УСТРОЙСТВО ПНЕВМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ КЛАПАНАМИ МИКРОФЛЮИДНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2016 года по МПК C12M3/02 B01L5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к устройствам для культивирования клеточных моделей тканей млекопитающих, а именно к устройству управления, включающему пневматическую схему управления работой клапанов, расположенных в микроканалах микрофлюидной системы (устройства) с циркулирующей питательной средой.

В настоящем изобретении под микрофлюидной системой (МС) понимается устройство, которое в литературе также может встречаться как биочип, и представляет собой изделие из стекла, кремния, термопластов и/или реактопластов, содержащее микрофлюидные (с характерным размером сечения от 1 мкм до 1000 мкм) каналы, а также эластичные клапаны, обладающие способностью деформироваться под воздействием повышенного или пониженного относительного давления воздуха, изменяя просвет канала вплоть до полного его закрытия. МС могут в числе прочего использоваться для решения задач in vitro исследований, в том числе включающих культивирование живых клеток.

Заявляемое устройство пневматического управления выполнено с возможностью подачи воздуха под повышенным или пониженным относительно атмосферного давлением на клапаны, регулировки величины повышенного или пониженного давления подаваемого воздуха, частоты и порядка переключения клапанов, обеспечивающих управление движением питательной среды в микрофлюидной системе. Микрофлюидные системы с заявляемым устройством пневматического управления клапанами позволяют моделировать микроциркуляцию крови in vivo путем поддержания пульсирующего тока питательной среды с определенными характеристиками и могут быть использованы при проведении исследований в области клеточной биологии, в т.ч. для изучения фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных средств, для исследований in vitro биологически активных веществ и ксенобиотиков на клеточных моделях, а также в персонализированной медицине, например, при персонализированном подборе химиотерапии.

Уровень техники

Культивирование клеток в МС на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных подходов, обеспечивающих in vitro условия, сходные с условиями in vivo, для поддержания жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени (до 28 дней), с возможностью регистрации изменения параметров, характеризующих функциональный статус клеток на молекулярном уровне, что позволяет исследовать отдельные параметры безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики лекарственных средств и ксенобиотиков.

В настоящее время с целью изучения системного ответа организма на воздействие лекарственных средств в условиях, близких к физиологическим, активно разрабатываются МС для культивирования клеток различной органной принадлежности. При этом для оптимизации процесса разработки лекарственных препаратов известно использование микрофлюидных биореакторов, позволяющих одновременно совместно культивировать несколько клеточных моделей тканей. Для указанных целей используются МС с ячейками объемом менее 1 мл для культивирования клеток, объединенных сетью микроканалов диаметром менее 1 мм [Ashraf, Tayyaba, Afzulpurkar, 2011; Verpoorte, Rooij De, 2003]. Микроскопические модели тканей и органов на основе клеточных культур, воспроизводящие реальные соотношения между объемами различных тканей в организме и моделирующие взаимодействия между ними в условиях, близких к физиологическому току жидкости (так называемые «орган на чипе» и «человек на чипе»), представляют собой замену традиционных методов исследований с использованием клеточных культур и доклинических испытаний на животных. При этом следует отметить, что морфофункциональный статус клеток, культивируемых в МС (биореакторе), сильно зависит от условий культивирования. Важную роль при воспроизведении условий, близких к физиологическим, в процессе культивирования клеток, играют механические, в том числе гидродинамические воздействия, обусловленные как геометрической структурой, параметрами клеточных ячеек и соединяющих их каналов, так и параметрами микронасоса и клапанов, управляющих током жидкости. В качестве основных параметров таких воздействий можно выделить давление жидкости в ячейке с клетками и касательные напряжения на поверхности клетки. Негативное влияние на функциональный статус клеточных моделей оказывает как отсутствие механического воздействия на клеточные модели, так и воздействие, превышающее физиологическую норму. Периодичность (частота) воздействия, что характерно для живых систем, играет не меньшую роль, чем величина и характер воздействия. Правильно организованный процесс культивирования существенно улучшает морфофункциональный статус клеток, позволяет избежать стрессирования клеток, качественным образом повышая информативность модели. Поддержание вышеперечисленных параметров МС осуществляется, как правило, посредством устройств управления МС.

В ряде МС применяются эластичные клапаны для управления движением среды [US 6899137 В2]. Комбинация из нескольких клапанов может использоваться для создания интегрированного в МС насоса, клапаны при этом могут управляться пневматически [US 20140197339 А1].

Известен комплекс AF1 Dual фирмы Elveflow, предназначенный для управления микрофлюидными устройствами повышенным или пониженным давлением воздуха. Однако данный комплекс предназначен для прямого управления давлением жидкости в микрофлюидных устройствах и имеет соответствующие характеристики, кроме того, имеет только один управляющий выход, что в совокупности не позволяет применять его для управления насосами на основе нескольких эластичных мембран.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является устройство управления LiverChip фирмы Zyoxel (CN BIO Innovations Ltd) [С. Rowe и др. LiverChip supports enhanced maturation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells // Application Note LCP-001. 2014. CN BIO Innovations Ltd.]. LiverChip имеет в биочипе микронасос на основе эластичных мембран, управляемый пневматически повышенным или пониженным давлением воздуха. Для создания данных управляющих сигналов используются пневмораспределители аналогично заявляемому изобретению.

