914 506 525 3'UTR TTGGTTACATG AAATCCCAT 93 503 522 0 79 420915 508 527 3'UTR TCTTGGTTACAT GAAATCCC 92 505 524 0 80 420916 509 528 3'UTR CTCTTGGTTAC ATGAAATCC 88 506 525 0 81 420917 510 529 3'UTR ACTCTTGGTTA CATGAAATC 92 507 526 0 82 420918 511 530 3'UTR TACTCTTGGTTA CATGAAAT 88 508 527 0 83 420919 512 531 3'UTR ATACTCTTGGTT ACATGAAA 89 509 528 0 84 420920 514 533 3'UTR GAATACTCTTG GTTACATGA 87 511 530 0 85 420921 515 534 3'UTR GGAATACTCTT GGTTACATG 92 512 531 0 86 420922 516 535 3'UTR TGGAATACTCT TGGTTACAT 95 513 532 0 87 420923 517 536 3'UTR ATGGAATACTC TTGGTTACA 90 514 533 0 88 420924 518 537 3'UTR AATGGAATACT CTTGGTTAC 75 515 534 0 89 420925 519 538 3'UTR AAATGGAATAC TCTTGGTTA 87 516 535 0 90 420926 520 539 3'UTR AAAATGGAATA CTCTTGGTT 88 517 536 0 91 420927 521 540 3'UTR AAAAATGGAAT ACTCTTGGT 50 518 537 0 92 420928 522 541 3'UTR TAAAAATGGAA TACTCTTGG 26 519 538 0 93 420929 523 542 3'UTR GTAAAAATGGA ATACTCTTG 56 520 539 0 94 420930 524 543 3'UTR AGTAAAAATGG AATACTCTT 18 521 540 0 95

420931 525 544 3'UTR TAGTAAAAATG GAATACTCT 12 522 541 0 96 420932 527 546 3'UTR TTTAGTAAAAAT GGAATACT 1 524 543 0 97 420933 528 547 3'UTR CTTTAGTAAAAA TGGAATAC 0 525 544 0 98 420934 529 548 3'UTR GCTTTAGTAAA AATGGAATA 6 526 545 0 99 420935 530 549 3'UTR TGCTTTAGTAAA AATGGAAT 0 527 546 0 100 420936 531 550 3'UTR CTGCTTTAGTA AAAATGGAA 40 528 547 0 101 420937 533 552 3'UTR CACTGCTTTAG TAAAAATGG 47 530 549 0 102 420938 534 553 3'UTR ACACTGCTTTA GTAAAAATG 30 531 550 0 103 420939 535 554 3'UTR AACACTGCTTT AGTAAAAAT 0 532 551 0 104 420940 536 555 3'UTR AAACACTGCTT TAGTAAAAA 0 533 552 0 105 420941 537 556 3'UTR AAAACACTGCT TTAGTAAAA 0 534 553 0 106 420942 538 557 3'UTR GAAAACACTGC TTTAGTAAA 0 535 554 0 107 420943 540 559 3'UTR GTGAAAACACT GCTTTAGTA 14 537 556 0 108 420944 541 560 3'UTR GGTGAAAACAC TGCTTTAGT 43 538 557 0 109 420945 542 561 3'UTR AGGTGAAAACA CTGCTTTAG 41 539 558 0 110 420946 543 562 3'UTR GAGGTGAAAAC ACTGCTTTA 20 540 559 0 111 420947 544 563 3'UTR TGAGGTGAAAA CACTGCTTT 69 541 560 0 112 420948 545 564 3'UTR ATGAGGTGAAA ACACTGCTT 63 542 561 0 113

420949 579 598 3'UTR TTTATTGTCTCT GCCTGGAC 84 576 595 0 114 420950 580 599 3'UTR TTTTATTGTCTC TGCCTGGA 69 577 596 0 115 420951 581 600 3'UTR GTTTTATTGTCT CTGCCTGG 87 578 597 0 116 420952 582 601 3'UTR TGTTTTATTGTC TCTGCCTG 67 579 598 0 117 420953 583 602 3'UTR ATGTTTTATTGT CTCTGCCT 51 580 599 0 118 420954 584 603 3'UTR AATGTTTTATTG TCTCTGCC 60 581 600 0 119 420955 585 604 3'UTR GAATGTTTTATT GTCTCTGC 65 582 601 0 120 420956 586 605 3'UTR GGAATGTTTTAT TGTCTCTG 67 583 602 0 121 420957 587 606 3'UTR AGGAATGTTTT ATTGTCTCT 68 584 603 0 122 420958 588 607 3'UTR CAGGAATGTTT TATTGTCTC 45 585 604 0 123 420959 589 608 3'UTR ACAGGAATGTT TTATTGTCT 28 586 605 0 124

Таблица 2 Ингибирование уровней мРНК транстиретина человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, имеющими 5-10-5 МОЕ-боковые сегменты и дезокси-гэп, нацеленными на SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4 № ISIS Иниц. сайт человека Терм. сайт человека Область Последовательность % ингибирования Иниц. сайт макака-резуса Терм. сайт макака-резуса Несп ар. основания SEQ ID NO 420960 606 625 экзон -интрон GATGTCACAGA ААСАСТСАС 13 1755 1774 0 125 420961 665 684 интрон 1 GCAAAGCTGGA AGGAGTCAC 7 1814 1833 0 126 420962 748 767 интрон 1 GAACTTCATTCT 0 1897 1916 0 127

        TTTTGAAG           420963 882 901 интрон 1 AGCTTCCTTAAT АТСАТАТС 0 2031 2050 0 128 420964 966 985 интрон 1 TATAGGGCCAG ААТАТААТС 10 2115 2134 0 129 420965 1010 1029 интрон 1 ACTAAGCCTTTT AAAGATTA 17 2159 2178 0 130 420966 1208 1227 интрон 1 TGGAATTACTG AAAAGATGT 35 2356 2375 0 131 420967 1289 1308 интрон 1 ACCAGGGATGT GTATAATGA 43 2437 2456 0 132 420968 1364 1383 интрон 1 TCCCTACTCAG ТАТААСАСА 0 2512 2531 0 133 420969 1472 1491 интрон 1 GATCAGAGTGA AAGGATTTA 0 2620 2639 0 134 420970 1687 1706 интрон 2 GGGAAGATAAA ACCAAGTCC 46 2826 2845 0 135 420971 1739 1758 интрон 2 TAAATTCTTTAG CAGATGAT 0 2878 2897 0 136 420972 1842 1861 интрон 2 AATGATGCTCA GGTTCCTGG 23 2980 2999 0 137 420973 2051 2070 интрон 2 TTGGTGTTACC CAGGGACAC 0 3187 3206 0 138 420974 2207 2226 интрон 2 AAAGTGTTCATT AGGCAAAA 29 3344 3363 0 139 420975 2655 2674 интрон 2 GGCATTTTATAT АААСАТАА 0 3798 3817 0 140 420976 2733 2752 интрон 2 AAGAACATTGG AATATTTTT 0 3876 3895 0 141 420977 2874 2893 интрон 2 GTTGGAAATTG СТТСССАТТ 9 4017 4036 0 142 420978 3015 3034 интрон 2 AGTGGAAAACC TAAAGTAGG 0 4156 4175 0 143 420979 3618 3637 интрон 2 ТТССССТСААС TAAGTCAGA 0 4795 4814 0 144 420980 3735 3754 интрон2- CCTATAAGGTG 0 4930 4949 0 145       экзон 3 TGAAAGTCT           420981 4096 4115 интрон 3 TGTAAGTTCAA GTCATGTTA 0 5291 5310 0 146 420982 4306 4325 интрон 3 GTGTTGCCAAG AATCACTTG 0 5502 5521 0 147 420983 4404 4423 интрон 3 ААААСАСТТАТА ATTGTGTC 0 5600 5619 0 148 420984 4518 4537 интрон 3 CTTTGACAAGTT ATTTGACT 0 5714 5733 0 149 420985 4880 4899 интрон 3 ATCCATGACTA AGCCAGAGA 0 6073 6092 0 150 420986 5185 5204 интрон 3 ATGGTTCCCAT CAGGCTGAG 0 6379 6398 0 151 420987 5542 5561 интрон 3 GCATTTATCAG AAGAAGCTG 0 6732 6751 0 152 420988 6030 6049 интрон 3 TTGACCTTCAG CCCACTTGA 0 7226 7245 0 153 420989 6133 6152 интрон 3 AGGAAGTGAGA АТСАССТАА 0 7641 7660 0 154 420990 6320 6339 интрон 3 AGAAGACAGTA AAGATGTGT 0 7828 7847 0 155 420991 6457 6476 интрон 3 AAATTGTGGAT CAAAATGCT 0 7966 7985 0 156 420992 6736 6755 интрон 3 AACCAGACTTG AATTATTGT 0 8246 8265 0 157 420993 6811 6830 интрон 3 AGTGGCTGCCA ACCACAGAC 0 8321 8340 0 158 420994 7106 7125 интрон 3 GGAAGTCCAGT GCCAACTTA 0 8615 8634 0 159 420995 7162 7181 интрон 3 АТССАТТТССАС CAGAGCCC 0 8670 8689 0 160

Вследствие малой длины мРНК транстиретина человека, второй набор праймер-зонд был сконструирован на некотором расстоянии от первого набора праймер-зонд, RTS1396, во избежание амплификации олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды также были подвергнуты испытаниям с целью определения их эффекта на мРНК транстиретина in vitro с использованием нового человеческого набора праймер-зонд RTS3029 (прямая последовательность CTTGCTGGACTGGTATTTGTGTCT, обозначенная тут как SEQ ID NO:161, обратная последовательность AGAACTTTGACCATCAGAGGACACT, обозначенная тут как SEQ ID NO:162; последовательность зонда CCCTACGGGCACCGGTGAATCCX, обозначенная тут как SEQ ID NO:163). Культивируемые клетки HepG2 при плотности 10000 клеток на лунку трансфицируют с использованием реагента липофектина 50 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Результаты представлены в Таблице 3 как процент ингибирования для набора клеток с PBS-контролем.

Таблица 3 Ингибирование уровней мРНК транстиретина человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, имеющими 5-105 МОЕ-боковые сегменты и дезокси-гэп с набором праймер-зонд RTS3029 № ISIS Область % ингибирования 304267 кодирующая 13 304268 кодирующая 10 304280 кодирующая 23 304284 кодирующая 10 304285 кодирующая 34 304286 кодирующая 0 304287 кодирующая 34 304288 кодирующая 45 304289 кодирующая 3 304290 кодирующая 16 304291 кодирующая-терминирующий кодон 4 304292 кодирующая-терминирующий кодон 10 304293 кодирующая-терминирующий кодон 14 304294 терминирующий кодон-3' UTR 30 304296 экзон 4 78 304297 экзон 4 29 304298 экзон 4 19 304299 экзон 4 85 304300 экзон 4 52 304301 экзон 4 15 304302 экзон 4 45 304303 экзон 4 51 304304 экзон 4 62 304307 экзон 4 76 304308 экзон 4 63 304309 экзон 4 75 304311 экзон 4 81 304312 экзон 4 68 420871 кодирующая 0 420872 кодирующая 5 420873 кодирующая 19 420874 кодирующая 0 420875 кодирующая 6 420876 кодирующая 20 420877 кодирующая 28 420878 кодирующая 37 420879 кодирующая 34 420880 кодирующая 36 420881 кодирующая 10 420882 кодирующая 27 420883 кодирующая 13 420884 кодирующая 28 420885 кодирующая 4 420886 кодирующая 21 420887 кодирующая 39 420888 кодирующая 37 420889 кодирующая 9 420890 кодирующая 27 420891 кодирующая 39 420892 кодирующая 43 420893 кодирующая 39 420894 кодирующая 0 420895 кодирующая 0 420896 кодирующая 24 420897 кодирующая 31 420898 кодирующая- 0 420899 терминирующий кодон-3'UTR 41 420900 терминирующий кодон-3'UTR 26 420901 терминирующий кодон-3'UTR 28 420902 терминирующий кодон-3'UTR 20 420903 терминирующий кодон-3'UTR 20 420904 терминирующий кодон-3'UTR 22 420905 терминирующий кодон-3'UTR 32 420906 терминирующий кодон-3'UTR 13 420907 терминирующий кодон-3'UTR 0 420908 терминирующий кодон-3'UTR 45 420909 3'UTR 41 420910 3'UTR 14 420911 3'UTR 45 420912 3'UTR 62 420913 3'UTR 81 420914 3'UTR 68 420915 3'UTR 71 420916 3'UTR 54 420917 3'UTR 50 420918 3'UTR 43 420919 3'UTR 65 420920 3'UTR 61 420921 3'UTR 65 420922 3'UTR 68 420923 3'UTR 62 420924 3'UTR 9 420925 3'UTR 17 420926 3'UTR 47 420927 3'UTR 57 420928 3'UTR 51 420929 3'UTR 46 420930 3'UTR 39 420931 3'UTR 14 420932 3'UTR 6 420933 3'UTR 1 420934 3'UTR 48 420935 3'UTR 13 420936 3'UTR 62 420937 3'UTR 65 420938 3'UTR 48 420939 3'UTR 7 420940 3'UTR 3 420941 3'UTR 31 420942 3'UTR 0 420943 3'UTR 40 420944 3'UTR 78 420945 3'UTR 58 420946 3'UTR 52 420947 3'UTR 71 420948 3'UTR 73 420949 3'UTR 88 420950 3'UTR 82 420951 3'UTR 90 420952 3'UTR 82 420953 3'UTR 71 420954 3'UTR 67 420955 3'UTR 73 420956 3'UTR 65 420957 3'UTR 74 420958 3'UTR 69 420959 3'UTR 63 420960 экзон 1-интрон 1 14 420961 интрон 1 16 420962 интрон 1 0 420963 интрон 1 0 420964 интрон 1 14 420965 интрон 1 23 420966 интрон 1 25 420967 интрон 1 12 420968 интрон 1 0 420969 интрон 1 0 420970 интрон 2 25 420971 интрон 2 0 420972 интрон 2 25 420973 интрон 2 7 420974 интрон 2 28 420975 интрон 2 9 420976 интрон 2 21 420977 интрон 2 14 420978 интрон 2 37 420979 интрон 2 37 420980 интрон 2-экзон 3 16 420981 интрон 3 0 420982 интрон 3 28 420983 интрон 3 0 420984 интрон 3 0 420985 интрон 3 0 420986 интрон 3 7 420987 интрон 3 0 420988 интрон 3 0 420989 интрон 3 0 420990 интрон 3 6 420991 интрон 3 15 420992 интрон 3 0 420993 интрон 3 0 420994 интрон 3 0 420995 интрон 3 10

На основании результатов определения ингибирования с использованием нового набора праймер-зонд RTS3029, антисмысловые олигонуклеотиды, демонстрирующие 50% или больше ингибирования мРНК транстиретина, были выбраны для дальнейших исследований.

Пример 2: Антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2 олигонуклеотидами, сконструированными способом микроскользящего зондирования

Дополнительные гапмеры были сконструированы на основе гапмеров, представленных в Таблице 3, которые продемонстрировали ингибирование, по меньшей мере, 50%. Эти гапмеры были сконструированы путем создания гапмеров, немного смещенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции (т.е. "микроскользящее зондирование") оригинальных гапмеров из Таблицы 3. Были также созданы гапмеры с различными мотивами, например, мотивами 5-10-5 МОЕ, 3-14-3 МОЕ, 2-13-5 МОЕ и 4-11-5 МОЕ. Эти гапмеры были подвергнуты испытаниям in vitro. Культивируемые клетки HepG2 при плотности 10000 клеток на лунку трансфицируют с использованием реагента липофектина 50 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Человеческий набор праймер-зонд RTS3029 используют для измерения уровней мРНК транстиретина. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Результаты представлены в Таблице 4.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 4 были сконструированы в виде гапмеров 5-10-5 МОЕ, 3-14-3 МОЕ, 2-13-5 МОЕ или 4-11-5 МОЕ. Гапмеры, отмеченные звездочкой (*) в Таблице 4, представляют собой оригинальные гапмеры, на основании которых были спроектированы гапмеры ISIS 42565O-425763 с помощью способа микро-скользящего зондирования. Гапмеры 5-10-5 имеют 20 нуклеотидов в длину, причем центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкируется с обоих сторон (в 5'- и 3'-направлениях) боковыми сегментами, содержащими каждый по пять нуклеотидов. Гапмеры 3-14-3 имеют 20 нуклеотидов в длину, причем центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкируется с обеих сторон (в 5'- и 3'-направлениях) боковыми сегментами, содержащими каждый по три нуклеотида. Гапмеры 2-13-5 имеют 20 нуклеотидов в длину, причем центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкируется в 5'- и 3'-направлениях боковыми сегментами, содержащими два и пять нуклеотидов, соответственно. Гапмеры 4-11-5 имеют 20 нуклеотидов в длину, причем центральный гэп-сегмент состоит из одиннадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкируется в 5'- и 3'-направлениях боковыми сегментами, содержащими четыре и пять нуклеотидов, соответственно. Для каждого из мотивов (5-10-5, 3-14-3, 2-13-5 и 4-11-5), каждый нуклеотид в 5'-боковом сегменте и каждый нуклеотид в 3'-боковом сегменте имеют 2'-МОЕ модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом гапмере представляют собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гапмере представляют собой 5-метилцитидины. "Целевой инициирующий сайт" указывает крайний с 5'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер. "Целевой терминирующий сайт" указывает крайний с 3'-конца нуклеотид, на который нацелен гапмер. Каждый гапмер, указанный в Таблице 4, нацелен на участок-мишень, охватывающий нуклеооснования 481-619 SEQ ID NO:1 (№ Доступа GENBANK NM_000371.2).

