УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СПЕКТРА ИМПЕДАНСА БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР Российский патент 2020 года по МПК G01N27/02 G01N33/49 

Изобретение относится к области измерительной техники и может использоваться для измерения спектра импеданса биологических тканей и органов млекопитающих, в частности, образцов in vitro моделей барьерных тканей в биологических экспериментах, а также позволяет измерять импеданс различных растворов с целью определения их физических свойств (концентрации, проводимости и т.д.).

Культивирование клеток в микрофлюидных системах на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных подходов, обеспечивающих in vitro условия, сходные с условиями in vivo, для поддержания жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени (до 28 дней), с возможностью регистрации изменения параметров, характеризующих функциональный статус клеток на молекулярном уровне. Изучение клеточных структур в естественном состоянии позволяет получить новые знания о процессах, происходящих в клетках, определить способы воздействия на клетки, приводящие к тому или иному результату. Это является важным при создании эффективных лекарственных средств и разработке новых методов лечения заболеваний.

Модели биологических барьеров чрезвычайно важны для исследования физиологических функций, механизмов транспорта, патологий. Слои образующих барьер эпителиальных и эндотелиальных клеток, прежде всего, характеризуются способностью формировать плотные межклеточные контакты, разделяющие апикальную и базолатеральную стороны слоя. Клетки формируют между соответствующими компартментами слой с селективной проницаемостью, контролирующий диффузию через парацеллюлярные пути и транспорт - через интрацеллюлярные. При этом, барьер не является статическим и может модулироваться различными стимулами, приводящими к его закрытию или открытию. Функционирование этого барьера необходимо для выполнения тканью своей физиологической функции.

Импедансная спектрометрия является воспроизводимым и информативным методом измерения трансэпителиального или трансэндотелиального сопротивления. Метод заключается в измерении амплитуды и фазы переменного тока, при воздействии синусоидального переменного напряжения с частой обычно изменяемой в диапазоне от 1 Гц до 100 кГц. Из полученного спектра полного сопротивления путем «подгонки» модели, основанной на эквивалентной схеме, можно извлечь информацию не только об активном сопротивлении, но и реактивных компонентах сопротивления, позволяющих оценить различные параметры клеточной модели.

Из уровня техники известны различные устройства, обеспечивающие измерение импеданса биологических структур.

В частности, из заявки WO 2013172512 известно устройство измерения импеданса клетки, включающее чип фильтрующего электрода, состоящий из подложки, слоя, формирующего канал на подложке со входом и выходом, через который могут проходить клетки в жидкости, а также фильтрующего электрода, находящегося в том же слое, что и канал, и второго электрода, находящегося на некотором расстоянии от фильтрующего, в результате чего канал оказывается расположенным между электродами.

Из патента RU 2381008 известно устройство для измерения электродинамических параметров биологических тканей. Устройство включает источник СВЧ-сигнала, датчик и блок обработки и регистрации сигнала. Источник СВЧ-сигнала выполнен в виде генератора качающейся частоты, датчик в виде - контактного резонансного датчика. Вход датчика подключен к выходу генератора качающейся частоты, а выход через последовательно соединенные детектор и аналого-цифровой преобразователь подключен к блоку обработки и регистрации сигнала. Выход тактового сигнала генератора качающейся частоты подключен ко входам тактового сигнала АЦП и блока обработки и регистрации сигнала, управляющий выход которого соединен с управляющим входом АЦП.

Устройство и интегральная схема для анализа импеданса клеток известны из патента CN 103630579. Данная интегральная схема включает диэлектрическую подложку, в центре которой расположена область анализа импеданса, и массив металлических электродов миниатюрного размера, изолированных друг от друга и равномерно распределенных по периметру области анализа импеданса.

Международная заявка WO 2015181322 описывает устройство для измерения межслойного электрического импеданса в in vitro модели клеточного барьера. В заявке предлагается устройство, монтируемое в in vitro модели клеточного барьера. Модель включает первую камеру, вторую камеру и, по крайней мере, одну опору для разделения первой и второй камер. Устройство включает два набора электродов. Первый набор электродов включает первый электрод и второй электрод, адаптированные для размещения друг между другом на внутренней поверхности первой камеры. Второй набор электродов также включает первый и второй электроды, аналогичные электродам первого набора и размещенные на внутренней поверхности второй камеры.

Известен также прибор "cellZscope" (nanoAnalytics, https://www.nanoanalytics.com/de/produkte/cellzscope/cellzscopeplus.html), позволяющий производить мониторинг импеданса в режиме реального времени в 24 мембранных вставках с последующей оценкой трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и электрической емкости. Прибор представляет собой измерительный модуль из ячеек-электродов, изготовленных из нержавеющей стали, в которые помещаются мембранные вставки с клеточными моделями. Устройство позволяет работать со вставками различного диаметра. Измерительный модуль имеет защитную крышку и позволяет проводить измерения в инкубаторе в режиме реального времени. Все элементы модуля автоклавируемы.