Однако известное устройство не обеспечивает постоянные не зависящие от изменений объемных расходов воздуха значения повышенного и пониженного давления, подаваемые на мембраны микронасоса, что может приводить к стрессированию клеточных моделей из-за повышения частоты механических воздействий, вызванного нежелательными изменениями давления на мембранах насоса.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание устройства, обеспечивающего пневматическое управление работой клапанов МС и реализующего оптимальный режим движения жидкости по микроканалам МС с оптимальными механическими воздействиями на клеточные модели.

Техническим результатом является повышение стабильности характеристик пневматических сигналов, формируемых заявляемым устройством и направляемых на клапаны микронасоса МС, обеспечивающих изменение положения клапанов с минимальным побочным механическим воздействием на культивируемые в МС клеточные модели. В результате достигается улучшение морфофункционального статуса культивируемых клеточных моделей за счет обеспечения условий культивирования, близких к наблюдаемым in vivo (в организме), в частности касательных напряжений на поверхности слоя клеток (в зависимости от ткани от 0,01 до 2 Па), мгновенной скорости циркулирующей жидкости (приблизительно 1 мм/с в капиллярах), давления (2-4 кПа в капиллярах), частоты импульсов движения жидкости (60-140 в минуту).

Кроме того, заявляемое устройство характеризуется низким тепловыделением и низким уровнем шума, а также компактностью, что позволяет размещать блок управления на лабораторном столе клеточного бокса непосредственно рядом с СО₂-инкубатором.

Высокая стабильность характеристик устройства (точность установки и поддержания установленного значения управляющего давления на выходе из заявляемого устройства (пневмораспределителей), изменения величины давления) обеспечивается заявляемым комплексом конструктивных элементов, управляющих процессом генерации вакуума, регулировкой пониженного и повышенного давления, подачей на клапаны МС повышенного или пониженного давления в соответствии с заданным алгоритмом, фильтрацией нежелательных колебаний в питающих линиях, вызванных переключением большого количества пневмораспределителей и т.д. Нетривиальность задачи обусловлена необходимостью управления параметрами МС с учетом малых разностей давления, малых расходов жидкости и т.д. и тем, что промышленно выпускаемые пневматические компоненты рассчитаны на существенно более высокие объемные расходы воздуха и более низкую точность поддержания давлений, чем требуется в данном случае.

Поставленная задача решается тем, что устройство пневматического управления клапанами микрофлюидной системы включает линию повышенного и линию пониженного (относительно атмосферного) давлений, выполненные в виде системы трубок и фитингов, с помощью которых реализовано соединение конструктивных элементов устройства; линию подачи рабочей среды (сжатого газа, например, воздуха, подаваемого под давлением 450-800 кПа), которая соединена с линиями повышенного и пониженного давлений, при этом с линией пониженного давления соединение реализовано через эжектор; по крайней мере два блока пневмораспределителей, где каждый из блоков имеет два входа, один из которых подключен к выходу линии повышенного давления, второй - к выходу линии пониженного давления, а управляющий выход каждого пневмораспределителя блоков выполнен с возможностью подключения к соответствующему входу микрофлюидной системы для подачи повышенного или пониженного давлений через ограничитель максимального расхода рабочей среды; при этом каждая из линий повышенного и пониженного давлений включает последовательно подключенные: двухступенчатый пилотный стравливающий регулятор повышенного или пониженного давления, соответственно, при этом регуляторы давления выбраны с возможностью, обеспечивающей установку давлений в диапазоне от 5 до 50 кПа и от -50 до -5 кПа, соответственно, с погрешностью установки давления, не превышающей ±5 кПа, и имет время реакции на изменение расхода рабочей среды, не превышающее 50 мс; ресивер, при этом ресивер выбран с конструктивным решением, обеспечивающим перепад давления не более 15% при одновременном переключении не более 1/3 всех пневмораспределителей блоков; датчик давления.

Устройство может быть дополнительно снабжено глушителем, расположенным на выходе из эжектора, предназначенном для сброса рабочей среды.

В одном из вариантов осуществления устройство может выполнено с возможностью подключения к внешнему источнику вакуума со стороны выхода из эжектора для сброса рабочей среды, при этом оно дополнительно содержит вентиль, подключенный к линии подачи рабочей среды с возможностью перекрытия доступа рабочей среды в линию пониженного давления на участке перед подключением эжектора, при этом эжектор выполняет функцию соединителя (фитинга).

Пневмораспределители блока выполнены расположенными на одной монтажной плите.

Устройство может дополнительно содержать гидрофобные фильтры, выполненные из пористого политетрафторэтилена, расположенные на выходах из пневмораспределителей до или после ограничителей максимального расхода воздуха, предотвращающие попадание влаги в устройство из микрофлюидной системы.

