СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ Российский патент 2017 года по МПК C07K1/16 C07K1/34 C07K1/36 C07K16/00 

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета Временной заявки на патент США, серийный № 61/391762, поданной 11 октября 2010 года, которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей ее полноте.

Уровень техники

Настоящее изобретение относится в целом к способам очистки белков.

Экономика крупномасштабной очистки белков являются важной, в частности, для терапевтических антител, поскольку антитела представляют собой большой процент терапевтических биологических продуктов на рынке. В дополнение к их терапевтической ценности, например, моноклональные антитела являются также важными инструментами в области диагностики. Многочисленные моноклональные антитела разработаны и используются при диагностике многих заболеваний, при диагностике беременности и при исследовании лекарственных средств.

Типичные способы очистки включают множество стадий хроматографии для того, чтобы удовлетворить требованиям по чистоте, выходу и производительности. Стадии, как правило, включают фракционно-захватную хроматографию, промежуточную очистку или доочистку и конечную очистку. Афинная хроматография (на белке А или G) или ионообменная хроматография часто используется как стадия фракционно-захватной хроматографии. Традиционно, после стадии фракционно-захватной хроматографии следуют, по меньшей мере, две других стадии хроматографии для промежуточной очистки или доочистки для обеспечения адекватной чистоты и очистки от вирусов. Стадия промежуточной очистки или доочистки, как правило, осуществляется с помощью афинной хроматографии, ионообменной хроматографии или хроматографии гидрофобных взаимодействий, среди других способов. В традиционном способе, стадия конечной очистки может осуществляться с помощью ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий или гель-фильтрационной хроматографии. Эти стадии удаляют примеси, связанные со способами и продуктами, включая белки клеток-хозяев (HCP), ДНК, выщелоченный белок A, агрегаты, фрагменты, вирусы и другие низкомолекулярные примеси из потока продукта и культуры клеток.

Сущность изобретения

Вкратце, настоящее изобретение направлено, в одном из вариантов его осуществления, на способ очистки белка, включающий получение образца, содержащего белок, обработку образца с помощью поглощающей хроматографической смолы с получением первого элюата, содержащего белок, дезактивирование вирусов в первом элюате с получением дезактивированного элюата, содержащего белок, обработку дезактивированного элюата с помощью, по меньшей мере, одного фильтра глубинного типа, с получением отфильтрованного элюата, содержащего белок, и переработку отфильтрованного элюата с помощью, по меньшей мере, одной ионообменной мембраны, с получением второго элюата, содержащего белок.

Кроме того, в одном из вариантов его осуществления, настоящее изобретение направлено на способ очистки белка, включающий получение образца, содержащего белок, осветление образца с получением осветленного образца, обработку осветленного образца с помощью поглощающей хроматографической смолы с получением первого элюата, содержащего белок, дезактивирование вирусов в первом элюате с получением дезактивированного элюата, содержащего белок, обработку дезактивированного элюата с помощью, по меньшей мере, одного фильтра глубинного типа, с получением отфильтрованного элюата, содержащего белок, обработку отфильтрованного элюата с помощью, по меньшей мере, одной ионообменной мембраны, которую либо устанавливают последовательно с фильтром глубинного типа, либо используют на отдельной стадии, с получением второго элюата, содержащего белок, обработку второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы с получением третьего элюата, содержащего белок, воздействие на третий элюат нанофильтрования с получением нанофильтрованного элюата, содержащего белок, и воздействие на нанофильтрованный элюат ультрафильтрования и нанофильтрования или диафильтрования.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует блок-схему одного из вариантов осуществления способа.

Фиг.2 иллюстрирует блок-схему другого варианта осуществления способа.

Фиг.3 иллюстрирует блок-схему другого варианта осуществления способа.

Фиг.4 иллюстрирует блок-схему другого варианта осуществления способа.

Фиг.5 иллюстрирует профили элюирования на белке А при фракционно-захватной хроматографии на ProSep® Ultra Plus при 280 нм.

Фиг.6 иллюстрирует профили элюирования на белке А при фракционно-захватной хроматографии на ProSep® Ultra Plus при 302 нм.

Фиг.7 иллюстрирует профили хроматографии на Phenyl Sepharose® HP при 280 нм.

Фиг.8 иллюстрирует профили хроматографии на Phenyl Sepharose® HP при 302 нм.

Подробное описание вариантов осуществления

Теперь будут описываться подробно варианты осуществления настоящего изобретения, один или несколько примеров которых приводятся ниже. Каждый пример приводится в качестве пояснения настоящего изобретения, но не в качестве ограничения настоящего изобретения. Фактически, специалистам в данной области будет ясно, что различные модификации и варианты могут осуществляться в настоящем изобретении без отклонения от рамок или духа настоящего изобретения. Например, признаки, иллюстрируемые или описываемые как часть одного из вариантов осуществления, можно использовать в другом варианте осуществления с получением еще одного варианта осуществления.

Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение перекрывает такие модификации и варианты, как следует из рамок прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов. Другие цели, признаки и аспекты настоящего изобретения описываются в следующем далее подробном описании или являются очевидными из него. Специалисты в данной области должны понять, что настоящее обсуждение представляет собой только описание иллюстративных вариантов осуществления и не рассматриваются как ограничивающие более широкие аспекты настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение включает систему и способ очистки белка. Блок-схемы вариантов осуществления настоящей системы очистки приводятся на фиг.1-4.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, получают образец, который содержит белок. Любой образец, содержащий белок, можно использовать в настоящем изобретении. Образец, который содержит белок, может содержать, например, культуру клеток или асцитную жидкость грызунов. В качестве примера, белок может экспрессироваться в клетках яичников китайского хомячка (CHO) в перемешиваемых биореакторных танках. Белок может представлять любой белок или его фрагмент, известный в данной области. В различных вариантах осуществления, белок представляет собой белок слияния, такой как белок Fc-слияния.

В некоторых вариантах осуществления, белок представляет собой антитело. В конкретном варианте осуществления, белок представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент. В некоторых случаях, белок может представлять собой моноклональное антитело человека. В других вариантах осуществления, белок представляет собой антитело иммуноглобулина G. В одном из вариантов осуществления, белок может представлять собой венированное антитело иммуноглобулина G, гуманизированное антитело иммуноглобулина G или рекомбинантное антитело иммуноглобулина G. В конкретном варианте осуществления, белок может представлять собой иммуноглобулин IgG1. В определенных вариантах осуществления белок может быть специфичным к эпитопу рецептора фактора эпидермального роста человека (EGFR). В другом варианте осуществления белок может представлять собой рекомбинантное гуманизированное нейтрализующее моноклональное антитело, направленное против уникального эпитопа на IL-13.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, образец, содержащий белок, может сначала осветляться с использованием любого способа, известного в данной области (смотри фиг.1-4, стадия 1). Стадия осветления пытается удалить из образца клетки, остатки клеток и некоторые примеси, связанные с клетками-хозяевами. В одном из вариантов осуществления, образец может осветляться с помощью одной или нескольких стадий центрифугирования. Центрифугирование образца может осуществляться так, как известно в данной области. Например, центрифугирование образца может осуществляться с использованием нормированной нагрузки примерно от 1×10^-8-м/сек и силы тяжести примерно от 5000×g примерно до 15000×g.

В другом варианте осуществления, образец может осветляться с помощью одной или нескольких стадий фильтрования на фильтре глубинного типа. Фильтрование на фильтре глубинного типа относится к способу удаления частиц из раствора с использованием ряда фильтров, расположенных последовательно, которые имеют уменьшающиеся размеры пор. Трехмерная матрица фильтра глубинного типа создает лабиринтообразный путь, через который проходит образец. Главные механизмы удерживания фильтров глубинного типа основываются на случайной адсорбции и на механическом удерживании в глубине матрицы. В различных вариантах осуществления, мембраны или листы фильтра могут представлять собой навитой хлопок, полипропилен, вискозную целлюлозу, стекловолокно, спеченный металл, фарфор, диатомовую землю или другие известные компоненты. В определенных вариантах осуществления, композиции, которые содержат мембраны фильтров глубинного типа, могут химически обрабатываться для придания электроположительного заряда, то есть, катионного заряда, чтобы дать возможность фильтру для фракционно-захватной хроматографии отрицательно заряженных частиц, таких как ДНК, белки клеток-хозяев или агрегаты.

Любую систему фильтрования на фильтрах глубинного типа, доступную специалистам в данной области, можно использовать в этом варианте осуществления. В конкретном варианте осуществления, стадия фильтрования с помощью фильтра глубинного типа может осуществляться с помощью системы фильтров глубинного типа Millistak+® Pod, сред XOHC, доступных от Millipore Corporation. В другом варианте осуществления, стадия фильтрования с помощью фильтра глубинного типа может осуществляться с помощью Zeta Plus™ Depth Filter, доступного от 3M Purification Inc.