Как показано в Таблице 4, несколько гапмеров продемонстрировали, по меньшей мере, 50% ингибирования, включая номера ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425699, 425739, 304299, 425660, 425700, 425740, 420915, 420916, 425662, 425702, 420919, 425703, 420920, 425664, 425704, 425742, 420921, 425665, 425705, 425743, 420922, 425666, 425706, 420923, 420937, 420944, 425669, 425709, 425746, 425710, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425673, 425713, 425749, 425651, 425675, 425715, 425751, 304309, 425676, 425716, 425752, 420949, 425677, 425717, 425753, 420950, 425678, 425718, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 425756, 420953, 425681, 425721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425759, 425724, 425760, 425762, 304310, 425729, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 425768, 304313, 425734 и 425769.

Несколько гапмеров продемонстрировали, по меньшей мере, 60% ингибирования, включая номера ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425739, 304299, 425740, 420915, 425702, 420919, 420920, 425742, 420921, 425665, 425705, 425706, 420923, 425746, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425651, 425715, 425751, 304309, 425716, 425752, 425677, 425717, 425753, 420950, 425718, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 420953, 425681, 425721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425724, 425760, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 304313 и 425769.

Несколько гапмеров продемонстрировали, по меньшей мере, 70% ингибирования, включая номера ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425737, 420913, 425738, 420914, 425659, 304299, 420915, 420920, 425742, 425712, 425748, 425716, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 425680, 425721, 425757, 425760, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425767, 425693 и 304313.

Несколько гапмеров продемонстрировали, по меньшей мере, 80% ингибирования, включая номера ISIS: 304296, 425655, 425695, 425736, 420913, 425659, 304299, 420915, 425716, 425754, 425719, 425757, 425765 и 425767.

Несколько гапмеров продемонстрировали, по меньшей мере, 85% ингибирования, включая номера ISIS: 420913, 425716, 425754 и 425719.

Один гапмер, ISIS 425719, продемонстрировал 90% ингибирования.

Таблица 4 Ингибирование уровней мРНК транстиретина человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на SEQ ID NO:1 (№Доступа GENBANK IMM000371.2) Олиго-нуклеотид Иниц. сайт Терм. сайт Последовательность Мотив % ингибирования SEQ ID NO *304296 481 500 GTCCTTCAGGTCCACTGGAG 5-10-5 83 22 425655 481 500 GTCCTTCAGGTCCACTGGAG 3-14-3 80 22 425695 481 500 GTCCTTCAGGTCCACTGGAG 2-13-5 80 22 425735 481 500 GTCCTTCAGGTCCACTGGAG 4-11-5 72 22 425649 482 501 CGTCCTTCAGGTCCACTGGA 5-10-5 75 170 425656 482 501 CGTCCTTCAGGTCCACTGGA 3-14-3 78 170 425696 482 501 CGTCCTTCAGGTCCACTGGA 2-13-5 74 170 425736 482 501 CGTCCTTCAGGTCCACTGGA 4-11-5 83 170 *420912 504 523 GGTTACATGAAATCCCATCC 5-10-5 73 77 425657 504 523 GGTTACATGAAATCCCATCC 3-14-3 76 77 425697 504 523 GGTTACATGAAATCCCATCC 2-13-5 69 77 425737 504 523 GGTTACATGAAATCCCATCC 4-11-5 78 77 *420913 505 524 TGGTTACATGAAATCCCATC 5-10-5 89 78 425658 505 524 TGGTTACATGAAATCCCATC 3-14-3 69 78 425698 505 524 TGGTTACATGAAATCCCATC 2-13-5 61 78 425738 505 524 TGGTTACATGAAATCCCATC 4-11-5 78 78 *420914 506 525 TTGGTTACATGAAATCCCAT 5-10-5 70 79 425659 506 525 TTGGTTACATGAAATCCCAT 3-14-3 83 79 425699 506 525 TTGGTTACATGAAATCCCAT 2-13-5 56 79 425739 506 525 TTGGTTACATGAAATCCCAT 4-11-5 69 79 *304299 507 526 CTTGGTTACATGAAATCCCA 5-10-5 83 25

425660 507 526 CTTGGTTACATGAAATCCCA 3-14-3 59 25 425700 507 526 CTTGGTTACATGAAATCCCA 2-13-5 52 25 425740 507 526 CTTGGTTACATGAAATCCCA 4-11-5 69 25 *420915 508 527 TCTTGGTTACATGAAATCCC 5-10-5 81 80 425661 508 527 TCTTGGTTACATGAAATCCC 3-14-3 48 80 425701 508 527 TCTTGGTTACATGAAATCCC 2-13-5 41 80 425741 508 527 TCTTGGTTACATGAAATCCC 4-11-5 37 80 *420916 509 528 CTCTTGGTTACATGAAATCC 5-10-5 52 81 425662 509 528 CTCTTGGTTACATGAAATCC 3-14-3 57 81 425702 509 528 CTCTTGGTTACATGAAATCC 2-13-5 63 81 *420919 512 531 ATACTCTTGGTTACATGAAA 5-10-5 69 84 425663 512 531 ATACTCTTGGTTACATGAAA 3-14-3 46 84 425703 512 531 ATACTCTTGGTTACATGAAA 2-13-5 52 84 *420920 514 533 GAATACTCTTGGTTACATGA 5-10-5 71 85 425664 514 533 GAATACTCTTGGTTACATGA 3-14-3 57 85 425704 514 533 GAATACTCTTGGTTACATGA 2-13-5 58 85 425742 514 533 GAATACTCTTGGTTACATGA 4-11-5 71 85 *420921 515 534 GGAATACTCTTGGTTACATG 5-10-5 68 86 425665 515 534 GGAATACTCTTGGTTACATG 3-14-3 65 86 425705 515 534 GGAATACTCTTGGTTACATG 2-13-5 60 86 425743 515 534 GGAATACTCTTGGTTACATG 4-11-5 56 86 *420922 516 535 TGGAATACTCTTGGTTACAT 5-10-5 54 87 425666 516 535 TGGAATACTCTTGGTTACAT 3-14-3 56 87 425706 516 535 TGGAATACTCTTGGTTACAT 2-13-5 64 87 425744 516 535 TGGAATACTCTTGGTTACAT 4-11-5 39 87 *420923 517 536 ATGGAATACTCTTGGTTACA 5-10-5 62 88 425667 517 536 ATGGAATACTCTTGGTTACA 3-14-3 44 88 425707 517 536 ATGGAATACTCTTGGTTACA 2-13-5 30 88 *420937 533 552 CACTGCTTTAGTAAAAATGG 5-10-5 59 102 425668 533 552 CACTGCTTTAGTAAAAATGG 3-14-3 37 102 425708 533 552 CACTGCTTTAGTAAAAATGG 2-13-5 32 102 425745 533 552 CACTGCTTTAGTAAAAATGG 4-11-5 43 102 *420944 541 560 GGTGAAAACACTGCTTTAGT 5-10-5 52 109 425669 541 560 GGTGAAAACACTGCTTTAGT 3-14-3 54 109 425709 541 560 GGTGAAAACACTGCTTTAGT 2-13-5 54 109

425746 541 560 GGTGAAAACACTGCTTTAGT 4-11-5 60 109 *420945 542 561 AGGTGAAAACACTGCTTTAG 5-10-5 38 110 425670 542 561 AGGTGAAAACACTGCTTTAG 3-14-3 38 110 425710 542 561 AGGTGAAAACACTGCTTTAG 2-13-5 52 110 *420947 544 563 TGAGGTGAAAACACTGCTTT 5-10-5 34 112 425671 544 563 TGAGGTGAAAACACTGCTTT 3-14-3 27 112 425711 544 563 TGAGGTGAAAACACTGCTTT 2-13-5 68 112 425747 544 563 TGAGGTGAAAACACTGCTTT 4-11-5 61 112 *420948 545 564 ATGAGGTGAAAACACTGCTT 5-10-5 66 113 425672 545 564 ATGAGGTGAAAACACTGCTT 3-14-3 47 113 425712 545 564 ATGAGGTGAAAACACTGCTT 2-13-5 70 113 425748 545 564 ATGAGGTGAAAACACTGCTT 4-11-5 71 113 *304304 546 565 TATGAGGTGAAAACACTGCT 5-10-5 46 30 425673 546 565 TATGAGGTGAAAACACTGCT 3-14-3 51 30 425713 546 565 TATGAGGTGAAAACACTGCT 2-13-5 50 30 425749 546 565 TATGAGGTGAAAACACTGCT 4-11-5 58 30 425650 547 566 ATATGAGGTGAAAACACTGC 5-10-5 28 171 425674 547 566 ATATGAGGTGAAAACACTGC 3-14-3 40 171 425714 547 566 ATATGAGGTGAAAACACTGC 2-13-5 44 171 425750 547 566 ATATGAGGTGAAAACACTGC 4-11-5 47 171 425651 577 596 TATTGTCTCTGCCTGGACTT 5-10-5 65 172 425675 577 596 TATTGTCTCTGCCTGGACTT 3-14-3 55 172 425715 577 596 TATTGTCTCTGCCTGGACTT 2-13-5 65 172 425751 577 596 TATTGTCTCTGCCTGGACTT 4-11-5 62 172 *304309 578 597 TTATTGTCTCTGCCTGGACT 5-10-5 66 33 425676 578 597 TTATTGTCTCTGCCTGGACT 3-14-3 59 33 425716 578 597 TTATTGTCTCTGCCTGGACT 2-13-5 87 33 425752 578 597 TTATTGTCTCTGCCTGGACT 4-11-5 67 33 *420949 579 598 TTTATTGTCTCTGCCTGGAC 5-10-5 57 114 425677 579 598 TTTATTGTCTCTGCCTGGAC 3-14-3 67 114 425717 579 598 TTTATTGTCTCTGCCTGGAC 2-13-5 68 114 425753 579 598 TTTATTGTCTCTGCCTGGAC 4-11-5 69 114 *420950 580 599 TTTTATTGTCTCTGCCTGGA 5-10-5 61 115 425678 580 599 TTTTATTGTCTCTGCCTGGA 3-14-3 59 115 425718 580 599 TTTATTGTCTCTGCCTGGA 2-13-5 69 115

425754 580 599 TTTTATTGTCTCTGCCTGGA 4-11-5 86 115 *420951 581 600 GTTTTATTGTCTCTGCCTGG 5-10-5 78 116 425679 581 600 GTTTTATTGTCTCTGCCTGG 3-14-3 73 116 425719 581 600 GTTTTATTGTCTCTGCCTGG 2-13-5 90 116 425755 581 600 GTTTTATTGTCTCTGCCTGG 4-11-5 73 116 *420952 582 601 TGTTTTATTGTCTCTGCCTG 5-10-5 61 117 425680 582 601 TGTTTTATTGTCTCTGCCTG 3-14-3 77 117 425720 582 601 TGTTTTATTGTCTCTGCCTG 2-13-5 67 117 425756 582 601 TGTTTTATTGTCTCTGCCTG 4-11-5 57 117 *420953 583 602 ATGTTTTATTGTCTCTGCCT 5-10-5 65 118 425681 583 602 ATGTTTTATTGTCTCTGCCT 3-14-3 61 118 425721 583 602 ATGTTTTATTGTCTCTGCCT 2-13-5 77 118 425757 583 602 ATGTTTTATTGTCTCTGCCT 4-11-5 83 118 *420954 584 603 AATGTTTTATTGTCTCTGCC 5-10-5 63 119 425682 584 603 AATGTTTTATTGTCTCTGCC 3-14-3 42 119 425722 584 603 AATGTTTTATTGTCTCTGCC 2-13-5 69 119 425758 584 603 AATGTTTTATTGTCTCTGCC 4-11-5 61 119 *420955 585 604 GAATGTTTTATTGTCTCTGC 5-10-5 65 120 425683 585 604 GAATGTTTTATTGTCTCTGC 3-14-3 30 120 425723 585 604 GAATGTTTTATTGTCTCTGC 2-13-5 44 120 425759 585 604 GAATGTTTTATTGTCTCTGC 4-11-5 50 120 *420956 586 605 GGAATGTTTTATTGTCTCTG 5-10-5 47 121 425684 586 605 GGAATGTTTTATTGTCTCTG 3-14-3 44 121 425724 586 605 GGAATGTTTTATTGTCTCTG 2-13-5 65 121 *420957 587 606 AGGAATGTTTTATTGTCTCT 5-10-5 37 122 425685 587 606 AGGAATGTTTTATTGTCTCT 3-14-3 46 122 425725 587 606 AGGAATGTTTTATTGTCTCT 2-13-5 43 122 425760 587 606 AGGAATGTTTTATTGTCTCT 4-11-5 78 122 *420958 588 607 CAGGAATGTTTTATTGTCTC 5-10-5 41 123 425686 588 607 CAGGAATGTTTTATTGTCTC 3-14-3 6 123 425726 588 607 CAGGAATGTTTTATTGTCTC 2-13-5 41 123 425761 588 607 CAGGAATGTTTTATTGTCTC 4-11-5 39 123 *420959 589 608 ACAGGAATGTTTTATTGTCT 5-10-5 43 124 425687 589 608 ACAGGAATGTTTTATTGTCT 3-14-3 22 124 425727 589 608 ACAGGAATGTTTTATTGTCT 2-13-5 25 124

425762 589 608 ACAGGAATGTTTTATTGTCT 4-11-5 57 124 425652 590 609 CACAGGAATGTTTTATTGTC 5-10-5 23 173 425688 590 609 CACAGGAATGTTTTATTGTC 3-14-3 11 173 425728 590 609 CACAGGAATGTTTTATTGTC 2-13-5 37 173 425763 590 609 CACAGGAATGTTTTATTGTC 4-11-5 38 173 304310 595 614 CCTTTCACAGGAATGTTTTA 5-10-5 57 174 425689 595 614 CCTTTCACAGGAATGTTTTA 3-14-3 38 174 425729 595 614 CCTTTCACAGGAATGTTTTA 2-13-5 58 174 425764 595 614 CCTTTCACAGGAATGTTTTA 4-11-5 60 174 425653 596 615 GCCTTTCACAGGAATGTTTT 5-10-5 79 175 425690 596 615 GCCTTTCACAGGAATGTTTT 3-14-3 73 175 425730 596 615 GCCTTTCACAGGAATGTTTT 2-13-5 76 175 425765 596 615 GCCTTTCACAGGAATGTTTT 4-11-5 83 175 *304311 597 616 TGCCTTTCACAGGAATGTTT 5-10-5 71 34 425691 597 616 TGCCTTTCACAGGAATGTTT 3-14-3 74 34 425731 597 616 TGCCTTTCACAGGAATGTTT 2-13-5 73 34 425766 597 616 TGCCTTTCACAGGAATGTTT 4-11-5 79 34 *304312 598 617 GTGCCTTTCACAGGAATGTT 5-10-5 71 35 425692 598 617 GTGCCTTTCACAGGAATGTT 3-14-3 69 35 425732 598 617 GTGCCTTTCACAGGAATGTT 2-13-5 67 35 425767 598 617 GTGCCTTTCACAGGAATGTT 4-11-5 83 35 425654 599 618 AGTGCCTTTCACAGGAATGT 5-10-5 64 176 425693 599 618 AGTGCCTTTCACAGGAATGT 3-14-3 79 176 425733 599 618 AGTGCCTTTCACAGGAATGT 2-13-5 68 176 425768 599 618 AGTGCCTTTCACAGGAATGT 4-11-5 50 176 304313 600 619 AAGTGCCTTTCACAGGAATG 5-10-5 73 177 425694 600 619 AAGTGCCTTTCACAGGAATG 3-14-3 45 177 425734 600 619 AAGTGCCTTTCACAGGAATG 2-13-5 55 177 425769 600 619 AAGTGCCTTTCACAGGAATG 4-11-5 62 177