Ресивер, подключенный к линии повышенного давления, представляет собой ресивер проходного типа.

Устройство может содержать третий датчик давления, подключенный к линии подачи рабочей среды, а также датчик расхода воздуха, подключенный к линии повышенного давления между регулятором давления и ресивером, для определения наличия утечки воздуха между устройством и микрофлюидной системой по разности расчетного и измеренного расхода рабочей среды.

Ограничитель максимального расхода воздуха может быть выполнен в виде дросселя с площадью проходного сечения от 0,05 до 0,5 мм², в виде детали с отверстием постоянного проходного сечения, в виде протяженной трубки.

Линия для подачи рабочей среды может включать, по крайней мере, три трубки, соединенные между собой через тройник, первая из которых предназначена непосредственно для подачи рабочей среды, вторая предназначена для соединения с линией повышенного давления, третья - для соединения с линией пониженного давления.

Наилучший результат достигается при следующей конструктивной реализации заявляемого устройства: при использовании эжектора модели Festo VN-07-H, регулятора повышенного давления модели Festo LRP-1/4-0,7, регулятора пониженного давления (вакуума) модели SMC IRV10A-C06, блоков пневмораспределей модели Festo МНА1-M1LH-3/2G-0,6-HC, ресивера с объемом 0,4 литра, датчика расхода воздуха модели SMC PFMV530-1, дросселей модели Festo GRLO-M5-QS-3-LF-C, или Camozzi SCO 602-05, или SMC AS1001FM-04, или GRLO-M5-QS-3-LF-C. Количество пневмораспределителей в каждом блоке выбрано равным 12.

Для работы заявляемого устройства требуется подключение источника сжатого воздуха. Устройство может работать от встроенного или внешнего источника вакуума. В первом случае исключается необходимость во внешнем источнике вакуума, во втором - существенно снижается потребление сжатого воздуха. Использование двухступенчатых пилотных стравливающих регуляторов повышенного и пониженного давления конкретной модели обеспечивает постоянство установленных значений вакуума и давления вне зависимости от количества одновременно переключаемых клапанов и частоты переключения. Применение ресиверов в линиях повышенного и пониженного давления приводит к существенному снижению колебаний давления при одновременном переключении большого количества клапанов. Слабое взаимное влияние давлений на выходах обеспечивается применением блоков быстродействующих соленоидных пневмораспределителей с большим проходным сечением магистралей монтажной плиты (манифольда).

Работой устройства может управлять программируемый логический контроллер. Входное давление, а также выходное повышенное давление и выходное пониженное давление контролируются датчиками давления, что позволяет проводить диагностику нештатных ситуаций (например, отсутствие давления на входе, чрезмерный расход вследствие утечек) и контроль за устанавливаемыми с помощью регуляторов повышенным и пониженным давлениями.

Заявляемое устройство предназначено для использования с МС, обеспечивающими культивирование клеточных моделей в условиях циркуляции питательной среды. Проведенные исследования МС с заявляемым устройством управления на примере культивирования клеток линий MCF7, HEPG2, MOLT7 и других клеточных моделей показали, что предложенная схема пневматического управления клапанами МС обеспечивает создание оптимального режима тока питательной среды, и, соответственно, условий культивирования клеток, которые привели к улучшению их морфологических и функциональных свойств по сравнению с условиями в культуральных планшетах.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 и 2 представлены фотографии с общим видом устройства для культивирования клеточных моделей, включающего блок управления, в котором было реализовано заявляемое устройство управления, и МС, подключенную к блоку управления, на фиг. 3 и 4 представлены схемы заявляемого устройства управления, при этом на фиг. 3 представлена конструктивная детализация одного из вариантов выполнения пневматической части заявляемого устройства, на фиг. 5 показана в разрезе ячейка МС, на фиг. 6 представлен пример реализации структурной схемы микроканалов и микронасоса в МС, на фиг. 7 представлена диаграмма одного из возможных алгоритмов работы микронасоса в течение одного цикла, где T1-Т6 - интервалы времени изменения управляющего пневматического сигнала, на фиг. 8 представлена зависимость изменения величины давления через определенные интервалы времени (Т1-Т6), демонстрирующая перепад давления между входом и выходом насоса в течение полного цикла его работы.

Позициями на фигурах обозначены:

1 - поликарбонатная плата,

2 - слой полидиметилсилоксана (ПДМС),

3 - предметное стекло,

4 - клеточная ячейка,

5 - крышка клеточной ячейки,

6 - микроканалы,

7, 8, 10, 11 - клапаны,

9 - рабочая камера микронасоса,

12 - входное отверстие,

13 - трубки,

14 - линия подачи рабочей среды (например, сжатого воздуха),

15 - линия повышенного давления,

16 - линия пониженного давления,

17 - датчик давления рабочей среды (сжатого воздуха),

18 - эжектор,

19 - регулятор повышенного давления,

20 - регулятор пониженного давления,

21 - датчик пониженного давления,

22 - датчик повышенного давления,

23, 24 - блоки пневмораспределителей,

25 - ресивер линии пониженного давления,

26 - ресивер линии повышенного давления,

27 - выход для глушителя,

28 - глушитель,

29 - вентиль,

30 - дроссели,

31 - выходы управления.

