СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/58 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения риска развития артериальной гипертензии.

Известен способ определения риска развития артериальной гипертензии, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами, анализ продуктов амплификации с помощью электрофореза на агарозном геле и на основании этого определение инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента (см. Гончарова Л.Н., Снеговский В.А., Кузовенкова О.Н. «Инсерционно-делеционный полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента у лиц с эссенциальной артериальной гипертензией» // Казанский медицинский журнал. - 2009. - №4 (том 90). - С. 564-566).

Однако данный способ из-за использования метода ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации имеет низкую пропускную способность ввиду сложности, трудоемкости и длительности (после проведения амплификации данный способ имеет дополнительный этап электрофореза). Также данный метод требует использования реагентов, являющихся вредными для медицинского персонала, проводящего их, и требует более высоких затрат при массовых исследованиях. Кроме того, известный способ имеет низкую надежность из-за высокого риска контаминации амплификационной смеси и продуктов амплификации. Все перечисленное затрудняет определение риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого за короткие (сжатые) сроки времени.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа определения риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, и повышение степени его достоверности при проведении предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого за короткие (сжатые) сроки времени.

В настоящем изобретении используется метод ПЦР в режиме реального времени, который имеет ряд преимуществ перед методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации, а именно: упрощение и повышение скорости получения результатов в связи с исключением дополнительного этапа электрофореза, повышение степени достоверности результатов в связи с автоматизацией процесса, исключение риска контаминации амплификационной смеси и продуктов амплификации, данный метод не требует использования реагентов, являющихся вредными для медицинского персонала, проводящего их.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа и повышение скорости определения риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, при одновременном повышении степени его достоверности.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе определения риска развития артериальной гипертензии, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами, анализ продуктов амплификации методом флюоресцентной детекции в режиме реального времени, и на основании этого определение инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента, при приготовлении амплификационной смеси используют специфические прямой и обратный праймеры по сторонам инсерции/делеции и два зонда типа TaqMan на I- и D-аллели, при этом прямой праймер - gga gac сас tec cat cct ttc, 14045-14067 по AF118569, 13351-13372 по EU 332840, обратный праймер - atg tgg cca tca cat tcg tca gat, 14499-14522 по AF 118569, 13515-13537 по EU 332840, зонд на I-аллель - (5′TAM) cca cag gcg ccc gec act ac (3′BHQ1), 14235-14252 по AF 118569 с флуорофором FAM, при этом зонд на I-аллель расположен внутри вставки (14094-14381 по AF 118569), зонд на D-аллель - (5′HEX) get gec tat аса gtc act ttt atg tgg t (3′BHQ1), 13391-13417 по EU 332840 с флуорофором HEX, после приготовления амплификационной смеси проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией накопления продуктов амплификации и по интенсивности полученных в результате ПЦР флуоресцентных сигналов определяют генотип гена ангиотензинпревращающего фермента: гомозигота по I-аллели (генотип I/I), гетерозигота (генотип I/D) или гомозигота по D-аллели (генотип D/D), при этом риск развития артериальной гипертензии у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого при генотипе I/I гена ангиотензинпревращающего фермента составляет ниже 50%, при генотипе I/D - 50-70%, а при генотипе D/D - выше 70%.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ может быть использован при проведении предварительных и периодических медицинских осмотров у промышленных рабочих в медсанчастях и диагностических лабораториях, укомплектованных типовым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью. Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.

Артериальная гипертензия - мультифакториальное заболевание, где выявляется сложный механизм формирования фенотипа, который сопровождается взаимодействием генетических факторов с факторами окружающей среды. Хроническое воздействие шума может способствовать развитию артериальной гипертензии путем активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатической нервной систем. Другой системой регуляции артериального давления является ренин-ангиотензин-альдостероновая система, ключевым ферментом которой является ангиотензинпревращающий фермент, уровень и активность которого связаны с полиморфизмом инсерция/делеция Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. В связи с чем хроническое воздействие шума совместно с наличием делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента может значительно повышать риск развития артериальной гипертензии из-за одновременной активации различных систем, участвующих в механизмах развития артериальной гипертензии.

Предлагаемый способ пояснен на чертеже.

На фиг. 1 представлен пример графика накопления ДНК, полученного при использовании амплификатора «CFX 96» (фирма Bio Rad) в реакции ПЦР согласно предлагаемому способу, соответствующего гомозиготе по 1-аллели (генотип 1Л) гена ангиотензинпревращающего фермента.

На фиг. 2 представлен пример графика накопления ДНК, полученного при использовании амплификатора «CFX 96» (фирма Bio Rad) в реакции ПЦР согласно предлагаемому способу, соответствующего гетерозиготе (генотип I/D) гена ангиотензинпревращающего фермента.

