ОЧИСТКА БЕЛКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИС-ТРИС БУФЕРА Российский патент 2016 года по МПК C07K1/36 C07K1/22 

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ

Изобретение относится к двухэтапному способу хроматографии для мелко- и крупномасштабной очистки белков, в частности, моноклональных антител, с использованием четырех буферных растворов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Очистка антител может представлять собой один из наиболее затратных аспектов биопродукции. Моноклональные антитела (mAb) в целом очищают трехстадийным способом хроматографии с использованием трех смол и специфической буферной системы на каждой стадии. Этот обычный способ очистки включает стадию захвата с последующей стадией ионного обмена и заключительной стадией полировки и обычно занимает от 3 до 5 рабочих дней (включая хранения и открытые фазы). С увеличением титров клеточных культур и более крупными объемами клеточных культур, используемыми для продукции, технологию производства и выделения целевого продукта рассматривают как слабое место производства. Это, в частности, относится к производству моноклональных антител, где средоточие внимания сместилось с серийного объема в сторону производительности технологии получения и выделения целевого продукта. Кроме того, исследования на ранней преклинической и клинической фазе требуют более быстрого производства бόльших количеств антител, чем это возможно в уровне техники. Поэтому в промышленности существует потребность и в уменьшении числа стадий, подлежащих использованию для очистки антител, и времени, затрачиваемого для получения партий.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители обнаружили новый способ очистки антител, причем указанный способ включает ограниченные числа стадий, в то же время, обеспечивая возможность получения высоких выходов очищенных антител с превосходной степенью чистоты. Таким образом, очищенные белки пригодны для различных видов применения в медицине. Соответственно, данный способ можно применять при очистке белков для клинических испытаний и/или для реализации на рынке фармацевтической композиции, содержащей белок.

Вкратце, этот способ включает только две хроматографические стадии: одну аффинную хроматографию и одну хроматографию через колонку с мультимодальной смолой. Кроме того, было обнаружено, что все буферы, используемые во время этих двух стадий хроматографии, можно получить, начиная с того же маточного раствора. Иными словами, все буферы могут состоять из одних и тех же химических веществ, хотя концентрации указанных химических веществ могут варьироваться от одного буфера к другому. Эти буферы преимущественно содержат Бис-Трис, например, в комбинации с NaCl, уксусной кислотой и водой. Поскольку нет необходимости в каком-либо обмене буфера, способ легко осуществить, и он очень подходит для автоматизации и/или для проведения в непрерывном режиме. Кроме того, тот факт, что все буферы могут состоять из одних и тех же химических веществ, дает возможность значительно уменьшить время для подготовки хроматографических колонок, а также уменьшает потребность в ручных вмешательствах. Способ по изобретению дополнительно обеспечивает возможность уменьшения или отмены открытых фаз (т.е. стадий, где система очистки открывается для проведения ручной операции, такой как подготовка хроматографической колонки для нового буфера, разведение образца или доведение до требуемой величины его pH), посредством этого снижая риск загрязнения. Поэтому способ по изобретению обеспечивает возможность и быстрого производства партий, и снижения времени использования систем очистки. Таким образом, он пригоден для наращивания масштабов производства и очистки рекомбинантных белков в промышленном масштабе.

Две определенных последовательности операций были установлены и осуществлены для трех различных антител. В первом протоколе pH элюента неочищенного белка, полученного в конце первой хроматографической стадии, регулируют, используя раствор Бис-Трис (см. примеры 3, 4 и 5). Было показано, что этот протокол универсален в той мере, пока он дает превосходные и воспроизводимые результаты, независимо от определенного антитела, которое очищается (см. пример 6). Во втором протоколе элюент неочищенного белка, полученный в конце первой хроматографической стадии, непосредственно проходит через вторую хроматографическую колонку, т.е. без подвергания какой-либо обработке, подобной регулированию pH, обмену или разбавлению буфера (см. пример 7). В этом протоколе за указанными двумя хроматографическими стадиями может следовать прохождение через мембранный поглотитель. Этот второй протокол имеет преимущество крайне быстрого проведения (примерно 7 или 8 часов для 100 л исходного материала). Кроме того, его можно полностью автоматизировать, проводить в непрерывном режиме, и он не включает никакой открытой фазы.

Таким образом, изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему первую хроматографическую стадию, включающую прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, прохождение раствора через первую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, прохождение промывного и обеззараживающего буфера через первую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, элюирование элюента неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер, и, необязательно, регулирование pH элюента неочищенного белка, используя раствор Бис-Трис; и вторую хроматографическую стадию, включающую прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, прохождение элюента неочищенного белка через вторую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, и извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему первую хроматографическую стадию, включающую прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, прохождение раствора через первую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, элюирование неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер, и, необязательно, регулирование pH элюента неочищенного белка, используя раствор Бис-Трис; и вторую хроматографическую стадию, включающую прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, прохождение элюента неочищенного белка через вторую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, прохождение промывного и обеззараживающего буфера через вторую хроматографическую колонку, прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, и извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер.

В одном варианте осуществления изобретения раствор Бис-Трис представляет собой 1М раствор Бис-Трис. В других вариантах осуществления каждый из буферов содержит Бис-Трис и/или каждый из буферов содержит варьирующиеся концентрации одних и тех же химических веществ. В другом варианте осуществления каждый буфер содержит Бис-Трис, уксусную кислоту, NaCl и воду.

В одном варианте осуществления изобретения первая хроматографическая колонка представляет собой колонку белка A, а вторая хроматографическая колонка представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой. В другом варианте осуществления изобретения первая хроматографическая колонка представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой, а вторая хроматографическая колонка представляет собой колонку белка A. В других вариантах осуществления изобретения способ очистки белка из раствора не включает какой-либо хроматографической стадии, которая включает прохождение раствора через анионообменную хроматографическую (AEX) колонку.

В одном варианте осуществления изобретения очищаемый белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает прохождение элюента неочищенного белка через мембранный поглотитель после стадии (b). В других вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию нанофильтрации после стадии (b) и/или стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации.

В определенных вариантах осуществления изобретения первый элюционный буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 3,5 уксусной кислотой; второй элюционный буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 4,5 уксусной кислотой; уравновешивающий буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 7,4 уксусной кислотой; и промывной раствор и обеззараживающий буфер состоит из 20 мМ Бис-Трис и 1M NaCl, pH которого доводят до 7,4 уксусной кислотой. В других вариантах осуществления изобретения первый элюционный буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 4,5 уксусной кислотой; второй элюционный буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 3,5 уксусной кислотой; уравновешивающий буфер содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 7,4 уксусной кислотой; и промывной раствор и обеззараживающий буфер состоит из 20 мМ Бис-Трис, и 1M NaCl, pH которого доводят до 7,4 уксусной кислотой.