Осуществление изобретения

Заявляемое устройство (фиг. 1, 3, 4) было использовано в составе устройства, содержащего МС для культивирования клеток, и испытано при культивировании клеток линий MCF7, HEPG2, MOLT7 и других клеточных моделей в условиях циркуляции питательной среды.

МС для культивирования клеток представляла собой (фиг. 2, 5, 6) расположенный на поликарбонатной плате 1 слой полидиметилсилоксана (ПДМС) 2 с выполненными в нем шестью ячейками 4 для размещения и культивирования клеточных моделей органов (например, сфероидов или вставок с мембраной с нанесенными на нее клетками), связанными между собой микроканалами с образованием контура циркуляции жидкости (питательной среды) (фиг. 6). Ячейки и микроканалы герметизированы стандартным предметным стеклом 3. Каждая ячейка снабжена крышкой 5, расположенной в соответствующем резьбовом отверстии в поликарбонатной плате 1. В структуру микроканалов МС включен микронасос (образованный элементами 7, 8, 9), обеспечивающий подачу питательных веществ к клеткам, и микроклапаны (10, 11), обеспечивающие управление током среды, перемещаемой по микроканалам. Микронасос включает три входных отверстия 12 подачи рабочего давления, выполненные в слое ПДМС и поликарбонатной плате, при этом два входных отверстия предназначены для управления направлением перемещения среды, вытесняемой или аккумулируемой рабочей камерой насоса 8, в которых на границе соединения с микроканалами размещены клапаны 7 и 9, выполненные в виде мембраны с размещенной на ней перегородкой, обеспечивающей возможность перекрытия микроканала (тока жидкости). Третье входное отверстие расположено между первыми двумя и предназначено для подачи рабочего давления в рабочую камеру 8, образованную полостью микроканала между упомянутыми двумя клапанами, и в котором также на границе соединения с микроканалом размещена тонкостенная мембрана (без перегородки). В данном варианте исполнения были использованы сформированные в слое ПДМС три мембраны толщиной 500 мкм и диаметром 2 мм. При этом объем вытесненной из рабочей камеры жидкости в диапазоне от -50 до +50 кПа практически линейно зависит от величины давления. Положение трех мембран каждого микронасоса контролируется устройством управления пневматически, посредством трубок 13, подключенных к соответствующим входным отверстиям 12. При подаче на клапан воздуха под давлением ниже атмосферного - клапан открывается, при подаче воздуха под давлением выше атмосферного - клапан закрывается. Переключение повышенного и пониженного давления на клапанах и мембране рабочей камеры микронасоса в определенной последовательности (фиг. 7, 8) обеспечивает циркуляцию жидкости (питательной среды) по микроканалам через ячейки 4 в определенном направлении и с определенной скоростью.

Следует отметить, что МС может содержать несколько микронасосов, организованных несколькими группами клапанов. К устройству управления, имеющему 24 управляющих выхода, можно подключить до 8 МС, что позволяет проводить эксперименты с необходимым для статистической обработки количеством данных.

Устройство управления подает воздух под пониженным или повышенным давлением на клапаны МС, позволяет регулировать величину давления и скорость изменения давления подаваемого воздуха, частоту и порядок переключения клапанов и, как следствие, направление и скорость движения среды в МС.

Формирование пневмосигналов с заданными стабильными характеристиками, управляющих клапанами МС, является основной функцией заявляемого устройства, в частности, устройство обеспечивает изменение положения клапанов с заданной амплитудой и скоростью, в определенной последовательности, приводящее к циркуляции жидкости в МС и физиологичному механическому воздействию на клетки посредством движения жидкости в МС.

В предлагаемом варианте исполнения заявляемое устройство размещено в блоке управления, которое представляет собой корпус (например, APRA 280-311), снабженный сенсорным дисплеем, расположенным на лицевой панели корпуса (например, Hitachi Displays TX17D01VM2CAA), а также блоками питания (например, Artesyn Embedded Technologies LPS105-М и TDK-Lambda LS25-5). На лицевую панель корпуса выведены выходы для подключения МС, на заднюю панель - регуляторы пониженного и повышенного давления, выключатель и розетка для подключения шнура питания, интерфейсные разъемы, вход для подачи сжатого воздуха и выход для подключения глушителя. Блок управления также содержит размещенную в корпусе плату микроконтроллера STMicroelectronics STM32F417 с необходимой обвязкой, оперативной и Flash-памятью, четырьмя сдвиговыми регистрами NXP 74HCT594D и четырьмя сборками ключей Дарлингтона TI ULN2003A, а также плату дисплея с контроллером дисплея Solomon Systech SSD1963 и контроллером сенсорной панели ST Microelectronics STMPE811. Сдвиговые регистры соединены между собой, подключены через последовательную шину SPI к микроконтроллеру STM32F417 и через параллельную шину к сборкам ключей Дарлингтона, которые в свою очередь, через разъемы на плате подключены к блокам пневмораспределителей. Также к микроконтроллеру STM32F417 через разъемы и соответствующую аналоговую развязку подключены датчики повышенного и пониженного давления, датчик давления сжатого воздуха и датчик расхода. Розетка шнура питания через выключатель подключена к блокам питания, низковольтные выходы которых подключены к дисплею и платам. Плата дисплея подключена к плате микроконтроллера шлейфом соединяющим микроконтроллер STM32F417 параллельной шиной с контроллером SSD1963 и последовательной шиной SPI с контроллером STMPE811.