В некоторых вариантах осуществления, среды фильтров глубинного типа имеют номинальный размер пор примерно от 0,1 мкм примерно до 8 мкм. В других вариантах осуществления, среды фильтров глубинного типа могут иметь размеры пор примерно от 2 мкм примерно до 5 мкм. В конкретном варианте осуществления, среды фильтров глубинного типа могут иметь размеры пор примерно от 0,01 мкм примерно до 1 мкм. В других вариантах осуществления, среды фильтров глубинного типа могут иметь размеры пор, которые больше примерно, чем 1 мкм. В других варианты осуществления среды фильтров глубинного типа могут иметь размеры пор, которые меньше примерно, чем 1 мкм.

В некоторых вариантах осуществления, стадия осветления может включать использование двух или более фильтров глубинного типа, расположенных последовательно. Фильтры глубинного типа могут быть одинаковыми или отличными один от другого. В этом варианте осуществления, например, фильтры mini DOHC и XOHC от Millistak+® могут соединяться последовательно и использоваться на стадии осветления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, стадия осветления может включать использование трех или более фильтров глубинного типа. В одном из вариантов осуществления, стадия осветления может включать использование множества (например, десяти) узлов фильтров глубинного типа, расположенных параллельно. В этом варианте осуществления, множество узлов фильтров глубинного типа могут представлять собой фильтры XOHC от Millipore®.

В конкретном варианте осуществления, стадия осветления может осуществляться с помощью использования центрифугирования с последующим фильтрованием на фильтре глубинного типа XOHC, осуществляемых последовательно (фиг.2-4, стадия 1).

В другом варианте осуществления, образец может осветляться с помощью мембраны для микрофильтрования или ультрафильтрования в режиме тангенциального проточного фильтрования (TFF). Любые способы осветления с помощью TFF, известные в данной области, можно использовать в этом варианте осуществления. TFF обозначает способ мембранного разделения в конфигурации поперечного потока, приводимого в движение с помощью градиента давления, при котором мембрана фракционирует компоненты жидкой смеси в зависимости от размера частиц и/или растворенного вещества и их структуры. При осветлении, выбранный размер пор мембраны позволяет некоторым компонентам проходить через поры вместе с водой, удерживая при этом клетки и остатки клеток над поверхностью мембраны. В одном из вариантов осуществления, осветление с помощью TFF может осуществляться с использованием, например, порога молекулярных масс 0,1 мкм или 750 кД, 5-40 фунт/кв. дюйм (0,31-2,48 кг/кв. см) в датчике и температур примерно от 4°C примерно до 60°C с помощью полисульфоновых мембран.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, стадия осветления может включать обработку образца детергентом. Используемый детергент может представлять собой любой детергент, о котором известно, что он является пригодным для использования в способах очистки белков. В варианте осуществления, детергент может применяться в образце при низком уровне, а образец затем инкубироваться в течение достаточного периода времени для дезактивирования вирусов млекопитающих в оболочке. Уровень детергента, который должен применяться, в одном из вариантов осуществления, может составлять примерно от 0 примерно до 1% (объем/объем). В другом варианте осуществления, уровень детергента, который должен применяться, может составлять примерно от 0,05% примерно до 0,7% (объем/объем). В другом варианте осуществления, уровень детергента, который должен применяться, может составлять примерно 0,5% (объем/объем). В конкретном варианте осуществления, детергент может представлять собой полисорбат 80 (Tween® 80), доступный от Sigma-Aldrich, Inc., или Triton® X-100, доступный от Roche Diagnostics GmbH.

Любое сочетание этих или других способов осветления, которые известны в данной области, можно использовать в качестве стадии осветления по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления, после стадии осветления по настоящему изобретению, образец может подвергаться воздействию стадии фракционно-захватной хроматографии с помощью хроматографии (смотри фиг.1-4, стадия 2). Стадию фракционно-захватной хроматографии конструируют для отделения целевого белка от других примесей, присутствующих в осветленном образце. Часто, стадия фракционно-захватной хроматографии уменьшает содержание белка клеток-хозяев (HCP), ДНК клеток-хозяев и частиц эндогенных вирусов или вирусообразных частиц в образце. Хроматографическая методика, используемая в этом варианте осуществления, может представлять собой любую методику, о которой известно в данной области, что она может использоваться в качестве стадии фракционно-захватной хроматографии. В одном из вариантов осуществления, образец может подвергаться воздействию афинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии в смешанном режиме или хроматографии гидрофобных взаимодействий в качестве стадии фракционно-захватной хроматографии.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве стадии фракционно-захватной хроматографии можно использовать афинную хроматографию. Афинная хроматография использует взаимодействие специфичного связывания между молекулами. Конкретный лиганд химически иммобилизуется или "связывается" с твердой подложкой. Когда образец проходит над смолой, белок в образце, который имеет сродство специфичного связывания с лигандом, становится связанным. После того, как другие компоненты образца отмывают, связанный белок затем отделяется от иммобилизованного лиганда и элюируется, что приводит к его выделению из исходного образца.

В этом варианте осуществления настоящего изобретения, стадия фракционно-захватной хроматографии с помощью афинной хроматографии может включать взаимодействие между антигеном и антителом, ферментом и субстратом или рецептором и лигандом. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, стадия фракционно-захватной хроматографии с помощью афинной хроматографии может включать хроматографию на белке А, хроматографию на белке G, хроматографию на белке А/G или хроматографию на белке L.

В определенном варианте осуществления, афинную хроматографию на белке A можно использовать на стадии фракционно-захватной хроматографии по настоящему изобретению (смотри фиг.2-4, стадия 2). Афинная хроматография на белке А включает использование в качестве белка А бактериального белка, который демонстрирует специфичное связывание с не связывающей антигена частью многих классов иммуноглобулинов. Используемая смола с белком А может представлять собой любую смолу с белком А. В одном из вариантов осуществления, смола с белком А может выбираться из семейства смол MabSelect™, доступных от GE Healthcare Life Sciences. В другом варианте осуществления, смола с белком А может представлять собой смолу ProSep® Ultra Plus, доступную от Millipore Corporation. На этой стадии можно использовать любую колонку, доступную в данной области. В конкретном варианте осуществления, колонка может представлять собой колонку, набитую смолой MabSelect™, доступной от GE Healthcare Life Sciences, или колонку (например, колонку Quickscale), набитую смолой ProSep® Ultra Plus, доступной от Millipore Corporation.

Если в качестве стадии хроматографии используют сродство к белку А, колонка может иметь внутренний диаметр примерно 35 см при длине колонки 20 см. В других вариантах осуществления, длина колонки может составлять примерно от 5 см примерно до 35 см. Еще в одном варианте осуществления, длина колонки может составлять примерно от 10 см примерно до 20 см. В другом варианте осуществления, длина колонки может составлять 5 см или больше. В одном из вариантов осуществления, внутренний диаметр колонки может составлять примерно от 0,5 см примерно до 100 или 200 см. В другом варианте осуществления, внутренний диаметр колонки может составлять примерно от 10 см примерно до 50 см. Еще в одном варианте осуществления, внутренний диаметр колонки может составлять 15 см или больше.

Конкретные способы, используемые для стадии фракционно-захватной хроматографии, включая протекание образца через колонку, промывку и элюирование, зависят от конкретной используемой колонки и смолы и обычно поставляются производителями или являются известными в данной области. Как используется в настоящем документе, термин "обрабатываемый" может описывать процесс протекания или прохождение образца через хроматографическую колонку, смолу, мембрану, фильтр или другой механизм, и будет включать непрерывное протекание через каждый механизм, а также протекание, которое приостанавливается или прекращается между каждыми соседними механизмами.

После стадии фракционно-захватной хроматографии, элюат может подвергаться воздействию стадии сочетанной обработки. Эта сочетанная стадия, в одном из вариантов осуществления, может включать дезактивирование вирусов с последующей обработкой с помощью одного или нескольких фильтров глубинного типа и ионообменных мембран (смотри фиг.1-4, стадия 3). В одном из вариантов осуществления, фильтрование на фильтрах глубинного типа и ионообменных мембранах может конструироваться как последовательность из последовательно соединенных фильтров.

В одном из вариантов осуществления, стадия дезактивирования вирусов может включать дезактивирование вирусов при низких значениях pH. В одном из аспектов, можно применить использование глицинового буфера высокой концентрации при низких значениях pH для элюирования, без дополнительной регулировки pH, в конечном пуле элюата в целевом диапазоне для дезактивирования вирусов при низких значениях pH. Альтернативно, для элюирования можно использовать ацетатный или цитратный буферы, и пул элюата может затем титроваться до соответствующего диапазона pH для дезактивирования вирусов при низких значениях pH. В одном из вариантов осуществления, pH составляет примерно от 2,5 примерно до 4. В другом варианте осуществления, pH составляет примерно от 3 примерно до 4.