Наиболее близким к предлагаемому устройству является прибор "TEER 24" (Applied BioPhysics, https://www.biophysics.com/products-ecisTeer24.php), позволяющий измерять в режиме реального времени трансэпителиальное электрическое сопротивление на частоте 75 Гц, включающий планшет с 24 ячейками для мембранных вставок с монослоем клеток, вставку с золотыми электродами и крышку, при этом электроды расположены на дне планшета. Планшет автоклавируется и позволяет измерять импеданс в режиме реального времени, располагаясь в инкубаторе.

Однако известные устройства не обеспечивают получение спектра импеданса на различных значениях частот. Кроме того, в известных устройствах максимальное число используемых мембранных вставок ограничено 24. В связи с большой распространенностью на сегодняшний день производительных 96-луночных культуральных планшетов с мембранными вставками, существует потребность в создании простых в сборке и эксплуатации, а также учитывающих специфику работы с клетками устройств измерения импеданса, совместимых с данным форматом культуральных планшетов. Проведение измерений спектра импеданса известными устройствами возможно только при помощи поставляемых производителями ячеек с электродами, либо электродами, размещаемыми у объекта измерений вручную. Такая схема затрудняет процесс измерений, а точность результатов зависит от квалификации и действий лаборанта.

Технической проблемой, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание простого в сборке и эксплуатации устройства, обеспечивающего измерение в режиме реального времени спектра импеданса биологических структур (клеточной модели), размещенных, в том числе в многолуночных (включая 96-луночный) культуральных планшетах с мембранными вставками, а также микрофлюидных чипах, в широком диапазоне частот (от 20 Гц до 20 кГц).

Техническим результатом является обеспечение быстроты и удобства сборки и эксплуатации устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, культивируемых на мембранных вставках, размещенных в многолуночном планшете или в микрофлюидном чипе. Дополнительными результатами являются минимизация шумов при измерениях, повышение точности измерений за счет выделения составляющих сопротивления среды и мембаны от сопротивления клеточного монослоя, при получении спектра импеданса в широком диапазоне частот (от 20 Гц до 20 кГц), возможность быстрой калибровки устройства перед каждой сессией измерений, которая достигается удобным интерфейсом устройства, возможность автоматического измерения импеданса клеточных структур, размещенных в каждой лунке планшета или чипа. Кроме того, за счет наличия световой индикации, устройство позволяет следить за процессом измерений в режиме реального времени и оперативно реагировать на смену статуса прибора.

Технический результат достигается за счет разработки устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, расположенных в контейнерах (в качестве которых могут выступать мембранные вставки с клетками, размещенные в многолуночном планшете, многослойных микрофлюидных чипах со встроенной системой электродов и другими электродами, позволяющими проводить измерения по четырехэлектродной схеме), включающего корпус, состоящий из трех частей: основания с управляющей платой, крышки с платой индикации, и средней части, включающей рамку, размещаемую между основанием и крышкой, при этом с внешней стороны крышки размещены два дисплея для отображения результатов измерения; управляющая плата содержит управляющий микроконтроллер, блок питания, измерительный входной и выходной каскады, блок памяти, разъем для коммутации с платой индикации, по меньшей мере, четыре разъема для подключения к контейнерам с биологическими структурами через плату коммутации, сигнальный разъем для обеспечения коммутации между управляющей платой и платой коммутации, разъем для подачи питания, разъем для подключения к периферийным устройствам и энкодер, обеспечивающий выбор частоты измерений и переключение между диапазонами частот. Плата индикации содержит ответный разъем для коммутации с управляющей платой, разъемы для подключения дисплеев, и кнопки управления, включающие кнопку запуска процесса измерений, кнопки навигации по меню, кнопки переключения между графиками, отображающими измеренные параметры, и роторный переключатель, обеспечивающий выбор сохраненного файла измерений для просмотра; при этом крышка снабжена сквозными отверстиями, расположенными в соответствии с расположением кнопок, роторного переключателя и энкодера, а рамка снабжена защитными вставками, зафиксированными в зоне крепления разъемов платы управления, снабженными отверстиями, соответствующими разъемам платы управления; в корпусе расположены индикаторные светодиоды, закрепленные с возможностью излучения на рамку; между основанием и управляющей платой размещена изолирующая прокладка; рамка выполнена из светорассеивающего материала для вывода световой индикации от светодиодов.

При этом плата индикации и плата управления могут быть закреплены на крышке и основании, соответственно, посредством винтового соединения.

Светодиоды могут быть выполнены многоцветными и припаяны по периметру платы управления.

Рамка может быть выполнена из поликарбоната.

