СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРТИЛЬНЫХ ЛИНИЙ СОРГО, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ВОССТАНОВИТЕЛЯМИ ФЕРТИЛЬНОСТИ ДЛЯ ЦМС ТИПА 9Е Российский патент 2016 года по МПК A01H1/04 A01H5/02 

Изобретение относится к генетике и репродуктивной биологии растений и может быть использовано в селекции и в теоретических исследованиях генетического контроля цитоплазматической мужской стерильности и развития мужской генеративной сферы.

Известен способ создания линий-восстановителей фертильности у кукурузы, согласно которому линию-донор гена Rf скрещивают с ЦМС-линией. Полученный гибрид опыляют пыльцой линии, для которой создают аналог, обладающий восстановительной способностью. Полученный двойной гибрид подвергают беккроссированию с этой линией, после чего проводят самоопыление, и в самоопыленном потомстве отбирают растения, которые проявляют восстановительную способность в тестерных скрещиваниях с ЦМС-линиями (Турбин Н.В., Тарасенко Н.Д. Генетические методы в селекции растений. М., Колос, 1974, - 206 с.).

Этот способ, однако, долог и трудоемок при работе с сорго, поскольку после восстановления мужской фертильности гибридные растения для проведения последующих скрещиваний необходимо кастрировать вручную. Кроме того, в тех случаях, если в качестве материнской ЦМС-линии используются линии, несущие ЦМС типа 9Е, этот способ не позволяет достичь результата, поскольку экспрессия генов-восстановителей этого типа ЦМС зависит от условий выращивания гибридов (режима влагообеспеченности, температуры внешней среды в период микроспоро- и микрогаметогенеза), в связи с чем гибриды F₁ часто оказываются мужски-стерильными (Elkonin L.A., Kozhemyakin V.V, Ishin A.G. Influence of water availability on fertility restoration of CMS lines with the ′M35-1A′, A4 and ′9E′ CMS-inducing cytoplasms of sorghum // Plant Breeding, 2005, v. 124, p. 565-571).

Известен также способ создания линий-восстановителей сорго, который основан на использовании молекулярных маркеров, сцепленных с одним из генов-восстановителей мужской фертильности (Rf1), локализованным на 8 хромосоме (Klein R.R., Klein Р.Е., Chhabra А.K., Dong J., Pammi S., Childs K.L., Mullet J.E., Rooney W.L., Schertz K.F. Molecular mapping of the rf1 gene for pollen fertility restoration in sorghum (Sorghum bicolor L.) // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102, p. 1206-1212). Этот способ, однако, имеет существенное ограничение, поскольку ген Rf1 восстанавливает мужскую фертильность только у гибридов с ЦМС-линиями на стерильной цитоплазме типа А1, тогда как из-за генетических различий стерильных цитоплазм восстановление фертильности в других типах ЦМС сорго контролируется другими генами (Pring D.R., Tang H.V., Schertz K.F. Cytoplasmic male sterility and organelle DNAs of sorghum // Molecular Biology of Plant Mitochondria. Eds: C.S. Levings III, I.K. Vasil. Kluwer Academic Publ., Boston, MA, USA, 1995, 461-495; Эльконин Л.А., Кожемякин B.B., Ишин А.Г. Использование новых ЦМС-индуцирующих цитоплазм для создания скороспелых линий сорго с мужской стерильностью // Докл. РАСХН, 1997, №2, с. 7-9). Кроме того, молекулярные маркеры генов-восстановителей ЦМС типа 9Е на сегодняшний день не известны.