Изобретение относится к набору, содержащему хроматографическую колонку с мультимодальной смолой и/или колонку белка A; и по меньшей мере один буфер, содержащий или состоящий из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды. В некоторых вариантах осуществления набор используют для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.

Изобретение также относится к набору, содержащему хроматографическую колонку с мультимодальной смолой и/или колонку белка A; и инструкции по получению по меньшей мере одного буфера, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды. В некоторых вариантах осуществления набор используют для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.

Изобретение дополнительно относится к применению буфера, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды, для очистки белка из раствора по меньшей мере одной хроматографической стадией. В некоторых вариантах осуществления хроматографическая стадия представляет собой хроматографическую стадию на колонке с мультимодальной смолой и/или хроматографическую стадию на колонке белка A. Изобретение также относится к применению буфера, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды, для очистки белка из раствора способом по изобретению.

Изобретение дополнительно относится к способу получения уравновешивающего буфера, включающему создание 100 л раствора с конечной концентрацией 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl; доведение pH раствора до 7,4 уксусной кислотой; и сбор 50 л раствора. Изобретение также относится к способу получения промывного и обеззараживающего буфера, включающему доведение pH оставшихся 50 л раствора от получения уравновешивающего буфера до 4,5 уксусной кислотой; и сбор 25 л раствора. Изобретение дополнительно относится к способу получения элюционного буфера, включающему доведение pH оставшихся 25 л раствора от получения промывного и обеззараживающего буфера до 3,5 уксусной кислотой. Изобретение дополнительно относится к способу получения элюционного буфера, включающему добавление эквивалентного объема 1M NaCl к 25 л раствора, оставшихся от получения элюционного буфера. Буферы, полученные раскрытыми здесь способами, можно использовать для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.

Эти и другие признаки и преимущества описанного способа очистки станут более полно понятными из следующего подробного описания, взятого вместе с сопровождающей формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется перечисленными в ней положениями, а не определенным обсуждением признаков и преимуществ, изложенным в описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующее подробное описание вариантов осуществления раскрытого способа очистки можно лучше всего понять при чтении в сочетании со ссылкой на следующие чертежи.

На фиг. 1 показана схема последовательности операций, используемой для составления буферов способа очистки, описанных в примерах 3-6.

На фиг. 2 показана схема двухстадийного способа очистки.

На фиг. 3 показана схема применения двухстадийного способа очистки для колонок крупномасштабной очистки.

На фиг. 4 показана схема крупномасштабной очистки по принципу «одна партия в день».

На фиг. 5 показаны результаты крупномасштабной очистки по принципу «одна партия в день».

На фиг. 6 показана схема последовательности операций, используемой для составления буферов способа очистки, описанных в примере 7.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

На основании доступности смол смешанного типа (также называемых мультимодальными смолами) заявители разработали новый способ очистки с использованием лишь двух хроматографических стадий. Иными словами, способ включает только две стадии, включающие прохождение через хроматографическую колонку.

Изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- прохождение указанного раствора через первую хроматографическую колонку;

- элюирование неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер; и

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- прохождение элюента неочищенного белка, полученного в конце стадии (a) через вторую хроматографическую колонку;

- извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер,

причем каждый из буферов содержит Бис-Трис.

Конкретнее, каждая из двух указанных выше хроматографических стадий может включать или состоять из:

- прохождения уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- прохождения раствора или элюента неочищенного белка через хроматографическую колонку (как указано выше);

- прохождения уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, прохождения промывного и обеззараживающего буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, прохождения уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- элюирования элюента неочищенного белка или извлечения очищенного белка из хроматографической колонки, используя элюционный буфер (как указано выше),

причем каждый из буферов содержит Бис-Трис.

Как указано выше, упомянутый выше способ по изобретению включает только две хроматографические стадии. Конкретнее, способ может быть лишен хроматографической стадии, которая включает прохождение раствора через анионообменную хроматографическую (AEX) колонку, и/или хроматографической стадии для полировки. Даже хотя способ по изобретению включает только две хроматографические стадии, он обеспечивает возможность получения очищенных белков, которые пригодны для фармацевтических целей, и, в частности, для введения людям.

Кроме того, для уменьшения числа стадий в способе очистки с трех до двух (и, как следствие, сокращения общего времени, требуемого для завершения процесса очистки), описанный способ уменьшает число буферов, используемых для очистки, с семи до четырех. Кроме того, буферы содержат одинаковые компоненты (т.е. Бис-Трис, NaCl, уксусную кислоту и воду), что существенно облегчает получение буфера. Описанный способ очистки также упрощает очистку mAb, улучшает общий выход и уменьшает количество сырьевых материалов, стоимость готовой продукции и длительности производственного процесса, в дополнение к обеспечению возможности очистки разнообразных mAb.

В отличие от обычных способов очистки белка, как указано выше, в описанном здесь способе используют четыре буфера: уравновешивающий буфер, промывной буфер и два элюционных буфера. Буферы, используемые в описанном способе, изготавливают с таким же составом соединений, из маточного раствора, что существенно облегчает получение буфера.

Используемый в настоящем описании термин «буферы в соответствии с изобретением» относится к буферам, содержащим Бис-Трис. Бис-Трис представляет собой соединение, хорошо известное специалистам в данной области техники, названием которого по номенклатуре IUPAC (Международного Союза Чистой и Прикладной Химии) является 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол, и номером которого по реестру CAS (Службы Химической Ассоциации) является 6976-37-0. Такие буферы в соответствии с изобретением могут соответствовать уравновешивающему буферу, промывному и обеззараживающему буферу, и/или элюционному буферу.

Конкретнее, такие буферы в соответствии с изобретением могут содержать или состоять из варьирующихся концентраций одинаковых химических соединений (причем один из них представляет собой Бис-Трис). В определенном варианте осуществления буферы содержат или состоят из Бис-Трис, уксусной кислоты и воды. В более конкретном варианте осуществления буферы содержат или состоят из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды. Иными словами, такие буферы содержат или состоят из варьирующихся концентраций Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды.

Элюционный буфер может, например, содержать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl, с pH, доведенным до уровня от 3 до 4 (например, 3,5) уксусной кислотой. Такой элюционный буфер особенно пригоден для использования с колонкой для аффинной хроматография, такой как колонка белка A.

Элюционный буфер может также содержать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl, с pH, доведенным до уровня от 4 до 5 (например, 4,5) уксусной кислотой. Такой элюционный буфер особенно пригоден для использования с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, такой как, например, Capto Adhere.

Элюционный буфер может также содержать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и 150-250 мМ (например, 200 мМ) NaCl, с pH, доведенным до уровня от 8 до 9 уксусной кислотой. Такой элюционный буфер особенно пригоден для использования с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, такой как, например, Capto ММC.