Пневматическая принципиальная схема заявляемого устройства представлена на фиг. 4. Схема включает линию подачи сжатого воздуха (рабочей среды) 14, соединенную с линиями повышенного 15 и пониженного 16 (относительно атмосферного) давлений. В устройство управления поступает с внешнего источника сжатый воздух, давление которого контролируется при помощи датчика давления 17. Воздух поступает на эжектор 18 и на регулятор давления 19. Эжектор 18 обеспечивает разрежение рабочей среды в линии отрицательного давления блока управления. Величина пониженного давления регулируется регулятором вакуума 20 и контролируется датчиком 21. Регулятор давления 19 обеспечивает поддержание заданного давления в линии повышенного давления блока управления, давление воздуха в линии контролируется датчиком давления 22.

В одном из вариантов исполнения заявляемое устройство управления имеет два блока пневмораспределителей 23 и 24 с 12 выходами каждый, через которые подают повышенное или пониженное давление на клапаны и в рабочую камеру микронасоса МС. Пневмораспределители в блоках 23 и 24 управляются электрически с платы с микропроцессором, реализующим в т.ч. алгоритм, представленный на фиг. 7. Оператор может задавать параметры работы МС с помощью, например, сенсорного дисплея, расположенного на корпусе устройства управления. Для минимизации колебательных процессов и поддержания постоянства давления в блоках пневмораспределителей 23 и 24 при резких изменениях расхода воздуха линии повышенного 15 и пониженного 16 давлений содержат ресиверы 25 и 26. Для снижения шума на выходе 27 эжектора 18 установлен глушитель 28.

Регуляторы 19 и 20 обеспечивают постоянство давления в линиях пониженного 16 и повышенного 15 давления при медленном (более 50 мс) изменении расхода воздуха в них, а ресиверы 25 и 26 - при быстром (менее 50 мс).

Устройство выполнено с возможностью подключения к внешнему источнику вакуума. Для этого вентиль 29 перекрывается. Подключение осуществляется через выход 27 (фитинг) для глушителя 28. Такой тип подключения значительно уменьшает расход сжатого воздуха (приблизительно с 25 до 4 л/мин.). Эжектор при этом выполняет функцию соединителя (фитинга).

Одним из основных параметров механического воздействия является величина касательных напряжений на поверхности клеточной модели, обусловленная движением жидкости и напрямую связанная с мгновенной скоростью жидкости. Поскольку мгновенная скорость жидкости непосредственно связана с изменением давления на рабочей камере насоса МС, необходима определенная скорость изменения давления на выходах устройства управления. Для канала прямоугольного сечения зависимость касательного напряжения от скорости жидкости выглядит следующим образом:

где τ_µ - касательное напряжение [Па], µ - динамический коэффициент вязкости жидкости [Па·с], ν - скорость жидкости [м/с], h=10^-4 - высота канала [м].

Максимальное пиковое значение скорости жидкости зависит от характера переходного процесса изменения давления воздуха на рабочей камере микронасоса 8. Экспериментально было получено, что время изменения скорости жидкости в канале при закрытии рабочей камеры равно времени нарастания давления на рабочей камере 8. Для задания этого времени к выходам пневмораспределителей 24 подключены дроссели 30, выходы которых являются управляющими выходами 31 устройства управления.

Давление в канале под мембраной рабочей камеры 8 зависит от нескольких параметров:

где t - время [с], d - диаметр проходного сечения дросселя 30 [м²], p_max - максимальное давление воздуха на мембране рабочей камеры 8 [Па], p_min - минимальное давление воздуха на мембране рабочей камеры 8 [Па], V - объем трубки 13 [м³].

Скорость изменения объема в трубке 13 равна расходу воздуха через дроссель 30:

где - расход воздуха через дроссель 30 [м³/с].

Подставляя из уравнения состояния:

где R_Г=287 - газовая постоянная [Дж/К·кг], Т - температура воздуха [К], ρ - плотность воздуха перед дросселем[кг/м³].

Расход через дроссель 30 составляет:

где F - площадь отверстия на входе в дроссель 30 [м²], γ=0.8 - коэффициент истечения из отверстия, k=1.4 - показатель адиабаты.

Скорость изменения давления на мембране рабочей камеры 8 описывается следующим уравнением:

Легко заметить, что скорость изменения давления достигает своего максимума в начальный момент процесса закрытия рабочей камеры 8, когда р=p_min. Таким образом, при постоянных значениях p_max и p_min максимальная скорость изменения давления, а также максимальная скорость течения жидкости в канале, будут линейно зависеть от площади проходного сечения отверстия дросселя 30.