Пример 3: Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2

Гапмеры по Примеру 2, демонстрирующие значительное in vitro ингибирование транстиретина человека, были подвергнуты испытаниям в разных дозах в клетках HepG2. Клетки высеивают при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 625 нМ, 1250 нМ, 2500 нМ, 5000 нМ и 10000 нМ, как указано в Таблице 5. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS3029 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) каждого олигонуклеотида также представлена в Таблице 5 и рассчитывалась путем построения графика зависимости используемых концентраций олигонуклеотидов от процента ингибирования экспрессии мРНК транстиретина, достигнутого при каждой концентрации, и определения концентрации олигонуклеотида, при которой достигалось 50% ингибирования экспрессии мРНК транстиретина по сравнению с контролем. Как показано в Таблице 5, уровни мРНК транстиретина значительно снижались зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 5 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2 с помощью электропорации № ISIS 625 нМ 1250нМ 2500 нМ 5000 нМ 10000 нМ IC₅₀ (мкМ) 304296 57 74 83 91 96 <0,625 304299 43 76 82 95 94 0,627 420913 59 75 90 88 98 <0,625 420915 60 85 91 95 99 <0,625 420951 64 77 90 97 99 <0,625 425653 70 86 86 88 82 <0,625 425655 48 80 85 97 96 <0,625 425656 70 89 92 92 96 <0,625 425659 46 56 68 82 93 0,8 425679 63 77 72 94 97 <0,625 425680 28 79 85 93 98 0,8 425693 2 64 74 76 81 1,7 425695 74 87 91 97 98 <0,625 425716 69 84 95 97 98 <0,625 425719 58 84 92 96 98 <0,625 425721 40 75 89 95 98 0,7 425736 64 71 86 93 93 0,625 425737 78 93 95 97 98 <0,625 425738 40 77 88 94 95 0,7 425754 56 75 87 96 99 <0,625 425755 58 84 88 94 97 <0,625 425757 62 82 94 97 99 <0,625 425760 58 42 74 85 93 <0,625 425765 81 86 87 83 88 <0,б25 425766 83 89 81 75 74 <0,625 425767 56 75 83 81 80 <0,625

Также были испытаны гапмеры по Примеру 2 в разных дозах в клетках HepG2 с использованием реагента для трансфекции - липофектина. Клетки высеивают при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ и 100 нМ, как указано в Таблице 6. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS3029 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 6, уровни мРНК транстиретина значительно снижались зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 6 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2 с использованием реагента липофектина № ISIS 6,25 нМ 12,5нМ 25 нМ 50 нМ 100 нМ IC₅₀ (НМ) 304296 26 41 43 52 65 39 304299 22 70 43 74 83 20 420913 4 60 60 68 82 30 420915 36 31 46 64 67 28 420951 10 37 56 85 84 19 425653 25 38 60 74 77 18 425655 27 15 62 79 81 16 425656 37 62 47 69 82 15 425659 17 35 33 79 73 30 425679 32 6 63 79 77 14 425680 16 48 41 84 84 28 425693 10 19 51 66 61 26 425695 36 23 54 76 84 28 425716 57 52 36 85 81 38 425719 25 39 28 60 76 45 425721 0 22 38 73 75 32 425736 25 60 30 77 80 22 425737 36 52 50 60 76 14 425738 13 15 19 65 70 27 425754 8 18 38 75 71 42 425755 26 46 54 77 86 20 425757 0 37 81 83 71 19 425760 28 46 72 70 80 18 425765 0 52 48 66 69 29 425766 24 19 48 69 71 29 425767 41 49 48 65 75 14

Пример 4: Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2

Гапмеры, выбранные в Примере 3, были подвергнуты испытаниям в разных дозах в клетках HepG2. Клетки высеивают при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 0,0617 мкМ, 0,1852 мкМ, 0,5556 мкМ, 1,6667 мкМ и 5 мкМ, как указано в Таблице 7. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS3029 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 7, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 7 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2 с помощью электропорации № ISIS 0,0617 мкМ 0,1852 мкМ 0,5556 мкМ 1,6667 мкМ 5 мкМ IC₅₀ (мкМ) 304296 0 6 44 58 83 1,2 304299 38 10 57 83 92 0,6 420913 51 51 54 73 93 0,2 420915 33 35 62 65 93 0,2 420951 40 33 36 82 96 0,4 425653 55 58 74 72 84 <0,06 425655 8 35 54 57 90 0,5 425656 12 43 43 78 94 0,4 425659 14 35 19 46 82 0,6 425679 30 13 23 69 91 0,8 425680 0 35 45 74 84 0,7 425693 0 6 14 32 59 3,4 425695 15 47 61 81 91 0,3 425716 20 17 53 77 91 0,6 425719 0 14 45 78 94 0,8 425721 0 0 22 74 84 0,9 425736 42 43 56 76 91 0,3 425737 21 29 61 81 97 0,3 425738 14 39 57 74 93 0,4 425754 29 34 45 78 94 0,4 425755 8 21 57 78 95 0,5 425757 29 28 62 83 95 0,4 425760 3 6 9 56 77 1,4 425765 24 51 75 77 88 0,3 425766 7 41 59 73 77 0,3 425767 1 18 49 66 79 1,0

Пример 5: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в клетках Нер3В

Гапмеры по Примеру 4, демонстрирующие значительное in vitro ингибирование транстиретина человека, были подвергнуты испытаниям в разных дозах в клетках Нер3В. Клетки высеивают при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 0,0206 мкМ, 0,062 мкМ, 0,185 мкМ, 0,556 мкМ, 1,667 мкМ и 5 мкМ, как указано в Таблице 8. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS1396 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 8, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом. Значения IC₅₀ для каждого олигонуклеотида также представлены в Таблице 8.

Таблица 8 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках Нер3В с помощью электропорации № ISIS 0,0206 мкМ 0,062 мкМ 0,185 мкМ 0,556 мкМ 1,667 мкМ 5 мкМ IC₅₀ (мкМ) 304299 27 2 25 52 76 96 0,5 420915 0 12 27 30 69 93 0,8 425653 23 13 55 86 88 91 0,1 425655 3 30 32 62 84 94 0,3 425656 0 0 29 66 82 95 0,5 425679 0 21 36 71 92 97 0,3 425695 37 23 63 79 94 98 0,1 425736 31 43 40 64 82 95 0,1 425737 0 13 62 82 95 98 0,2 425755 17 8 18 69 86 98 0,4 425757 22 47 53 79 96 98 0,2

Пример 6: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в первичных гепатоцитах трансгенных мышей с транстиретином человека

Гапмеры по Примеру 5 также были испытаны в разных дозах в первичных гепатоцитах трансгенных мышей с транстиретином человека. ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312 и ISIS 420951 (см. Пример 2) также были повторно испытаны вместе с этими гапмерами в таких же условиях культивации. Клетки высеивают при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью цитофектина концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 18,75 нМ, 37,5 нМ, 75 нМ, 150 нМ и 300 нМ, как указано в Таблице 9. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS1396 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 9, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 9 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в первичных гепатоцитах мыши с использованием цитофектина № ISIS 18,75 нМ 37,5 нМ 75 нМ 150нМ 300 нМ Мотив 304299 54 79 97 98 99 5-10-5 304309 48 77 94 99 99 5-10-5 304311 45 79 92 96 98 5-10-5 304312 33 71 89 96 98 5-10-5 420915 40 70 92 98 99 5-10-5 420951 41 86 96 98 99 5-10-5 425653 44 81 93 96 99 5-10-5 425655 61 88 96 99 99 3-14-3 425656 61 84 94 98 99 3-14-3 425679 74 78 97 98 99 3-14-3 425695 66 84 96 98 99 2-13-5 425736 58 84 95 98 99 4-11-5 425737 57 77 95 98 99 4-11-5 425755 61 82 96 99 99 4-11-5 425757 37 77 93 98 98 4-11-5

Пример 7: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в клетках HepG2

Гапмеры по Примеру 6 были подвергнуты испытаниям в разных дозах в клетках HepG2. Клетки высеивают при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 0,062 мкМ, 0,185 мкМ, 0,556 мкМ, 1,66 мкМ и 5,000 мкМ, как указано в Таблице 10. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS1396 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 10, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 10 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в клетках HepG2 с помощью электропорации № ISIS 0,062 мкМ 0,185 мкМ 0,556 мкМ 1,667 мкМ 5,000 мкМ IC₅₀ (мкМ) Мотив 304299 55 66 72 87 96 0,037 5-10-5 304309 41 65 72 91 96 0,087 5-10-5 304311 57 83 88 89 83 0,001 5-10-5 304312 46 69 74 84 81 0,038 5-10-5 420915 38 62 80 90 98 0,096 5-10-5 420951 45 71 84 93 97 0,049 5-10-5 425653 48 73 87 88 82 0,017 5-10-5 425655 40 57 77 85 95 0,105 3-14-3 425656 28 54 70 94 97 0,177 3-14-3 425679 43 51 81 95 99 0,106 3-14-3 425695 49 67 90 96 99 0,043 2-13-5 425736 32 63 85 95 98 0,108 4-11-5 425737 42 71 90 98 99 0,053 4-11-5 425755 24 63 85 95 99 0,137 4-11-5 425757 21 62 86 96 99 0,148 4-11-5

Пример 8: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в первичных гепатоцитах трансгенных мышей с транстиретином человека

Гапмеры по Примеру 6 также были испытаны в разных дозах в первичных гепатоцитах трансгенных мышей с транстиретином человека. Клетки высеивают при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью цитофектина концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 40 нМ и 80 нМ, как указано в Таблице 11. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS3029 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 11, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.

Таблица 11 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в первичных гепатоцитах мыши с использованием цитофектина № ISIS 5 нМ 10 нМ 20 нМ 40 нМ 80 нМ Мотив 304299 0 8 37 69 90 5-10-5 304309 0 9 39 75 93 5-10-5 304311 1 13 43 70 81 5-10-5 304312 0 3 32 64 76 5-10-5 420915 0 0 34 59 87 5-10-5 420951 0 12 57 84 92 5-10-5 425653 0 9 44 72 84 5-10-5 425655 0 19 45 80 91 3-14-3 425656 0 2 33 70 93 3-14-3 425679 0 13 42 72 90 3-14-3 425695 3 12 33 70 90 2-13-5 425736 2 7 37 70 89 4-11-5 425737 0 4 36 65 89 4-11-5 425755 0 25 50 75 94 4-11-5 425757 0 5 43 72 92 4-11-5

Гапмеры также были подвергнуты испытаниям с использованием электропорации в качестве агента трансфекции. Клетки высеивают при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 148,148 нМ, 444,444 нМ, 1333,333 нМ, 4000 нМ и 12000 нМ, как указано в Таблице 12. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS3029 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Таблица 12 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в первичных гепатоцитах мыши с помощью электропорации № ISIS 148,148 нМ 444,444 нМ 1333,333 нМ 4000 нМ 12000 нМ Мотив 304299 75 96 98 98 99 5-10-5 304309 72 96 98 98 98 5-10-5 304311 68 92 93 94 97 5-10-5 304312 50 84 92 93 97 5-10-5 420915 55 89 96 96 97 5-10-5 420951 65 92 95 96 98 5-10-5 425653 68 89 91 93 95 5-10-5 425655 63 94 96 96 96 3-14-3 425656 69 93 98 98 98 3-14-3 425679 63 92 97 98 98 3-14-3 425695 69 92 96 96 95 2-13-5 425736 75 93 96 96 96 4-11-5 425737 71 94 96 96 95 4-11-5 425755 70 93 95 95 95 4-11-5 425757 61 91 95 95 95 4-11-5

Пример 9: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в первичных гепатоцитах яванского макака

Гапмеры по Примеру 6 также были испытаны в разных дозах в первичных гепатоцитах яванского макака. Клетки высеивают при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, равными 1250 нМ, 2500 нМ, 5000 нМ, 10000 нМ и 20000 нМ, как указано в Таблице 13. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS1396 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 13, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в гепатоцитах, обработанных олигонуклеотидами ISIS.

Из-за отсутствия полной генной последовательности яванского макака в базе данных NCBI, олигонуклеотиды были подвергнуты испытаниям на перекрестную реактивность с генной последовательностью макака-резуса, поскольку оба вида принадлежат к одному роду Масаса. Человеческие олигонуклеотиды являются перекрестно реактивными с геном транстиретина макака-резуса, обозначенным тут как SEQ ID NO:4 (экзоны 1-4, выделенные из №Доступа GENBANK NW_301105671.1). "Неспаренные основания" указывают число неспаренных оснований между олигонуклеотидом человека и геном транстиретина макака-резуса, "н.д." указывает, что олигонуклеотид человека имеет более 3 неспаренных оснований с геном транстиретина макака-резуса и потому перекрестно не реагирует с ним.

Таблица 13 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в первичных гепатоцитах макака-резуса с помощью электропорации № ISIS 1250 нМ 2500 нМ 5000 нМ 10000 нМ 20000 нМ IC₅₀ (мкМ) Целевой иниц. сайт макака-резуса Целевой терм. сайт макака-резуса Неспаренные основания 304299 21 45 69 80 95 3,1 504 523 0 304309 53 66 79 85 93 <1,25 575 594 0 304311 75 78 82 86 90 <1,25 594 613 0 304312 37 53 65 75 80 2,3 595 614 0 420915 59 54 77 87 94 <1,25 505 524 0 420951 67 77 91 93 96 <1,25 578 597 0 425653 56 72 84 83 85 <1,25 593 612 0 425655 0 7 0 21 45 >20 478 497 2 425656 41 20 38 53 51 8,7 479 498 2 425679 68 74 88 94 98 <1,25 578 597 0 425695 42 29 41 49 65 25,8 478 497 2 425736 36 27 37 49 74 8,2 479 498 2 425737 76 78 89 95 97 <1,25 501 520 0 425755 79 80 92 94 97 <1,25 578 597 0 425757 68 74 88 95 96 <1,25 580 599 0

Пример 10: In vivo ингибирование транстиретина человека у трансгенных мышей с транстиретином человека

Гапмеры по Примеру 6, демонстрирующие значительное ингибирование мРНК транстиретина, были подвергнуты испытаниям на трансгенных мышах, содержащих ген транстиретина человека, с проведением оценки эффективности гапмеров.

Экспериментальное введение

Пятнадцати группам по четыре самки hTTR трансгенных мышей в каждой вводят подкожно два раза в неделю в течение четырех недель 25 мг/кг ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425653, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, ISIS 425755 или ISIS 425757. Другой группе из четырех самок hTTR трансгенных мышей вводят инъекцией 25 мг/кг контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, обозначенная тут как SEQ ID NO:165) два раза в неделю в течение четырех недель. Другой группе из четырех самок hTTR трансгенных мышей вводят подкожными инъекциями PBS два раза в неделю в течение четырех недель. Мыши, получавшие инъекции PBS, служат контрольной группой. Образцы крови берут у всех групп в недели 0, 1, 2, 3 и 4 для анализа уровня транстиретина плазмы. Мышей умерщвляют через два дня после последней дозы и берут печень для анализа мРНК-мишени.

Анализ РНК

РНК экстрагируют из ткани печени для анализа транстиретина способом ПЦР в реальном масштабе времени с использованием набора праймер-зонд RTS3029. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина человека, по сравнению с PBS-контролем. Как видно из Таблицы 14, введение антисмысловых олигонуклеотидов ISIS приводит к значительному снижению мРНК транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем. Введение контрольного олигонуклеотида, ISIS 141923, не приводило к значительному снижению транстиретина, как ожидалось.

Таблица 14 Ингибирование мРНК транстиретина человека в печени DTTR трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем № ISIS % ингибирования 304299 79 304309 83 304311 63 304312 64 420915 82 420951 92 425653 66 425655 76 425656 76 425679 93 425695 82 425736 63 425737 76 425755 91 425757 91 141923 28

Анализ белка

Уровни белка транстиретина человека измеряют в плазме трансгенных мышей способом ELISA с использованием поликлонального антитела против транстиретина (Abeam Ab 37774) и детектирующего антитела овечьей анти-TTR пероксидазы хрена (Abeam, №по каталогу 35217). Цветную реакцию получают с помощью Набора ImmunoPure^® TMB Substrate и измеряют поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для микротитровальных планшетов. Образцы плазмы берут до введения дозы и в дни 7, 14 и 28. Результаты, представленные в Таблице 15, выражены как процент ингибирования по сравнению с уровнями до введения дозы и демонстрируют время-зависимое снижение уровней белка при введении олигонуклеотидов ISIS.