На фиг. 3 представлен пример графика накопления ДНК, полученного при использовании амплификатора «CFX 96» (фирма Bio Rad) в реакции ПЦР согласно предлагаемому способу, соответствующего гомозиготе по D-аллели (генотип D/D) гена ангиотензинпревращающего фермента.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в TE-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК используют для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Затем готовят амплификационную смесь для выявления инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Объем амплификационной смеси - 20 мкл, при этом используют стандартный буфер для полимеразной цепной реакции, содержащий 1 единицу активности Taq-полимеразы. Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры с зондами типа TaqMan на I- и D-аллели гена ангиотензинпревращающего фермента.

Реакцию амплификации проводят по следующей программе:

Согласно предлагаемому способу пробирки с амплификационной смесью выдерживают при +95°C - 5 мин, затем 40 циклов: при 95°C - 20 с, при 64°C - 30 с. Детекцию продуктов амплификации производят по каналам FAM и HEX. При этом используют, например, амплификатор «CFX 96» (фирма Bio Rad). Детекцию продуктов амплификации осуществляют на каждом цикле амплификации. На основании этих данных амплификатор строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов сигналу.

Результаты проведенной ПЦР согласно предлагаемому способу представлены на фиг. 1÷3.

При этом при генотипе I/I гена ангиотензинпревращающего фермента у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого риск развития артериальной гипертензии составляет менее 50%, при генотипе I/D гена ангиотензинпревращающего фермента у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого риск развития артериальной гипертензии составляет 50-70%, при генотипе D/D гена ангиотензинпревращающего фермента у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого риск развития артериальной гипертензии составляет выше 70%.

Пример 1.

Пациент П., 56 лет. Профессия - командир воздушного судна, летный стаж - 35 лет, общее летное время - 15 108 часов 28 минут. Работал в условиях воздействия интенсивного шума, помесячные эквивалентные уровни шума превышали ПДУ от 1,75 до 31,02 дБА (см. СН 2.2.4/2.1.8.562-96 «Шум на рабочих местах, в помещениях, жилых, общественных зданий и на территории жилой застройки»). Ежегодно проводились периодические медицинские осмотры, у работника П. не выявлено развития артериальной гипертензии.

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в TE-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Затем готовили амплификационную смесь для выявления инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Объем амплификационной смеси - 20 мкл, при этом использовали стандартный буфер для полимеразной цепной реакции, содержащий 1 единицу активности Taq-полимеразы. Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры с зондами типа TaqMan на I- и D-аллели гена ангиотензинпревращающего фермента.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе:

Согласно предлагаемому способу пробирки с амплификационной смесью выдерживали при +95°C - 5 мин, затем 40 циклов: при 95°C - 20 с, при 64°C - 30 с. Использовали амплификатор «CFX 96» (фирма Bio Rad), детекцию продуктов амплификации производили по каналам FAM и HEX. Детекцию продуктов амплификации осуществляли на каждом цикле амплификации. На основании этих данных амплификатор строил кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов сигналу. График накопления ДНК с праймерами для определения инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента представлен на фиг. 1.

Вывод:

У пациента П. выявлен гомозиготный I/I генотип гена ангиотензинпревращающего фермента, свидетельствующий о наличии менее 50% риска развития артериальной гипертензии в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого. Это подтверждено тем, что у данного работника после 35 лет работы в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого не была диагностирована артериальная гипертензия.

Пример 2.

Пациент Ш., 41 год. Профессия - формовщика ручной (и машинной) формовки участка литейного производства, стаж - 17 лет. Работал в условиях воздействия интенсивного шума в течение 8-и часового рабочего дня, превышающего ПДУ от 10,15 до 22,3 дБА (см. СН 2.2.4/2.1.8.562-96 «Шум на рабочих местах, в помещениях, жилых, общественных зданий и на территории жилой застройки»). Ежегодно проводились периодические медицинские осмотры, артериальная гипертензия 2 степени была диагностирована после 17 лет работы. Постоянно принимает антигипертензивные препараты.

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в TE-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Затем готовили амплификационную смесь для выявления инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Объем амплификационной смеси - 20 мкл, при этом использовали стандартный буфер для полимеразной цепной реакции, содержащий 1 единицу активности Taq-полимеразы. Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры с зондами типа TaqMan на I- и D-аллели гена ангиотензинпревращающего фермента.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе:

Согласно предлагаемому способу пробирки с амплификационной смесью выдерживали при +95°C - 5 мин, затем 40 циклов: при 95°C - 20 с, при 64°C - 30 с. Использовали амплификатор «CFX 96» (фирма Bio Rad), детекцию продуктов амплификации производили по каналам FAM и HEX. Детекцию продуктов амплификации осуществляли на каждом цикле амплификации. На основании этих данных амплификатор строил кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов сигналу. График накопления ДНК с праймерами для определения инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента представлен на фиг. 2.