На мембрану рабочей камеры с одной стороны действует сила давления воздуха, с другой - сила упругости мембраны и давление, обусловленное гидродинамическим сопротивлением жидкости и деформацией каналов МС. Смещение мембраны можно выразить через величину давления на мембране:

где x - смещение мембраны [м], S - площадь мембраны [м²], k - коэффициент упругости мембраны [Н/м]. Зная смещение мембраны, можно определить объем жидкости, который она вытесняет под действием данного давления:

Мгновенная скорость питательной среды с вытесненным объемом связана через проходное сечение микроканала:

где S_ch - площадь проходного сечения микроканала [м²].

В частности, исходя из характерного для клеток легкого касательного напряжения 1.5 Па и размеров канала 5.2×0.1 мм, по формулам (6)-(9) несложно получить площадь проходного сечения дросселя, равную приблизительно 0.1 мм². Исходя из этого значения проходного сечения для снижения фронтов нарастания и спада повышенного и пониженного давления были выбраны дроссели Festo GRLO-M5-QS-3-LF-C, Camozzi SCO 602-05 и SMC AS1001FM-04. Экспериментально было установлено, что расход в столь малых диапазонах лучше всего (точность установки и фиксация установленного значения) регулирует GRLO-M5-QS-3-LF-C.

Кроме того, необходимо обеспечить отсутствие существенных перепадов давления на управляющих выходах устройства (±10 кПа с учетом демпфирования давления мембранами 7-11 и трубками 13), обусловленных изменением давления на других управляющих выходах, поскольку это может привести к недетерминированному повышению частоты механического воздействия на клеточные модели и, следовательно, снижению валидности модели.

Требуемую точность и быстродействие могут обеспечить только двухступенчатые пилотные регуляторы давления, стравливающие воздух в случае превышения заданного давления. Кроме того, требуется введение в пневматическую схему ресиверов - в линии пониженного и повышенного давления, а также подбор остальных элементов пневматической схемы определенных моделей с учетом их пропускной способности и других параметров.

Ниже более подробно представлено обоснование выбора конструктивных элементов заявляемой пневматической схемы устройства управления.

Регуляторы повышенного давления выбирались среди двухступенчатых пилотных стравливающих регуляторов хорошо зарекомендовавших себя производителей пневматических компонентов. Сравниваясь Festo LRP-1/4-0,7 (5…70 кПа), SMC ARP20-01-1 (5…200 кПа), SMC IR1000-F01 (5…200 кПа). Было выявлено, что модель фирмы Festo быстрее других реагирует на изменение расхода (менее 50 мс) и имеет наиболее точную регулировку, благодаря более узкому диапазону выходных давлений. Также может быть использован регулятор Airtrol components R-800-10-W/*.

Точная регулировка отрицательного давления (глубины вакуума) не является распространенной в промышленности задачей, что обуславливает достаточно скудный выбор готовых решений. При генерации пониженного давления с помощью эжектора регулировку величины давления можно осуществлять рядом способов: регулировкой давления сжатого воздуха на входе эжектора, регулировкой расхода сжатого воздуха, например дросселем, регулировкой посредством специализированного регулятора вакуума на выходе эжектора. Первые два способа обеспечивают только грубую регулировку, при этом величина отрицательного давления на выходе существенно зависит от расхода воздуха на выходе. Таким образом, решение задачи возможно за счет применения специализированного регулятора. Исходя из известных характеристик регулятора (точность установки ±1 кПа, стабилизация ±3 кПа при расходе 0-10 сл./мин) и результатов эксперимента был выбран регулятор IRV10A-C06 производства SMC. Также может быть использован регулятор Airtrol components P-800-30-W/*.

Переключение давления между повышенным и пониженным на выходах устройства управления осуществляется посредством пневматических распределителей (пневмораспределителей). Для управления МС требуется высокое быстродействие (не менее 5 Гц), долговечность (не менее 200 млн. циклов). Для обеспечения минимального уровня пульсаций требуется большое проходное сечение магистралей в монтажной пластине (манифольде) на которой установлены пневмораспределители, при минимальных проходных сечениях самих пневмораспределителей и стравливаемых ими при переключении объемах. Кроме того, пневмораспределители, по возможности, должны иметь компактные размеры и низкое тепловыделение. Экспериментально были отобраны блоки пневмораспределителей на электромагнитных клапанах прямого действия Festo MHA1-M1LH-3/2G-0,6-HC, Camozzi K8000-403-K23 и SMC S070M-5AC-32. Наибольшими габаритными размерами среди них обладают блоки пневмораспределителей Camozzi, наименьшими - SMC. При приблизительно равных быстродействии, сроке службы, тепловыделении, блоки Festo в эксперименте показали наименьшие перепады давления на одном выходе при одновременном переключении 8 пневмораспределителей (максимальное количество одновременно переключаемых пневмораспределителей при 8 работающих микронасосах) на соседних выходах при максимальных давлениях ±50 кПа.