Таблица 15 Ингибирование белка транстиретина человека в плазме hTTR трансгенных мышей по сравнению с уровнями до введения доз   PBS ISIS 304299 ISIS 304309 ISIS 420915 ISIS 420951 ISIS 425679 ISIS 425695 ISIS 425755 ISIS 141923 день 7 0 50 63 71 92 99 69 57 3 день 14 3 76 78 90 98 100 80 72 3 день 21 20 88 81 95 100 99 88 78 13 день 28 13 89 83 98 100 100 91 79 8

Вес тела и вес органов

Вес тела мышей измеряют до введения дозы и в конце периода введения дозы. Значения веса тела приведены в Таблице 16 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований и он также приведен в Таблице 16 как процент изменений по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля. Как видно из Таблицы 16, не наблюдалось значительных изменений веса тела или органов в результате введения антисмыслового олигонуклеотида.

Таблица 16 Процент изменения веса тела или органов трансгенных мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 1,1 1,0 1,0 1,0 ISIS 304299 1,1 1,1 1,0 0,8 ISIS 304309 1,1 1,1 1,0 1,0 ISIS 304311 1,1 1,2 1,0 1,2 ISIS 304312 1,1 1,3 1,0 0,8 ISIS 420915 1,1 1,1 1,0 1,1 ISIS 420951 1,1 1,2 1,0 1,5 ISIS 425653 1,1 1,1 0,9 1,0 ISIS 425655 1,1 1,3 1,0 1,2 ISIS 425656 1,2 1,3 1,0 1,3 ISIS 425679 1,2 1,2 1,0 1,6 ISIS 425695 1,1 1,3 1,0 1,0 ISIS 425736 1,2 1,2 1,0 1,0 ISIS 425737 1,1 1,2 1,1 1,2 ISIS 425755 1,2 1,3 1,1 1,3 ISIS 425757 1,1 1,9 1,0 1,5 ISIS 141923 1,1 1,1 1,0 0,8

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы), и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 17. Также измеряют уровни билирубина плазмы с помощью такого же клинического химического анализатора; результаты также приведены в Таблице 17 и выражены в мг/дл.

Таблица 17 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени трансгенных мышей   ALT (IU/л) AST (IU/л) Билирубин (мг/дл) PBS 31 78 0,23 ISIS 304299 40 121 0,19 ISIS 304309 38 119 0,20 ISIS 304311 34 60 0,16 ISIS 304312 43 67 0,17 ISIS 420915 34 75 0,26 ISIS 420951 75 124 0,17 ISIS 425653 35 78 0,20 ISIS 425655 131 109 0,16 ISIS 425656 68 110 0,19 ISIS 425679 119 180 0,20 ISIS 425695 43 69 0,15 ISIS 425736 23 58 0,16 ISIS 425737 35 64 0,19 ISIS 425755 109 162 0,16 ISIS 425757 1904 937 0,24 ISIS 141923 31 76 0,19

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки, измеряют концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты приведены в Таблице 18 и выражены в мг/дл. Данные указывают, что антисмысловое ингибирование транстиретина не влияет на уровни BUN у этих трансгенных мышей.

Таблица 18 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN (мг/дл) в почке трансгенных мышей   BUN (мг/дл) PBS 26 ISIS 304299 24 ISIS 304309 29 ISIS 304311 28 ISIS 304312 26 ISIS 420915 25 ISIS 420951 25 ISIS 425653 24 ISIS 425655 28 ISIS 425656 25 ISIS 425679 26 ISIS 425695 28 ISIS 425736 25 ISIS 425737 23 ISIS 425755 24 ISIS 425757 25 ISIS 141923 23

Пример 11: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, у CD1-мышей

CD1^®-мыши (Charles River, MA) представляют собой многоцелевую мышиную модель, часто используемую для испытаний на безопасность и эффективность. Мышам вводят ISIS-антисмысловые олигонуклеотиды, выбранные по результатам исследований, описанных в Примере 10, и оценивают изменения уровней различных метаболических маркеров.

Экспериментальное введение

Группам по восемь CD1-мышей в каждой вводят подкожными инъекциями два раза в неделю 50 мг/кг ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 и ISIS 425755. По четыре мыши из каждой группы используют для оценки в неделю 2 и неделю 6 периода эксперимента. Через три дня после последней дозы в каждый момент времени, измеряют вес тела, мышей подвергают эвтаназии и органы и плазму собирают для дальнейшего анализа.

Вес тела и органов

Вес тела мышей измеряют до введения дозы и в конце каждого периода введения (две недели и шесть недель). Значения веса тела приведены в Таблицах 19 и 20 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований, и они также представлены в Таблицах 19 и 20 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 19 Изменение веса тела и органов CD1-мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида (%) в неделю 2   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 1,1 1,0 1,0 1,0 ISIS 304299 1,1 1,1 1,1 1,1 ISIS 304309 1,1 1,1 1,1 1,0 ISIS 420915 1,1 1,1 1,1 1,0 ISIS 420951 1,1 1,3 1,7 1,2 ISIS 425655 1,1 1,2 1,2 0,9 ISIS 425656 1,1 1,1 1,1 1,0 ISIS 425679 1,1 1,1 1,4 1,1 ISIS 425695 1,1 1,1 0,9 1,1 ISIS 425736 1,1 1,1 1,0 1,1 ISIS 425737 1,2 1,1 1,1 1,1 ISIS 425755 1,2 1,2 1,3 1,2

Таблица 20 Изменение веса тела и органов CD1-мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида (%) в неделю 6   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 1,2 1,0 1,0 1,0 ISIS 304299 1,3 1,2 1,4 1,0 ISIS 304309 1,3 1,3 2,0 1,0 ISIS 420915 1,3 1,1 1,5 0,9 ISIS 420951 1,3 1,3 2,0 1,1 ISIS 425655 1,4 1,3 1,7 0,9 ISIS 425656 1,3 1,3 1,1 1,0 ISIS 425679 1,3 1,4 2,3 1,2 ISIS 425695 1,3 1,4 1,5 1,0 ISIS 425736 1,3 1,1 1,2 0,9 ISIS 425737 1,2 1,1 1,3 1,0 ISIS 425755 1,3 1,3 2,1 1,0

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) измеряют, и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблицах 21 и 22. Уровни билирубина и альбумина плазмы также измеряют с помощью такого же клинического химического анализатора и результаты также представлены в Таблицах 21 и 22.

Таблица 21 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени CD1-мышей в неделю 2   ALT (IU/л) AST (IU/л) Билирубин (мг/дл) Альбумин (г/дл) PBS 38 66 0,19 5,0 ISIS 304299 42 79 0,33 3,8 ISIS 304309 52 77 0,22 3,2 ISIS 420915 32 61 0,28 3,5 ISIS 420951 1184 804 0,17 3,7 ISIS 425655 60 70 0,20 3,9 ISIS 425656 37 53 0,31 3,5 ISIS 425679 88 147 0,23 3,7 ISIS 425695 25 50 0,23 3,6 ISIS 425736 31 79 0,23 3,2 ISIS 425737 39 43 0,23 3,1 ISIS 425755 104 85 0,29 3,6

Таблица 22 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени CD1-мышей в неделю 6   ALT (IU/л) AST (IU/л) Билирубин (мг/дл) Альбумин (г/дл) PBS 31 67 0,20 5,6 ISIS 304299 54 71 0,20 5,2 ISIS 304309 1211 504 0,30 5,2 ISIS 420915 89 91 0,17 5,0 ISIS 420951 872 319 0,20 3,6 ISIS 425655 730 247 0,13 4,3 ISIS 425656 502 261 0,17 4,3 ISIS 425679 935 475 0,29 4,5 ISIS 425695 1627 563 0,16 4,0 ISIS 425736 41 47 0,15 4,1 ISIS 425737 32 55 0,16 4,1 ISIS 425755 233 176 0,16 4,3

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки, концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) и креатинина измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблицах 23 и 24.

Таблица 23 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры (мг/дл) в почке CD1-мышей в неделю 2   BUN Креатинин PBS 32 0,23 ISIS 304299 26 0,21 ISIS 304309 30 0,19 ISIS 420915 30 0,22 ISIS 420951 24 0,17 ISIS 425655 29 0,22 ISIS 425656 25 0,19 ISIS 425679 28 0,19 ISIS 425695 29 0,19 ISIS 425736 24 0,19 ISIS 425737 24 0,16 ISIS 425755 27 0,17

Таблица 24 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры (мг/дл) в почке CD1-мышей в неделю 6   BUN Креатинин PBS 24 0,15 ISIS 304299 19 0,11 ISIS 304309 20 0,14 ISIS 420915 24 0,18 ISIS 420951 19 0,08 ISIS 425655 22 0,11 ISIS 425656 21 0,10 ISIS 425679 20 0,06 ISIS 425695 21 0,08 ISIS 425736 22 0,07 ISIS 425737 18 0,07 ISIS 425755 22 0,09

Гематологические анализы

Кровь, взятую у всех мышей группы, отправляли в Antech Diagnostics для измерений и анализов гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН) и средней концентрации эритроцитарного гемоглобина (МСНС), а также для проведения дифференциального анализа клеток крови, таких как белые кровяные клетки (WBC) (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), красные кровяные клетки (RBC) и тромбоциты, и общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблицах 25-28. Проценты, приведенные в таблицах, указывают процент изменения общего количества клеток крови по сравнению с PBS-контролем. Антисмысловые олигонуклеотиды, не вызывавшие снижения числа тромбоцитов до значения, составляющего менее 70% от PBS-контроля, или более чем двукратного увеличения числа моноцитов, были выбраны для дальнейших исследований.

Таблица 25 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CD1-мышей в неделю 2 № ISIS WBC RBC Гемоглобин НСТ MCV МСН МСНС 304299 -15 -3 -2 0 +3 +1 -1 304309 -13 -4 -7 -6 -2 -4 -2 420915 +7 -7 -7 -5 +2 +1 -2 420951 +79 -6 -5 -5 +1 +1 0 425655 +56 -3 -5 -4 -1 -2 -1 425656 +69 -5 -6 -5 0 -1 -2 425679 +30 -6 -7 -7 -1 -1 0 425695 +49 -3 -4 -4 0 0 +1 425736 +15 -6 -6 -4 +1 0 -2 425737 +19 -5 -7 -5 -1 -3 -2 425755 +85 -3 -6 -6 -4 -3 0

Таблица 26 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CD1-мышей в неделю 6 № ISIS WBC RBC Гемоглобин НСТ MCV МСН МСНС 304299 -7 -9 -10 -13 -5 0 +4 304309 +10 -12 -11 -15 -5 +1 +6 420915 +11 -7 -8 -10 -4 -2 +2 420951 +81 -12 -20 -19 -9 -9 -1 425655 +29 -3 -11 -10 -8 -9 -2 425656 +72 -1 -5 -6 -4 -5 -1 425679 +154 -11 -20 -21 -10 -9 +2 425695 +118 +3 -9 -9 -2 -12 +3 425736 +51 +4 -5 -7 0 -10 +1 425737 +30 +8 -1 -2 0 -8 +1 425755 +54 -1 -11 -12 -8 -10 0

Таблица 27 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на дифференциальное определение клеток крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CDI-мышей в неделю 2 № ISIS Нейтрофилы Моноциты Лимфоциты Тромбоциты 304299 11 -3 20 17 304309 -11 5 8 14 420915 1 4 -24 41 420951 18 -7 32 -9 425655 18 -5 20 18 425656 31 -7 -4 24 425679 2 -1 24 -19 425695 -50 15 20 29 425736 8 -1 0 10 425737 -29 10 -8 24 425755 -13 7 -4 9

Таблица 28 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на дифференциальное определение клеток крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CDI-мышей в неделю 6 № ISIS Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты Тромбоциты 304299 -60 +26 +10 -16 304309 -28 +12 +30 +2 420915 -29 +6 +50 -30 420951 -26 +11 0 -40 425655 -16 +8 -10 -19 425656 -22 +16 -50 -25 425679 -36 +19 -20 -27 425695 -25 +9 -15 -49 425736 -41 +16 -5 -46 425737 -53 +23 -20 -65 425755 -20 +4 +25 -41

Пример 12: Измерение периода полувыведения антисмыслового олигонуклеотида в печени CD1-мышей

CD1-мышам вводят ISIS антисмысловые олигонуклеотиды, определенные по результатам исследований, описанных в Примере 11, и оценивают период полувыведения олигонуклеотида, а также время, проходящее до деградации олигонуклеотида и выведения из печени.

Введение

Группам по двенадцать CD1-мышей каждая вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 2 недель 50 мг/кг ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 и ISIS 425755. По четыре мыши из каждой группы умерщвляют через 3 дня, 28 дней и 56 дней после последней дозы. Берут печень на анализ.

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряют концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (включая деградированную форму). Используемый способ представляет собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые состоят в фенол-хлороформенной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазовой экстракцией. Перед экстракцией прибавляют внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный 2'-O-метоксиэтил-модифицированный фосфоротиоатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный тут как SEQ ID NO:166). Концентрации в образцах тканей рассчитывают с использованием калибровочных кривых, при нижнем пределе количественного определения (LLOQ), равном приблизительно 1,14 мкг/г. Затем рассчитывают периоды полувыведения с помощью прикладной программы WinNonlin (PHARSIGHT).

Результаты представлены в Таблицах 29 и 30, и выражены в мкг/г ткани печени. Период полувыведения каждого олигонуклеотида приведен в Таблице 31. Антисмысловые олигонуклеотиды с периодами полувыведения в пределах 11-34 дней были выбраны для дальнейших исследований.

Таблица 29 Концентрация полноразмерного олигонуклеотида (мкг/г) в печени CD1-мышей № ISIS 3 дня 28 дней 56 дней 304299 180 56 8 304309 317 254 106 420915 248 126 34 420951 173 109 49 425655 191 113 33 425656 256 73 29 425679 201 73 27 425695 315 194 65 425736 219 110 47 425737 190 40 9 425755 211 120 47

Таблица 30 Полная концентрация олигонуклеотида (мкг/г) в печени CD1-мышей № ISIS Здня 28 дней 56 дней 304299 268 168 38 304309 389 354 152 420915 314 229 83 420951 262 196 131 425655 298 217 87 425656 328 135 85 425679 333 161 103 425695 364 263 143 425736 298 211 140 425737 266 117 31 425755 337 227 140

Таблица 31 Период полувыведения олигонуклеотида (дней) в печени CD1-мышей № ISIS Период полувыведения (дней) 304299 12 304309 33 420915 19 420951 29 425655 21 425656 17 425679 18 425695 23 425736 24 425737 12 425755 24

Пример 13: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, у крыс Sprague-Dawley

Крысам Sprague-Dawley вводят ISIS антисмысловые олигонуклеотиды, выбранные по результатам исследований, описанных в Примерах 11 и 12, и оценивают изменения уровней различных метаболических маркеров.

Введение

Значения веса тела, клинический анализ крови и дифференциальный анализ крови, а также соотношение белок/креатинин в моче крыс оценивают до введения дозы. Группам из четырех крыс Sprague-Dawley вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю 50 мг/кг ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 и ISIS 425755. Через три дня после последней дозы для каждого момента времени измеряют вес тела, крыс подвергают эвтаназии и органы и плазму собирают для дальнейшего анализа.

бес тела и органов

Значения веса тела крыс измеряют до введения дозы и в конце периода введения дозы. Значения веса тела приведены в Таблице 32 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований и он также приведен в Таблице 32 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 32 Изменение веса тела и органов крыс Sprague-Dawley после введения антисмыслового олигонуклеотида (%)   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 1,6 1,0 1,0 1,0 ISIS 304299 1,2 1,7 4,9 1,6 ISIS 304309 1,1 1,6 4,3 1,4 ISIS 420915 1,4 1,4 3,3 1,3 ISIS 420951 1,1 1,4 5,0 1,5 ISIS 425655 1,2 1,5 3,4 1,3 ISIS 425656 1,2 1,5 2,9 1,2 ISIS 425679 1,0 1,9 6,4 1,7 ISIS 425695 1,2 1,6 3,3 1,3 ISIS 425736 1,3 1,5 2,9 1,2 ISIS 425737 1,2 1,7 4,0 1,5 ISIS 425755 1,0 1,5 5,4 1,5

Как видно из Таблицы 32, определенные соединения демонстрируют менее чем 4-кратное увеличение веса селезенки.

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) и в Таблице 33 представлены результаты, выраженные в IU/л. Уровни билирубина и альбумина плазмы также измеряют с помощью такого же клинического химического анализатора и результаты также приведены в Таблице 33.

Таблица 33 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени крыс Sprague-Dawley   ALT (IU/л) AST (IU/л) Билирубин (мг/дл) Альбумин (г/дл) PBS 55 138 0,15 3,3 ISIS 304299 69 154 0,15 2,7 ISIS 304309 80 138 0,11 2,9 ISIS 420915 43 95 0,11 3,0 ISIS 420951 353 511 0,32 2,6 ISIS 425655 312 497 0,47 2,6 ISIS 425656 277 335 0,20 3,0 ISIS 425679 537 659 0,38 2,7 ISIS 425695 228 445 0,23 2,3 ISIS 425736 362 553 0,32 2,9 ISIS 425737 55 79 0,09 1,9 ISIS 425755 271 303 0,41 2,8

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки, концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) и креатинина измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 34. Отношение общего белка мочи к креатинину также оценивалось и представлено в Таблице 35.

