СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ СОРГО С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции растений и может быть применено для создания новых линий сорго с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС), необходимых для производства коммерческих гетерозисных гибридов, а также для получения мутантных клеточных линий, используемых в генной и клеточной инженерии.

У сорго многие селекционно-ценные образцы несут гены-восстановители ЦМС стандартного типа (А1). Поэтому стерильные аналоги таких образцов нельзя получить традиционным методом, путем бэккроссов с ЦМС-линиями на цитоплазме А1 (milo). Путь, основанный на скрещиваниях с ЦМС-линиями на других мужски стерильных цитоплазмах достаточно долог и трудоемок и ведет к получению либо нестабильных типов ЦМС (на цитоплазмах А2 и А4), либо чрезвычайно устойчивых типов ЦМС, (на цитоплазмах А3 и 9Е), мужская фертильность которых восстанавливается лишь очень небольшим количеством образцов.

Способы модификации генотипа растений, основанные на использовании клеточных технологий, открывают новые возможности для ускоренного создания новых линий с ЦМС.

Известны аналогичные между собой способы получения форм растений с ЦМС путем переноса мужски стерильной цитоплазмы в клетки фертильных растений с помощью соматической гибридизации (цибридизации), включающие выделение протопластов стерильного и фертильного растений, слияние этих протопластов, регенерацию растений из продуктов слияния и отбор форм с мужской стерильностью (для табака Belliard G. Pelletier G. Ferault M. Fusion de protoplastes de Nicotiana tabacum a cytoplasmes differents: etube bes hybrides cytopasmigues neoformes. C. R.Acad sci. 1977, D 284, N 9, P. 749-752; для петуньи izhar S. Tabib V. Schwartzberg D. Reciprocal transfer of male sterile and normal plasmons in Petunia. Theor. Appl. Genet. 1984, V.68, N 5, P. 455-457; для рапса Vfrrow S.A. Wu S.C. Barsby T.L. et al. The introduction of CMS mitochondria to triazine tolerant Brassica napus L. var. "Regent", by microminipulftion of individual heterocaryons. Plant Cell Repts. 1986, V.5, N 6, P. 415-418).

Эти известные способы, однако, применимы только для тех образцов (генотипов), у которых удается получить протопласты, способные к регенерации растений. Однако для многих возделываемых растений, прежде всего, злаков, надежная регенерация растений из пропластов представляет пока еще серьезную проблему.

Известны также способы получения форм растений с цитоплазматической мужской стерильностью, при которых производят обработку частей растений (семян) водным раствором антибиотика стрептомицина, выращивают из обработанных семян растений и выявляют среди них растения с ЦМС (для сахарной свеклы: Kinoshita T. Takahashi M. Mikami T. Cytoplasmic mutations of male sterility induced by chemical mutagenes in sugar beets. Proc. Japfn Acad. 1982, V. 58B, N 10, P. 319-322; проса африканского: Burton G.W. Hanna W.W. Stable cytoplasmic male-sterile mutanrs induced in TiftDB pearl millet with mitomycin and streptomycin. Crop Sci. 1982, V. 22. N 4, P 651-652; подсолнечника: Jan C.C. Rurger J.N. Mitomycin C and Streptomycin-induced Male Sterility in Cultivqated Sunflower. Crop Sci. 1988, V.28, N 5, P.792-795). Частота возникновения растений с ЦМС при использовании этих способов, однако, сравнительно невысока и не превышает 3-5% от выборки.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения цитоплазматической мужской стерильности у кукурузы (US Patent N 3594152, кл. A 01 N 9/00; US Cl. 71-88, N 669407, 21.09.67, 20.07.71.), заключающийся в обработке частей растений (семян) кукурузы водным раствором стрептомицина в концентрациях 0,0001-10 мл в течение 24 ч. выращивании из них растений и отборе среди них мужски стерильных форм. В результате от 33,3 до 50,0% растений, полученных из обработанных семян, обладали полной мужской стерильностью.

Однако прототип применим только к линиям кукурузы, являющимися закрепителями ЦМС, у которых отсутствуют доминантные ядерные гены восстановления фертильности, препятствующие проявлению цитоплазматических мутаций мужской стерильности. При попытке применения прототипа на сорго для получения стерильных аналогов ценных линий-восстановителей нами были получены либо только фертильные, либо единичные стерильные и полустерильные растения.