В одном из вариантов осуществления, после того, как pH пула элюата понижают, пул инкубируют в течение промежутка времени примерно от 15 примерно до 90 минут. В конкретном варианте осуществления, стадия дезактивирования вирусов при низких значениях рН может осуществляться посредством титрования с помощью 0,5M фосфорной кислоты с получением pH примерно от 3,5, а затем образец может инкубироваться в течение периода времени, находящегося в пределах между примерно 60 минутами и 90 минутами.

После стадии дезактивирования вирусов при низких значениях рН, дезактивированный пул элюата может нейтрализоваться до более высоких pH. В одном из вариантов осуществления, нейтрализованный, более высокий pH может представлять собой pH примерно от 5 примерно до 10. В другом варианте осуществления, нейтрализованный, более высокий pH может представлять собой pH примерно от 8 примерно до 10. В другом варианте осуществления, нейтрализованный, более высокий pH может представлять собой примерно от 6 примерно до 10. В другом варианте осуществления, нейтрализованный, более высокий pH может представлять собой pH примерно от 6 примерно до 8. В другом варианте осуществления, нейтрализованный, более высокий pH может представлять собой pH примерно 8,0.

В одном из вариантов осуществления, нейтрализация pH может осуществляться с использованием 3,0M троламина или другого буфера, известного в данной области. Электропроводность дезактивированного пула элюата может затем регулироваться с помощью очищенной или деионизованной воды. В одном из вариантов осуществления, электропроводность дезактивированного пула элюата может регулироваться в пределах примерно от 0,5 примерно до 50 мС/см. В другом варианте осуществления, электропроводность дезактивированного пула элюата может регулироваться в пределах примерно от 4 примерно до 6 мС/см. В конкретном варианте осуществления, электропроводность дезактивированного пула элюата может регулироваться около 5,0 мС/см.

В альтернативных вариантах осуществления, аспект дезактивирования вирусов стадии сочетанной обработки может осуществляться с использованием других способов, известных в данной области. Например, стадия дезактивирования вирусов может включать, в различных вариантах осуществления, обработку кислотой, детергентом, растворителем, химикалием, агентами для поперечной сшивки нуклеиновых кислот, ультрафиолетовым светом, гамма излучением, теплом или с помощью любого другого способа, о котором известно в данной области, что он пригоден для этой цели.

После дезактивирования вирусов и нейтрализации, дезактивированный пул элюата может обрабатываться с помощью одного или нескольких фильтров глубинного типа, как полностью описано выше, и одной или нескольких ионообменных мембран, гидрофобных мембран или мембран, работающих в смешанном режиме, расположенных в виде последовательности фильтров или последовательно.

Аспект фильтрования на фильтрах глубинного типа на сочетанной стадии может включать один или несколько фильтров глубинного типа. В одном из вариантов осуществления, аспект фильтрования на фильтрах глубинного типа на сочетанной стадии может содержать несколько узлов фильтров глубинного типа. Эти фильтры глубинного типа, в одном из вариантов осуществления, могут представлять собой фильтры X0HC от Millipore®. Специалист в данной области заметит, что выбор типа и количества используемых фильтров будет зависеть от объем образца, который обрабатывают.

Аспект ионного обмена на сочетанной стадии может представлять собой любой ионообменный процесс, известный в данной области. В одном из вариантов осуществления, эта стадия включает капсулу для мембранной хроматографии. В одном из вариантов осуществления можно использовать Chromasorb™ Membrane Adsorber.

В конкретном варианте осуществления, хроматографический аспект стадии включает капсулу Q для мембранной хроматографии. В одном из вариантов осуществления, капсула Q для мембранной хроматографии может включать капсулу для мембранной хроматографии Mustang® Q (доступную от Pall Corporation) или Sartobind® Q (доступную от Sartorius Stedim Biotech GmbH). В одном из вариантов осуществления, капсула Q для мембранной хроматографии работает в проточном режиме.

После каждой из стадий с использованием фильтров глубинного типа и ионообменных мембран, в одном из вариантов осуществления, может осуществляться стадия капсульного фильтрования. Например, стадия капсульного фильтрования может включать капсульный фильтр Sartopore® 2, доступный от Sartorius Stedim Biotech GmbH.

После стадии сочетанной обработки, образец может подвергаться воздействию стадии промежуточной/конечной очистки (фиг.1-4, стадия 4). Эта стадия, в одном из вариантов осуществления, может включать дополнительную стадию хроматографии. Любая форма хроматографии, известная в данной области, может быть приемлемой. Например, в одном из вариантов осуществления, стадии промежуточной/конечной очистки может включать стадию хроматографии, работающей в смешанном режиме (известную также как мультирежимная) (фиг.3, стадия 4). Стадия хроматографии в смешанном режиме, используемая в настоящем изобретении, может использовать любой способ хроматографии в смешанном режиме, известный в данной области. Хроматография в смешанном режиме включает использование твердофазных хроматографических набивок в формате смолы, монолита или мембраны, которые используют множество химических механизмов для адсорбции белков или других растворенных веществ. Примеры, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают, но, не ограничиваясь этим, хроматографические набивки, которые используют сочетания двух или более из следующих механизмов: анионный обмен, катионный обмен, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, тиофильное взаимодействие, водородную связь, образование пи-пи связей и сродство к металлам. В конкретных вариантах осуществления, способ хроматографии в смешанном режиме объединяет: (1) методики анионного обмена и гидрофобных взаимодействий; (2) методики катионного обмена и гидрофобных взаимодействий и/или (3) методики электростатических и гидрофобных взаимодействий.

В одном из вариантов осуществления, стадия хроматографии в смешанном режиме может осуществляться с использованием такой колонки и смолы, как колонка и смола Capto® adhere, доступные от GE Healthcare Life Sciences. Колонка Capto® adhere представляет собой мультирежимную среду для промежуточной очистки и доочистки моноклональных антител после фракционно-захватной хроматографии. В конкретном варианте осуществления, стадия хроматографии в смешанном режиме может осуществляться в проточном режиме. В других вариантах осуществления, стадия хроматографии в смешанном режиме может осуществляться в режиме связывания-элюирования.

В других вариантах осуществления, стадию хроматографии в смешанном режиме можно осуществлять с использованием одной или нескольких из следующих систем: Capto® MMC (доступна от GE Healthcare Life Sciences), HEA HyperCel™ (доступна от Pall Corporation), PPA HyperCel™ (доступна от Pall Corporation), MBI HyperCel™ (доступна от Pall Corporation), MEP HyperCel™ (доступна от Pall Corporation), Blue Trisacryl M (доступна от Pall Corporation), CFT™ Ceramic Fluoroapatite (доступна от Bio-Rad Laboratories, Inc.), CHT™ Ceramic Hydroxyapatite (доступна от Bio-Rad Laboratories, Inc.) и/или ABx (доступна от J.T. Baker). Конкретные способы, используемые для стадии хроматографии в смешанном режиме, могут зависеть от конкретных используемых колонок и смол, и, как правило, они поставляются производителем или известны в данной области.

В другом варианте осуществления, стадия промежуточной/конечной очистки может включать катионообменную хроматографию (фиг.4, стадия 4). Стадия катиоонобменной хроматографии, используемая в настоящем изобретении может использовать любой известный в данной области процесс катионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления, стадия катионообменной хроматографии может осуществляться с использованием колонки, набитой смолой Poros XS (Life Technologies). В конкретном варианте осуществления, стадия катиоонобменной хроматографии может работать в режиме связывания-элюирования.

Каждая колонка, используемая в способе, может быть достаточно большой, чтобы обеспечить максимальную производственную емкость и экономику для данного масштаба. Например, в определенных вариантах осуществления, каждая колонка может определять внутренний объем примерно от 1 л примерно до 1500 л, примерно от 1 л примерно до 1000 л, примерно от 1 л примерно до 500 л или примерно от 1 л примерно до 250 л. В некоторых вариантах осуществления, колонка, работающая в смешанном режиме, или катионообменная колонка может иметь внутренний диаметр примерно 1 см и длину колонки примерно от 7 см. В другом варианте осуществления, внутренний диаметр колонки, работающей в смешанном режиме, или катиоонобменной колонки может составлять примерно от 0,1 см примерно до 100 см, от 0,1 до 50 см, от 0,1 см примерно до 10 см, примерно от 0,5 см примерно до 5 см, примерно от 0,5 см примерно до 1,5 см или может составлять примерно 1 см. В одном из вариантов осуществления, длина колонки для колонки, работающей в смешанном режиме, или катиоонобменной колонки, может составлять примерно от 1 примерно до 50 см, примерно от 1 примерно до 20 см, примерно от 5 примерно до 10 см или может составлять примерно 7 см.