Таблица 34 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры (мг/дл) в почке крыс Sprague-Dawley   BUN Креатинин PBS 20 0,26 ISIS 304299 30 0,40 ISIS 304309 24 0,33 ISIS 420915 20 0,26 ISIS 420951 37 0,47 ISIS 425655 28 0,40 ISIS 425656 25 0,34 ISIS 425679 46 0,42 ISIS 425695 30 0,37 ISIS 425736 26 0,37 ISIS 425737 30 0,36 ISIS 425755 29 0,36

Таблица 35 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на общий белок мочи/креатинин в почке крыс Sprague-Dawley   До введения дозы Неделя 6 PBS 0,82 0,95 ISIS 304299 0,95 7,57 ISIS 304309 1,10 5,20 ISIS 420915 0,91 5,30 ISIS 420951 0,90 5,02 ISIS 425655 0,78 6,03 ISIS 425656 0,86 9,37 ISIS 425679 0,91 7,80 ISIS 425695 0,89 5,71 ISIS 425736 1,00 5,85 ISIS 425737 0,86 43,76 ISIS 425755 0,78 3,70

Как видно из Таблиц 34 и 35, определенные соединения продемонстрировали менее чем 7-кратное увеличение общего белка мочи/креатинина в почке этих крыс. Кроме того, определенные соединения продемонстрировали менее чем 6-кратное увеличение общего белка мочи/креатинина в почке этих крыс.

Гематологические анализы

Кровь, взятую у всех групп крыс, отправляли в Antech Diagnostics для измерений и анализов гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН) и средней концентрации эритроцитарного гемоглобина (МСНС), а также измерений дифференциального количества клеток крови, таких как белые кровяные клетки (WBC) (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), красные кровяные клетки (RBC) и тромбоциты, и общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблицах 36 и 37. Проценты, приведенные в таблицах, указывают процент изменения общего количества клеток крови по сравнению с PBS-контролем.

Таблица 36 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у крыс Sprague-Dawley № ISIS WBC RBC Гемоглобин НСТ MCV МСН МСНС 304299 +4 -5 -3 +2 +11 +5 -5 304309 -10 -8 -11 -12 -4 -3 +1 420915 -9 -16 -20 -17 +1 -3 -3 420951 +5 -5 -8 -5 +1 -2 -3 425655 +22 -17 -18 -19 -2 0 +2 425656 -1 -13 -19 -16 -3 -6 -2 425679 +49 -42 -32 -28 +26 +19 -5 425695 -2 -25 -31 -29 -4 -8 -3 425736 +18 +1 -3 +2 0 -4 -4 425737 -15 -20 -18 -20 +2 +3 +1 425755 +35 -31 -27 -23 +14 +8 -4

Таблица 37 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у крыс Sprague-Dawley № ISIS Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты Тромбоциты 304299 -61 +15 -10 -41 304309 -35 +8 +10 -37 420915 -23 +6 0 -29 420951 -62 +15 +10 -67 425655 +23 -8 +80 -13 425656 -14 0 +70 -15 425679 -4 -1 +60 -75 425695 +68 -20 +80 -5 425736 0 -2 +70 -1 425737 -6 +1 +20 -21 425755 -18 +3 +70 -58

Пример 14: Фармакокинетические исследования концентрации антисмыслового олигонуклеотида в печени и почке крыс Sprague-Dawley

Крысам Sprague-Dawley вводят ISIS-антисмысловые олигонуклеотиды, определенные по результатам исследований, описанных в Примере 13, и оценивают период полувыведения олигонуклеотида, а также время, проходящее до деградации олигонуклеотида и выведения из печени и почки.

Введение

Группам по четыре крысы Sprague Dawley вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 2 недель 20 мг/кг ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 и ISIS 425755. Через три дня после последней дозы, крыс умерщвляют и печень и почки берут для анализов.

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряют концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (включая деградированную форму). Используемый способ представляет собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые заключаются в фенол-хлороформенной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазовой экстракцией. Перед экстракцией прибавляют внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный 2'-O-метоксиэтил-модифицированный фосфоротиоатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный тут как SEQ ID NO:166). Концентрации в образцах тканей рассчитывают с использованием калибровочных кривых, при нижнем пределе количественного определения (LLOQ), равном приблизительно 1,14 мкг/г.Результаты, представленные в Таблицах 38 и 39, выражены в мкг/г ткани печени или почки. Также рассчитывают отношение полноразмерного олигонуклеотида к почке и печени, приведенное в Таблице 38.

Таблица 38 Концентрация полноразмерного олигонуклеотида (мкг/г) и отношение в печени и почке крыс Sprague-Dawley № ISIS Печень Почка Отношение почка/печень 304299 165 487 2,9 304309 344 606 1,8 420915 171 680 4,0 420951 214 389 1,8 425655 242 466 1,9 425656 286 595 2,1 425679 290 334 1,2 425695 266 566 2,1 425736 245 571 2,3 425737 167 477 2,9 425755 218 379 1,7

Таблица 39 Полная концентрация олигонуклеотида (мкг/г) в печени и почке крыс Sprague-Dawley № ISIS Печень Почка 304299 208 653 304309 409 803 420915 196 844 420951 348 879 425655 340 764 425656 329 703 425679 461 710 425695 369 843 425736 282 738 425737 195 587 425755 351 886

Пример 15: In vivo дозазависимое ингибирование транстиретина человека у трансгенных мышей

Трансгенным мышам, содержащим ген транстиретина человека, вводят возрастающие дозы ISIS-олигонуклеотидов, выбранных по результатам исследований, описанных в Примере 14, для оценки эффекта дозазависимого ингибирования транстиретина человека у этих мышей.

Введение

Группам по четыре мыши, два самца и две самки, вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель 4 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425679, ISIS 425736, ISIS 425737 или ISIS 425755. Одной группе из четырех мышей, двух самцов и двух самок, вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель 25 мг/кг контрольного олигонуклеотида, ISIS 141923. Одной контрольной группе из четырех мышей, двух самцов и двух самок, вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель PBS. Образцы плазмы берут в каждой группе в дни 0, 7, 14, 21 и 28. Через два дня после последней дозы мышей подвергают эвтаназии и органы собирают для дальнейших анализов.

Анализ РНК

РНК экстрагируют из ткани печени для анализа транстиретина способом ПЦР в реальном масштабе времени с использованием набора праймер-зонд RTS3029. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина человека, по сравнению с PBS-контролем. Как видно из Таблицы 40, введение антисмысловых олигонуклеотидов ISIS приводит к значительному дозазависимому снижению мРНК транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем. Введение контрольного олигонуклеотида, ISIS 141923 не приводило к значительному снижению транстиретина, как ожидалось.

Таблица 40 Ингибирование мРНК транстиретина человека в печени hTTR трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем № ISIS Доза (мг/кг) % ингибирования 304299 25 73 10 60 4 9 420915 25 78 10 57 4 43 420951 25 91 10 85 4 52 425679 25 94 10 88 4 42 425736 25 49 10 54 4 15 425737 25 82 10 59 4 21 425755 25 91 10 79 4 24 141923 25 0

Анализ белка

Уровни белка транстиретина человека измеряют в плазме трансгенных мышей способом ELISA с использованием поликлонального антитела против транстиретина (Abeam Ab37774) и овечьего анти-TTR пероксидаза хрена, детектирующего антитела (Abeam, №по каталогу 35217). Цветную реакцию создают с помощью набора ImmunoPure^® TMB Substrate Kit и измеряют поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для микротитровальных планшетов. Образцы плазмы берут до введения дозы и в дни 7, 14, 21 и 28. Результаты, представленные в Таблице 41, выражены как процент ингибирования по сравнению уровнями до введения дозы и демонстрируют времязависимое и дозазависимое снижение уровней белка при введении олигонуклеотидов ISIS.

Таблица 41 Ингибирование белка транстиретина человека в плазме трансгенных мышей по сравнению с уровнями до введения дозы № ISIS   День 0 День 7 День 14 День 21 День 28 141923 25 0 0 20 77 41 304299 25 0 44 85 100 88 10 0 0 8 93 78 4 0 0 0 57 0 420915 25 0 0 67 86 91 10 0 21 39 70 71 4 0 25 0 0 0 420951 25 0 83 96 100 100 10 0 35 66 91 86 4 0 7 26 0 0 425679 25 0 93 97 96 98 10 0 38 80 96 95 4 0 0 0 0 0 425736 25 0 56 76 82 92 10 0 0 33 37 66 4 0 0 0 0 0 425737 25 0 90 96 99 98 10 0 51 80 88 89 4 0 29 21 37 31 425755 25 0 88 96 98 99 10 0 52 76 90 88 4 0 29 22 36 26

Вес тела и вес органов

Вес тела мышей измеряют до введения дозы и в конце периода введения дозы. Значения веса тела приведены в Таблице 42 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований, и он также приведен в Таблице 42 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 42 Изменение веса тела и органов трансгенных мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида (%)   Доза (мг/кг) Вес тела Печень Селезенка Почка PBS   +13 0 0 0 ISIS 304299 25 +17 +16 +3 -2 10 +14 +10 -13 -4 4 +17 +2 +17 -2 ISIS 420915 25 +18 +12 -6 -6 10 +16 +6 -4 -5 4 +15 +4 +8 -2 ISIS 420951 25 +22 +23 +32 -2 10 +16 +11 +10 -3 4 +24 +7 +19 +5 ISIS 425679 25 +24 +33 +40 -1 10 +14 +5 +9 -2 4 +19 +7 +10 0 ISIS 425736 25 +16 +15 0 -5 10 +28 +8 -12 -6 4 +20 +10 -9 -2 ISIS 425737 25 +16 +13 0 -2 10 +19 +6 +18 -3 4 +19 +5 +4 +1 ISIS 425755 25 +21 +25 +34 -5 10 +17 +10 +13 -4 4 +22 +3 +27 +4 ISIS 141923 25 +20 +8 -3 -4

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 43. Также измеряют уровни билирубина плазмы с помощью такого же клинического химического анализатора; результаты также приведены в Таблице 43 и выражены в мг/дл.

Таблица 43 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени трансгенных мышей   Доза (мг/кг) ALT (IU/л) AST (IU/л) TBIL (мг/дл) PBS - 48 112 0,20 ISIS 304299 25 42 93 0,14 10 37 56 0,18 4 35 71 0,15 ISIS 420915 25 63 181 0,22 10 46 132 0,22 4 35 114 0,22 ISIS 420951 25 63 85 0,17 10 42 107 0,21 4 31 74 0,19 ISIS 425679 25 156 150 0,13 10 93 148 0,23 4 38 119 0,22 ISIS 425736 25 37 78 0,21 10 33 62 0,20 4 46 228 0,23 ISIS 425737 25 55 121 0,20 10 41 94 0,18 4 32 73 0,14 ISIS 425755 25 74 160 0,17 10 31 80 0,16 4 45 122 0,21 ISIS 141923 25 66 141 0,17

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки, концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты приведены в Таблице 44 и выражены в мг/дл.

Таблица 44 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN (мг/дл) в почке трансгенных мышей   Доза (мг/кг) BUN PBS   22 ISIS 304299 25 22 10 22 4 22 ISIS 420915 25 24 10 25 4 20 ISIS 420951 25 24 10 25 4 26 ISIS 425679 25 26 10 24 4 22 ISIS 425736 25 20 10 22 4 22 ISIS 425737 25 21 10 19 4 23 ISIS 425755 25 23 10 21 4 20 ISIS 141923 25 21

Пример 16: In vivo ингибирование транстиретина человека у трансгенных мышей с транстиретином человека

Антисмысловые олигонуклеотиды с мотивами 5-10-5 МОЕ, ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957 и ISIS 420959 из Таблицы 4. Эти антисмысловые олигонуклеотиды, демонстрирующие 65% ингибирования мРНК транстиретина или больше, были выбраны и испытаны на трансгенных мышах, содержащих ген транстиретина человека. Дополнительные олигонуклеотиды с последовательностями, перекрывающимися с ISIS 420951 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG (SEQ ID NO:116)), и с различными мотивами, также были конструированы для испытаний на трансгенных мышах. Такими дополнительными олигонуклеотидами были ISIS 450518 (III l ATTGTCTCTGCCTG (SEQ ID NO:5-8-5 МОЕ (SEQ ID NO:167)), ISIS 450519 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 6-8-6 МОЕ (SEQ ID NO:116)), ISIS 450520 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 3-10-7 МОЕ (SEQ ID NO:116)), ISIS 450521 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 7-10-3 МОЕ (SEQ ID NO:116)), ISIS 450522 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 2-10-8 МОЕ (SEQ ID NO:116)) и ISIS 450523 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 8-10-2 МОЕ (SEQ ID NO:116)).

Введение

Группам по четыре hTTR трансгенных мышей в каждой, два самца и две самки, вводят подкожно два раза в неделю в течение четырех недель 25 мг/кг ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522 или ISIS 425523. Контрольной группе из четырех hTTR трансгенных мышей, двух самцов и двух самок, вводят подкожными инъекциями PBS два раза в неделю в течение четырех недель. Образцы крови берут у всех групп в дни 0, 14 и 28 для анализа уровня транстиретина плазмы. Мышей умерщвляют через два дня после последней дозы и берут печень для анализа мРНК-мишени.

Анализ РНК

РНК экстрагируют из ткани печени для анализа транстиретина способом ПЦР в реальном масштабе времени с использованием набора праймер-зонд RTS3029. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем. Как видно из Таблицы 45, введение антисмысловых олигонуклеотидов ISIS приводит к значительному снижению мРНК транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем.

Таблица 45 Ингибирование мРНК транстиретина человека в печени hTTR трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем № ISIS % ингибирования 304313 68 420913 83 420919 64 420921 70 420922 82 420937 46 420944 58 420947 62 420949 87 420950 94 420952 95 420953 93 420955 93 420957 90 420959 73 450518 80 450519 87 450520 85 450521 94 450522 73 450523 94 420951 94

Анализ белка

Уровни белка транстиретина человека измеряют в плазме трансгенных мышей способом ELISA с использованием поликлонального антитела против транстиретина (Abeam Ab37774) и овечьего анти-TTR пероксидаза хрена детектирующего антитела (Abeam, №по каталогу 35217). Цветную реакцию создают с помощью набора ImmunoPure^® TMB Substrate Kit и измеряют поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для микротитровальных планшетов. Образцы плазмы берут до введения дозы и в дни 7, 14 и 28. Результаты, представленные в Таблице 46, выражены как процент ингибирования по сравнению с уровнями до введения дозы и демонстрируют время-зависимое снижение уровней белка при введении олигонуклеотидов ISIS.

Таблица 46 Ингибирование белка транстиретина человека в плазме hTTR трансгенных мышей по сравнению с уровнями до введения дозы   День 0 День 14 День 28 PBS 0 0 0 ISIS 304313 0 62 77 ISIS 420913 0 91 97 ISIS 420919 0 70 82 ISIS 420921 0 83 87 ISIS 420922 0 95 97 ISIS 420937 0 37 59 ISIS 420944 0 57 72 ISIS 420947 0 57 65 ISIS 420949 0 93 99 ISIS 420950 0 97 100 ISIS 420952 0 98 100 ISIS 420953 0 99 100 ISIS 420955 0 89 100 ISIS 420957 0 92 94 ISIS 420959 0 69 87 ISIS 450518 0 80 97 ISIS 450519 0 94 100 ISIS 450520 0 83 100 ISIS 450521 0 100 100 ISIS 450522 0 93 97 ISIS 450523 0 100 100 ISIS 420951 0 99 100

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминаза) и AST (аспартаттрансаминаза), и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 47. Также измеряют уровни билирубина плазмы с помощью такого же клинического химического анализатора; результаты также приведены в Таблице 47 и выражены в мг/дл.

Таблица 47 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени трансгенных мышей   ALT (IU/л) AST (IU/л) Билирубин (мг/дл) PBS 34 88 0,20 ISIS 304313 42 79 0,16 ISIS 420913 35 67 0,17 ISIS 420919 63 177 0,20 ISIS 420921 47 103 0,15 ISIS 420922 42 128 0,16 ISIS 420937 33 160 0,15 ISIS 420944 38 84 0,15 ISIS 420947 42 120 0,17 ISIS 420949 46 125 0,15 ISIS 420950 73 106 0,15 ISIS 420952 151 271 0,19 ISIS 420953 982 452 0,16 ISIS 420955 47 80 0,15 ISIS 420957 53 133 0,18 ISIS 420959 31 89 0,11 ISIS 450518 103 200 0,20 ISIS 450519 64 81 0,12 ISIS 450520 350 270 0,12 ISIS 450521 104 226 0,13 ISIS 450522 109 201 0,14 ISIS 450523 80 170 0,19 ISIS 420951 67 100 0,09

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки, концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 48.