Цель изобретения повышение выхода при направленном создании форм с генетически обусловленной цитоплазматической мужской стерильностью у сорго за счет использования в качестве мишени для воздействия стрептомицина клеток выращиваемых в культуре in vitro морфогенных каллусов, полученных от мужски-фертильных растений.

Поставленная цель достигается тем, что по предлагаемому способу получения растений сорго с ЦМС, включающему обработку частей растений в течение 24 ч водным раствором стрептомицина, выращивании из них растений и выявлении среди них стерильных форм, в качестве частей растений для обработки используют морфогенные каллусные культуры мужски-фертильных растений, с последующим получением из них растений-регенерантов, при этом концентрация стрептомицина составляет 0,5-1,0 мг/мл.

В науке и технике не обнаружено решений, обладающих совокупностью признаков, аналогичной предлагаемому. Необходимо отметить существенную роль всех перечисленных факторов в совокупности для достижения цели изобретения. Не является очевидным использование в качестве мишеней для воздействия стрептомицина в концентрации 0,5-1,0 мг/л выращиваемых в культуре in vitro морфогенных каллусов.

Таким образом, предлагаемое техническое решение отвечает критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Из эксплантантов растений сорго (зрелых или незрелых зародышей, фрагментов молодых метелок или листочков) в соответствии с известными способами культивирования тканей и органов получают каллусные культуры, содержащие способные к регенерации растений морфогенные образования (имбриоиды или стеблевые почки). Для этого эксплантаты стерилизуют 70% этиловым спиртом (30-45 с), затем 5% хлорамином (5 мин) и культивируют в темноте (t 26±1^oC) на питательных средах, способствующих формированию морфогенных каллусов, например, Мурасиге и Скуга (MS), c 2,4-дихлорфеноксиуксусуной кислотой (2,4-д) и цитокинином 6-бензиламинопурином (6-БАП) или на среде N 6 c 2,4-Д, L-аспарагином (asp) и L-пролином (рrо). Каллусы с морфогенными структурами размножают в течение 1-3 пассажей (каждый длительностью 25-30 дн) на средах, способствующих формированию морфогенных каллусов, получая активно пролиферирующие каллусные линии с большим количеством морфогенных образований.

Затем каллусы (приблизительно 1 г) на 24 ч помещают в чашки Петри с водным раствором стрептомицина (0,5-1,0 мг/мл). После обработки каллусы рассаживают на среды, способствующих формированию морфогенных каллусов, для получения достаточного количества морфогенных образований. Эти соединений затем переносят на среду для регенерации растений (MS 1,0 мг/л ИУК + 0,1 мг/л кинетина). Через 30 дн регенеранты переносят в открытые пробирки с водой для получения развитой корневой системы и затем высаживают в горшки и выращивают в теплице. У регенерантов анализируют мужскую фертильность и выявляют мужски стерильные растения по следующим критериям: отсутствие пыльцевого облака при встряхивании метелки, наличие пустых мелких сморщенных пыльников, отсутствие семян под изолятором. При полном отсутствии семян растение определяется как стерильное; при наличии частично озерненной метелки как полустерильное.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

В качестве материала для получения растений с ЦМС с помощью воздействия стрептомицина на каллусные культуры были выбраны следующие селекционно-ценные скороспелые образцы сорго: Желтозерное-10, Волжское-2, Пищевое-1, Фетерита-293. Все эти образцы являются восстановителями ЦМС типа А1, поэтому их стерильные аналоги нельзя получить традиционным путем (с помощью бэккроссирования).

Каллусные культуры были получены из молодых метелок использованных образцов на среде MS + 2,4-Д + 6-БАП (Волжское-2, Пищевое-1, Фетеритта-293) и на среде N6 + 2,4-Д + asp + pro (Желтозерное-10). После двух пассажей на данных средах каллусы были обработаны водным раствором стрептомицина в концентрациях 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл в течение суток.

У обработанных стрептомицином каллусов при последующем культивировании наблюдалось снижение интенсивности пролиферации и эмбриоидогенной активности по сравнению с каллусами, обработанными дистиллированной водой, а часть каллусов некротизировала (см. табл.1).