В некоторых вариантах осуществления, системы по настоящему изобретению могут манипулировать с высокими концентрациями фильтрования, например, с концентрациями примерно 5 г/л, примерно 6 г/л, примерно 7 г/л, примерно 8 г/л, примерно 9 г/л, примерно 10 г/л, примерно 12,5 г/л, примерно 15 г/л, примерно 20 г/л, примерно 25 г/л, с концентрациями примерно от 1 г/л примерно до 5 г/л, с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 10 г/л, с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 12,5 г/л, с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 15 г/л, с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 20 г/л, с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 55 г/л или с концентрациями примерно от 5 г/л примерно до 100 г/л. Например, некоторые системы могут манипулировать с высокими концентрациями антител, в то же время, обрабатывая примерно от 200 л примерно до 2000 л культуры в час, примерно от 400 л культуры примерно до 2000 л в час, примерно от 600 л примерно до 1500 л культуры в час, примерно от 800 л примерно до 1200 л культур в час или больше примерно, чем 1500 л культуры в час.

В одном из вариантов осуществления, стадия промежуточной/конечной очистки может осуществляться с помощью одного или нескольких мембранных адсорберов или монолитов. Мембранные адсорберы представляют собой тонкие синтетические микропористые или макропористые мембраны, которые дериватизуют с помощью функциональных групп, сходных с группами на эквивалентных смолах. На своих поверхностях, мембранные адсорберы несут функциональные группы, лиганды, переплетенные волокна или реагенты, способные взаимодействовать, по меньшей мере, с одним веществом в контакте с фазой текучей среды, протекающей сквозь мембрану под действием силы тяжести. Мембраны, как правило, пакетируют толщиной от 5 до 15 слоев в сравнительно небольшом картридже для генерирования гораздо меньшей площади под ними, чем для колонны со сходной производительностью. Мембранный адсорбер, используемый в настоящем документе, может представлять собой мембранный ионообменник, мембрану с лигандами, работающую в смешанном режиме, и/или гидрофобную мембрану.

В одном из вариантов осуществления, используемый мембранный адсорбер может представлять собой ChromaSorb™ Membrane Adsorber, доступный от Millipore Corporation. ChromaSorb™ Membrane Adsorber представляет собой анионообменник на основе мембраны, сконструированный для удаления микроскопических примесей, включая HCP, ДНК, эндотоксины и вирусы, для очистки MAb и белков. Другие мембранные адсорберы, которые могут использоваться, включают Sartobind® Q (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® S (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® C (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® D (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® Phenyl (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® IDA (доступный от Sartorium BBI Systems GmbH), Pall Mustang® (доступный от Pall Corporation) или любой другой мембранный адсорбер, известный в данной области.

Как указано выше, монолиты можно использовать на стадии промежуточной/конечной очистки по настоящему изобретению. Монолиты представляют собой сплошные пористые структуры непрерывных и взаимосвязанных каналов конкретного контролируемого размера. Образцы транспортируются через монолиты посредством конвекции, что приводит к быстрому массопереносу между подвижной и стационарной фазой. Как следствие, хроматографические характеристики не зависят от потока. Кроме того, монолиты демонстрируют низкие перепады давления, даже при высоких скоростях потока, значительно сокращая время очистки. В одном из вариантов осуществления, монолит может представлять собой ионообменный монолит или работающий в смешанном режиме монолит на основе лигандов. В одном из аспектов, используемые монолиты могут включать монолиты CIM® (доступные от BIA separations), монолиты UNO® (доступные от Bio-Rad Laboratories, Inc.) или монолиты ProSwift® или IonSwift™ (доступные от Dionex Corporation).

Еще в одном варианте осуществления, стадия промежуточной/конечной очистки может осуществляться с помощью дополнительной стадии фильтрования на фильтрах глубинного типа вместо использования мембранных адсорберов, монолитов или колонки, работающей в смешанном режиме. В этом варианте осуществления, фильтрование на фильтрах глубинного типа, используемое для промежуточной/конечной очистки, может представлять собой применение фильтра глубинного типа CUNO Zeta Plus VR®. В этом варианте осуществления, фильтр глубинного типа может служить для цели промежуточной/конечной очистки, а также для очистки от вирусов.

В конкретном варианте осуществления, стадия промежуточной/конечной очистки может представлять собой стадию хроматографии гидрофобных взаимодействий (фиг.2, стадия 4). В одном из вариантов осуществления, эта стадия может использовать смолу с гидрофобными взаимодействиями Phenyl Sepharose® High Performance и хроматографическую колонку Chromaflow® Acrylic, каждая из них доступна от GE Healthcare. Смолы Phenyl Sepharose® HP основаны на жесткой агарозе в виде шариков, имеющей высокую степень поперечной сшивки, со средним диаметром частиц 34 мкм. Функциональные группы присоединяются к матрице посредством незаряженных химически стабильных связей простых эфиров, приводящих к получению гидрофобной среды с минимизированными ионными свойствами. В этом варианте осуществления, образец может фильтроваться через капсульный фильтр Sartopore® перед введением в колонку.

Если на стадии промежуточной/конечной очистки используют хроматографию гидрофобных взаимодействий, внутренний диаметр колонки может находиться в пределах примерно между 10 и 100 см. В конкретном варианте осуществления, внутренний диаметр может составлять примерно 60 см. Высота колонки, в одном из вариантов осуществления, может находиться в пределах примерно между 10 и 20 см. В одном из вариантов осуществления, высота колонки составляет примерно 15 см.

После хроматографической стадии промежуточной/конечной очистки, пул элюата может подвергаться воздействию стадии нанофильтрования (смотри фиг.1-4, стадия 5). В одном из вариантов осуществления, стадию нанофильтрования осуществляют с помощью одного или нескольких нанофильтров или фильтров для вирусов. Фильтры могут представлять собой любые фильтры, известные в данной области как пригодные для этой цели, и могут включать, например, фильтры от Millipore Pellicon® или Millipak® или фильтры от Sartorius Vivaspin® или Sartopore®. В конкретном варианте осуществления, стадия нанофильтрования может осуществляться с помощью последовательности фильтров, состоящей из предварительного фильтра и нанофильтра или фильтров для вирусов. В качестве примера, последовательность фильтров может состоять из двух капсульных фильтров Pall, 0,15 м², -0,1-мкм Fluorodyne® II PVDF, доступных от Pall Corporation, в качестве защитных фильтров для двух 20-дюймовых фильтров Sartorius Virosart® CPV, доступных от Sartorius Stedim Biotech GmbH, параллельно. В другом примере, последовательность фильтров может состоять из одного (0,17 м²) 0,1-мкм предварительного фильтра Maxicap® и двух 20-дюймовых фильтров Virosart® CPV, оба они от Sartorius Stedim Biotech GmbH. Специалист в данной области поймет, что выбор типов и количеств фильтров будет зависеть от объема образца, который обрабатывают.

Как показано на фиг.1-4, стадия 6, после стадии нанофильтрования, может необязательно следовать ультрафильтрование/диафильтрование (UF/DF), для достижения целевой концентрации лекарственного вещества и состояния буфера перед бутылированием. В одном из вариантов осуществления, это можно осуществить с использованием фильтров. Фильтры могут представлять собой любые фильтры, о которых известно в данной области, что они пригодны для этой цели, и могут включать, например, фильтры от Millipore Pellicon®, Millipak® или Sartopore®. В конкретном варианте осуществления, UF/DF можно осуществлять с помощью трех UF модулей от Millipore®, Pellicon® 2, Biomax с порогом молекулярных масс 30 кД и с площадью поверхности 2,5 м² каждый, с последующим необязательным фильтрованием через стерильный капсульный фильтр Sartopore® 2, 800. Стадии нанофильтрования и UF/DF могут объединяться или заменяться любым способом (способами), о котором известно в данной области, что он может обеспечить очищенный белок, который является приемлемым для бутылирования (фиг.1-4, стадия 7). Перед бутылированием, образцы могут, в одном из вариантов осуществления, прокачиваться через 0,22-мкм фильтр Millipak® 200 в предварительно стерилизованные контейнеры из не содержащего пирогенов полиэтилентерефталатгликоля (PETG).

Следующие далее примеры описывают различные варианты осуществления настоящего изобретения. Другие варианты осуществления в рамках формулы изобретения в настоящем описании будут ясны специалистам в данной области при рассмотрении описания или практики настоящего изобретения, как описано в настоящем документе. Предполагается, что описание, вместе с примерами, должно считаться только иллюстративным, при этом рамки и дух настоящего изобретения указываются с помощью формулы изобретения, которая следует после примеров.