Уравновешивающий буфер может содержать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl, с pH, доведенным до уровня от 7 до 8 (например, 7,4) уксусной кислотой.

Промывной и обеззараживающий буфер может содержать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и 0,9-1,1 мМ (например, 1M) NaCl с pH, доведенным до уровня от 7 до 8 (например, 7,4) уксусной кислотой.

Конкретнее, один уравновешивающий буфер для использования в описанном способе содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 7,4 2 мМ уксусной кислоты. Один промывной буфер для использования в описанном способе содержит 20 мМ Бис-Трис и 1M NaCl, pH которого доводят до 7,4 2 мМ уксусной кислоты. Первый элюционный буфер для использования в описанном способе содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 3,5 275 мМ уксусной кислоты. Второй элюционный буфер для использования в описанном способе содержит 20 мМ Бис-Трис и 20 мМ NaCl, pH которого доводят до 4,5 35 мМ уксусной кислоты.

Преимущества указанных выше составов включают способность продукта mAb проходить через две хроматографические колонки, используемые в описанном способе, с большей совместимостью, в то же время, сводя к минимуму нежелательные взаимодействия, ограничивая падения pH и проводимость, и содействуя увеличенному выходу в сравнении с традиционными способами очистки. В дополнение к использованию уменьшенного числа буферов, другим аспектом описанного способа является использование Бис-Трис буфера.

Используемые в настоящем описании термины «полипептид» или «белок» относятся к молекуле, имеющей последовательность нативных белков, то есть, белков, продуцируемых естественно встречающимися и, в частности, нерекомбинантными клетками, или полученными методами генной инженерии или рекомбинантными клетками, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции из, добавления к и/или замещения одной или нескольких аминокислот нативной последовательности. В определенных аспектах подлежащий очистке белок представляет собой антитело.

Используемый здесь термин «антитело» относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Связывающие фрагменты включают без ограничения F(ab), F(ab′), F(ab′)₂, Fv и одноцепочечные антитела. Термин «тяжелая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности в отношении антигена.

Используемый здесь термин «тяжелая цепь» охватывает тяжелую цепь полной длины и ее фрагменты. Тяжелая цепь полной длины включает домен вариабельной области, VH, и три домена константной области, CH1, CH2 и CH3. Домен VH находится на амино-конце полипептида, и домен CH3 находится на карбоксильном конце.

Используемый здесь термин «легкая цепь» охватывает легкую цепь полной длины и ее фрагменты. Легкая цепь полной длины включает домен вариабельной области, VL, и домен константной области, CL. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится на амино-конце полипептида. Используемый здесь термин «легкая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности в отношении антигена.

Структурные единицы естественно встречающихся антител обычно содержат тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно составлен из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую цепь полной длины (обычно имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь полной длины (обычно имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Амино-концевая часть каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, которая ответственна за распознавание антигена. Карбокси-концевая часть каждой цепи обычно ограничивает константную область, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи обычно классифицируются как каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи обычно классифицируются как мю, дельта, гамма альфа или эпсилон, и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая без ограничения IgM1 и IgM2. IgA аналогичным образом подразделяется на подклассы, включающие без ограничения IgA1 и IgA2. В пределах легкой и тяжелой цепей полной длины вариабельные и константные области обычно соединены областью «J» из примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает область «D» из примерно 10 или более аминокислот.

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи обычно образуют антиген-связывающий сайт. Вариабельные области обычно проявляют одинаковую общую структуру относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также именуемыми определяющими комплементарность областями или CDR. CDR из двух цепей каждой пары обычно совмещаются каркасными областями, которые могут обеспечить возможность связывания с определенным эпитопом. От N-конца до C-конца вариабельные области и легкой, и тяжелой цепи обычно включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот в каждый домен происходит в соответствии с определениями Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Биспецифическое или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелой цепи/легкой цепи и два различных сайта связывания.

Фрагмент F(ab) состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы F(ab) не может образовывать дисульфидную связь с другой тяжелой цепью молекулы. Фрагмент F(ab′) содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть константной области между доменами CH1 и CH2, так что межцепочечная дисульфидная связь может образовываться между двумя тяжелыми цепями для образования молекулы F(ab′)₂. Область Fv включает вариабельные области и из тяжелой, и из легкой цепей, но не имеет константных областей. Одноцепочечные антитела представляют собой молекулы Fv, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи были соединены гибким линкером для образования одной полипептидной цепи, которая образует антиген-связывающую область. В определенных вариантах осуществления подразумевается, что бивалентное антитело, отличное от «мультиспецифического» или «мультифункционального» антитела, содержит сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.

Моноклональные антитела (mAb), которые могут быть очищены описанным способом, можно продуцировать разнообразными технологиями, включая обычную методологию моноклональных антител, например, стандартную технологию гибридизации соматических клеток, хорошо известную в данной области техники. Хотя предпочтительны процедуры гибридизации соматических клеток, в принципе, можно использовать другие технологии продукции моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию B-лимфоцитов. Моноклональное антитело может, например, соответствовать мышиному, химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу.

В определенном варианте осуществления антитело, очищенное способом по изобретению, представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела, которое специфически связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка (например, гуманизированное антитело), антитело, которое специфически связывается с поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG) бактериального поверхностного полисахарида (например, полностью человеческое антитело) и антитело, которое специфически связывается с трансмембранным гликопротеином CD38 (например, гуманизированное антитело).

Используемая здесь фраза «извлечение белка» относится к сбору белка после использования описанного способа очистки. Описанный способ очистки может быть достигнут с использованием разнообразных стандартных технологий хроматографии белка, таких как без ограничения аффинная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрационная хроматография и хроматография с использованием мультимодальной смолы.

В определенных вариантах осуществления описанного способа первая или вторая хроматографическая колонка представляет собой колонку белка A. Колонка белка A функционирует посредством аффинитета между лигандом смолы и белком, приводя к высокоэффективному удалению примесей. Другое преимущество использования колонки белка A в описанном способе состоит том, что mAb имеют универсальный аффинитет в отношении белка A. В одном варианте осуществления описанного способа колонка белка A представляет собой смолу MabSelect Sure (GE Healthcare).

В дополнительных вариантах осуществления описанного способа первая или вторая хроматографическая колонка представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной (смешанного типа) смолой. Мультимодальная смола взаимодействует с представляющим интерес белком посредством нескольких механизмов при mAb:ионных, гидрофобных взаимодействиях и взаимодействиях с водородными связями. Конкретнее, в хроматографической колонке с мультимодальной смолой mAb:ионное взаимодействие представляет собой mAb:катионное взаимодействие, в отличие от mAb:анионных взаимодействий, которые происходят в классической анионообменной хроматографической (AEX) колонке.