Известен также способ селекции линий-восстановителей сорго с использованием молекулярных маркеров гена-восстановителя фертильности стерильной цитоплазмы типа А1, располагающегося на 2 хромосоме (Kushalappa K., Primomo V., Tulsieram L., Li Z.-L., Porter K., Kebede Y., Monk R., DeLong R. Sorghum fertility restorer genotypes and methods of marker-assisted selection // US 2011/0162100 A1. Pub. Date 30.06.2011, Appl. No 61/290,283; 28.12.2009). Однако этот способ также не может быть применен при создании восстановителей фертильности ЦМС типа 9Е, поскольку ген Rf1 восстанавливает мужскую фертильность только у гибридов с ЦМС-линиями на стерильной цитоплазме типа А1, тогда как из-за генетических различий стерильных цитоплазм восстановление фертильности в других типах ЦМС сорго контролируется другими генами (Pring D.R., Tang H.V., Schertz K.F. Cytoplasmic male sterility and organelle DNAs of sorghum // Molecular Biology of Plant Mitochondria. Eds: C.S. Levings III, I.K. Vasil. Kluwer Academic Publ., Boston, MA, USA, 1995, 461-495; Эльконин Л.А., Кожемякин В.В., Ишин А.Г. Использование новых ЦМС-индуцирующих цитоплазм для создания скороспелых линий сорго с мужской стерильностью // Докл. РАСХН, 1997, №2, с. 7-9). Кроме того, молекулярные маркеры генов-восстановителей ЦМС типа 9Е на сегодняшний день не известны.

Наиболее близким к предлагаемому является способ селекции линий-восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е (Эльконин Л.А., Кожемякин В.В. Способ селекции линий-восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е // Заявка на выдачу патента №2010135106/10 (049885) от 20.08.2010. Патент РФ №2545688, зарегистрир. 26.02.2015 г. Бюлл. №10, 10.04.2015. ФИПС, Москва). Согласно этому способу-прототипу метелки ЦМС-линий с цитоплазмой типов М35-1А или 9Е опыляют пыльцой линий, несущих гены-восстановители фертильности (Rf). Семена гибридов F₁ высевают в грядке и получают из них растения. На стадии появления флагового листа на грядку устанавливают укрытие («засушник»), препятствующее попаданию на нее атмосферных осадков. Среди гибридов F₁ отбирают фертильные растения, потомство которых (F₂) выращивают в следующем сезоне в грядке, на которую вновь устанавливают «засушник». С фертильных растений берут пыльцу и опыляют ею метелки растений ЦМС-линии, т.е. производят тестерное скрещивание. Семена тест-кроссных гибридов и самоопыленное потомство их отцовских родителей (семьи F₃) высевают в следующем сезоне, на грядку устанавливают «засушник» и по результатам оценки фертильности и отбирают гибриды F₃, которые дали наибольший процент фертильных растений в тестерных скрещиваниях. С этими гибридами проводят новые тест-кроссы, которые также оценивают в условиях «засушника». Аналогичным образом проводят отбор в поколениях F₄ и F₅ и получают линии-восстановители фертильности, несущие гены-восстановители фертильности (Rf) в гомозиготном состоянии, которые оказываются эффективными как в засушливые, так и во влажные сезоны.

Однако данный способ создания восстановителей фертильности для ЦМС типа 9Е оказывается недостаточно эффективным: в F₁ (тест-кроссах), выращенном в условиях засушника, во многих гибридных комбинациях присутствует значительная доля стерильных растений, а в некоторых скрещиваниях фертильные (завязываемость от 80% до 100%) и полуфертильные (завязываемость 40-70%) растения вообще отсутствуют (табл. 1) (в отличие от гибридов на цитоплазме М35-1А), что может служить основанием для ошибочного вывода об отсутствии гена-восстановителя у отцовской линии-опылителя.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение фертильных линий сорго, служащих восстановителями фертильности, на основе стерильных гибридов с ЦМС типа 9Е.

Технический результат достигается тем, что по предлагаемому способу получения фертильных линий сорго, являющихся восстановителями фертильности для ЦМС типа 9Е, включающему выращивание гибридных растений, полученных от скрещивания ЦМС-линий и фертильных линий, оценку их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, согласно изобретению гибридные растения выращивают в условиях теплицы, способствующих реверсии к мужской фертильности, а их потомство выращивают в полевых условиях, где производят отбор фертильных растений, способных к восстановлению фертильности гибридов F₁.