Пример 1

Вообще говоря, образец белка (MAb A) выделяют из супернатанта культуры клеток с помощью ряда стадий извлечения, фракционно-захватной хроматографии и очистки. Стадии первичного извлечения включают центрифугирование и фильтрование с помощью фильтров глубинного типа. Стадии фракционно-захватной хроматографии включают хроматографию на белке А, с последующим дезактивированием вирусов, фильтрованием с помощью фильтров глубинного типа и хроматографией на Q мембране Mustang®. Стадии тонкой очистки включают хроматографию гидрофобных взаимодействий, нанофильтрование и ультрафильтрование/диафильтрование. Затем конечный продукт фильтруют, бутылируют и замораживают. Операции извлечения и фракционно-захватной хроматографии осуществляют при температуре окружающей среды. Стадии тонкой очистки осуществляют при температуре 17±2°C, если не указано иного. Три загрузки сбора MAb A из 3000-л биореактора очищают с помощью этого способа.

Первичное извлечение

Первичное извлечение посредством центрифугирования и фильтрования с помощью фильтров глубинного типа используют для удаления клеток и остатков клеток из промышленного танка биореактора. Для этой стадии способа используют центрифугу Alfa-Laval BTUX 510. 3000-л промышленный биореактор служит в качестве танка с исходными материалами для непрерывной проточной пакетной дисковой центрифуги. Центрифуга работает примерно при 5200 об/мин при скорости введения 28 л/минут. Центрифугированный сбор впоследствии проходит через последовательность фильтров, которая состоит из десяти узлов Pod, 1,1 м², со средами X0HC от Millipore®. После того, как содержимое биореактора фильтруют на фильтрах глубинного типа, последовательность фильтров последовательно промывают 200 кг 25 мМ Tris буфера, 100 мМ хлорида натрия, pH 7,2, а затем продувают воздух для удаления оставшегося фильтрата. Центрифугирование и фильтрование сбора осуществляют как одну операцию узла. Фильтрат собирают в 3000-л танке для сбора, охлаждают быстро до 4-12°C и выдерживают в течение до 5 дней.

В одном из опытов, центрифугу не используют, и ряд фильтров Pod используют вместо нее для обработки материалов. В целом пятнадцать фильтров D0HC и десять фильтров X0HC используют для осветления примерно 3000 л материалов сбора. Опять же, последовательность фильтров последовательно промывают 200 кг 25 мМ Tris буфера, 100 мМ хлорида натрия, pH 7,2, а затем продувают воздух для удаления оставшегося фильтрата. Выход осветления при использовании одного только фильтра глубинного типа сходен с выходом с использованием, как центрифуги, так и фильтра глубинного типа. В целом, средний выход стадии сбора составляет 91% при средней концентрации сбора 1,85 г/л. Результаты операций центрифугирования и фильтрования сбора приводятся в таблице 1.

Таблица 1 Сводка операции первичного извлечения № опыта 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Конечная концентрация в реакторе (г/л) 2,07 2,07 2,02 2,05 0,03 Конечный объем в реакторе (кг) 2903 2923 2937 2921 17

Конечная концентрация сбора (г/л) 1,87 1,79 1,88 1,85 0,05 Конечный объем сбора (кг) 2931 3013 2895 2946 60 Выход стадии сбора (%) 91 89 92 91 2

Фракционно-захватная хроматография на белке А

Хроматографию на белке А используют для фракционно-захватной хроматографии белка из осветленного сбора и для уменьшения количества примесей, технологических.

Для этой стадии способа используют смолу ProSep® Ultra Plus (Millipore) и хроматографическую колонку Quickscale (Millipore). Колонка для фракционно-захватной хроматографии на белке А имеет диаметр 35 см при целевой высоте 20 см (объем набивки 19,2 л). Предел нагрузки для MAb A в колонке составляет 42 грамма образца на литр смолы с белком А. Осуществляют по семь циклов для каждой загрузки. Стадию осуществляют при температуре окружающей среды и используют 3-стадийное линейное изменение скорости введения, при 720 см/час до 36 г/л, при 480 см/час до 39 г/л и при 240 см/час до 42 г/л. Колонку уравновешивают с помощью 25 мМ Tris буфера, 100 мМ хлорида натрия, pH 7,2, и вводят осветленный сбор.

После нагрузки, колонку промывают до фонового поглощения (A₂₈₀) с помощью уравновешивающего буфера. Вторую промывку из 20 мМ цитрата натрия/лимонной кислоты, 0,5 M хлорида натрия, pH 6,0, используют для уменьшения количества технологических примесей. Третья промывка из уравновешивающего буфера приводит оптическую плотность (OD), pH и электропроводность назад к фоновым значениям. Продукт элюируют из колонки с помощью 0,1M уксусной кислоты, pH 3,5. Элюат собирают от OD 1 в голове до OD 1 на хвосте при 280 нм, при длине пути 1 см. Для каждой загрузки культуры клеток, колонку циклируют еще шесть раз для обработки приблизительно 5500 г сырого белка, который ожидается. Между каждыми последующими циклами, колонку регенерируют с помощью 0,2 M уксусной кислоты. Пул элюата выдерживают до 5 дней, быстро охлаждают до 4-12°C перед осуществлением стадии дезактивирования вирусов при низких значениях рН.

Рабочие данные и выходы для стадии фракционно-захватной хроматографии на белке А показаны в таблице 2. Средние нагрузки колонки составляют приблизительно 42 г белка на л смолы за один цикл за исключением седьмого цикла для каждой загрузки, который нагружают лишь частично, используя оставшийся объем нагрузки. Средний выход для стадии фракционно-захватной хроматографии на белке А равен 90%. Операции колонки для фракционно-захватной хроматографии согласуются друг с другом относительно профилей хроматографического элюирования. Типичные профили иллюстрируются на фиг.5 и 6.

Таблица 2 Сводка для фракционно-захватной хроматографии белка с помощью A ProSep® Ultra Plus № опыта 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Общий объем нагрузки (кг) 2931 3013 2895 2946 60 Концентрация нагрузки для колонки (г/л) 1,87 1,79 1,88 1,85 0,05 Объем пула элюата (кг) 245 247 229 240 10

Концентрация пула элюата (г/л) 20,24 19,71 21,09 20,35 0,70 Выход стадии (%) 91 91 89 90 1

Дезактивирование вирусов, фильтрование с помощью фильтра глубинного типа и Q мембранной хроматографии

Пул элюата на белке А подвергают воздействию низких pH для дезактивирования вредных вирусов, которые могут присутствовать. Стадию осуществляют при температуре окружающей среды. Стадию дезактивирования при низких значениях рН осуществляют посредством доведения pH пула элюата до 3,5±0,1 (измерено при 25°C) с помощью 0,5M фосфорной кислоты. После периода выдерживания в 60-90 минут, дезактивированный материал нейтрализуют до pH 8,0±0,1 (измерено при 25°C) с использованием 3,0M троламина и разбавляют очищенной водой до электропроводности 5,0±0,5 мС/см. После нейтрализации, материал, дезактивированный с помощью pH, проходит через последовательность фильтров в танк для хранения. Последовательность фильтров состоит из двух компонентов. Первый состоит из шести узлов Pod, 1,1 м², со средами XOHC от Millipore® и второй представляет собой 780-мл Pall Mustang® Q Chromatography Capsule. Средняя нагрузка на капсулу Mustang® Q составляет 6,3 г белка на мл капсулы Q. После фильтрования на фильтре глубинного типа, и опять, после обработки с помощью мембраны Q, образец протекает через 20-дюймовый капсульный фильтр Sartopore® 2, (0,45+0,2 мкм). После фильтрования содержимого танка для исходных материалов, последовательность фильтров последовательно промывают приблизительно 100 кг 25 мМ троламина и 40 мМ хлорида натрия. Элюент выдерживают при ≤22°C в течение до 1 дня. В других случаях, элюент быстро охлаждают до ≤8°C и выдерживают до 3 дней перед осуществлением стадии хроматографии на Phenyl Sepharose® HP.

Сводка результатов операций дезактивирования при низких значениях рН и фильтрования приводятся в таблице 3. Средняя нагрузка на капсулу Mustang® Q составляет 6,3 г белка на мл капсулы Q (эквивалент 409 мл белка на мл капсулы Q). Три опыта имеют средний выход стадии 96%.