В одном определенном варианте осуществления описанного способа мультимодальная смола представляет собой смолу Capto Adhere (GE Healthcare). Capto Adhere представляет собой мультимодальный анионный обменник с высоко поперечно сшитой агарозной матрицей основы. Характеристики Capto adhere суммированы ниже (см. GE Healthcare Life Sciences, файл данных 28-9078-88 AC).

Матрица Высоко поперечно сшитая агароза Функциональная группа Мультимодальный сильный анионный обменник Общая ионная емкость Среда, содержащая от 0,09 до 0,12 ммоль Cl-/мл Размер частиц 75 мкм (d_50v) Скорость потока По меньшей мере 600 см/ч в колонке диаметром 1 м с высотой слоя 20 см при 20°C с использованием рабочих буферов с такой же вязкостью как вязкость воды, при <3 бар (0,3 мПа) Стабильность pH   Краткосрочная от 2 до 14 Долгосрочная от 3 до 12 Рабочая температура от +4°C до +30°C

В другом определенном варианте осуществления описанного способа мультимодальная смола представляет собой смолу Capto ММC (GE Healthcare). Capto ММC представляет собой мультимодальный катионный обменник с высоко поперечно сшитой агарозной матрицей основы. Характеристики смолы Capto ММC суммированы ниже (см. GE Healthcare Life Sciences, файл данных 11-0035-45 AA).

Матрица Высоко поперечно сшитая агароза Функциональная группа Мультимодальный слабый катионный обменник Общая ионная емкость Среда, содержащая от 0,07 до 0,09 ммоль H+/мл Размер частиц 75 мкм (d50v) Скорость потока По меньшей мере 600 см/ч в колонке диаметром 1 м с высотой слоя 20 см при 20°C с использованием рабочих буферов с такой же вязкостью как вязкость воды, при <3 бар (0,3 мПа) Динамическое связывание >45 мг BSA/мл среды при 30 мС/см Стабильность pH   Краткосрочная от 2 до 14 Долгосрочная от 2 до 12 Рабочая температура от +4°C до +30°C

Способ в соответствии с изобретением может включать или не включать регулирование pH элюента неочищенного белка, используя раствор Бис-Трис в конце первой хроматографической стадии.

В первом варианте осуществления pH элюента неочищенного белка при использовании раствора Бис-Трис в конце первой хроматографической стадии, например, доводят до pH, составляющего от 6 до 7 (например, 6,5). Такой раствор Бис-Трис может представлять собой 1M раствор Бис-Трис. В таком способе хроматографическая колонка с мультимодальной смолой может, например, соответствовать колонке Capto Adhere. Определенный пример этого способа описан в примерах с 3 по 6.

Во втором варианте осуществления элюент неочищенного белка, полученный в конце первой хроматографиеской стадии, непосредственно пропускают через вторую хроматографическую колонку. Конкретнее, затем между двумя стадиями не проводят обработку (такую как регулирование pH, обмен или разбавление буфера). В таком способе хроматографическая колонка с мультимодальной смолой может, например, соответствовать колонке Capto ММC. Кроме того, элюент неочищенного белка можно пропустить через мембранный поглотитель после второй хроматографической стадии, как дополнительно описано ниже. Конкретный пример этого способа описан в примере 7. В таком способе между стадиями полностью отсутствуют обработки, требующие ручного вмешательства и открытия системы очистки (например, разбавление в сосуде для инактивации, фильтрацию после инактивации и регулирование pH в сосуде для пула белка A).

Описанный здесь способ можно использовать для извлечения очищенных белков. Используемый здесь термин «очищенные» относится к чистоте, которая обеспечивает возможность эффективного использования белка in vitro, ex vivo или in vivo. Для белка, подлежащего использованию при видах применения in vitro, ex vivo или in vivo, он должен по существу не содержать загрязняющих веществ, других белков и/или химических соединений, которые могут мешать применению этого белка при таких видах применения, или включение которых с представляющим интерес белком было бы по меньшей мере нежелательно. Такие виды применения включают этот способ получения терапевтических композиций, введение белка в терапевтической композиции и другие способы, описанные здесь. Предпочтительно, указанный здесь «очищенный» белок представляет собой белок, который можно получить любым способом (т.е. прямой очисткой из натурального источника, рекомбинантно или синтетически), и который был очищен от других белковых компонентов, так что белок содержит по меньшей мере примерно 80% масс./масс. общего белка в данной композиции, а предпочтительнее, по меньшей мере примерно 85%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 90%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 91%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 92%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 93%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 94%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 95%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 96%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 97%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 98%, и предпочтительнее, по меньшей мере примерно 99% масс./масс. общего белка в данной композиции.

Используемый здесь термин «неочищенный белок» относится к белку, который может быть получен любым способом (например, прямой очисткой из натурального источника, рекомбинантно или синтетически), и который был очищен от других белковых компонентов, так что белок содержит менее чем примерно 80% масс./масс. общего белка в данной композиции.

В одном варианте осуществления описанный способ дополнительно включает третью стадию, именуемую «стадией (c)», на которой элюент неочищенного белка пропускают через мембранный поглотитель после стадии (b). В частности, стадию (c) можно проводить, когда элюент неочищенного белка, полученный в конце первой хроматографической стадии, непосредственно пропускают через вторую хроматографическую колонку. Мембранный поглотитель представляет собой форму хроматографической матрицы или фильтр, в котором используются мембраны с большими порами, а не микропористые частицы. Эти поры покрывают всю площадь фильтра и способствуют очень высокой скорости потока образца, а также оптимальное связывание целевых молекул в пределах внутренней структуры мембраны. Мембраны могут быть включены в центрифужные колонки, что обеспечивает возможность легкого и селективного отделения целевых белков из сложных растворов. Выгоды использования мембранного поглотителя состоят в том, что они так же эффективны как обычные хроматографические способы связывания загрязняющих веществ; они обеспечивают возможность высоких скоростей потока при переработке, они не требуют упаковки, поверки или очистки, и являются одноразовыми, но могут использоваться повторно. Устойчивые к соли мембраны обеспечивают возможность даже большего числа типов очистки. В определенных вариантах осуществления мембранный поглотитель представляет собой толерантный к взаимодействию с солью хроматографический мембранный поглотитель (например, мембранный поглотитель Satorius STIC) или Q мембранный поглотитель.