Электрическое управление пневмораспределителями может осуществляться промышленно выпускаемым программируемыми логическими контроллерами (ПЛК), например, Siemens Simatic S7.

Для сглаживания перепадов давления, обусловленных недостаточной производительностью эжектора в моменты одновременного переключения большого числа пневмораспределителей и запаздыванием реакции регуляторов на резкое изменение расхода воздуха, в разрыв линий повышенного и пониженного давления были установлены ресиверы. Выбор оптимального объема ресиверов был сделан по итогам эксперимента, аналогичному вышеописанному, за исключением того, что перепад давления измерялся на конце трубки с внутренним диаметром 1.2 мм и длиной 2 м. Сравнивались варианты с ресивером объемом 0.1 л, 0.4 л, 0.75 л и без ресивера. Ресивер объемом 0.4 л снижал перепады давления до менее чем 15% (7.5 кПа) от максимума (±50 кПа). Перепады сглаживались приблизительно в два раза в линии повышенного давления и в четыре раза - в линии пониженного, относительно варианта без ресивера. Ресивер 0.75 л сглаживал перепады давления до 12% от максимума, в этой связи с учетом массогабаритных характеристик были выбраны ресиверы объемом 0.4 л.

Пример конкретного выполнения

Заявляемое устройство включало в себя два блока пневмораспределителей, каждый из которых содержал 12 клапанов Festo MHA1-M1LH-3/2G-0,6-HC, к выходам которых были подключены дроссели Festo GRLO-M5-QS-3-LF-C. Источником вакуума служил эжектор Festo VN-07-H с подключенным к нему глушителем. В качестве регуляторов пониженного и повышенного давления использовались Festo LRP-1/4-0,7 и SMC IRV10A-С06 соответственно, с подключенными к их выходам ресиверами Festo объемом 0.4 л. Клапанами пневмораспределителей управляла плата микроконтроллера с программным обеспечением, реализующим в числе прочего графический интерфейс, позволяющий управлять устройством с помощью сенсорного дисплея, и алгоритм переключения клапанов согласно фиг. 7. Подробное описание конструктивного выполнения электроники представлено выше. Входное давление сжатого воздуха контролировалось через графический интерфейс датчиком Festo SDE5-D10, а пониженное и повышенное давления - датчиками Honeywell 40РС015, подключенными к плате. Использовались фитинги Festo серий QS и QSM. Пневматические компоненты были соединены согласно фиг. 4.

Заявляемое устройство было апробировано в МС, представляющем собой биореактор, на примере культивирования клеточных линий MCF7, HepG2, MOLT7 и других клеточных моделей в условиях непрерывной циркуляции питательной среды. Устройство управления позволило поддерживать заданный средний объемный расход циркулирующей в МС питательной среды в пределах от 0 до 32 мкл/мин, с мгновенными скоростями в диапазоне от 0.1 до 1.8 мм/с, средними скоростями от 0 до 0.5 мм/с и пульсирующим течением (фиг. 8), что позволило воспроизвести условия микроокружения, наблюдаемые в капиллярах и соответствующие касательные напряжения на поверхностях клеток.

В частности, при культивировании дифференциированных клеток линии HepG2 (карцинома печени человека) использовались следующие параметры: пониженное давление -30 кПа и повышенное +30 кПа с частотой переключения пневмораспределителей 2 Гц по алгоритму, указанному на фиг. 7. Клеточные модели находились во вставках с мембранами из поликарбоната с размером пор 0.4 мкм (около 50 тысяч клеток на вставку). Таким образом, наружная часть мембраны омывалась циркулирующей питательной средой.

Перед использованием МС последовательно промывалась антисептическим и буферным растворами. Затем МС заполнялась питательной средой (DMEM), в нее помещались мембранные вставки с клеточными культурами и включалась циркуляция (переключение положения клапанов по алгоритму фиг. 7). Далее МС помещалась в CO₂ инкубатор (37°С, 5% СО₂). В процессе культивирования в течение трех суток экспрессия белков теплового шока оставалась на уровне, сравнимом с таковым для клеток, культивируемых в статических условиях. Экспрессия специфичного для клеток печени гена CYP3A4 значимым образом возросла. Таким образом, культивирование клеток HepG2 с использованием заявляемого устройства управления привело к улучшению морфофункционального статуса клеточной модели.

Заявляемое устройство, применяемое для обеспечения условий моделирующего микроциркуляцию динамического культивирования в МС, позволяет получить модель с фенотипом более близким к in vivo, чем при культивировании в статических условиях.