Разрабатываемое устройство обладает широким диапазоном исследуемых частот (от 20 Гц до 20 кГц), что позволяет не только определять значение TEER, но и значение дополнительных электрических параметров, таких как емкость и фоновое сопротивление. Их определение позволяет более полно охарактеризовать состояние клеточного барьера, вплоть до определения многослойности структуры клеточной модели. Предложенное устройство позволяет с помощью удобных и интуитивно понятных органов управления наблюдать полученные при измерении данные, которые представлены на дисплеях в виде графиков и годографов, а также позволяет переносить полученные данные на ПК, что значительно упрощает статистическую обработку. Кроме того, данное устройство имеет режим измерений, при котором в реальном времени выводятся на дисплей интересующие электрические параметры наблюдаемой клеточной модели на любой из всего диапазона частоте, что открывает гораздо больше возможностей для исследователей, изучающих динамику развития клеточных барьеров.

Изобретение поясняется чертежами и фотографиями, где на Фиг. 1 представлен общий вид устройства; на Фиг. 2 - фрагмент крышки с платой индикации и дисплеями; на Фиг. 3 - основание с платой управления и средней частью с разъемами и рамкой, на Фиг. 4 - пример выполнения платы управления; на Фиг. 5 - пример выполнения платы индикации; на Фиг. 6 приведена взрыв-схема устройства; на Фиг. 7 - устройство со снятой крышкой; на Фиг. 8 - функциональная схема микросхемы AD5933; на Фиг. 9 - принципиальная электрическая схема выходного каскада синусоидального тока с постоянной амплитудой (пример), на Фиг. 10 - принципиальная электрическая схема входного измерительного каскада (пример), на Фиг. 11 - образец изготовленного устройства с подключенной платой коммутации; на Фиг. 12-17 - примеры отображения информации на дисплеях устройства при его различных режимах функционирования.

Позициями на Фиг. 1-17 обозначены:

1 - основание;

2 - крышка;

3 - рамка;

4 - плата управления;

5 - плата индикации;

6 - дисплей для отображения результатов измерений;

7 - управляющий микроконтроллер;

8 - блок питания

9 - измерительный входной каскад;

10 - выходной каскад синусоидального тока с постоянной амплитудой;

11 - блок памяти;

12 - разъем для коммутации с платой индикации;

13 - разъем для подключения к электродам в контейнере с биологическими структурами;

14 - плата коммутации;

15 - сигнальный разъем для обеспечения коммутации между управляющей платой и платой коммутации;

16 - разъем для подачи питания;

17 - разъем для подключения к периферийным устройствам;

18 - энкодер, обеспечивающий выбор частоты измерений и переключение между диапазонами частот;

19 - ответный разъем платы индикации для коммутации с управляющей платой;

20 - разъем для подключения дисплея;

21 - кнопка «Start» для запуска процесса измерений;

22 - кнопка навигации по меню;

23 - кнопка переключения между графиками, отображающими измеренные параметры;

24 - роторный переключатель, обеспечивающий выбор сохраненного файла измерений для просмотра;

25 - сквозное отверстие в крышке;

26 - защитная вставка в рамке 3;

27 - сквозное отверстие в защитной вставке 26;

28 - кабель с разъемом;

29 - индикаторный светодиод;

30 - изолирующая прокладка;

31 - элемент питания;

32 - винтовое соединение.

Предлагаемое устройство предназначено для измерения спектра импеданса (в нескольких точках) биологических структур (например, клеточного монослоя), расположенных в контейнерах - многолуночных планшетах или клеточных ячейках микрофлюидных чипов со встроенной системой электродов или в других емкостях с электродами, позволяющими проводить измерения по четырехэлектродной схеме. Устройство может подключаться к электродам микрофлюидных чипов, применяемых для культивирования и/или исследования клеток человека, животных, растений и/или культур вирусов. Ниже представлено более детальное описание заявляемого устройства, не ограничивающее сущность, представленную в независимом пункте формулы, а лишь демонстрирующее возможность достижение заявленного технического результата.

Устройство включает прямоугольный корпус, состоящий из трех частей: основания 1, крышки 2 (лицевой панели) и средней части устройства, включающей рамку 3, расположенную между основанием 1 и крышкой 2. В основании 1 корпуса расположена плата управления 4, а в крышке 2 - плата индикации 5. С внешней стороны крышки 2 размещены два дисплея 6 для отображения результатов измерения и параметров.