При очистке рекомбинантных белков для фармацевтических целей за хроматографическими стадиями обычно следуют стадии фильтрации. Поэтому способ по изобретению может дополнительно включать стадию нанофильтрации после стадии (b) или (c). Стадию ультрафильтрации и диафильтрации можно дополнительно проводить после стадии нанофильтрации. Используемый здесь термин «ультрафильтрация» или «UF» относится к технологии фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора на основании размера частиц и размера пор в UF мембране. Используемый здесь термин «нанофильтрация» относится к фильтрации раствора через нанофильтр, который используется для удаления, например, вирусных частиц. Используемый здесь термин «диафильтрация» относится к технологии, в которой используются ультрафильтрационные мембраны для полного удаления, замещения или снижения концентрации солей или растворителей в растворах.

Наконец, очищенный белок можно включать в состав композиции, пригодной для хранения, и/или в фармацевтическую композицию для введения животным и/или людям.

Одно из многочисленных преимуществ описанного способа состоит в том, что он обеспечивает возможность получения достаточных выходов высокочистого белка. Очищенный белок, который извлекается способом по изобретению, может, например, проявлять чистоту по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Кроме того, способ по изобретению может обеспечить возможность извлечения очищенного белка с выходом по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Другой аспект изобретения относится к способу получения буферов, пригодных для использования в способе по изобретению. Действительно, все эти буферы можно очень легко и быстро получить, начиная с одного маточного раствора.

Такой способ получения буферов может включать или состоять из стадий:

i) создания раствора (например, 100 л раствора) с конечной концентрацией от 15 до 25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и от 15 до 25 мМ (например, 20 мМ) NaCl;

ii) доведения pH раствора до величины в диапазоне от 7 до 8 (например, 7,4) уксусной кислотой;

iii) сбора половины раствора, посредством этого получая уравновешивающий буфер;

iv) доведения pH оставшейся половины раствора со стадии (iii) до величины в диапазоне от 4 до 5 (например, 4,5) уксусной кислотой;

v) сбора половины раствора, полученного на стадии (iv), посредством этого получая элюционный буфер;

vi) доведения pH оставшейся половины раствора со стадии (v) до величины в диапазоне от 3 до 4 (например, 3,5) уксусной кислотой, посредством этого получая дополнительный элюционный буфер;

vii) сбора половины уравновешивающего буфера, полученного на стадии (iii), и добавления NaCl для получения конечной концентрации NaCl в диапазоне от 0,9 до 1,1 мМ (например, 1М), посредством этого получая промывной и обеззараживающий буфер.

Такой способ схематически изображен на фиг. 1.

Альтернативно, способ получения буферов может включать или состоять из:

i) создания раствора (например, 100 л раствора) с конечной концентрацией от 15 до 25 мМ (например, 20 мМ) Бис-Трис и от 15 до 25 мМ (например, 20 мМ) NaCl;

ii) доведения pH раствора до величины в диапазоне от 8 до 9 (например, 8,2) уксусной кислотой;

iii) сбора одно четвертой части (например, 25 л) раствора, посредством этого получая элюционный буфер;

iv) доведения pH оставшегося раствора со стадии (iii) до величины в диапазоне от 7 до 8 (например, 7,4) уксусной кислотой;

v) сбора двух третей раствора, полученного на стадии (iv), посредством этого получая уравновешивающий буфер;

vi) доведения pH оставшегося раствора со стадии (v) до величины в диапазоне от 3 до 4 (например, 3,5) уксусной кислотой, посредством этого получая дополнительный элюционный буфер;

vii) сбора половины уравновешивающего буфера, полученного на стадии (v), и добавления NaCl для получения конечной концентрации NaCl в диапазоне от 0,9 до 1,1 мМ (например, 1М), посредством этого получая промывной и обеззараживающий буфер.

Такой способ схематически изображен на фиг. 6.

Один из описанных выше способов получения буферов может также соответствовать самой первой стадии способа по изобретению, перед выполнением двух хроматографических стадий.

Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему или состоящему из:

(a) хроматографической колонки с мультимодальной смолой и/или колонки для аффинной хроматография, такой как колонка белка A; и

(b) по меньшей мере одного буфера в соответствии с изобретением (например, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды), и/или инструкции по получению по меньшей мере одного буфера в соответствии с изобретением (например, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды).

Изобретение дополнительно предусматривает применение буфера в соответствии с изобретением (например, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды) для очистки белка из раствора по меньшей мере одной хроматографической стадией. Конкретнее, эта по меньшей мере одна хроматографическая стадия может представлять собой стадию хроматографии на мультимодальной смоле и/или стадию аффинной хроматографии, например, на колонке белка A.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют определенные варианты осуществления описанного способа и различные виды его применения. Они изложены только с целью объяснения, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1: Оптимизация буферов очистки

1.1. Бис-Трис буфер можно использовать в качестве элюционного буфера с колонкой белка A

При проведении хроматографической стадии с колонкой белка A, элюционный буфер обычно состоит из цитратного или глицинового буфера. Такую хроматографическую стадию с колонкой белка A проводили с использованием следующих классических условий

- Колонка: MabSelect Sure емкостью 80 мл

- Уравновешивающий буфер: буфер PBS (фосфатный буферный раствор) при pH 7,2

- Элюционный буфер: 100 мМ цитрата натрия при pH 3,0

- Загрузка: 1 л раствора, содержащего 1,48 г/л mAb к CD38.

175 мл элюента неочищенного белка, содержащего 7,92 г/л mAb, получали после хроматографической стадии (1,386 г mAb).

Заявители исследовали, можно ли цитратный буфер заместить Бис-Трис буфером. Использовали следующие условия:

- Колонка: MabSelect Sure емкостью 80 мл

- Уравновешивающий буфер: PBS буфер при pH 7,2

- Элюционный буфер: 100 мМ Бис-Трис при pH 3,5 (pH доводили уксусной кислотой)

- Загрузка: 1 л раствора, содержащего 1,48 г/л mAb к CD38.

Заявители получили 200 мл элюента неочищенного белка, содержащего 6,8 г/л mAb (1,369 г mAb).

Это показывает, что при выполнении хроматографической стадии на колонке белка A использование Бис-Трис буфера в качестве элюционного буфера обеспечивает возможность получения таких же желательных результатов, как и с классическим буфером цитрата натрия.

1.2. Бис-Трис буферы можно преимущественно использовать в качестве буферов с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой

Элюент неочищенного белка, полученный после прохождения через хроматографическую колонку белка A, затем пропускали через хроматографическую колонку Capto adhere с мультимодальной смолой. Для этого заявители сначала испытали следующие условия:

Колонка: Capto adhere емкостью 1 мл

- Уравновешивающий буфер: 100 мМ цитрата натрия при pH 8,6 (80%) и 100 мМ лимонной кислоты при pH 2,2 (20%), причем конечный pH близок к 5,3.

- Элюционный буфер: Варьирующиеся концентрации двух указанных выше буферов для идентификации того, где происходит оптимальное элюирование.

- Промывной буфер: Идентичный уравновешивающему буферу.