У выживших каллусов наблюдалось образование эмбрионов и почек, которые затем были высажены на среду для регенерации. Большинство регенерированных растений были альбиносными или пестролистными, причем количество хлорофилл-дефектных регенерантов значительно возрастало при увеличении концентрации стрептомицина (см. табл. 2). Следует отметить, что, в целом, с увеличением концентрации стрептомицина регенерационная способность почти у всех образцов снижалась; при концентрации 1,0 мг/мл все или большинство регенерантов были хлорофилл-дефектными. Пластомы разных образцов проявляли различную чувствительность к воздействию стрептомицина. Так, у Желтозерного-10 и Волжского-2 после обработки стрептомицином в концентрации 1,0 мг/мл зеленые регенеранты вообще отсутствовали. Пестролистные и зеленые регенеранты были высажены в почву для доращивания до цветения и анализа их мужской фертильности.

Результаты анализа мужской фертильности регенерантов, полученных из обработанных каллусов, суммированы в табл. 3. Эти данные свидетельствуют о том, что обработка каллуса стрептомицином приводит к полной или частичной мужской стерильности регенерантов, причем частота возникновения стерильных форм у некоторых образцов оказывается достаточно высока (до 100%). При использовании прототипа у данных образцов были получены лишь одиночные стерильные и полустерильные формы (см.табл. 4).

Концентрация стрептомицина оказала существенное влияние на количество и уровень мужской стерильности у регенерантов. Так, у Желтозерного-10 для получения полностью мужски стерильных регенерантов эффективной оказалась концентрация 0,5 мг/мл. У Волжского-2 в этом варианте были получены, в основном, полустерильные и фертильные регенеранты, тогда как при увеличении концентрации до 1,0 мг/мл возникали полностью мужски стерильные регенеранты. У образцов Пищевое-1 и Фетерита-293 при концентрации 0,5 мг/мл были получены только фертильные регенеранты, тогда как при концентрации 1,0 мг/мл возникали полустерильные формы. Дальнейшее увеличение концентрации стрептомицина (выше 1,0 мг/мл) нецелесообразно из-за его сильного воздействия на пластом и рибосомы хлорпластов, ведущего к альбинизму и резкому снижению выхода зеленых регенерантов (см. табл. 2).

Мужская стерильность, индуцированная у регенерантов сорго, является генетически обусловленной. Так, при скрещивании стерильного мутанта1, полученного из образца Желтозерное-10 с исходной формой (Желтозерное-10) все растения F1 проявляют мужскую стерильность (см. табл. 5). Это указывает на цитоплазматический характер локализации индуцированной мутации мужской стерильности. Следовательно, предлагаемый способ позволяет с высокой частотой получать мутанты с ЦМС.

При скрещивании же мутанта1 с линией Фетерита-14, гомозиготной по генам-восстановителям цитоплазм А2, А4 и 9Е и закрепляющей цитоплазму А3, в F1 наблюдалось расщепление по признаку мужской стерильности, что свидетельствует от отличии индуцированной мутации от всех ранее известных у сорго типов мужских стерильных цитоплазм.

Таким образом, взаимодействие мутагенных факторов культуры in vitro со стрептомицином значительно повышает мутабильность генетических систем, контролирующих мужскую фертильность растений, и может использоваться для получения мутантов с ЦМС.

Использование - изобретение относится к сельскохяйственной биотехнологии и селекций растений и может быть применено для создания новых линий сорго с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС), а также для получения мутантных клеточных линий, используемых в генной и клеточной инженерии. Сущность: согласно предлагаемому способу для получения растений сорго с ЦМС морфогенные каллусные культуры, полученные от мужски фертильных растений, обрабатывают водным раствором стрептомицина в течение 24 часов, при этом концентрация стрептомицина составляет 0,5-1,0 мг/мл. Из обработанных каллусов получают растения-регенеранты и выявляют среди них формы с мужской стерильностью. Предлагаемый способ позволяет получить с высокой частотой (до 100% у некоторых образцов) мужски стерильные регенеранты, при этом стерильность наследуется как цитоплазматическая мутация. 2 табл.

Способ получения растений сорго с цитоплазматической мужской стерильностью, включающий обработку частей растение водным раствором стрептомицина в течение 24 ч, выращивание из них зрелых растений и отбор среди них мужских стерильных форм, отличающийся тем, что в качестве частей растений для обработки используют морфогенные каллусные культуры мужских фертильных растений с последующим получением из них растений-регенерантов, при этом концентрация стрептомицина составляет 0,5 1,0 мг/мл.