Из уровня техники на дату подачи заявки неизвестна совокупность заявляемых признаков. Не является очевидным, что доминантный характер экспрессии генов-восстановителей мужской фертильности ЦМС типов 9Е в гетерозиготном состоянии зависит от условий внешней среды, тогда как в гомозиготном состоянии условия внешней среды не оказывают значительного влияния на работоспособность этих генов. То есть характер взаимодействия аллелей, обладающих закрепительной и восстановительной способностью, в локусах, контролирующих восстановление мужской фертильности, определяется условиями внешней среды. В этой связи, изменение условий выращивания стерильных гибридных растений влечет за собой не только восстановление их мужской фертильности, но позволяет получить генотипы, у которых гены-восстановители за счет самоопыления и рекомбинации переходят в гомозиготное состояние и оказываются способными обеспечить восстановление фертильности в тех условиях внешней среды, при которых они не экспрессировались у исходных гибридов.

Предлагаемый способ иллюстрируется тремя фигурами (фиг. 1-3), на которых представлены примеры создания фертильных линий, в том числе линий-восстановителей фертильности. На схемах курсивом выделено название гибридной комбинации или полевой номер семьи, прямым шрифтом указано количество фертильных (ф), полустерильных (пс), стерильных (с) растений.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Гибридные популяции (F₁, F₂, F₃ и т.п.), полученные от скрещивания фертильных линий сорго с ЦМС-линиями на стерильной цитоплазме типа 9Е, выращивают в полевых условиях, соблюдая известные общепринятые технологии выращивания зернового сорго (к примеру: Исаков Я.И. Сорго // М.: Россельхозиздат, 1982. С. 37-59). В таких условиях растения подвергаются действию воздушной и почвенной засухи, высокой температуры - обычным факторам, характерным для летнего сезона в зонах соргосеяния, которые могут влиять на экспрессию генов-восстановителей фертильности.

Метелки растений до начала цветения изолируют пергаментными изоляторами. Растения, не завязавшие семян на метелках (стерильные растения), выкапывают и переносят в условия теплицы, способствующие реверсии к мужской фертильности. Условия выращивания растений сорго в теплице включают в себя определенный световой режим: освещение в течение 14 ч с помощью металл-галогеновых ламп (к примеру, ДРИ-2000) при интенсивности 5-10 тыс. люкс на уровне растений; температурный режим: 26-28°С днем, 21-23°С ночью; поддержание высокой относительной влажности воздуха (65-85%); регулярный полив вегетационных сосудов водопроводной водой (400-500 мл/8 л сосуд с землей, через день) (см., к примеру: Beal D.F., Morgan P.W., Mander L.N. et al. Genetic regulation of development in Sorghum // Plant Physiol. 1991, V. 95. P. 116-1254; или Jardine D.J., Leslie J.F. Aggressiveness of Gibberella fujicuroi (Fusarium montiliforme) isolates to grain sorghum under greenhouse conditions // Plant Des. 1992. V. 76. P. 897-900). При этом из узла кущения у стерильных растений, выращенных в полевых условиях, в теплице развиваются побеги, несущие фертильные метелки. Семена, завязавшиеся на таких метелках, высевают в следующем сезоне в полевых условиях. Метелки растений изолируют пергаментными изоляторами, выявляют среди них экземпляры, способные к формированию фертильной пыльцы, которые служат основой для создания фертильных линий. Для выявления способности к восстановлению мужской фертильности полученные фертильные линии скрещивают с ЦМС-линиями, несущими стерильную цитоплазму типа 9Е. Для создания линий-восстановителей отбирают потомство тех ревертантов, которые дают наиболее полное восстановление мужской фертильности в тест-кроссах с ЦМС-линиями.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. В 2007 г. на опытной делянке выращивали семью F₂, полученную от скрещивания ЦМС-линии 9Е Тх398, несущей ЦМС типа 9Е, с фертильной линией зернового сорго Перспективное-1 (фиг. 1). В данной семье наблюдалось расщепление по мужской фертильности в соотношении 3 фертильных:1 стерильных, при объединении частично и полностью фертильных растений в один класс (χ²=1.286; 0.25<Р<0.05). Стерильное растение №14 было выкопано и перенесены в условия теплицы, где у него из узлов кущения были получены новые побеги, давшие фертильные метелки. Семена, завязавшиеся на этих метелках, были высеяны в поле, и дали фертильные, полустерильные и стерильные растения. Самоопыленное потомство фертильных растений было преимущественно фертильным и стабильно наследовало фертильность в последующих поколениях. При скрещивании с ЦМС-линиями на цитоплазме 9Е (9Е Желтозерное-10, 9Е Пищевое-614, 9Е Суданка-16) полученная фертильная линия (№240/11) давала фертильные гибриды F1, т.е. являлась восстановителем фертильности для ЦМС типа 9Е.