- Загрузка: 20 мл элюента неочищенного белка, содержащего 35 мг mAb к CD38, имеющего pH 5,3.

Было обнаружено, что антитело элюируется во время стадии промывания, очевидно, потому что падал pH. Действительно, pH моментально падал с 5,3 до 4,0 перед увеличением снова до pH 5,3. Тот факт, что pH упал до 4,0, был достаточен для элюирования антитела во время стадии промывания.

Затем заявители исследовали, могло ли применение Бис-Трис буфера избежать нежелательного элюирования во время стадии промывания. Они испытали следующие условия:

Колонка: Capto adhere емкостью 1 мл

- Уравновешивающий буфер: 20 мМ Бис-Трис при pH 7,0 (pH доводили уксусной кислотой)

- Элюционный буфер: 20 мМ Бис-Трис при pH 6,0 (pH доводили уксусной кислотой)

- Промывной/регенерационный буфер: 20 мМ Бис-Трис при pH 4,0 (pH доводили уксусной кислотой)

- Обеззараживающий буфер: 0,5н NaOH

- Загрузка: 18 мл элюента неочищенного белка, содержащего примерно 30 мг mAb к CD38. Этот элюент поступил со 2-ой хроматографической стадии, описанной выше в параграфе 1.1. pH элюента доводили до pH 7,2 раствором 1М Бис-Трис перед загрузкой на колонку Capto adhere.

Заявители обнаружили, что эти условия дали возможность получить правильное элюирование антитела. Действительно, антитело элюировали элюционным буфером Бис-Трис, имеющим pH 6,0. Два меньших и игнорируемых пика наблюдали во время восстановления при pH 4,0 и во время обеззараживания NaOH.

Дополнительно испытывали, могло ли оказывать благоприятный эффект доведение pH буферами Бис-Трис с HCl вместо уксусной кислоты. Использовали следующие условия:

- Колонка: Capto adhere емкостью 1 мл

- Уравновешивающий буфер: 20 мМ Бис-Трис при pH 7,0 (pH доводили 1н HCl).

- Элюционный буфер: градиент с Бис-Трис буфером (20 мМ, pH 4, pH доводили 1н HCl).

- Загрузка: 10 мл элюента неочищенного белка, содержащего примерно 15 мг mAb к CD38. Этот элюент поступил со 2-ой хроматографической стадии, описанной выше в параграфе 1.1. pH элюента доводили до pH 7,2 раствором 1М Бис-Трис перед загрузкой на колонку Capto adhere.

Используя эти условия, антитело не элюировалось во время стадии промывания. Поэтому данный анализ подтверждает то, что использование буфера Бис-Трис обеспечивает возможность предотвращения нежелательного элюирования антитела во время стадии промывания. Однако pH не падал так же быстро во время стадии элюирования, когда pH доводили HCl, а не уксусной кислотой. Таким образом, элюирование антитела было менее эффективным при регулировании pH HCl, чем уксусной кислотой.

В заключение, заявители к удивлению обнаружили, что во время хроматографической стадии на мультимодальной смоле использование уравновешивающего и элюционного буферов, содержащих Бис-Трис, обеспечивает возможность избежать нежелательного элюирования антитела во время стадии промывания и обеззараживания. Они дополнительно обнаружили, что было предпочтительно регулирование pH Бис-Трис буфера уксусной кислотой. Поскольку было также обнаружено, что Бис-Трис буфер пригоден для выполнения хроматографической стадии на белке A, то заявители нашли способ очистки, где все буферы могут быть получены с одинаковой матрицей соединений, что в значительной степени облегчает получение буферов.

Дополнительные эксперименты проводили для определения оптимального pH для уравновешивающего буфера, промывного буфера и двух элюционных буферов, которые все содержат Бис-Трис, а также уксусную кислоту для целей регулирования pH. Заявители дополнительно неожиданно обнаружили, что NaCl можно предпочтительно добавлять к буферам. Эти дополнительные эксперименты привели к получению буферов и последовательностей операций очистки, описанных в примерах со 2-го по 7-ой.

Пример 2: Составление буферов очистки

В описанном здесь двухстадийном способе очистки используются четыре буфера: уравновешивающий буфер, промывной и обеззараживающий буфер и два элюционных буфера, все полученные из одного и того же маточного раствора. Схема последовательности операций показана на фиг. 1 и является следующей: эквивалентный объем 20 мМ Бис-Трис и эквивалентный объем 20 мМ NaCl добавляли к 100 л воды для инъекции (WFI) в качестве маточного раствора, и затем pH раствора доводили до 7,4, используя уксусную кислоту. Затем собирали 50 л полученного раствора и хранили в качестве уравновешивающего буфера. Затем 25 л уравновешивающего буфера удаляли и добавляли эквивалентный объем 1М NaCl, посредством этого уменьшая pH до 3,5. Эти полученные в результате 25 л раствора представляли собой промывной и обеззараживающий буфер. Затем pH остающихся 50 л маточного раствора доводили до 4,5 уксусной кислотой. Затем 25 л этого раствора собирали в качестве одного из элюционных буферов. Затем pH остающихся 25 л маточного раствора доводили до 3,5, используя уксусную кислоту, что в результате обеспечивало получение другого элюционного буфера.

Пример 3: Двухстадийный способ очистки моноклональных антител

Двухстадийный способ очистки моноклональных антител (mAb) начинают с первой хроматографической стадии, используя смолу MabSelect Sure. 2 колоночных объема (CV) уравновешивающего буфера пропускают через колонку. Затем раствор mAb загружают на колонку. Два CV промывного буфера затем пропускают через колонку, с последующими двумя CV уравновешивающего буфера. Затем раствор неочищенного mAb элюируют, используя один CV первого элюционного буфера. Между двумя хроматографическими стадиями производят обработку при низком pH. Это может представлять собой регулирование pH до низкого уровня с использованием 1М уксусной кислоты для достижения pH 3,5±0,1 или регулирование pH с использованием 1М Бис-Трис для достижения pH 5±0,1. Вторую хроматографию проводят, используя хроматографическую колонку Capto Adhere. 2 CV уравновешивающего буфера пропускают через колонку. Затем раствор неочищенного mAb загружают на колонку с последующим пропусканием 4 CV уравновешивающего буфера. Затем раствор частично очищенного mAb элюируют, используя один CV второго элюционного буфера. После хроматографии mAb можно фильтровать и нанофильтрацией, и ультрафильтрацией/диафильтрацией. Нанофильтрация начинается стадией префильтрации с использование префильтров X0HC и VPD (Millipore) и завершается нанофильтрацией с использованием фильтра Viresolve Pro (Millipore). Затем ультрафильтрацию проводят при целевой концентрации 50 г/л с последующей диафильтрацией с использованием 7 объемов гистидинового буфера (схему способа см. на фиг. 2).