Плата управления 4 содержит управляющий микроконтроллер 7, блок питания 8, измерительный входной 9 и выходной 10 каскады, блок памяти 11. При этом плата управления 4 выполнена на базе микросхемы - конвертера AD5933 (Analog Devices 1MSPS, 12-bit Impedance Converter. Network Analyzer, www.analog.com; Образцов С., Троицкий Ю. Прецизионный конвертор импеданса AD5933 // Современная электроника. -2009. - №. 9. - С. 12-15.), предназначенного для оценки спектрального состава комплексного сопротивления в широком диапазоне частот (Фиг. 8). Микросхема содержит все основные составляющие части для реализации системы измерения импеданса, такие как: цифровой синтезатор частоты (DDS), выходной цифро-аналоговый преобразователь (ЦАП), входной аналого-цифровой преобразователь (АЦП), блок выходных/входных усилителей, а также цифровой сигнальный процессор (DSP), выполняющий дискретное преобразование Фурье (DFT) в каждой точке-частоте выбранного диапазона. Измерительный входной каскад 9 устройства построен на инструментальном операционном усилителе (ОУ) с программируемым коэффициентом усиления (G=1, 2, 5, 10) AD8250 и буферных входных усилителях AD8065. По каждому входу установлены блокирующие конденсаторы с целью не пропустить постоянную составляющую, которая может ограничить динамический диапазон и вызвать насыщение выхода ОУ, а также резисторы для создания цепи стекания постоянного тока на землю. В качестве источника тока выбран источник Хауленда, управляемый напряжением, так как он позволяет контролировать и задавать значение тока, проходящего через исследуемые биологические образцы. Принципиальные электрические схемы входного измерительного каскада 9 и выходного каскада 10 синусоидального тока с постоянной амплитудой представлены на Фиг. 9, 10.

В верхней части платы управления 4 расположен разъем 12 для коммутации с платой индикации, а по периметру платы расположены, по меньшей мере, четыре разъема 13 для подключения электродов в контейнерах с биологическими структурами через плату коммутации 14, сигнальный разъем 15, обеспечивающий коммутацию между управляющей платой и платой коммутации 14, разъем 16 для подачи питания и разъем 17 для подключения к периферийным устройствам (например, персональному компьютеру). В одном из частных вариантов реализации устройства разъемы 13, 15 расположены вдоль большей стороны платы, а разъемы 16, 17 - вдоль меньшей стороны, что обеспечивает удобство эксплуатации устройства. В нижней части платы 4 расположен энкодер 18, обеспечивающий выбор частоты измерений и переключение между диапазонами частот, например, роторный квадратурный энкодер PES11S-929K-S0015. При этом часть платы и корпуса устройства в месте расположения энкодера выполнены скругленными, соответствующими форме ручки энкодера. Плата управления 4 может также содержать дополнительный сменный элемент питания 31. Основной функцией элемента питания является питание блока памяти 11 для хранения параметров и настроек режимов измерения при отсутствии внешнего питания через разъем питания 16.

Плата индикации 5 содержит ответный разъем 19 для коммутации с платой управления 4 (разъем для подключения к управляющей плате) и разъемы 20 для подключения дисплеев 6. Плата 5 также содержит два блока тактовых кнопок 22, 23, при этом верхний блок кнопок 22 предназначен для навигации по меню, а нижний 23 - для переключения между графиками, отображающими измеренные параметры. В нижней части платы 5 расположены кнопка «Start» 21, обеспечивающая запуск процесса измерений и механический роторный переключатель 24, обеспечивающий выбор сохраненного файла измерений для просмотра, например, на 8 позиций.

На плате индикации расположены контактные площадки для крепления и подключения тактовых кнопок 22 и 23, кнопки «Start» 21 и роторного переключателя 24. Плата индикации обеспечивает питание дисплеев 6 и вывод графической информации через разъем 20.

Задачей платы индикации 5 является обеспечение взаимодействия пользователя с платой управления 4, а именно вывод на дисплеи 6 необходимой информации о проведении измерений и возможность установки режимных параметров устройства. Управление настройками и навигация по меню осуществляется при помощи кнопок 22, 23, роторного переключателя 24 и энкодера 18.

Крышка 2 устройства снабжена сквозными отверстиями 25, расположенными в соответствии с расположением кнопок платы индикации, роторного переключателя и энкодера, которые выполнены выступающими за лицевую поверхность крышки, что обеспечивает доступ пользователя к данным элементам для ввода команд, управления настройками и навигации по меню. При этом на выступающих кнопках 21, 22, 23 расположены накладки из эргономических соображений, а энкодер 18 снабжен рукояткой, установленной на лицевой поверхности крышки.

Рамка 3 снабжена защитными вставками 26, зафиксированными в зоне крепления разъемов платы управления, обеспечивающими фиксацию и электрическую изоляцию разъемов 14-17, при этом во вставках 26 выполнены сквозные отверстия 27, соответствующие форме каждого разъема. В частном варианте выполнения устройство имеет две защитные вставки (Фиг. 3), расположенные на смежных сторонах рамки, одна из которых снабжена двумя отверстиями для выводов разъема для подачи питания и разъема для подключения к периферийным устройствам, а вторая снабжена пятью отверстиями, четыре из которых предназначены для разъемов для подключения к контейнеру с биологическими структурами и одно - для сигнального разъема для подключения платы коммутации 14. При этом в основании 1 и крышке 2 в зоне расположения защитных вставок 26 выполнены фигурные вырезы, соответствующие форме защитных вставок. Подключение устройства к электродам в контейнерах с биологическими структурами может быть осуществлено через плату коммутации 14 при помощи кабелей 28 с разъемами.