Таблица 48 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN (мг/дл) в почке трансгенных мышей PBS 35 ISIS 304313 29 ISIS 420913 30 ISIS 420919 29 ISIS 420921 29 ISIS 420922 27 ISIS 420937 29 ISIS 420944 27 ISIS 420947 26 ISIS 420949 25 ISIS 420950 34 ISIS 420952 23 ISIS 420953 34 ISIS 420955 24 ISIS 420957 23 ISIS 420959 29 ISIS 450518 28 ISIS 450519 25 ISIS 450520 29 ISIS 450521 24 ISIS 450522 29 ISIS 450523 27 ISIS 420951 25

Пример 17: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, у CD1-мышей

CD1-мышам вводят антисмысловые олигонуклеотиды ISIS по Примеру 16 и оценивают изменения уровней различных метаболических маркеров.

Введение

Группам по восемь CD1-мышей в каждой вводят подкожными инъекциями два раза в неделю 50 мг/кг ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522 или ISIS 425523. Через три дня после последней дозы для каждого момента времени измеряют вес тела, мышей подвергают эвтаназии и органы и плазму собирают для дальнейшего анализа.

Вес тела и органов

Вес тела мышей измеряют до введения дозы и в конце каждого периода введения (две недели и шесть недель). Значения веса тела приведены в Таблице 49 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований и он также приведен в Таблице 49 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 49 Изменение веса тела и органов CD1-мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида (%) в неделю 6   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 1,3 1,0 1,0 1,0 ISIS 304313 1,2 1,2 1,4 1,2 ISIS 420913 1,2 1,2 1,3 1,1 ISIS 420919 1,3 1,2 1,9 1,1 ISIS 420921 1,1 1,1 2,2 1,1 ISIS 420922 1,1 1,0 1,6 0,9 ISIS 420937 1,1 1,0 1,2 1,0 ISIS 420944 1,1 1,1 2,0 1,0 ISIS 420947 1,3 1,2 1,7 1,0 ISIS 420949 1,3 1,2 1,8 1,1 ISIS 420950 1,3 1,0 1,7 1,0 ISIS 420952 1,4 1,3 2,1 0,9 ISIS 420953 1,3 1,5 2,2 1,0 ISIS 420955 1,2 1,2 2,2 1,0 ISIS 420957 1,1 1,1 1,8 1,1 ISIS 420959 1,3 1,2 3,2 1,1 ISIS 450518 1,4 1,3 1,8 1,1 ISIS 450519 1,3 1,5 2,4 1,0 ISIS 450520 1,4 1,4 2,2 1,0 ISIS 450521 1,2 1,2 1,9 1,1 ISIS 450522 1,3 1,5 2,3 1,1 ISIS 450523 1,2 1,3 2,4 1,1 ISIS 420951 1,3 1,2 1,9 1,0

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы), и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 50. Уровни билирубина и альбумина плазмы также измеряют с помощью такого же клинического химического анализатора, и результаты также приведены в Таблице 50.

Таблица 50 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени CD1-мышей   ALT AST TBIL PBS 34 88 0,20 ISIS 304313 42 79 0,16 ISIS 420913 35 67 0,17 ISIS 420919 63 177 0,20 ISIS 420921 47 103 0,15 ISIS 420922 42 128 0,16 ISIS 420937 33 160 0,15 ISIS 420944 38 84 0,15 ISIS 420947 42 120 0,17 ISIS 420949 46 125 0,15 ISIS 420950 73 106 0,15 ISIS 420952 151 271 0,19 ISIS 420953 982 452 0,16 ISIS 420955 47 80 0,15 ISIS 420957 53 133 0,18 ISIS 420959 31 89 0,11 ISIS 450518 103 200 0,20 ISIS 450519 64 81 0,12 ISIS 450520 350 270 0,12 ISIS 450521 104 226 0,13 IS1S 450522 109 201 0,14 ISIS 450523 80 170 0,19 ISIS 420951 67 100 0,09

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) и креатинина измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 51.

Таблица 51 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN (мг/дл) в почке CD1-мышей BUN PBS 35 ISIS 304313 29 ISIS 420913 30 ISIS 420919 29 ISIS 420921 29 ISIS 420922 27 ISIS 420937 29 ISIS 420944 27 ISIS 420947 26 ISIS 420949 25 ISIS 420950 34 ISIS 420952 23 ISIS 420953 34 ISIS 420955 24 ISIS 420957 23 ISIS 420959 29 ISIS 450518 28 ISIS 450519 25 ISIS 450520 29 ISIS 450521 24 ISIS 450522 29 ISIS 450523 27 ISIS 420951 25

Гематологические анализы

Кровь, взятую у всех мышей группы, отправляли в Antech Diagnostics для измерений и анализов гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН) и средней концентрации эритроцитарного гемоглобина (МСНС), а также измерений дифференциального количества клеток крови, таких как белые кровяные клетки (WBC) (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), красные кровяные клетки (RBC) и тромбоциты, и общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблицах 52 и 53. Проценты, приведенные в таблицах, указывают процент изменения общего количества клеток крови по сравнению с PBS-контролем.

Таблица 52 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CD1-мышей   WBC RBC Гемоглобин НСТ MCV МСН МСНС ISIS 304313 +80 -5 -7 -9 -4 -2 +4 ISIS 420913 -10 -1 -3 -5 -4 -2 +3 ISIS 420919 +26 -2 -7 -9 -7 -5 +4 ISIS 420921 +60 -9 -12 -15 -6 -3 +5 ISIS 420922 +18 -6 -11 -16 -11 -6 +6 ISIS 420937 +42 -3 -4 -7 -5 -1 +5 ISIS 420944 +49 -5 -9 -13 -8 -4 +6 ISIS 420947 +36 -2 -2 -5 -3 0 +4 ISIS 420949 +61 -4 -6 -9 -7 -3 +5 ISIS 420950 +56 -14 -16 -19 -7 -3 +6 ISIS 420952 +36 -20 -24 -25 -7 -5 +4 ISIS 420953 +105 -21 -24 -26 -6 -4 +4 ISIS 420955 +107 -14 -19 -21 -9 -5 +6 ISIS 420957 +79 -5 -10 -13 -9 -6 +5 ISIS 420959 +92 -8 -14 -18 -11 -7 +6 ISIS 450518 +138 -5 -10 -12 -7 -4 +4 ISIS 450519 +118 -17 -21 -24 -9 -5 +6 ISIS 450520 +151 -18 -21 -23 -7 -4 +4 ISIS 450521 +118 -15 -21 -23 -11 -7 +5 ISIS 450522 +63 -22 -28 -31 -12 -8 +6 ISIS 450523 +116 -22 -27 -29 -11 -7 +6 ISIS 420951 +54 -15 -21 -24 -10 -6 +5

Таблица 53 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на дифференциальное определение клеток крови (%) по сравнению с PBS-контролем у CD1-мышей   Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты Тромбоциты ISIS 304313 -54 +49 -45 +36 ISIS 420913 -46 +39 -21 -2 ISIS 420919 -57 +49 -21 +19 ISIS 420921 -55 +47 -24 +25 ISIS 420922 -53 +46 -31 +24 ISIS 420937 -63 +57 -48 +20 ISIS 420944 -40 +37 -28 +18 ISIS 420947 -55 +49 -38 -9 ISIS 420949 -30 +24 +7 +17 ISIS 420950 -50 +40 0 +6 ISIS 420952 -34 +33 -28 +13 ISIS 420953 -37 +35 -34 +11 ISIS 420955 -37 +34 -21 +30 ISIS 420957 -71 +61 -28 +16 ISIS 420959 -52 +45 -24 -1 ISIS 450518 -56 +49 -28 +18 ISIS 450519 -18 +11 +41 +55 ISIS 450520 -41 +34 0 +7 ISIS 450521 -41 +36 -14 +21 ISIS 450522 -41 +31 +17 +58 ISIS 450523 -28 +19 +31 +51 ISIS 420951 -28 +24 0 +26

Пример 18: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, у крыс Sprague-Dawley

ISIS олигонуклеотиды, выбранные по результатам исследований, описанных в Примере 17, также были испытаны на крысах Sprague-Dawley для оценки изменений уровней различных метаболических маркеров.

Введение

Значения веса тела, клинический анализ крови и дифференциальный анализ крови, а также соотношение белок/креатинин в моче крыс оценивают до введения дозы. Группам из четырех крыс Sprague-Dawley вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю 50 мг/кг ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 и ISIS 420959. Через три дня после последней дозы для каждого момента времени, измеряют вес тела, крыс подвергают эвтаназии и органы и плазму собирают для дальнейшего анализа.

Вес тела и органов

Значения веса тела крыс измеряют до введения дозы и в конце периода введения дозы. Значения веса тела приведены в Таблице 54 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований, и они также приведены в Таблице 54 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 54 Изменение веса тела и органов крыс Sprague-Dawley после введения антисмыслового олигонуклеотида (%)   Вес тела Печень Селезенка Почка PBS 2,1 1,0 1,0 1,0 ISIS 420913 1,5 1,5 4,7 1,1 ISIS 420921 1,6 1,5 4,2 1,3 ISIS 420922 1,3 1,5 4,4 1,4 ISIS 420950 1,4 1,5 6,4 1,7 ISIS 420955 1,5 1,6 5,9 1,4 ISIS 420957 1,4 1,4 6,8 1,3 ISIS 420959 1,5 1,4 5,5 1,4

Как видно из Таблицы 54, соединения продемонстрировали менее чем 1O-кратное увеличение веса органов этих крыс. Кроме того, определенные соединения продемонстрировали менее чем 7-кратное увеличение веса органов этих крыс. В то же время определенные соединения продемонстрировали менее чем 6-кратное увеличение веса органов этих крыс. Определенные соединения продемонстрировали менее чем 5-кратное увеличение веса органов этих крыс.

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 55. Уровни билирубина и альбумина плазмы также измеряют с помощью такого же клинического химического анализатора, и результаты также приведены в Таблице 55.

Таблица 55 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени крыс Sprague-Dawley   ALT (IU/л AST (IU/л) TBIL (мг/дл) Альбумин (г/дл) PBS 26 66 0,09 4,5 ISIS 420913 38 95 0,08 3,3 ISIS 420921 65 151 0,11 3,2 ISIS 420922 40 121 0,11 4,0 ISIS 420950 398 327 0,19 4,0 ISIS 420955 78 241 0,18 4,1 ISIS 420957 84 244 0,14 3,7 ISIS 420959 82 405 0,17 4,6

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) и креатинина измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 56. Отношение общего белка мочи к креатинину также оценивалось и представлено в Таблице 56.

Таблица 56 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры (мг/дл) в почке крыс Sprague-Dawley   BUN Креатинин PBS 14 0,05 ISIS 420913 22 0,09 ISIS 420921 23 0,07 ISIS 420922 21 0,08 ISIS 420950 20 0,11 ISIS 420955 22 0,06 ISIS 420957 23 0,18 ISIS 420959 24 0,17

Таблица 57 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на общий белок мочи/креатинин в почке крыс Sprague-Dawley Отношение белок/креатинин мочи PBS 1,50 ISIS 420913 19,51 ISIS 420921 5,07 ISIS 420922 4,72 ISIS 420950 5,61 ISIS 420955 5,57 ISIS 420957 5,40 ISIS 420959 4,39

Гематологические анализы

Кровь, взятую у всех групп крыс, отправляли в Antech Diagnostics для измерений и анализов гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН) и средней концентрации эритроцитарного гемоглобина (МСНС), а также измерений дифференциального количества клеток крови, таких как белые кровяные клетки (WBC) (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), красные кровяные клетки (RBC) и тромбоциты, и общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблицах 58 и 59. Проценты, приведенные в таблицах, указывают процент изменения общего количества клеток крови по сравнению с PBS-контролем.

Таблица 58 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на клинический анализ крови (%) по сравнению с PBS-контролем у крыс Sprague-Dawley   WBC RBC Гемоглобин НСТ MCV МСН МСНС PBS 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ISIS 420913 1,7 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 ISIS 420921 1,6 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 ISIS 420922 1,6 0,9 0,9 0,8 1,0 1,0 1,0 ISIS 420950 2,2 0,7 0,7 0,7 1,0 1,0 1,0 ISIS 420955 1,9 0,7 0,8 0,7 1,1 1,2 1,0 ISIS 420957 3,1 0,8 0,8 0,8 1,0 1,0 1,0 ISIS 420959 2,2 0,8 0,8 0,8 1,0 1,0 1,0

Таблица 59 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на дифференциальное определение клеток крови (%) по сравнению с PBS-контролем у крыс Sprague-Dawley   Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты Тромбоциты PBS 1,0 1,0 1,0 1,0 ISIS 420913 0,5 1,1 1,7 0,7 ISIS 420921 0,7 1,0 1,6 0,6 ISIS 420922 0,5 1,1 1,3 0,7 ISIS 420950 0,8 1,0 2,3 0,7 ISIS 420955 0,5 1,0 2,4 0,7 ISIS 420957 0,7 1,0 1,6 0,3 ISIS 420959 0,5 1,1 1,3 n,d,

Пример 19: Фармакокинетические исследования периода двукратного снижения концентрации антисмыслового олигонуклеотида в печени и почке крыс Sprague-Dawley

Крысам Sprague-Dawley вводят ISIS-антисмысловые олигонуклеотиды, определенные по результатам исследований, описанных в Примере 18, и оценивают период полувыведения олигонуклеотида, а также время, проходящее до деградации олигонуклеотида и выведения из печени и почки.

Введение

Группам по четыре крысы Sprague Dawley вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 2 недель 20 мг/кг ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 и ISIS 420959. Через три дня после последней дозы крыс умерщвляют, и печень и почки берут для анализов.

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряют концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (включая деградированную форму). Используемый способ представляет собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые заключаются в фенол-хлороформенной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазовой экстракцией. Перед экстракцией прибавляют внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный 2'-O-метоксиэтил-модифицированный фосфоротиоатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный тут как SEQ ID NO:166). Концентрации в образцах тканей рассчитывают с использованием калибровочных кривых, при нижнем пределе количественного определения (LLOQ), равном приблизительно 1,14 мкг/г.Результаты, представленные в Таблицах 60 и 61, выражены в мкг/г ткани печени или почки. Также рассчитывают отношение концентраций олигонуклеотида в почке к печени, приведенное в Таблицах 60 и 61.

Таблица 60 Концентрации полноразмерного олигонуклеотида (мкг/г) и их отношение в печени и почке крыс Sprague-Dawley № ISIS Печень Почка Отношение почка/печень 420913 154 285 1,9 420921 147 293 2,0 420922 226 497 2,2 420950 161 411 2,6 420955 152 383 2,5 420957 235 453 1,9 420959 187 513 2,7

Таблица 61 Полная концентрация олигонуклеотида (мкг/г) в печени и почке крыс Sprague-Dawley № ISIS Печень Почка Отношение почка/печень 420913 180 310 1,7 420921 159 305 1,9 420922 238 544 2,3 420950 168 466 2,8 420955 156 442 2,8 420957 244 551 2,3 420959 202 534 2,6

Пример 20: In vivo дозазависимое ингибирование транстиретина человека у трансгенных мышей

ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420957 и ISIS 420959, которые проявляли хорошую эффективность и переносимость, как продемонстрировано в Примерах 16-19, были выбраны для исследований дозазависимого целенаправленного снижения экспрессии у трансгенных мышей гена транстиретина человека. ISIS 420950 и ISIS 420955, которые продемонстрировали 90% или больше целенаправленного снижения экспрессии, но которые также продемонстрировали токсичность у CD1-мышей (Примеры 16-19), также были выбраны для участия в этих исследованиях в целях сравнения.

Введение

Группам по четыре мыши, два самца и две самки, вводят каждой подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель 4 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 или ISIS 420959. Одной группе из четырех мышей, двух самцов и двух самок, вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель 25 мг/кг контрольного олигонуклеотида, ISIS 141923. Одной контрольной группе из четырех мышей, двух самцов и двух самок, вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 4 недель PBS. Образцы плазмы берут в каждой группе в дни 0, 14 и 28. Через два дня после последней дозы мышей подвергают эвтаназии и органы собирают для дальнейших анализов.