Пример 4: Очистка гуманизированного mAb 13C3 мелкими партиями

Последовательность операций, описанную в примере 2, использовали для очистки мелкой партии 53 г гуманизированного mAb 13C3. mAb 13C3 связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, как описано в опубликованной заявке на международный патент № WO 2009/065054.

Основную массу сбора mAb просветляли пропусканием через фильтрующую систему глубинного типа и фильтровали, используя фильтр с размером пор 0,22 мкм, перед хранением в одноразовом мешке емкостью 50 л в течение 96 ч при 2-8°C перед очисткой. 43 л массы сбора загружали на колонку MabSelect Sure емкостью 3,1 л при скорости потока 240 см/ч. Первую хроматографическую стадию выполняли, как описано выше, и собирали 6 л раствора mAb. Затем элюаты разбавляли 4 л воды Milli-Q для получения раствора, который имел концентрацию ~5 г/л. Затем pH снова доводили до 6,5 1 л 1М Бис-Трис. Затем общий объем 11,03 л фильтровали через глубинный фильтр типа C0HC и фильтр Millipak с размером пор 0,22 мкм. Затем собирали 11,58 л и хранили при 2-8°C. Для второй хроматографической стадии элюат MabSelect Sure загружали на колонку Capto adhere емкостью 4 л при скорости потока 240 см/ч. После стадии загрузки хроматографию проводили, как описано выше, и собирали в мешок емкостью 10 л при конечном объеме 5,58 л. Конечный продукт фильтровали через фильтр Millipak с размером пор 0,22 мкм и хранили при 2-8°C.

По сравнению с классической очисткой mAb, описанный здесь двухстадийный способ обеспечивает аналогичные результаты при общем выходе >90% и чистоте >98%, в данном случае, конкретно чистоте 99,4% и конечной концентрации 9,49 г/л.

Пример 5: Массовая очистка моноклональных антител

Двухстадийный способ очистки можно также применять для крупномасштабной очистки моноклональных антител. Для первой хроматографической стадии, общую массу сбора (216 л) гуманизированного mAb 13C3 делили на 4 аликвота и загружали на колонку MabSelect Sure емкостью 3,1 л при скорости потока 240 см/ч в 4 цикла примерно по 54 л каждый. Хроматографию проводили, как описано выше, и элюаты mAb собирали в мешок Mobuis емкостью 100 л. Кроме того, после каждой стадии загрузки колонку уравновешивали уравновешивающим буфером. По данным измерения pH 19,7 л раствора составил 3,9. Затем элюаты разбавляли до концентрации 5 г/л 60 л воды MilliQ. Затем pH доводили до 3,5 4,0 л 1М уксусной кислоты, при длительности процесса регулирования pH ~1 час. После удерживания pH, pH элюатов доводили до pH 6,5 для стадии Capto Adhere 7 л 1М раствора Бис-Трис. Конечный объем для этой стадии составил 91 л, и продукт хранили при 4°C. Для второй хроматографической стадии элюат MabSelect Sure разделяли и загружали на колонку Capto Adhere емкостью 3,5 л при скорости потока 240 см/ч в 4 цикла. После каждой стадии загрузки колонку уравновешивали уравновешивающим буфером. Все элюаты объединяли в одном и том же мешке Flexboy емкостью 50 л через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и после каждой стадии выполняли обеззараживание, используя промывной буфер. Конечный объем составил 22,1 л, и элюат хранили при 2-8°C. Затем стадию глубинной фильтрации выполняли фильтром X0HC filter (Millipore). Вследствие проблем совместимости между фильтром X0HC и префильтром VPF, используемым для следующей стадии, префильтр VPF добавляли к фильтру X0HC в одном и том же держателе для выполнения фильтрации. Для сведения к минимуму потери выхода, нанофильтр Modus 1.3 вставляли в магистраль после двух глубинных фильтров. Раствор фильтровали через 0,22 м² фильтра сорта X0HC (2×0,11 м²), 0,22 м² фильтра VPF (2×0,11 м²) и Modus 1,3 (0,21 м²). После фильтрационной промывки общий извлеченный объем составил 25,9 л. Не возникло никаких проблем с давлением, начиная с 1,8 и заканчивая примерно 1,3 бар при 460 мл/мин. Конечной стадией была ультрафильтрация и диафильтрация раствора. Эти два способа проводили в Millipore Cogent M с держателем, который увеличивал емкость до 1,71 м². Партию загружали на Cogent M при постоянном объеме 9,3 л для концентрации раствора до 50 г/л. Первую концентрацию достигали через 50 мин при поперечном потоке насоса 12 л/м/ч. Затем проводили диафильтрацию 7 объемами 10 мМ гистидина при pH 6,5 за 165 мин при поперечном потоке насоса 14 л/м/ч. Затем продукт медленно концентрировали в течение 30 мин при поперечном потоке насоса 8 л/м/ч. Поток подбирали так, чтобы давление оставалось ниже ΔP<0,6 бар, начиная при 1670 мл/мин и заканчивая при 520 мл/мин. Конечный объем собранного раствора составил 2,6 л, содержащий 457 г mAb, при конечной концентрации 175,7 г/л (UV). Наконец, продукт фильтровали, используя фильтр Sartopore 2-150 с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C.

Пример 6: Очистка различных моноклональных антител

В дополнение к гуманизированному антителу 13C3, описанный выше двухстадийный способ использовали для очистки дополнительных антител, а именно, полностью человеческого антитела, которое специфически связывается с поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG) бактериального поверхностного полисахарида, и гуманизированного моноклонального антитела, которое специфически связывается с трансмембранным гликопротеином CD38.

В таблице ниже показан общий выход и чистота, полученная после очистки этих трех антител.

Антитело Общий выход (%)¹ Чистота (%) Гуманизированное mAb 13C3 >90 >98 mAb к PNAG >95 >97 mAb к CD38 >85 >98 ¹Общий выход соответствует выходу перед стадиями нанофильтрации, ультрафильтрации и диафильтрации

Затем очищенное гуманизированное mAb 13C3 и очищенное mAb к PNAG вводили людям в рамках клинических испытаний.

В заключение, было подтверждено с тремя различными антителами, что двухстадийный способ очистки обеспечивает возможность получения хороших выходов очищенных антител с превосходной степенью чистоты, причем очищенные антитела имеют качество, пригодное для введения людям.