Изобретение относится к области культивирования клеточных моделей. Предложено устройство пневматического управления клапанами микрофлюидной системы. Устройство включает линии повышенного и пониженного давлений, линию подачи сжатого газа, блоки пневмораспределителей. Каждый из блоков имеет два входа, где один подключен к выходу линии повышенного давления, второй - к выходу линии пониженного давления. Управляющий выход каждого пневмораспределителя блоков выполнен с возможностью подключения к входу микрофлюидной системы для подачи повышенного или пониженного давлений через ограничитель максимального расхода рабочей среды. Каждая из линий повышенного и пониженного давлений включает ресивер, датчик давления, двухступенчатый пилотный стравливающий регулятор повышенного или пониженного давления, при этом регуляторы давления обеспечивают установку давлений в диапазоне от 5 до 50 кПа и от -50 до -5 кПа и имеют время реакции на изменение расхода рабочей среды до 50 мс. Ресивер выбран исходя из условия обеспечения перепада давления не более 15% при одновременном переключении не более 1/3 всех пневмораспределителей блоков. Изобретение обеспечивает повышение стабильности характеристик пневматических сигналов и улучшение морфо-функционального статуса культивируемых клеточных моделей. 20 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Устройство пневматического управления клапанами микрофлюидной системы для культивирования клеточных моделей, включающее линию повышенного и линию пониженного давлений, выполненные в виде системы трубок и фитингов, с помощью которых реализовано соединение конструктивных элементов устройства; линию подачи рабочей среды, представляющей собой сжатый газ, которая соединена с линиями повышенного и пониженного давлений, при этом с линией пониженного давления соединение реализовано через эжектор; по крайней мере два блока пневмораспределителей, где каждый из блоков имеет два входа, один из которых подключен к выходу линии повышенного давления, второй - к выходу линии пониженного давления, а управляющий выход каждого пневмораспределителя блоков выполнен с возможностью подключения к соответствующему входу микрофлюидной системы для подачи повышенного или пониженного давлений через ограничитель максимального расхода рабочей среды; при этом каждая из линий повышенного и пониженного давлений включает двухступенчатый пилотный стравливающий регулятор повышенного или пониженного давления соответственно, при этом регуляторы давления выбраны с возможностью, обеспечивающей установку давлений в диапазоне от 5 до 50 кПа и от -50 до -5 кПа соответственно, с погрешностью установки давления, не превышающей ±5 кПа, и имеют время реакции на изменение расхода рабочей среды, не превышающее 50 мс; также каждая из линий повышенного и пониженного давлений включает ресивер, при этом ресивер выбран исходя из условия обеспечения перепада давления не более 15% при одновременном переключении не более 1/3 всех пневмораспределителей блоков, и датчик давления.

2. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что оно дополнительно снабжено глушителем, расположенным на выходе из эжектора, предназначенном для сброса рабочей среды.

3. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что оно выполнено с возможностью подключения к внешнему источнику вакуума со стороны выхода из эжектора для сброса рабочей среды и содержит вентиль, подключенный к линии подачи рабочей среды с возможностью перекрытия доступа рабочей среды в линию пониженного давления на участке перед подключением эжектора, при этом эжектор выполняет функцию соединителя.

4. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что пневмораспределители блока расположены на одной монтажной плите.

5. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что оно дополнительно содержит гидрофобные фильтры, расположенные на выходах из пневмораспределителей до или после ограничителей максимального расхода воздуха, предотвращающие попадание влаги в устройство из микрофлюидной системы.

6. Устройство по п. 5, характеризующееся тем, что гидрофобные фильтры выполнены из пористого политетрафторэтилена.

7. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что ресивер, подключенный к линии повышенного давления, представляет собой ресивер проходного типа.

8. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что оно содержит третий датчик давления, подключенный к линии подачи рабочей среды.

9. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что оно содержит датчик расхода воздуха, подключенный к линии повышенного давления между регулятором давления и ресивером, для определения наличия утечки воздуха между устройством и микрофлюидной системой по разности расчетного и измеренного расхода рабочей среды.

10. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что ограничитель максимального расхода воздуха выполнен в виде дросселя с площадью проходного сечения дросселя от 0,05 до 0,5 мм².

11. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что ограничитель максимального расхода воздуха выполнен в виде детали с отверстием постоянного проходного сечения.

12. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что ограничитель максимального расхода воздуха выполнен в виде протяженной трубки.

13. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что количество пневмораспределителей в каждом блоке выбрано равным 12.

14. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что линия для подачи рабочей среды включает по крайней мере три трубки, соединенные между собой через тройник, первая из которых предназначена непосредственно для подачи рабочей среды, вторая предназначена для соединения с линией повышенного давления, третья - для соединения с линией пониженного давления.

15. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве эжектора использован эжектор модели Festo VN-07-H.

16. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве регулятора повышенного давления использован регулятор модели Festo LRP-1/4-0,7.

17. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве регулятора пониженного давления использован регулятор вакуума SMC IRV10A-C06.

18. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве блоков пневмораспределей использованы устройства модели Festo MHA1-M1LH-3/2G-0,6-HC.

19. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что ресиверы использованы объемом 0,4 литра.

20. Устройство по п. 9, характеризующееся тем, что в качестве датчика расхода воздуха использовано устройство модели SMC PFMV530-1.

21. Устройство по п. 10, характеризующееся тем, что использованы дроссели модели Festo GRLO-M5-QS-3-LF-C, Camozzi SCO 602-05, SMC AS1001FM-04, GRLO-M5-QS-3-LF-C.