Таблица 3 Сводка для операций дезактивирования вирусов, фильтрования на фильтрах глубинного типа и Q мембранной хроматографии № опыта 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Исходный объем (кг) 245 247 229 240 10 pH, начальный (дезактивирование вирусов) 4,0 4,1 4,1 4,1 0,1 pH, конечный (дезактивирование вирусов) 3,5 3,6 3,6 3,6 0,1 Добавление 0,5M фосфорной кислоты (кг) 6,7 7,1 7,0 6,9 0,2 pH, начальный 3,6 3,6 3,6 3,6 0,0 pH, конечный 7,9 7,9 7,9 7,9 0,0 Добавление 3,0M троламина (кг) 16,8 16,3 14,8 16,0 1,0 Электропроводность, начальная (мС/см) 6,4 6,5 6,7 6,5 0,1 Электропроводность, конечная (мС/см) 5,4 5,4 5,4 5,4 0,0 Добавление USP-PW (кг) 54,7 59,7 54,0 56,1 3,1

Нагрузка Mustang® Q
(г образца/мл Q капсулы) 6,4 6,2 6,2 6,3 0,1 Объем промывки последовательности фильтров (кг) 54,8 109,4 108,2 90,8 31,2 Конечный пул (кг) 378,0 439,5 413 410 31 Конечная концентрация (г/л) 11,93 10,87 10,85 11,22 0,62 Выход стадии (%) 91 100,4 97,1 96 5

Хроматография гидрофобных взаимодействий

Хроматографию на Phenyl Sepharose® HP используют для уменьшения количества технологических примесей и агрегированного антитела, которые могут присутствовать в элюенте мембран Q. Перед этой стадий доочистки, эффлюент от мембраны Q разбавляют 2,2M сульфатом аммония и 40 мМ фосфатом натрия, pH 7,0, чтобы он содержал целевую концентрацию 1,0M сульфата аммония и 18 мМ фосфата натрия, а затем фильтруют через 10-дюймовый капсульный фильтр Sartopore® 2 (0,45+0,2 мкм) перед введением в колонку.

Для этой стадии способа используют смолу с гидрофобным взаимодействием Phenyl Sepharose® HP (GE Healthcare) и хроматографическую колонку Chromaflow® Acrylic (GE Healthcare). Фенильная колонка имеет диаметр 60 см и целевую высоту 15±1 см (объем слоя 42,4 л). Предел нагрузки для колонки составляет 40 грамм образца на литр смолы Phenyl Sepharose® HP. Стадию осуществляют при 17±2°C и при скорости потока 75 см/час. Нагруженный материал нагревают, когда требуется, до 17±2°C перед началом первого цикла. Колонку предварительно промывают водой и уравновешивают с помощью 1,0M сульфата аммония и 18 мМ фосфата натрия, pH 7,0. После уравновешивания колонку нагружают с помощью разбавленной фенильной нагрузки. После введения нагрузки колонку промывают до фонового поглощения (A₂₈₀) с помощью 1,1M сульфата аммония и 20 мМ фосфата натрия, pH 7,0, а затем с помощью 0,95M сульфата аммония и 17 мМ фосфата натрия, pH 7,0, соответственно. Продукт элюируют из колонки при пониженной скорости потока 37,5 см/час с помощью 0,55M сульфата аммония и 10 мМ фосфата натрия, pH 7,0, в переносной танк. Элюат собирают от OD 5 в голове до OD 1 на хвосте при 280 нм, при длине пути 1 см. Для каждой загрузки культуры клеток, колонку циклируют два дополнительных раза для обработки приблизительно 4700 г образца белка, который ожидается. Между каждыми последовательными циклами, колонку регенерируют с помощью воды для инъекций (WFI). Элюат выдерживают при ≤22°C в течение 1 дня. Необязательно, элюат может быстро охлаждаться до ≤8°C и выдерживаться до 10 дней перед осуществлением стадии нанофильтрования. Операции фенильной колонки согласуются друг с другом по отношению к профилям хроматографического элюирования. Примеры иллюстрируются на фиг.7 и 8.

Рабочие данные и выходы для хроматографии на Phenyl Sepharose® HP подробно показаны в таблице 4. Средние нагрузки колонки составляет приблизительно 36 г белка на л смолы на один цикл. Средний выход для стадии с использованием Phenyl Sepharose® составляет 89%.

Таблица 4 Сводка для хроматографии на Phenyl Sepharose® HP № опыта 1 2 3 среднее значение Среднеквадратичное отклонение Величина нагрузки (г) 4509,5 4777,4 4481,1 4589,3 163,5 Нагрузка колонки (г образца/л смолы) 35 38 35 36 1 Пул элюата (л) 396,7 363,3 332,9 364,3 31,9 Концентрация пула элюата (г/л) 11,12 11,45 10,52 11,03 0,47 Выход стадии (%) 98 89 81 89 9

Нанофильтрование

Нанофильтрование используют для удаления вредных вирусов диаметром ≥20 нм, которые могут потенциально присутствовать в материале, очищенном на Phenyl Sepharose® HP. Последовательность фильтров для нанофильтрования состоит из двух 0,1-мкм капсульных фильтров Pall, 0,15 м², Fluorodyne® II PVDF (в целом номинальная площадь фильтра 0,3 м²) в качестве защитных фильтров для двух 20-дюймовых фильтров Sartorius Virosart® CPV (в целом номинальная площадь фильтра 2,8 м²) или двух 20-дюймовых фильтров Pall DV20, параллельно. Эту стадию осуществляют при 10-14°C. Для отслеживания фильтрования устанавливают датчики давления перед предварительным фильтром и перед каждым корпусом нанофильтра. Во время фильтрования, давление поддерживают при ≤32 фунт/кв. дюйм (1,98 кг/кв. см) в датчике. После фильтрования всего фенильного элюата, последовательность фильтров промывают с помощью 25 кг 15 мМ гистидина, pH 6,0, для извлечения любого образца белка, который может удерживаться в корпусах фильтров. Для каждой загрузки культуры клеток, осуществляют одно нанофильтрование. Фильтрат выдерживают при ≤22°C в течение до 1 дня или быстро охлаждают до ≤8°C и выдерживают до 10 дней перед осуществлением стадии приготовления.

Средний выход для операции нанофильтрования составляет 99%. Средняя нагрузка фильтра для фильтров Sartorius составляет 130 л/м²-на один опыт (эквивалент 1413 г/м²-на один опыт). Нагрузка для DV20 составляет 61 л/м²-на один опыт (эквивалент 693 г/м²-на один опыт). Операции фильтрования согласуются друг с другом по отношению к объемам фильтрата, концентрациям фильтрата и выходам. Операции и выходы подробно описаны в таблице 5.

Таблица 5 Сводка для операции нанофильтрования № опыта 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Номинальная площадь фильтров для вирусов (м²) 2,8 6,0 2,8 n/a n/a Нагрузка фильтра для вирусов (г образца/м² площади фильтра) 1575 693 1251 1413^a 230^a Объем нагрузки (л) 396,7 363,3 332,9 364,3 31,9 Нагрузка фильтра для вирусов (л образца/м² площади фильтра) 142 61 119 130^a 16^a Объем промывки (кг) 25 25 25 25 0 Объем фильтрата (л) 407,2 381,6 354,3 381,0 26,5 Концентрация фильтрата (г/л) 10,28 10,73 10,31 10,4 0,3

Выход стадии (%) 95 98 104 99 5 ^aЗначения вычисляют с использованием данных, относящихся к фильтрам от Sartorius, только в опытах 1 и 3.

Приготовление (ультрафильтрование и диафильтрование)

Каждый лот вирусного фильтрата концентрируют и приготавливают с помощью ультрафильтрования и диафильтрования. Три UF модуля Pellicon® 2 Biomax от Millipore с порогом молекулярных масс 30 кД и площадью поверхности 2,5 м², каждый (в целом номинальная площадь фильтра 7,5 м²), используют для работы при приготовлении первой порции. Стадию осуществляют при 10-14°C. Вирусный фильтрат сначала концентрируют до целевого значения 70 г/л с помощью ультрафильтрования. Затем осуществляют непрерывное диафильтрование с помощью минимум 8 объемов 19 мМ гистидина, pH 5,6. После диафильтрования, лекарственное вещество дополнительно концентрируют до целевого значения 195 г/л. Затем систему ультрафильтрования осушают от продукта и промывают с помощью приблизительно 8 кг 19 мМ гистидина, pH 5,6, для извлечения продукта, содержащегося в системе. Концентрат и промывку объединяют с получением диафильтрованного образца с целевой концентрацией 130-150 г/л. Затем приготовленный концентрат фильтруют через один стерильный капсульный фильтр Sartopore® 2, 800 в танк для хранения. Фильтрат выдерживают в течение до 7 дней при ≤22°C перед осуществлением стадии конечного бутылирования.

Средний выход для операции приготовления составляет 99%. Операции приготовления согласуются друг с другом по отношению к конечным объемам ретентата, его концентрациям и выходам (смотри таблицу 6).

Таблица 6 Сводка для операции приготовления № опыта 1 2 3 среднее значение Среднеквадратичное отклонение Начальное количество (г) 4186 4095 3653 3978 285 Объем ретентата (л) 30,9 26,1 24,0 27,0 3,5 Концентрация ретентата (г/л) 140,1 149,9 149,7 146,6 5,6 Количество ретентата (г) 4326 3911 3587 3941 370 Выход стадии (%) 103 96 98 99 4

Фильтрование, бутылирование и замораживание

Операции бутылирования осуществляют в ламинарном боксе при 2-8°C. Образец прокачивают через 0,22-мкм фильтр Millipak® 200, в предварительно стерилизованные контейнеры из не содержащего пирогенов полиэтилентерефталатгликоля. Заполняют приблизительно 1,6 л на 2 л бутыль. В пределах трех часов после окончания операции бутылирования, заполненные бутыли с этикетками замораживают при -80°C.