Устройство также содержит многоцветные индикаторные светодиоды 29, припаянные по периметру платы управления 4 с возможностью излучения на рамку 3, при этом рамка выполнена из светорассеивающего материала, например, поликарбоната, обеспечивающего вывод световой индикации от светодиодов 29.

Между основанием 1 и платой управления 4 расположена изолирующая прокладка 30, обеспечивающая предохранение электронных компонентов платы от электрического замыкания, выполненная, например, из акрила при помощи лазерной гравировальной машины. Рамка 3 также предохраняет электронные компоненты устройства от замыкания цепи.

Основание 1 и крышка 2 устройства могут быть выполнены из алюминиевого сплава Д16Т фрезерованием на станке с ЧПУ, что обеспечивает жесткость конструкции и защищает электронные компоненты устройства от внешних механических воздействий и возможного контакта с химическими веществами в лаборатории. Рамка 3 может быть изготовлена из поликарбоната также фрезерованием на станке с ЧПУ.

Плата управления 4 и плата индикации 5 закреплены, соответственно, на основании 1 и крышке 2 корпуса при помощи винтового соединения.

Сборку устройства осуществляют следующим образом.

В крышку 2 устройства монтируют дисплеи 6 при помощи клеевого соединения, например, двусторонним скотчем «3М». После установки дисплеев в крышке винтовым соединением (например, посредством гаек М3) фиксируют плату индикации 5, к которой подключают дисплеи через разъемы 20.

На плату управления 4 устанавливают токоизолирующую прокладку 30 и фиксируют в основании 1 при помощи винтового соединения. Между платами 4 и 5 устанавливают рамку 3 с защитными вставками, предохраняющими электронные компоненты от замыкания цепи, которые фиксируют в основании 1. Печатные платы 4 и 5 соединяют шлейфом через разъемы 12, 19, после чего производят сборку основания 1 и крышки 2 винтовыми соединениями.

В процессе сборки устройства на органах управления, расположенных на плате индикации 5, фиксируют накладки на кнопки и рукоятку энкодера (Фиг. 6, 7).

Устройство работает следующим образом.

Известно, что монослой эпителиальных клеток на мембранной подложке может быть представлен в виде эквивалентной электрической схемы, представляющей собой параллельно соединенный конденсатор и резистор, а сама клетка моделируется элементом постоянной фазы [Grimnes S., Martinsen O.G. Cole electrical impedance model - a critique and an alternative. // IEEE Trans. Biomed. Eng. 2005. V. 52, №1. P. 132-135]. Годограф эквивалентной схемы представляет собой окружность, центр которой смещен вниз по мнимой оси [Cole K.S. Electric phase angle of cell membranes // J. Gen. Physiol. 1932. V. 15, №6. P. 641-649.].

Метод измерений, лежащий в основе предлагаемого устройства, заключается в снятии электрических параметров с измерительных электродов, расположенных в контейнерах с биологическими структурами, в тот момент, когда на одну пару электродов подается разность потенциалов, продуцирующая протекание между ними электрического тока с заданными параметрами. Полученные данные со второй пары измерительных электродов позволяют определить значения импеданса на каждой частоте из реализуемого диапазона.

Для измерения спектра импеданса заявляемое устройство подключают к измерительным электродам, расположенным в контейнерах с биологическими структурами. В одном из частных вариантов выполнения устройства с четырьмя разъемами 13, два из них подключают к двум электродам, размещенным, например, в крышке измерительной ячейки, где располагается мембранная вставка с биологическим объектом, а два других - к двум электродам, расположенным на дне измерительной ячейки. Предлагаемое устройство может быть подключено к измерительным электродам микрофлюидных чипов для культивирования и исследования клеточных моделей, описанных, например, в патенте №2675998.

Подключение устройства к электродам может быть осуществлено с помощью платы коммутации 14. Плату коммутации, с одной стороны, присоединяют к предлагаемому устройству посредством кабелей через сигнальный разъем 15 и разъемы 13, а с другой - к измерительным электродам, при этом измерительные электроды могут быть подключены к плате коммутации напрямую при помощи кабелей, либо размещены непосредственно на плате коммутации 14.