Анализ РНК

РНК экстрагируют из ткани печени для анализа транстиретина способом ПЦР в реальном масштабе времени с использованием набора праймер-зонд RTS3029. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем. Как видно из Таблицы 62, введение антисмысловых олигонуклеотидов ISIS приводит к значительному дозазависимому снижению мРНК транстиретина человека по сравнению с PBS-контролем. Введение контрольного олигонуклеотида, ISIS 141923 не приводило к значительному снижению транстиретина, как ожидалось.

Таблица 62 Ингибирование мРНК транстиретина человека в печени hTTR трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем № ISIS Доза (мг/кг) % ингибирования 420913 25 78   10 65 4 32 420921 25 76 10 64 4 13 420922 25 80 10 53 4 21 420950 25 92 10 77 4 57 420955 25 88 10 56 4 23 420957 25 85 10 72 4 32 420959 25 75 10 26 4 11 141923 25 0

Анализ белка

Уровни белка транстиретина человека измеряют в плазме трансгенных мышей способом ELISA с использованием конъюгированных с транстиретином поликлональных антител против транстиретина (Abeam Ab37774) и овечьего детектирующего антитела против TTR, конъюгированного с пероксидазой хрена (Abeam, №по каталогу 35217). Цветную реакцию создают с помощью набора ImmunoPure^® TMB Substrate Kit и измеряют поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для микротитровальных планшетов. Образцы плазмы берут до введения дозы и в дни 7, 14, 21 и 28. Результаты, представленные в Таблице 63, выражены как процент ингибирования по сравнению уровнями до введения дозы и демонстрируют времязависимое и дозазависимое снижение уровней белка при введении олигонуклеотидов ISIS.

Таблица 63 Ингибирование белка транстиретина человека в плазме hTTR трансгенных мышей по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS Доза (мг/кг) день 0 день 14 день 28 420913 25 0 73 93 10 0 27 96 4 0 25 54 420921 25 0 73 90 10 0 63 79 4 0 42 67 420922 25 0 63 96 10 0 57 89 4 0 38 77 420950 25 0 95 97 10 0 71 96 4 0 29 53 420955 25 0 84 96 10 0 53 91 4 0 20 30 420957 25 0 83 93 10 0 51 66 4 0 32 49 420959 25 0 74 80 10 0 31 58 4 0 0 0 141923 25 0 22 0

Вес тела и вес органов

Вес тела мышей измеряют до введения дозы и в конце периода введения дозы. Значения веса тела приведены в Таблице 64 и выражены как процент увеличения по сравнению с весом PBS-контроля, определенным перед началом введения. Вес печени, селезенки и почки измеряют в конце исследований, и он также приведен в Таблице 64 как процент изменения по сравнению с соответствующим весом органов PBS-контроля.

Таблица 64 Изменение веса тела или органов трансгенных мышей после введения антисмыслового олигонуклеотида (%)     Вес тела Печень Селезенка Почка PBS   6,4 0,0 0,0 0,0 ISIS 420913 25 8,1 0,3 11,4 4,1 10 10,6 -8,6 14,3 13,6 4 7,4 3,7 5,0 12,0 ISIS 420921 25 10,5 8,8 25,6 -0,1 10 9,7 5,7 10,8 4,0 4 8,7 -4,4 16,0 11,0 ISIS 420922 25 8,4 5,6 18,0 1,7 10 9,2 -1,7 27,1 6,3 4 8,1 -2,1 -11,4 5,1 ISIS 420950 25 12,8 14,3 22,8 1,7 10 8,4 4,3 -2,8 0,6 4 9,1 0,4 14,2 1,5 ISIS 420955 25 10,1 14,6 17,7 -4,4 10 11,8 5,6 -0,3 1,4 4 7,9 4,7 -12,3 4,5 ISIS 420957 25 12,8 6,4 33,1 2,8 10 14,5 13,9 -6,3 9,7 4 7,4 -5,4 12,2 6,2 ISIS 420959 25 10,0 2,4 72,7 23,3 10 7,2 -5,4 40,2 9,8 4 4,1 -4,4 27,8 -6,6 ISIS 141923 25 9,2 -1,3 20,4 -5,5

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряют концентрации трансаминазы плазмы с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 65. Также измеряют уровни билирубина плазмы с помощью такого же клинического химического анализатора; результаты также приведены в Таблице 65 и выражены в мг/дл.

Таблица 65 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры в печени трансгенных мышей   Доза (мг/кг) ALT (IU/л) AST (IU/л) TBIL (мг/дл) PBS   47 63 0,16 ISIS 420913 25 42 69 0,13 10 49 90 0,17 4 42 59 0,18 ISIS 420921 25 56 96 0,12 10 51 68 0,22 4 42 75 0,14 ISIS 420922 25 50 76 0,12 10 40 170 0,14 4 37 48 0,13 ISIS 420950 25 74 116 0,14 10 37 67 0,13 4 34 64 0,11 ISIS 420955 25 46 117 0,15 10 54 76 0,16 4 50 153 0,17 ISIS 420957 25 40 73 0,13 10 36 63 0,20 4 37 61 0,12 ISIS 420959 25 51 92 0,19 10 48 69 0,13 4 37 67 0,13 ISIS 141923 25 44 79 0,12

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки концентрации в плазме остаточного азота мочевины крови (BUN) измеряют с помощью автоматического клинического химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 66.

Таблица 66 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN (мг/дл) в почке трансгенных мышей   Доза (мг/кг) BUN PBS - 23 ISIS 420913 25 24 10 22 4 20 ISIS 420921 25 24 10 22 4 23 ISIS 420922 25 23 10 22 4 24 ISIS 420950 25 22 10 26 4 23 ISIS 420955 25 23 10 24 4 25 ISIS 420957 25 20 10 22 4 20 ISIS 420959 25 25 10 22 4 22 ISIS 141923 25 19

Пример 21: Подтверждение дозового ответа антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, в первичных гепатоцитах яванского макака

Гапмеры, продемонстрировавшие переносимость у CD1-мышей и крыс Sprague Dawley (исследования, описанные в Примерах 17-19), а также действенность у трансгенных мышей (исследования, описанные в Примерах 16 и 20), были выбраны и подвергнуты испытаниям в разных дозах в первичных гепатоцитах яванского макака. Клетки высеивают при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицируют с помощью электропорации концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 156,25 нМ, 312,5 нМ, 625 нМ, 1250 нМ, 2500 нМ, 5000 нМ, 10000 нМ и 20000 нМ, как указано в Таблице 67. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, РНК выделяют из клеток и уровни мРНК транстиретина измеряют способом количественной ПЦР в реальном масштабе времени. Набор праймер-зонд для определения транстиретина человека RTS1396 используют для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК транстиретина регулируют в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 67, уровни мРНК транстиретина снижаются зависимым от дозы образом в гепатоцитах, обработанных всеми ISIS-олигонуклеотидами, которые являются перекрестно реактивными с геном транстиретина макака-резуса, обозначенным тут как SEQ ID NO:4 (экзоны 1-4, выделены из №Доступа GENBANK NW_001105671,1).

Таблица 67 Дозазависимое антисмысловое ингибирование транстиретина человека в первичных гепатоцитах яванского макака с помощью электропорации № ISIS 156,25 нМ 312,5 нМ 625 нМ 1250 нМ 2500 нМ 5000 нМ 10000 нМ 20000 нМ IC₅₀ (мкМ) Целевой иниц. сайт 304299 0 0 25 42 89 95 98 99 1,4 504 420913 0 0 42 49 84 96 98 98 1,2 502 420915 0 8 46 58 84 94 97 99 1 505 420921 0 0 26 30 53 74 94 97 2 512 420922 4 0 13 29 38 69 87 97 2,9 513 420950 23 27 60 71 88 94 98 98 0,6 577 420955 19 0 25 50 74 86 93 97 1,4 582 420957 0 0 15 34 65 72 87 94 2,2 584 420959 3 12 10 37 71 88 94 94 1,5 586

Пример 22: Измерение вязкости ISIS антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека

Вязкость антисмысловых олигонуклеотидов, использованных для исследований, описанных в Примере 21, измеряют с целью выделения антисмысловых олигонуклеотидов, имеющих вязкость более 40 сП. Олигонуклеотиды, имеющие вязкость более 40 сП, являются слишком труднотекущими для введения какому-либо субъекту.

ISIS-олигонуклеотиды (32-35 мг) взвешивают в стеклянном флаконе, прибавляют 120 мкл воды и антисмысловой олигонуклеотид растворяют до состояния раствор путем нагревания флакона при 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретого образца переносят пипеткой в микровискозиметр (Cambridge). Устанавливают температуру микровискозиметра, равную 25°С, и измеряют вязкость образца. Другую часть (20 мкл) предварительно нагретого образца переносят пипеткой в 10 мл воды для регистрации спектра УФ-поглощения при 260 нМ при 85°С (Сагу UV instrument). Результаты представлены в Таблице 68 и показывают, что все растворы антисмысловых олигонуклеотидов имеют оптимальную вязкость в соответствии с указанным выше критерием.

Таблица 68 Вязкость и концентрация ISIS антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека № ISIS Вязкость (сП) Концентрация (мг/мл) 304299 9,9 169 420913 6,5 178 420915 8,4 227 420921 8,2 234 420922 5,3 191 420950 12,5 297 420955 15,7 259 420957 12,9 233 420959 18,7 276

Пример 23: Измерение периода полувыведения антисмыслового олигонуклеотида в печени CD1-мышей

CD1-мышам вводят ISIS антисмысловые олигонуклеотиды, определенные по результатам исследований, описанных в Примере 22, и оценивают период полувыведения олигонуклеотида, а также время, проходящее до деградации олигонуклеотида и выведения из печени.

Введение

Группам по двенадцать CD1-мышей каждая вводят подкожными инъекциями два раза в неделю в течение 2 недель 50 мг/кг ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 и ISIS 420959. По четыре мыши из каждой группы умерщвляют через 3 дня, 28 дней и 56 дней после последней дозы. Берут печень на анализ.

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряют концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (включая деградированную форму). Используемый способ представляет собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые заключаются в фенол-хлороформенной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазовой экстракцией. Перед экстракцией прибавляют внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный 2'-O-метоксиэтил-модифицированный фосфоротиоатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный тут как SEQ ID NO:166). Концентрации в образцах тканей рассчитывают с использованием калибровочных кривых, при нижнем пределе количественного определения (LLOQ), равном приблизительно 1,14 мкг/г. Затем рассчитывают времена полувыведения с помощью прикладной программы WinNonlin (PHARSIGHT).

Результаты, выраженные в мкг/г ткани печени, представлены в Таблице 69. Период полувыведения каждого олигонуклеотида приведен в Таблице 70.

Таблица 69 Концентрация полноразмерного олигонуклеотида (мкг/г) в печени CD1-мышей № ISIS 3 дня 28 дней 56 дней 420913 243 109 33 420921 225 49 6 420922 310 129 53 420950 254 88 62 420955 308 137 79 420957 325 129 49 420959 258 97 37

Таблица 70 Период полувыведения олигонуклеотида (дней) в печени CD1-мышей № ISIS Период полувыведения (дней) 420913 18,5 420921 10,0 420922 20,7 420950 26,4 420955 27,2 420957 19,5 420959 18,9

Пример 24: Эффект ISIS-антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на транстиретин человека, у яванского макака

Яванским макакам вводят ISIS-антисмысловые олигонуклеотиды, использованные для исследований, описанных в Примерах 21, 22 и 23. Оценивают эффективность и переносимость антисмыслового олигонуклеотида, а также их фармакокинетический профиль в печени и почке.

Введение

Перед исследованиями, обезьян содержат в карантине на протяжении 30-дневного периода времени, во время которого проводят стандартные наборы химических и гематологических анализов сыворотки, анализы образцов кала на яйца и паразитов, и туберкулиновую пробу, для выявления аномальных или нездоровых обезьян. Девяти группам по четыре случайным образом распределенных самца яванского макака вводят каждой подкожными инъекциями три раза в неделю в первую неделю и затем два раза в неделю в течение следующих 11 недель по 25 мг/кг ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 или ISIS 420959. Контрольной группе из 4 яванских макак вводят инъекцией PBS подкожно три раза в неделю в первую неделю и затем два раза в неделю в течение следующих 11 недель. Образцы крови берут за 5 дней до введения, а также в разные дни периода исследований и анализируют. Животные голодают, по меньшей мере, 13 часов (в течение ночи) перед взятием крови. Все группы умерщвляют в конце исследований в день 86, через 48 часов после последней дозы.

На протяжении периода исследований, обезьян наблюдают ежедневно для выявления признаков болезни или недомогания. Любое животное с проявлениями нежелательных эффектов на введение препарата исключалось из исследований и направлялось к ветеринару, о чем сообщалось руководителю исследований. Все животные, получившие ISIS 420955, были исключены из исследований в день 31 вследствие симптомов болезни, выявленных у 2 обезьян группы. Аналогично, были исключены из исследований по одной обезьяне из групп, получавших ISIS 420957 и ISIS 420950, в дни 44 и 76, соответственно, вследствие признаков болезни.

Исследования ингибирования

Анализ РНК

В день 86 экстрагируют РНК из ткани печени для анализа транстиретина способом ПЦР в реальном масштабе времени с использованием набора праймер-зонд RTS3029. Результаты представлены как процент ингибирования транстиретина по сравнению с PBS-контролем, нормированный по циклофилину. Аналогичные результаты были получены при нормировании по RIBOGREEN^®. Как видно из Таблицы 71, введение антисмысловых олигонуклеотидов ISIS приводит к значительному снижению мРНК транстиретина по сравнению с PBS-контролем. Конкретнее, введение ISIS 420915 вызывало более сильное ингибирование мРНК TTR, чем введение ISIS 304299, несмотря на то, что два олигонуклеотида отличаются друг от друга смещением на одну пару оснований. Данные для животных, получавших ISIS 420955, были получены в день 31.

Таблица 71 Ингибирование мРНК транстиретина в печени яванского макака по сравнению с PBS-контролем № ISIS % ингибирования 304299 59 420915 78 420921 54 420922 61 420950 91 420955* 79 420957 64 420959 55 (* данные вдень 31)

Анализ белка

Обезьяны голодают в течение ночи перед взятием крови. Берут приблизительно 1 мл крови у всех отвечающих требованиям животных и помещают в пробирки, содержащие калиевую соль ЭДТА (EDTA). Пробирки центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения плазмы. Измеряют уровни белка транстиретина в плазме с помощью клинического анализатора. Образцы плазмы берут до введения дозы (в день -5) и в дни 1, 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72 и 86. Результаты, представленные в Таблице 72, выражены как процент ингибирования по сравнению уровнями до введения дозы и демонстрируют времязависимое снижение уровней белка при введении олигонуклеотидов ISIS. Конечные уровни TTR плазмы приведены в Таблице 73 и демонстрируют сильную корреляцию между снижением уровня белка TTR и ингибированием мРНК TTR (Таблица 71). Конкретнее, введение ISIS 420915 вызывало более сильное ингибирование белка TTR в плазме, чем введение ISIS 304299 (76% ингибирования против 47% ингибирования), несмотря на то, что эти два олигонуклеотида отличаются друг от друга смещением на одну пару оснований.

Таблица 72 Ход снижения уровня белка транстиретина в плазме яванского макака по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS День 0 День 9 День 16 День 23 День 30 День 44 День 58 День 72 День 86 304299 4 15 21 23 26 27 31 38 47 420915 2 8 23 34 42 54 63 70 76 420921 5 11 21 31 23 27 30 40 50 420922 0 17 37 42 49 49 50 49 54 420950 0 39 63 68 72 79 85 82 87 420955 0 42 63 80 81 н.д. н.д. н.д. н.д. 420957 2 18 28 26 26 35 35 41 50 420959 0 25 29 28 32 38 42 43 50 н.д. = для животных, получавших ISIS 420955, исследования были прекращены в день 31; поэтому данные для последующих дней отсутствуют.  

Таблица 73 Снижение уровня белка транстиретина в день 86 в плазме яванского макака по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS % снижения 304299 47 420915 76 420921 50 420922 54 420950 87 420957 50 420959 50

Также измеряют уровни белка RBP4 в плазме с помощью набора для ELISA. Образцы плазмы берут до введения дозы (в день -5) и в дни 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72 и 86. Результаты, представленные в Таблице 74, выражены как процент ингибирования по сравнению уровнями до введения дозы. Некоторые из ISIS-олигонуклеотидов (ISIS 420915, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955 и ISIS 420959) демонстрируют времязависимое снижение уровней белка, сопровождающееся снижением TTR. Конечные уровни RBP4 плазмы приведены в Таблице 75 и также демонстрируют сильную корреляцию между снижением уровней белка RBP4 и TTR (Таблица 73) при введении вышеперечисленных олигонуклеотидов. Конкретнее, введение ISIS 420915 вызывало более сильное ингибирование белка RBP4 в плазме, чем введение ISIS 304299 (63% ингибирования против 19% ингибирования), несмотря на то, что эти два олигонуклеотида отличаются друг от друга смещением на одну пару оснований.