Средний выход для конечной операции бутылирования составляет 99%. Операции бутылирования согласуются друг с другом по отношению к концентрациям белка, количествам белка и конечным выходам (смотри таблицу 7).

Таблица 7 Сводка для операций стерильного фильтрования, бутылирования и замораживания № опыта 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Исходное количество (г) 4287 3932 3564 3928 362 Объемная концентрация продукта (г/л) 138 150 148 145 6 Количество объемного лекарственного средства (г) 4234 3866 3517 3872 359 Выход стадии (%) 99 98 99 99 1

Сводка для значений выхода

Выходы для каждой стадии способа приведены в Таблице 8. Количество на выходе из реактора и количество бутылированного объемного лекарственного вещества используют для вычисления общего выхода. Средний вычисленный общий выход составляет 60%. При корректировке на отбор образца в самом способе, средний вычисленный общий выход составляет 68%.

Таблица 8 Сводка для выходов очистки MAb A Стадии 1 2 3 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Первичный сбор (%) 91 89 92 91 2 фракционно-захватная хроматография с помощью ProSep® Ultra Plus (%) 91 91 89 90 1

Дезактивирование вирусов/Pod/ мембрана Q (%) 91 100 97 96 5 Хроматография на Phenyl Sepharose® HP (%) 98 89 81 89 9 Фильтрование вирусов (%) 95 98 104 99 5 UF/DF (%) 103 96 98 99 4 Бутылирование (%) 99 98 99 99 1 Общий выход способа (скорректированный на отбор образцов) (%) 72 67 65 68 3

Качество продукта

Конечное объемное лекарственное вещество исследуют относительно полного набора атрибутов качества. В целом, три загрузки конечного лекарственного вещества согласуются друг с другом и со спецификациями относительно всех исследуемых атрибутов (смотри таблицу 9).

Таблица 9 Чистота продукта в конечном лекарственном веществе для MAb A Анализ Опыт 1 Опыт 2 Опыт 3 % Мономера 99 99 99 Белок клеток-хозяев (нг/мг) <0,21 <0,21 0,34 Белок A (нг/мг) 0,05 0,05 0,06 ДНК (рг/мг) <1 <1 <1

Пример 2

В этом примере, осуществляют способ очистки белка, сходный с тем, который описан в примере 1 для очистки MAb B. Различия между этими двумя способами описываются в настоящем документе. Если один из аспектов способа не описывается подробно, он является таким, как описано в примере 1.

Первичное извлечение

Центрифугирование и фильтрование на фильтрах глубинного типа служат в качестве стадий первичного извлечения. Способ центрифугирования является таким же, как описано для примера 1. Затем центрифугированный сбор пропускают через последовательность фильтров, которая состоит из десяти узлов Pod, 1,1 м², со средами X0HC от Millipore®. Затем образец фильтруют через три 30-дюймовых фильтра Sartopore® 2, 0,45/0,2 мкм, последовательно. После фильтрования образца, его промывают с помощью 200 кг 25 мМ Tris буфера, 100 мМ хлорида натрия, pH 7,2, затем продувают воздух для удаления оставшегося фильтрата.

Центрифугирование и фильтрование сбора осуществляют как операцию одного узла. Фильтрат собирают в 3000-л танке для сбора, быстро охлаждают до 4-12°C, и выдерживают до 5 дней.

Фракционно-захватная хроматография на белке А

Стадия фракционно-захватной хроматографии на белке А примера 2 является по существу сходной с тем, что описано в примере 1. Предел нагрузки для колонки составляет 43 грамм MAb B на литр смолы с белком А. Восемь - девять циклов осуществляют для каждой загрузки. Стадию осуществляют при температуре окружающей среды, и используют 2-стадийное введение с линейным повышением скорости, 600 см/час до 30 г/л и 400 см/час до 43 г/л. 0,15M фосфорную кислоту (pH 1,5) используют для регенерации после каждого цикла. 6 M мочевину используют для очистки, каждые пять циклов и в конце способа. 50 мМ ацетат Na, pH 5, 2% бензиловый спирт используют для санитарной обработки и хранения.

Дезактивирование вирусов, фильтрование на фильтрах глубинного типа и хроматография на мембране Q

Следующая стадия способа представляет собой сочетанную стадию, которая включает дезактивирование вирусов, фильтрование на фильтрах глубинного типа и хроматографию. На этой стадии, дезактивирование при низких значениях рН осуществляют способом, приведенном в примере 1. После дезактивирования, образец протекает через Pod, 8,8 м², с X0HC, затем через два 780-мл мембранных адсорбера Mustang® Q, которые устанавливают параллельно. Скорость потока через Q мембранный адсорбер составляет 10 объемов колонки/мин. После фильтрования с помощью фильтра глубинного типа и опять после обработки на мембране Q, образец протекает через 30-дюймовый капсульный фильтр Sartopore® 2 (0,45+0,2 мкм).

Хроматография гидрофобных взаимодействий

Смолу с гидрофобными взаимодействиями Phenyl Sepharose® HP (GE Healthcare) и хроматографическую колонку Chromaflow® Acrylic (GE Healthcare) используют на этой стадии способа. Фенильная колонка имеет диаметр 80 см с целевой высотой 15±1 см. Перед этой стадией доочистки, эффлюент от мембраны Q разбавляют с помощью 2,2M сульфата аммония и 40 мМ фосфата натрия, pH 7,0, с получением целевой концентрации 1,1M сульфата аммония и 11 мМ фосфата натрия, а затем фильтруют через капсульный фильтр Sartopore® 2 (0,45+0,2 мкм) перед введением в колонку. Колонку предварительно промывают водой и уравновешивают с помощью 1,1M сульфата аммония в 20 мМ растворе фосфата натрия, pH 7,0. После уравновешения, в колонку вводят разбавленную фенильную нагрузку при скорости потока 75 см/час. После введения, колонку промывают до фонового поглощения (A280) с помощью 1,4M сульфата аммония и 25 мМ фосфата натрия, pH 7,0. Продукт элюируют из колонки при пониженной скорости потока 37,5 см/час с помощью 0,625M сульфата аммония и 11 мМ фосфата натрия, pH 7,0. Элюат собирают от OD 1 в голове до OD 1 в хвосте при 280 нм при длине пути 1 см. Образец пропускают через колонку в два цикла. Предел нагрузки для колонки составляет 64 грамм образца на литр смолы Phenyl Sepharose® HP.

Нанофильтрование

Последовательность фильтров для нанофильтрования состоит из 0,1-мкм фильтра Maxicap® от Sartorius в качестве предварительного фильтра для двух 20-дюймовых фильтров Virosart® CPV, Sartorius, (общая номинальная площадь фильтра 2,8 м²) параллельно. Во время фильтрования давление поддерживают при ≤34 фунт/кв. дюйм (2,1 кг/кв. см) в датчике.

Приготовление (ультрафильтрование и диафильтрование)

Каждый лот фильтрата, очищенного от вирусов, концентрируют и приготавливают с помощью ультрафильтрования и диафильтрования. UF модули Pellicon® 2 Biomax от Millipore с порогом молекулярных масс 30 кД (общая площадь мембраны 10 м²) используют для первой части операции приготовления. Фильтрат, очищенный от вирусов, сначала концентрируют до целевой концентрации 50 г/л с помощью ультрафильтрования. Затем осуществляют непрерывное диафильтрование с помощью минимум 8 объемов 23 мМ гистидина, pH 5,6. После диафильтрования, лекарственное вещество дополнительно концентрируют до целевой концентрации 180 г/л. Затем систему ультрафильтрования осушают от продукта и промывают с помощью приблизительно 6-8 кг 15 мМ гистидина, pH 5,6, для извлечения продукта, содержащегося в системе. Концентрат и промывки объединяют с получением образца после диафильтрования с целевой концентрацией 120-160 г/л.

Фильтрование, бутылирование и замораживание осуществляют, как описано в примере 1.

Выходы очистки и качество конечного продукта для MAb B приведены в таблицах 10 и 11. Четыре загрузки пропускают последовательно при среднем общем выходе очистки 69%. Уровни примесей в конечных объемных лекарственных веществах во всех загрузках являются сравнимым и удовлетворяют спецификации качества продукта.