На разъем для подачи питания 16 подают постоянное напряжение 5 вольт. Разъемы для подключения электродов 13 обеспечивают подачу тока на электроды в контейнере и получение значений импеданса. Сигнальный разъем 15 обеспечивает управление платой коммутации 14. С помощью органов управления выбирают параметры сигнала для подачи на разъемы 13 для подключения электродов (амплитуда тока, диапазон частот, шаг смены частот при сканировании). Включают генерацию сигнала с предварительно выбранными параметрами. Генерируемый сигнал подают на разъемы 13 через выходной каскад 10 синусоидального тока с постоянной амплитудой, а с разъемов 13 снимают входной сигнал от платы коммутации и подают его на измерительный входной каскад 9. При этом входной сигнал подготавливают: сдвигают из отрицательной области при помощи микросхемы AD8065 (исходя из условия обеспечения работы внутреннего АЦП микросхемы AD5933 в линейном диапазоне входных сигналов), дополнительно усиливают в конвертере AD5933 операционным усилителем с программно-перестраиваемым коэффициентом усиления (G=1, 5) и очищают от помех фильтром низких частот. Затем подготовленный сигнал подают на вход АЦП (с частотой преобразования 1 MSPS) и с выхода АЦП оцифрованный сигнал подают на вход цифрового сигнального процессора DSP, реализующего дискретное преобразование Фурье с окном Хеннинга полученного сигнала для каждой частоты выбранного частотного диапазона измерений. В каждой точке переключения DDS генератора, осуществляется умножение и сложение 1024 дискретных отсчетов, полученных от АЦП. С выхода DSP снимают результирующие сигналы, которые являются зависимостями модуля импеданса от частоты, зависимостями фазы импеданса от частоты, зависимостями действительной части импеданса от частоты, зависимостями мнимой части импеданса от частоты. Эти данные сохраняют в блоке памяти 11. На основании измеренных данных управляющий микроконтроллер 7 строит зависимости мнимой части от действительной, получая годограф импеданса. Для вывода результатов на дисплей 6, сохраненные данные передаются через разъем 12 на плату индикации 5. Переключение между графиками осуществляются при помощи кнопок 23.

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает возможность измерения импеданса на одной частоте, на нескольких частотах, а также снятие спектра импеданса.

Описание режимов работы устройства.

После подключения питания через разъем 16 (Фиг. 1) устройство находится в спящем режиме, подсветка кнопок 21, 22, 23 погашена, роторный переключатель 24 горит красным цветом. Выход из спящего режима осуществляется длительным нажатием на роторный переключатель 24 до звукового сигнала и включения подсветки кнопок прибора 21,22, 23.

После выхода устройства из спящего режима на верхнем дисплее отображается главное меню устройства, состоящее из пяти пунктов: "Spectrum Scan", "Scan Options", "Device Setup", "Clock Viewer", "File Viewer".

Выбор необходимого пункта происходит с помощью верхнего блока тактовых кнопок 22, расположенных слева от верхнего дисплея (Фиг. 1). Меню циклически замкнуто и имеет возможность бесконечной прокрутки в любую сторону. Выбранный пункт меню отображается в центре дисплея и выделен более крупным шрифтом. По нажатию на кнопку 21 Start осуществляется вход в выбранный пункт меню. Если в течение трех секунд не нажимать на аппаратные кнопки прибра, выход из главного меню выполнится автоматически, а список пунктов сменится дисплеем, соответствующим режиму работы.

Выход из выбранного пункта меню осуществляется с помощью верхнего блока тактовых кнопок 22.

«Spectrum Scan»

Данный пункт меню является основным режимом работы устройства. В нем пользователь имеет возможность задать следующие параметры выходного сигнала (Фиг. 12):

1. Начальная частота (Start Freq.)

2. Шаг приращения частоты (StepFreq.)

3. Количество шагов приращения (Point num.)

4. Количество периодов стабилизации сигнала (STC)

5. Частота внешнего опорного генератора (CLK).

Выбор нужного пункта происходит последовательно при нажатии энкодера 18 и циклически замкнут. При остановке на одном из пунктов можно изменять его числовое значение при помощи вращения энкодера. У каждого пункта есть собственные минимальные и максимальные значения, запрограммированные в памяти устройства и недоступные для редактирования пользователем.

В процессе настройки на дисплее отображается шкала, пронумерованная делениями от 20 Гц до 20 кГц. На шкале отображается отрезок, начало и конец которого соответствуют начальной и конечной частотам выходного сигнала, заданного пользователем (Фиг. 12). Отрезок динамически изменяет свое положение на шкале в соответствии с данными, введенными пользователем в процессе настройки. Конечная частота "Stop freq." вычисляется автоматически и отображается над указателем в конце отрезка.

Запуск измерений производится коротким нажатием на кнопку 21 Start. В процессе измерения на верхнем дисплее отображаются следующие данные (Фиг. 13):

- Процентная шкала хода измерения

- Текущая частота выходного сигнала.

После завершения измерения отображается название файла, который был записан.

Запуск калибровки производится длительным нажатием на кнопку 21 Start. После включения прибора запуск измерения невозможен без проведения предварительной калибровки.