Таблица 74 Ход снижения уровня белка RBP4 в плазме яванского макака по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS День 9 День 16 День 23 День 30 День 44 День 58 День 72 День 86 304299 0 6 10 4 1 9 13 19 420915 5 22 22 30 38 47 54 63 420921 0 0 0 0 0 0 6 24 420922 4 19 16 34 33 29 15 32 420950 30 44 46 47 52 54 47 48 420955 6 36 53 65 н.д. н.д. Н.Д. н.д. 420957 0 10 0 0 0 0 3 27 420959 18 22 14 17 19 25 22 34 н.д. = для животных, получавших ISIS 420955, исследования были прекращены в день 31; поэтому данные для последующих дней отсутствуют.  

Таблица 75 Снижение уровня белка RBP4 в день 86 в плазме яванского макака по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS % снижения 304299 19 420915 63 420921 24 420922 32 420950 48 420957 27 420959 34

Исследования переносимости

Измерения веса тела и органов

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на общее состояние здоровья животных, измеряют вес тела и органов в день 86. Данные для животных, получавших ISIS 420955, были собраны в день 31. Вес тела измеряют и сравнивают с уровнем до введения дозы. Вес органов измеряют, и вес для экспериментальной группы сравнивают с соответствующим весом PBS-контроля. Данные представлены в Таблице 76.

Таблица 76 % Изменения конечного веса тела и органов у яванского макака по сравнению с уровнями до введения доз № ISIS Вес тела Вес печени Вес почки Вес селезенки 304299 +6 +27 +37 +53 420915 +6 +37 +26 +41 420921 +4 +42 +43 +22 420922 +4 +45 +39 +63 420950 0 +204 +166 +297 420955* -3 +36 +81 +70 420957 -6 +55 +184 +109 420959 0 +57 +101 +112 (* Данные вдень 31)

Функция печени

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени берут образцы крови у всех экспериментальных групп.Образцы крови собирают в пробирки, не содержащие каких-либо антикоагулянтов для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 90 мин и затем центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения сыворотки. Измеряют концентрации трансаминазы с помощью химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japan). Измеряют концентрации в плазме ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) в день 86 и результаты, выраженные в IU/л, представлены в Таблице 77. Щелочная фосфатаза, которая синтезируется в повышенных количествах пораженными клетками печени, также является маркером болезни печени и аналогично измеряется. С-реактивный белок (CRP), который синтезируется в печени и служит маркером воспаления, также аналогично измеряют в день 86. Результаты определения как щелочной фосфатазы, так и CRP, также приведены в Таблице 77. Билирубин также является метаболическим маркером печени и аналогично измеряется, и результаты, выраженные в мг/дл, представлены в Таблице 77.

Таблица 77 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на метаболические маркеры печени в плазме яванского макака   AST (IU/л) ALT (IU/n) ALP (IU/л) CRP (мг/л) Билирубин (мг/дл) PBS 60 54 955 2,4 0,24 ISIS 304299 81 101 747 3,3 0,17 ISIS 420915 68 62 672 1,6 0,15 ISIS 420921 98 107 832 3,2 0,14 ISIS 420922 94 96 907 2,4 0,15 ISIS 420950 132 94 1032 12,9 0,11 ISIS 420957 100 73 868 23,5 0,15 ISIS 420959 70 63 811 16,0 0,13

Функция почки

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на функцию почки берут образцы крови у всех экспериментальных групп. Образцы крови собирают в пробирки, не содержащие каких-либо антикоагулянтов для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 90 мин и затем центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения сыворотки. Измеряют концентрации BUN и креатинина в день 86 с помощью химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japan). Результаты, выраженные в мг/дл, приведены в Таблице 78.

Образцы мочи собирают с помощью дренажа из специальных поддонов клеток из нержавеющей стали в день 5 перед началом исследований и затем в дни 25 и 84. Измеряют соотношение общего белка мочи к креатинину с помощью химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japan) и результаты представлены в Таблице 79.

Таблица 78 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на BUN и уровни креатинина (мг/дл) в плазме яванского макака   BUN Креатинин PBS 28 0,86 ISIS 304299 27 0,85 ISIS 420915 25 0,90 ISIS 420921 33 0,99 ISIS 420922 28 0,86 ISIS 420950 36 0,97 ISIS 420957 35 0,86 ISIS 420959 27 0,89

Таблица 79 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на соотношение белка к креатину в моче яванского макака   День -5 День 25 День 84 PBS 0,003 0,01 0,00 ISIS 304299 0,000 0,01 0,00 ISIS 420915 0,003 0,00 0,00 ISIS 420921 0,033 0,13 0,09 ISIS 420922 0,010 0,05 0,02 ISIS 420950 0,008 0,29 0,21 ISIS 420955 0,000 0,61 н.д. ISIS 420957 0,000 0,48 0,36 ISIS 420959 0,005 0,08 0,03 н.д. = для животных, получавших ISIS 420955, исследования были прекращены в день 31; поэтому данные для последующих дней отсутствуют.

Гематология

Для оценки возможного воспалительного эффекта ISIS-олигонуклеотидов у яванского макака, берут образцы крови приблизительно по 0,5 мл у всех отвечающих критериям экспериментальных животных в пробирки, содержащие калиевую соль ЭДТА (EDTA). Образцы анализируют на количество красных кровяных клеток (RBC), количество белых кровяных клеток (WBC), процентное содержание индивидуальных белых кровяных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы, лимфоциты, а также на количество тромбоцитов и гематокрит (%), с помощью гематологического анализатора ADVIA120 (Bayer, USA). Данные приведены в Таблице 80.

Таблица 80 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на гематологические параметры яванского макака   WBC (×10³/мкл) RBC (×10⁶/мкл) Тромбоциты (×1000/мкл) Гематокрит (%) Лимфоциты (%) Нейтрофилы (%) Моноциты (%) PBS 9,6 5,3 415 40 62 35 1,8 ISIS 304299 11,6 5,2 395 38 68 26 3,1 ISIS 420915 10,3 5,1 382 36 72 22 3,5 ISIS 420921 9,8 5,2 385 36 60 34 2,5 ISIS 420922 11,6 5,2 396 37 62 29 5,4 ISIS 420950 13,7 4,4 260 33 51 34 7,8 ISIS 420957 18,6 4,7 298 33 52 35 9,1 ISIS 420959 7,7 4,8 306 32 62 29 5,5

Анализ факторов воспаления

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на факторы, вовлеченные в воспаление, берут кровь в день 86 у всех отвечающих предъявляемым требованиям животных для анализа комплемента С3, а также для измерения уровней цитокинов. Для анализа комплемента С3, образцы крови собирают в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 90 мин и затем центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения сыворотки. Комплемент С3 измеряют с помощью автоматического анализатора (химический анализатор Toshiba 200 FR NEO, Toshiba Co., Japan). Данные, выраженные в мг/дл, представлены в Таблице 81.

Для анализов уровня цитокинов, собирают кровь в пробирки, содержащие ЭДТА (EDTA) для отделения плазмы. Пробирки затем центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения плазмы. Образцы плазмы отправляют в Aushon Biosystems Inc. (Billerica, MA) для измерения уровней хемокинов и цитокинов. Уровни TNF-α измеряют с использованием соответствующих антител приматов и уровни MIP-1α, МСР-1 и MIP-1β измеряют с использованием соответствующих перекрестно реактивных человеческих антител. Измерения проводят за 5 дней до начала введения и в дни 3 и 86. Результаты представлены в Таблицах 82-85.

Таблица 81 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на комплемент С3 (мг/дл) у яванского макака   С3 PBS 133 ISIS 304299 96 ISIS 420915 104 ISIS 420921 91 ISIS 420922 102 ISIS 420950 70 ISIS 420957 69 ISIS 420959 95

Таблица 82 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на МСР-1 (пг/мл) у яванского макака   День -5 День 3 День 86 PBS 232 362 206 ISIS 304299 219 292 427 ISIS 420915 204 342 400 ISIS 420921 281 407 2120 ISIS 420922 215 482 838 ISIS 420950 170 370 3355 ISIS 420957 208 308 3485 ISIS 420959 237 715 2035

Таблица 83 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на TNF-α (пг/мл) у яванского макака   День -5 День 3 День 86 PBS 60 46 16 ISIS 304299 46 35 24 ISIS 420915 113 83 30 ISIS 420921 57 50 56 ISIS 420922 30 59 46 ISIS 420950 48 54 266 ISIS 420957 29 33 87 ISIS 420959 22 77 74

Таблица 84 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на MIP-1α (пг/мл) у яванского макака   День -5 День 3 День 86 PBS 6 7 7 ISIS 304299 6 7 9 ISIS 420915 5 5 10 ISIS 420921 8 11 9 ISIS 420922 9 8 5 ISIS 420950 7 9 5 ISIS 420957 6 6 6 ISIS 420959 9 6 5

Таблица 85 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на М1Р-1β (пг/мл) у яванского макака   День -5 День 3 День 86 PBS 13 19 42 ISIS 304299 17 23 54 ISIS 420915 15 27 72 ISIS 420921 23 43 112 ISIS 420922 9 41 70 ISIS 420950 8 25 126 ISIS 420957 16 27 182 ISIS 420959 36 46 117

Тесты на коагуляцию

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на факторы, вовлеченные в путь коагуляции, используют стандартные тесты на коагуляцию. РТ и аРТТ измеряют с использованием бедной тромбоцитами плазмы (РРР) обезьян на протяжении периода времени 48 часов. Значения РТ и аРТТ приведены в Таблицах 86 и 87 и выражены в секундах. Уровни фибриногена в плазме также количественно определяют на протяжении периода времени 48 часов и данные приведены в Таблице 88. Как видно из Таблиц 86-88, РТ, аРТТ и фибриноген не изменялись значительно у обезьян, получавших олигонуклеотиды ISIS по сравнению с PBS-контролем.

Таблица 86 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на РТ (с)   0 ч 1 ч 4 ч 8 ч 24 ч 48 ч PBS 10,08 10,38 10,10 10,33 9,83 9,40 ISIS 304299 10,38 10,30 10,48 10,20 9,95 9,53 ISIS 420915 10,15 10,13 10,38 9,93 9,75 9,48 ISIS 420921 10,28 10,13 10,43 10,18 9,80 9,55 ISIS 420922 9,95 10,00 10,05 9,70 9,48 9,28 ISIS 420950 10,30 10,47 10,57 10,27 9,63 9,50 ISIS 420957 10,63 10,47 10,60 10,77 10,33 10,27 ISIS 420959 10,08 10,10 10,20 10,15 9,80 9,55

Таблица 87 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на аРТТ (с)   0 ч 1 ч 4 ч 8 ч 24 ч 48 ч PBS 19,40 19,70 20,13 20,20 19,43 17,30 ISIS 304299 21,83 24,35 27,05 25,73 22,40 18,78 ISIS 420915 20,05 22,83 23,83 24,00 21,78 17,90 ISIS 420921 24,15 26,68 31,78 31,90 27,80 22,15 ISIS 420922 25,28 29,48 34,83 33,90 29,13 25,08 ISIS 420950 28,13 31,40 35,40 35,40 31,40 28,37 ISIS 420957 29,13 33,27 39,13 37,40 36,50 29,93 ISIS 420959 22,45 24,73 29,18 28,38 25,50 20,65

Таблица 88 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на фибриноген (мг/дл)   0 ч 1 ч 4 ч 8 ч 24 ч 48 ч PBS 212 203 240 247 282 272 ISIS 304299 175 172 198 207 227 200 ISIS 420915 213 196 204 258 257 215 ISIS 420921 208 209 230 237 301 249 ISIS 420922 278 277 335 338 400 304 ISIS 420950 293 295 348 376 390 296 ISIS 420957 280 299 344 330 434 328 ISIS 420959 276 277 354 326 414 320

Панельный анализ щитовидной железы

Для оценки эффекта ISIS-олигонуклеотидов на гормоны щитовидной железы, обезьяны голодали в течение ночи и 3,5 мл крови брали у каждого соответствующего критериям исследования животного за 5 дней до начала введения и в дни 51 и 86. Собранные образцы крови хранят в пробирках без антикоагулянта для отделения сыворотки. Пробирки выдерживают в течение 90 мин при комнатной температуре, после чего их центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения сыворотки. Образцы сыворотки направляют в Biomarkers Core Laboratory, Emory University (Atlanta, GA) для проведения панельного анализа щитовидной железы. Результаты для тиреостимулирующего гормона (TSH) приведены в Таблице 89 и выражены в мкл/мл. Результаты для общего и свободного Т3-гормона приведены в Таблицах 90 и 91. Результаты для общего и свободного Т4-гормона приведены в Таблицах 92 и 93. В общем, панельный анализ щитовидной железы показал, что все животные сохраняли приемлемые уровни гормонов, несмотря на то, что уровни экспрессии транстиретина снижались, указывая, что антисмысловые олигонуклеотиды транстиретина не влияют на уровни гормонов.

Таблица 89 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на TSH (мкл/мл)   День-5 День 51 День 86 PBS 0,8 0,7 1,0 ISIS 304299 1,4 1,0 2,2 ISIS 420915 1,4 1,5 2,5 ISIS 420921 0,7 0,6 1,0 ISIS 420922 1,0 1,2 1,9 ISIS 420950 0,6 2,2 5,4 ISIS 420957 0,6 2,6 4,9 ISIS 420959 0,9 1,6 4,7

Таблица 90 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на общий ТЗ (нг/дл)   День -5 День 51 День 86 PBS 177 248 140 ISIS 304299 202 226 176 ISIS 420915 156 206 156 ISIS 420921 217 204 137 ISIS 420922 188 177 131 ISIS 420950 260 208 105 ISIS 420957 266 160 78 ISIS 420959 299 219 137

Таблица 91 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на свободный Т3 (пг/мл)   День-5 День 51 День 86 PBS 7,7 5,8 5,2 ISIS 304299 9,2 6,0 4,7 ISIS 420915 8,9 5,6 4,5 ISIS 420921 10,2 4,8 4,0 ISIS 420922 8,9 5,4 3,7 ISIS 420950 7,2 3,8 2,1 ISIS 420957 8,8 4,0 2,4 ISIS 420959 8,3 4,9 3,3

Таблица 92 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на общий Т4 (нг/дл)   День -5 День 51 День 86 PBS 5,8 4,9 4,4 ISIS 304299 8,1 5,5 6,1 ISIS 420915 8,3 5,7 5,5 ISIS 420921 7,6 6,1 5,6 ISIS 420922 7,3 6,1 5,8 ISIS 420950 6,1 6,3 5,7 ISIS 420957 6,3 4,4 5,0 ISIS 420959 7,9 5,9 8,1

Таблица 93 Эффект введения антисмыслового олигонуклеотида на свободный Т4 (пг/мл)   День -5 День 51 День 86 PBS 3,4 2,4 1,7 ISIS 304299 3,2 2,5 1,7 ISIS 420915 5,0 1,8 1,7 ISIS 420921 2,6 1,5 1,5 ISIS 420922 3,5 1,6 1,5 ISIS 420950 2,5 1,2 1,1 ISIS 420957 2,4 1,2 1,2 ISIS 420959 3,8 1,4 1,5

Фармакокинетические исследования

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряют концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (включая деградированную форму). Используемый способ представляет собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые заключаются в фенол-хлороформенной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазовой экстракцией. Перед экстракцией прибавляют внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный 2'-O-метоксиэтил-модифицированный фосфоротиоатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный тут как SEQ ID NO:166). Концентрации в образцах тканей рассчитывают с использованием калибровочных кривых, при нижнем пределе количественного определения (LLOQ), равном приблизительно 1,14 мкг/г.Рассчитывают соотношение концентраций в почке против печени. Результаты, выраженные в мкг/г ткани, представлены в Таблицах 94 и 95.

Таблица 94 Концентрация полноразмерного олигонуклеотида (мкг/г) в печени яванского макака № ISIS Почка Печень Отношение почка/печень 304299 2179 739 2,9 420915 2439 1064 2,3 420921 4617 1521 3,0 420922 3957 1126 3,5 420950 3921 1082 3,6 420955 2444 1111 2,2 420957 3619 1230 2,9 420959 3918 1158 3,4

Таблица 95 Полная концентрация олигонуклеотида (мкг/г) в печени яванского макака № ISIS Почка Печень Отношение почка/печень 304299 3098 992 3,1 420915 3024 1266 2,4 420921 6100 1974 3,1 420922 4861 1411 3,4 420950 6003 1553 3,9 420955 2763 1208 2,3 420957 5420 1582 3,4 420959 5498 1501 3,7