Пример 7: Способ очистки «одна партия в один день»

При крупномасштабной очистке можно также использовать колонку белка A, соединенную с мультимодальной колонкой, путем прохождения элюента неочищенного белка, полученного в конце первой хроматографической стадии непосредственно через вторую хроматографическую колонку (см. фиг. 3). Некоторые из выгод использования способа для крупномасштабной очистки заключаются в том, что нет необходимости в дополнительных разбавлениях, регулировании pH или хранении. Кроме того, этот способ обеспечивает возможность быстрой загрузки препаратов неочищенных антител. Способ крупномасштабной очистки антител использовали для очистки партии 340 г mAb в течение периода 7 часов 30 минут (см. фиг. 4). Способ очистки привел к выходу 98% (332/340 г) и чистоте 96,9% (см. фиг. 5). Кроме того, удаление примесей с использованием данного способа осуществлялось до уровня, подобного наблюдаемому при обычных способах очистки.

Описанные выше способы крупномасштабной очистки можно использовать для достижения целей получения более крупных серий и более эффективных препаратов антитела для использования, например, в преклинических и клинических испытаниях.

Конкретнее, этот способ, который называется «одна партия в один день», применяли в крупномасштабной очистке гуманизированного mAb 13C3. Целью была очистка всей партии 200 л лишь за один день посредством двух хроматографических стадий без хранения, открытой фазы, стадии разбавления/регулирования.

Буферы получали, как показано на фиг. 6.

Для первой хроматографической стадии общую массу сбора (179 л) делили на 4 аликвоты и загружали на колонку MabSelect Sure емкостью 3,1 л в 4 порции. Все порции уравновешивали буфером B (20 мМ NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 7,4), промывали буфером D (1М NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 7,4) и элюировали буфером C (20 мМ NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 3,5). Каждый элюат загружали непосредственно в колонку Capto ММC емкостью 3,1 л. Перед каждой операцией загрузки колонку уравновешивали буфером C (20 мМ NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 3,5), затем после загрузки колонку уравновешивали буфером B (20 мМ NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 7,4) и продукт элюировали буфером A (200 мМ NaCl, 20 мМ Бис-Трис с pH 8,2). Всю партию очищали за один рабочий день с 7 часов утра до 3 часов дня.

После этих двух хроматографических стадий все элюированные фракции проходили через мембрану STIC перед сбором в мешок объемом 50 л.

Общий объем, загруженный на первую колонку, составлял 179 л при концентрации mAb 1,61 г/л. Общий очищенный объем составил 35,7 л при титре mAb 7,26 г/л. Общий выход был 90%.

Хотя изобретение было подробно описано со ссылкой на определенные варианты его осуществления, очевидно, что возможны его модификации и варианты без отхода от объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Конкретнее, хотя некоторые аспекты изобретения идентифицированы здесь как особенно предпочтительные, предусмотрено, что изобретение необязательно ограничивается этими конкретными аспектами.

Каждая ссылка, описанная и/или приведенная в настоящем описании, полностью включена в него путем ссылки.

Изобретение относится к двухстадийному способу хроматографии для очистки белков, в частности моноклональных антител, с использованием только четырех буферных растворов, полученных из маточного раствора. Способ включает (a) первую хроматографическую стадию, включающую: прохождение указанного раствора через первую хроматографическую колонку; элюирование неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер; и (b) вторую хроматографическую стадию, включающую: прохождение элюента неочищенного белка, полученного в конце стадии (а), через вторую хроматографическую колонку; извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер, причем каждый из буферов содержит Бис-Трис, уксусную кислоту и воду. Способ обеспечивает возможность быстрого производства партий очищенного белка и снижения времени использования систем очистки, что дает возможность очистки рекомбинантных белков в промышленном масштабе. 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 7 пр.

1. Способ очистки белка из раствора, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
- прохождение указанного раствора через первую хроматографическую колонку;
- элюирование неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер; и
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
- прохождение элюента неочищенного белка, полученного в конце стадии (а), через вторую хроматографическую колонку;
- извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер,
причем каждый из буферов содержит Бис-Трис, уксусную кислоту и воду, и где первая хроматографическая колонка представляет собой колонку для аффинной хроматографии.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая из двух хроматографических стадий включает:
- прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- прохождение раствора или элюента неочищенного белка через хроматографическую колонку;
- прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- необязательно прохождение промывного и обеззараживающего буфера через хроматографическую колонку;
- необязательно прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- элюирование элюента неочищенного белка или извлечение очищенного белка из хроматографической колонки, используя элюционный буфер,
причем каждый из буферов содержит Бис-Трис.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что каждый из буферов состоит из различающихся концентраций одних и тех же химических соединений.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что каждый из буферов состоит из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что способ очистки белка из раствора включает только две хроматографические стадии.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что колонка для аффинной хроматографии представляет собой колонку для аффинной хроматографии на основе белка А.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна из хроматографических колонок представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой.

8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает регулирование рН элюента неочищенного белка с использованием раствора Бис-Трис, в частности отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает регулирование рН элюента неочищенного белка до величины в диапазоне от 6 до 7 с использованием раствора Бис-Трис.

9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюент неочищенного белка, полученный в конце стадии (а), непосредственно проходит через вторую хроматографическую колонку, не подвергаясь никакой обработке, такой как регулирование рН, обмен буфера или разбавление.

10. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение раствора через первую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(iv) прохождение промывного и обеззараживающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(v) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(vi) элюирование элюата неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер; и
(vii) необязательно регулирование рН элюента неочищенного белка, используя раствор Бис-Трис;
и
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение элюента неочищенного белка со стадии (а) через вторую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку; и
(iv) извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер.

11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что белок представляет собой антитело, конкретнее отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело, еще конкретнее белок представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела, которое специфически связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, антитела, которое специфически связывается с поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG) бактериального поверхностного полисахарида, и антитела, которое специфически связывается с трансмембранным гликопротеином CD38.

12. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий после стадии (b) стадию (с) прохождения элюента неочищенного белка через мембранный поглотитель.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный мембранный поглотитель представляет собой толерантный к взаимодействию с солью хроматографический мембранный поглотитель.

14. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий стадию нанофильтрации после стадии (b) или (с).

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации.

16. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что первый элюционный буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, рН которого доводят до диапазона от 3 до 4 уксусной кислотой.

17. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что второй элюционный буфер:
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, рН которого доводят до диапазона от 4 до 5 уксусной кислотой, или
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 150 до 250 мМ NaCl, рН которого доводят до диапазона от 8 до 9 уксусной кислотой.

18. Способ по п. 2, отличающийся тем, что уравновешивающий буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, рН которого доводят до диапазона от 7 до 8 уксусной кислотой.

19. Способ по п. 2, отличающийся тем, что промывной и обеззараживающий буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 0,9 до 1,1 мМ NaCl, рН которого доводят до диапазона от 7 до 8 уксусной кислотой.

20. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что очищенный белок извлекается с выходом по меньшей мере 85%.

21. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что извлеченный очищенный белок демонстрирует чистоту по меньшей мере 95%.

22. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий стадию включения извлеченного очищенного белка в состав фармацевтической композиции.