В процессе калибровки на верхнем дисплее отображаются следующие данные (Фиг. 14):

- Процентная шкала хода измерения

- Текущая частота выходного сигнала.

После окончания измерения включается нижний дисплей и на нем отображаются полученные результаты (Фиг. 15):

- Зависимость модуля импеданса от частоты

- Зависимость фазы импеданса от частоты

- Зависимость действительной части импеданса от частоты

- Зависимость мнимой части импеданса от частоты

- Годограф действительной и мнимой частей импеданса

- Информация о проведенном измерении (время/дата/имя файла).

Переключение между этими пунктами осуществляется с помощью нижнего блока тактовых кнопок 23, расположенных слева от нижнего дисплея (Фиг. 1). На дисплее отображаются динамические шкалы по двум осям, на которых происходит построение графиков функций.

В процессе измерения все элементы аппаратного управления блокируются и недоступны для взаимодействия с пользователем; при попытке нажатия на кнопки прозвучит соответствующий звуковой сигнал.

«Scan Options»

Данный пункт меню позволяет произвести настройку выходного тока сканирования импеданса, включить фильтр, выбрать его разрядность, и настроить устройство на периодическое сканирование по таймеру без участия пользователя.

Опции настройки сканирования содержат следующее древовидное иерархическое меню:

"Output Current": «100 uAp (70 uA RMS)», «50 uAp (35 uA RMS)», «20 uAp (14 uA RMS)», «10 uAp (7 uA RMS)»;

"Data Filter": «Filter Off», «Filter On, num=3», «Filter On, num=5», «Filter On, num=10»;

"Periodic Scan": «Timer Off», «1 minute», «5 minutes», «10 minutes», «15 minutes», «30 minutes», «1 hour», «3 hours», «6 hours», «12 hours», «1 day».

Все настройки сохраняются в блоке памяти 11.

«Device Setup»

Данный пункт меню дает доступ к системным настройкам прибора. Он содержит следующие пункты: «Brightness» - регулировка яркости дисплеев от 30% до 100%; «Sound» - включение и отключение звуковых сигналов; «Memory» - отображение свободного объема памяти прибора и общего количества файлов с измерениями; «Power» - информация о напряжении блока питания и потребляемой прибором мощности; «System Info» - системные данные о приборе, в том числе версия аппаратного и программного обеспечения.

Пример изменения яркости дисплеев прибора показан на Фиг. 16

«Clock View»

Данный пункт меню предназначен для просмотра и установки текущих времени и даты. При проведении измерений спектра импеданса, все файлы измерений, сохраняемые в блок памяти 11, хранят информацию о времени и дате проведения эксперимента. Очень важно, чтобы на устройстве были актуальные текущие время и дата.

В устройстве может быть установлен не перезаряжаемый элемент питания 31 (Фиг. 4) типа CR2032, благодаря которому часы продолжают работать при отключенном внешнем питании.

Пример отображения времени и даты, а также приглашение возможности корректировки пользователем представлен на Фиг. 17.

«File Viewer»

Данный пункт меню предназначен для просмотра всех предыдущих измерений, хранящихся во внутренней энергонезависимой памяти устройства. На верхнем дисплее отображается таблица, поделенная на два столбца. Слева, в порядке возрастания, расположены даты проведения эксперимента, справа - время, в которое было проведено измерение в выбранную дату.

Как только отмечена какая-либо пара дата/время, на нижнем дисплее мгновенно отображаются данные, соответствующие измеренным параметрам спектра импеданса, как показано на Фиг. 15. Переключение отображаемых данных возможно с помощью кнопок 23 слева от нижнего дисплея 6.

С помощью разработанного прибора был измерен спектр импеданса в процессе культивирования клеточных моделей кишечного барьера в статических условиях, что позволило провести оценку барьерной функции монослоя дифференцированных клеток Сасо-2. Измерение спектров, в отличии от измерений сопротивления на одной частоте, дает больше характеристик измеряемого объекта, тем самым позволяет использовать для интерпретации результатов математические модели, наиболее достоверно описывающие процессы, происходящие с клетками. Для описания электрических свойств клеточного монослоя используется эквивалентная схема для барьерных культур. Данная схема предполагает отдельное рассмотрение сопротивления плотных контактов, а сама клетка моделируется элементом постоянной фазы, импеданс которого имеет вид формулы:

где ω - частота, A≥0, 0≤α≤1 - константы. При α=1 элемент постоянной фазы соответствует конденсатору с емкостью А, при α=0 - резистору с сопротивлением 1/А. Для клеток, как правило, константа альфа лежит в пределах от 0,8 до 1.