Вывод:

У пациента Ш. выявлен гетерозиготный I/D генотип гена ангиотензинпревращающего фермента, свидетельствующий о наличии 50-70% риска развития артериальной гипертензии в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого. Это подтверждено тем, что у данного работника после 17 лет работы в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого была диагностирована артериальная гипертензия 2 степени.

Пример 3.

Пациент И., 38 лет. Профессия - второй пилот воздушного судна, летный стаж - 7 лет, общее летное время - 7765 часов 40 минут. Работал в условиях воздействия интенсивного шума, превышающего ПДУ в течение всего периода летной работы от 1,15 до 16,49 дБА (см. СН 2.2.4/2.1.8.562-96 «Шум на рабочих местах, в помещениях, жилых, общественных зданий и на территории жилой застройки»). Ежегодно проводились периодические медицинские осмотры, артериальная гипертензия 2 степени диагностирована после 7 лет работы. Постоянно принимает антигипертензивные препараты, но уровень АД плохо контролируется.

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в TE-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Затем готовили амплификационную смесь для выявления инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Объем амплификационной смеси - 20 мкл, при этом использовали стандартный буфер для полимеразной цепной реакции, содержащий 1 единицу активности Taq-полимеразы. Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры с зондами типа TaqMan на I- и D-аллели гена ангиотензинпревращающего фермента.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе: Согласно предлагаемому способу пробирки с амплификационной смесью выдерживали при +95°C - 5 мин, затем 40 циклов: при 95°C - 20 с, при 64°C - 30 с. Использовали амплификатор «CFX 96» (фирма Bio Rad), детекцию продуктов амплификации производили по каналам FAM и HEX. Детекцию продуктов амплификации осуществляли на каждом цикле амплификации. На основании этих данных амплификатор строил кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов сигналу. График накопления ДНК с праймерами для определения инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента представлен на фиг. 3.

Вывод:

У пациента И. выявлен гомозиготный D/D генотип гена ангиотензинпревращающего фермента, свидетельствующий о наличии более 70% риска развития артериальной гипертензии в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого. Это подтверждено тем, что у данного работника после 7 лет работы в условиях воздействия уровня шума выше предельно допустимого была диагностирована артериальная гипертензия 2 степени.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает повышение скорости и воспроизводимости определения риска развития артериальной гипертензии при проведении предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого. Он также позволяет упростить процесс определения риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, повысить степень его достоверности.

Использование предлагаемого способа позволит разрабатывать профилактические мероприятия по предупреждению развития артериальной гипертензии с учетом индивидуальных особенностей организма, своевременно оценивать значение различных факторов внешней среды на здоровье отдельного человека. Он может найти широкое применение в медицине труда, терапии, кардиологии и экологии человека.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента. Риск развития артериальной гипертензии у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого при генотипе I/I гена ангиотензинпревращающего фермента оценивают ниже 50%, при генотипе I/D - 50-70%, а при генотипе D/D - выше 70%. Изобретение обеспечивает повышение скорости определения риска развития артериальной гипертензии у лиц, подвергающихся воздействию шума, и упрощение способа при одновременном повышении степени его достоверности. 3 ил., 3 пр.

Способ определения риска развития артериальной гипертензии, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами, анализ продуктов амплификации методом флюоресцентной детекции в режиме реального времени, и на основании этого определение инсерции/делеции Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента, отличающийся тем, что при приготовлении амплификационной смеси используют специфические прямой и обратный праймеры по сторонам инсерции/делеции и два зонда типа TaqMan на I- и D-аллели, при этом прямой праймер - gga gac сас tcc cat cct ttc, 14045-14067 по AF118569, 13351-13372 по EU332840, обратный праймер - atg tgg cca tca cat tcg tca gat, 14499-14522 по AF118569, 13515-13537 по EU332840, зонд на I-аллель - (5′FAM) cca cag gcg ccc gcc act ac (3′BHQ1), 14235-14252 по AF118569 с флуорофором FAM, при этом зонд на I-аллель расположен внутри вставки (14094-14381 по AF118569), зонд на D-аллель - (5′HEX) gct gcc tat аса gtc act ttt atg tgg t (3′BHQ1), 13391-13417 по EU332840 с флуорофором HEX, после приготовления амплификационной смеси проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией накопления продуктов амплификации и по интенсивности полученных в результате ПЦР флуоресцентных сигналов определяют генотип гена ангиотензинпревращающего фермента: гомозигота по I-аллели (генотип I/I), гетерозигота (генотип I/D) или гомозигота по D-аллели (генотип D/D), при этом риск развития артериальной гипертензии у работающих в условиях превышения уровня шума выше предельно допустимого при генотипе I/I гена ангиотензинпревращающего фермента составляет ниже 50%, при генотипе I/D - 50-70%, а при генотипе D/D - выше 70%.