Пример 2. В 2008 г. на опытной делянке выращивали семью F₁, полученную от скрещивания ЦМС-линии 9Е Желтозерное-10, несущей ЦМС типа 9Е, с фертильной линией зернового сорго КВВ-263 (фиг. 2). Из 30 растений F₁ 24 характеризовались полной мужской стерильностью, на шести растениях наблюдалось завязывание небольшого числа зерновок (менее 3%). Стерильные растения №18 и №19 были выкопаны и перенесены в условия теплицы, где у них из узлов кущения были получены новые побеги, давшие фертильные метелки. Семена, завязавшиеся на этих метелках, были высеяны в поле и дали фертильные, полустерильные и стерильные растения. Примечательно, что стерильное растение №4 из потомства №18, будучи перенесенным в условия теплицы, вновь давало фертильные метелки, в потомстве которых также присутствовали фертильные растения. Самоопыленное потомство фертильных растений наследовало фертильность в последующих поколениях. Скрещивание фертильной линии (№196/12), полученной в результате самоопыления одного из таких фертильных растений, с ЦМС-линиями 9Е Желтозерное-10 и 9Е Тх398, давало фертильные гибриды F₁, т.е. данная линия являлась восстановителем фертильности для ЦМС типа 9Е.

Пример 3. В 2007 г. на опытной делянке выращивали семью F₂, полученную от скрещивания ЦМС-линии 9Е Желтозерное-10 с фертильной линией сорго Перспективное-1 (фиг. 3). В данной семье наблюдалось расщепление по мужской фертильности в соотношении 3 фертильных:1 стерильных, при объединении частично и полностью фертильных растений в один класс (χ²=0.889; 0.25<Р<0.05). Стерильные растения были выкопаны и перенесены в условия теплицы, где у них из узлов кущения были получены новые побеги, давшие фертильные метелки. Семена, завязавшиеся на этих растениях, были высеяны в поле и дали семьи (№120/08, №121/08, №122/08), содержавшие фертильные, полустерильные и стерильные растения. В результате самоопыления фертильных растений были получены фертильные линии (№20/11, №28/11, №175/11). Тест-кроссы этих линий с ЦМС-линией 9Е Желтозерное-10 дали гибриды F₁, содержавшие фертильные и полустерильные растения, т.е. полученные фертильные линии проявляли себя как восстановители фертильности ЦМС типа 9Е.

Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет создавать линии-восстановители мужской фертильности для стерильной цитоплазмы сорго типа 9Е. Следует отметить, что данный способ позволяет создавать также фертильные линии сорго с нужными для селекционера или генетика генами. При этом стерильные линии с ЦМС типа 9Е без использования трудоемкой искусственной кастрации опыляют пыльцой линии-донора нужного гена. Полученные гибриды, проявляющие мужскую стерильность в полевых условиях, переносят в условия, способствующие реверсии к мужской фертильности, где они формируют фертильные побеги, и тем самым дают начало новым фертильным линиям, в генотипе которых будут присутствовать нужные гены.

Изобретение относится к генетике и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ получения фертильных линий сорго, являющихся восстановителями фертильности для ЦМС типа 9Е, включающий выращивание гибридных растений, полученных от скрещивания ЦМС-линий и фертильных линий, оценку их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, где гибридные растения выращивают в условиях теплицы, способствующих реверсии к мужской фертильности, а их потомство выращивают в полевых условиях, где производят отбор фертильных растений, способных к восстановлению фертильности гибридов F_1. Изобретение позволяет получать линии-восстановители мужской фертильности для стерильной цитоплазмы сорго типа 9Е. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения фертильных линий сорго, являющихся восстановителями фертильности для ЦМС типа 9Е, включающий выращивание гибридных растений, полученных от скрещивания ЦМС-линий и фертильных линий, оценку их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, отличающийся тем, что гибридные растения выращивают в условиях теплицы, способствующих реверсии к мужской фертильности, а их потомство выращивают в полевых условиях, где производят отбор фертильных растений, способных к восстановлению фертильности гибридов F₁.