В процессе измерений параметров в реальном времени при помощи данного устройства удалось определить, что с развитием монослоя возрастает не только электрическое сопротивление, но и емкость. Оценка электрической емкости может использоваться для контроля качества барьерных функций. При этом аналоги устройства позволяют измерять только электрическое сопротивление. Изучение изменения электрических параметров клеточного монослоя в процессе культивирования при помощи импедансной спектроскопии показывает, что электрическая емкость клеточного монослоя отражает степень дифференцированности клеток и может быть использована в качестве дополнительного параметра для контроля качества in vitro моделей барьерных тканей. Использование предлагаемого устройства также позволяет производить оценку формирования внеклеточного матрикса по нарастанию фонового сопротивления в процессе дифференцировки клеток Сасо-2.

Преимуществом устройства является возможность измерения электрического сопротивления и электрической емкости на разных частотах в автоматическом и ручном режимах.

Изобретение относится к области измерительной техники и может использоваться для измерения спектра импеданса биологических тканей и органов млекопитающих, в частности, образцов in vitro моделей барьерных тканей в биологических экспериментах, а также позволяет измерять импеданс различных растворов с целью определения их физических свойств (концентрации, проводимости и т.д.). Устройство для измерения спектра импеданса биологических структур включает корпус, состоящий из трех частей: основания с платой управления, крышки с платой индикации и средней части, включающей рамку, размещаемую между основанием и крышкой. С внешней стороны крышки размещены два дисплея для отображения результатов измерения. Плата управления содержит управляющий микроконтроллер, блок питания, измерительный входной каскад и выходной каскад синусоидального тока с постоянной амплитудой, блок памяти, разъем для коммутации с платой индикации, по меньшей мере четыре разъема для подключения к контейнерам с биологическими структурами через плату коммутации, сигнальный разъем для обеспечения коммутации между управляющей платой и платой коммутации, разъем для подачи питания, разъем для подключения к периферийным устройствам и энкодер, обеспечивающий выбор частоты измерений и переключение между диапазонами частот. Плата индикации содержит ответный разъем для коммутации с управляющей платой, разъемы для подключения дисплеев и кнопки управления, включающие кнопку запуска процесса измерений, кнопки навигации по меню, кнопки переключения между графиками, отображающими измеренные параметры, и роторный переключатель, обеспечивающий выбор сохраненного файла измерений для просмотра. При этом крышка снабжена сквозными отверстиями, расположенными в соответствии с расположением кнопок, роторного переключателя и энкодера, а рамка снабжена защитными вставками, зафиксированными в зоне крепления разъемов платы управления, снабженными отверстиями, соответствующими разъемам платы управления. В корпусе расположены индикаторные светодиоды, закрепленные с возможностью излучения на рамку. Между основанием и управляющей платой размещена изолирующая прокладка. Рамка выполнена из светорассеивающего материала для вывода световой индикации от светодиодов. Техническим результатом является обеспечение быстроты и удобства сборки и эксплуатации устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, культивируемых на мембранных вставках, размещенных в многолуночном планшете или в микрофлюидном чипе. 4 з.п. ф-лы, 17 ил.

1. Устройство для измерения спектра импеданса биологических структур, расположенных в контейнерах, включающее корпус, состоящий из трех частей: основания с платой управления, крышки с платой индикации и средней части, включающей рамку, размещаемую между основанием и крышкой, при этом с внешней стороны крышки размещены два дисплея для отображения результатов измерения; плата управления содержит управляющий микроконтроллер, блок питания, измерительный входной каскад и выходной каскад синусоидального тока с постоянной амплитудой, блок памяти, разъем для коммутации с платой индикации, по меньшей мере четыре разъема для подключения к контейнерам с биологическими структурами через плату коммутации, сигнальный разъем для обеспечения коммутации между управляющей платой и платой коммутации, разъем для подачи питания, разъем для подключения к периферийным устройствам и энкодер, обеспечивающий выбор частоты измерений и переключение между диапазонами частот; плата индикации содержит ответный разъем для коммутации с управляющей платой, разъемы для подключения дисплеев и кнопки управления, включающие кнопку запуска процесса измерений, кнопки навигации по меню, кнопки переключения между графиками, отображающими измеренные параметры, и роторный переключатель, обеспечивающий выбор сохраненного файла измерений для просмотра; при этом крышка снабжена сквозными отверстиями, расположенными в соответствии с расположением кнопок, роторного переключателя и энкодера, а рамка снабжена защитными вставками, зафиксированными в зоне крепления разъемов платы управления, снабженными отверстиями, соответствующими разъемам платы управления; в корпусе расположены индикаторные светодиоды, закрепленные с возможностью излучения на рамку; между основанием и управляющей платой размещена изолирующая прокладка; рамка выполнена из светорассеивающего материала для вывода световой индикации от светодиодов.

2. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что плата индикации и плата управления закреплены на крышке и основании, соответственно, посредством винтового соединения.

3. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что светодиоды выполнены многоцветными и припаяны по периметру платы управления.

4. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что рамка выполнена из поликарбоната.

5. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что плата управления выполнена на базе микросхемы - конвертера AD5933.