Таблица 10 Сводка выходов для очистки MAb B № опыта 1 2 3 4 Среднее значение Среднеквадратичное отклонение Осветление (%) 96 91 89 95 93 3 Фракционно-захватная хроматография на ProSep® Ultra Plus (%) 96 95 93 91 94 2 Дезактивирование вирусов/Pod/Q мембрана (%) 90 87 91 92 90 2 Хроматография на Phenyl Sepharose® HP (%) 89 93 95 90 92 3 Фильтрование вирусов (%) 99 102 97 101 100 2 UF/DF (%) 103 92 98 95 97 5 Бутылирование (%) 99 100 98 100 99 1

Общий выход способа (скорректированный на отбор образцов) (%) 75 65 67 69 69 4

Таблица 11 Чистота продукта в конечном лекарственном веществе для MAb B Анализ Опыт 1 Опыт 2 Опыт 3 Опыт 4 Мономер (%) 99,7 99,8 99,6 99,4 Белок клеток-хозяев (нг/мг) <0,14 <0,14 <0,14 0,14 Белок A (нг/мг) <0,29 <0,29 <0,29 <0,29 ДНК (пг/мг) <1 <1 <1 <1

Пример 3

В этом примере осуществляют другой способ очистки белков для очистки MAb A в лабораторном масштабе. Фильтрат от X0HC из опыта с третьей загрузкой, как описано в примере 1, доводят до pH 8,1 посредством добавления раствора 1M Tris буфера, pH 9,5, и электропроводность доводят до 9 мС/см посредством добавления 1M NaCl. Приблизительно 270 мл фильтрата с установленными параметрами протекают затем через три 0,18-мл устройства Q мембранных адсорберов Acrodisc® Mustang®, параллельно. Электропроводность пула, протекающего через мембраны Q, доводят дополнительно до 9 мС/см посредством добавления 1M NaCl, а затем фильтруют через 0,22-мкм поры. Этот кондиционированный пул протекает затем через 5-мл предварительно набитую колонку Capto® adhere при скорости потока, соответствующей времени пребывания 3 мин. Уровень нагрузки на колонке Capto® adhere составляет 221 мг/мл, и промывку с помощью 20 объемов колонки уравновешивающего буфера осуществляют после нагрузки исходных материалов. Пул продукта собирают на основе данных UV280 от 200 миллиед. оптической плотности во время введения продукта до 200 миллиед. оптической плотности во время промывки буфером. Эксперимент осуществляют при комнатной температуре. Концентрацию и объем пула продукта после Capto® adhere измеряют для вычисления выхода стадии, и пул анализируют на агрегаты/мономеры с использованием SEC (эксклюзионной хроматографии) и HCP, и уровни белка А анализируют с использованием осуществляемых лабораторными средствами анализов ELISA.

Протекание через мембрану Q в лабораторном масштабе показывает выход стадии 93-97%, а стадия доочистки на колонке Capto® adhere дает выход стадии 89%. Таким образом, общий выход способа с использованием Capto® adhere для конечной очистки сходен с выходом при использовании Phenyl Sepharose® HP, как показано в Примере 1. В дополнение к этому, качество пула продукта после очистки с помощью Capto® adhere также удовлетворяет спецификации продукта, как показано в таблице 12.

Таблица 12 Характеристики очистки для MAb A с помощью фракционно-захватной хроматографии на белке А с последующим фильтрованием на POD / протеканием через Q мембрану и доочисткой с помощью протекания через Capto® adhere Анализы Уровни примесей в пуле после Capto® adhere FTW Мономер % 99,8 Белок клеток-хозяев (нг/мг) 3,5 Белок A (нг/мг) 0,01

Пример 4

В этом пример, осуществляют способ очистки белков, сходный со способом, описанным в примере 3 для очистки MAb B, в лабораторном масштабе. Пул после протекания через мембрану Q из опыта со второй загрузкой, как описано в примере 2, доводят до pH 8,1 посредством добавления 1M Tris буфера, pH 9,5, и электропроводность доводят до 6 мС/см посредством добавления 1M NaCl перед фильтрованием через 0,22-мкм мембрану. Затем этот кондиционированный пул протекает через 5-мл предварительно набитую колонку Capto® adhere при скорости потока, соответствующей времени пребывания 3 мин. Уровень нагрузки на колонку Capto® adhere составляет 256 мг/мл, и осуществляют промывку с помощью 20 объемов колонки уравновешивающего буфера после введения нагрузки. Пул продукта собирают на основе данных UV280 от 200 миллиед. оптической плотности во время нагрузки продуктов до 200 миллиед. оптической плотности во время промывки буфером. Эксперимент осуществляют при комнатной температуре. Концентрацию и объем пула продукта после Capto® adhere измеряют для вычисления выхода стадии, и пул анализируют на агрегаты/мономер с использованием SEC, и НСР и уровни белка А анализируют с использованием осуществляемых лабораторными средствами анализов ELISA.

Стадия доочистки на колонке Capto® adhere дает выход стадии 91,6%, который сходен с выходом стадии элюирования со связыванием на Phenyl Sepharose® HP, показанным в примере 2. В дополнение к этому, качество пула продукта после очистки с помощью Capto® adhere удовлетворяет спецификации продукта, как приведено в таблице 13.

Таблица 13 Характеристики очистки для MAb B с помощью фракционно-захватной хроматографии на белке А с последующим фильтрованием на POD/протеканием через Q мембрану и доочисткой с помощью протекания через Capto adhere Анализы Уровни примесей в пуле после Capto adhere FTW Мономер % 99,0 Белок клеток-хозяев (нг/мг) 3,4 Белок A (нг/мг) 0,0

Пример 5

В этом примере осуществляют способ очистки белков, сходный со способом, описанным в примере 4, для очистки MAb B в лабораторном масштабе. Фильтрат после X0HC от опыта со второй загрузкой, как описано в примере 2, доводят до pH 6,5 посредством добавления 1M Tris буфера, pH 9,5, и электропроводность доводят до 6 мС/см посредством добавления 1M NaCl или разбавления водой Milli-Q® перед фильтрованием через 0,22-мкм мембрану. Затем этот кондиционированный пул протекает через 5-мл предварительно набитую колонку PPA HyperCel™ при скорости потока, соответствующей времени пребывания 3 мин. Осуществляют два опыта. Уровни нагрузки на колонке PPA HyperCel™ составляют 104 и 235 мг/мл, соответственно, и осуществляют промывку с помощью 20 объемов колонки уравновешивающего буфера после каждого введения нагрузки. Пул продукта собирают на основе данных UV280 от 200 миллиед. оптической плотности во время введения продукта до 200 миллиед. оптической плотности во время промывки буфером. Эксперимент осуществляют при комнатной температуре. Измеряют концентрацию и объем пула продукта после PPA HyperCel™ для вычисления выхода стадии, и пул анализируют на агрегаты/мономер с использованием SEC, и НСР и уровни белка А анализируют с использованием осуществляемых лабораторными средствами анализов ELISA.

Исходные материалы для этих экспериментов содержат примерно 98,1% мономера (1,7% агрегатов), 7 нг/мг HCP и в них вводят одной порцией 23,6 нг/мг белка А. Характеристики смолы PPA HyperCel™ приведены в таблице 14. Выход при более высоком уровне нагрузки (235 мг/мл) составляет 92%, что сравнимо с выходом стадии доочистки с помощью Phenyl Sepharose® HP, показанной в примере 2. Также, качество пулов продуктов после очистки с помощью PPA HyperCel™ удовлетворяет спецификации продукта.

Поскольку нагрузка для этого опыта не проходит через мембрану Q, ожидается, что качество продукта будет дополнительно улучшаться, при использовании мембраны Q между фильтрованием на XOHC и стадией доочистки с помощью PPA hypercel.

Таблица 14 Характеристики очистки для MAb B с помощью фракционно-захватной хроматографии на белке А с последующим фильтрованием на POD и доочисткой с помощью протекания через PPA Hypercel™ Исследование Уровни примесей в пуле после PPA hypercel FTW Нагрузка 100 мг/мл Нагрузка 235 мг/мл Мономер % 99,2 99,0 Белок клеток-хозяев (нг/мг) 2,31 3,62 Белок A (нг/мг) 0,02 0,03

Пример 6

В этом примере осуществляют другой способ очистки белка для очистки MAb B в лабораторном масштабе. Элюат после белка А, как описано в примере 2, доводят до pH 5 посредством добавления 1M раствора Tris буфера, pH 9,5, и электропроводность доводят до 8 мС/см посредством добавления 1M NaCl с последующим фильтрованием на 0,22-мкм мембране. Затем этот кондиционированный материал протекает через 8-мл катионообменную колонку Poros XS® (Life Technologies) при скорости потока, соответствующей времени пребывания 4 мин. Перед нагрузкой, колонку очищают с помощью 0,1M NaOH, уравновешивают с помощью буфера с 50 мМ ацетата натрия, 35 мМ NaCl, pH 5. После введения нагрузки 72 мг/мл MAb B, колонку промывают уравновешивающим буфером, а затем элюируют с помощью буфера с 50 мМ ацетата натрия, 220 мМ NaCl, pH 5. Элюат собирают на основе данных UV280 от 200 миллиед. оптической плотности до 200 миллиед. оптической плотности. Эксперимент осуществляют при комнатной температуре. Концентрацию и объем пула продукта после Poros XS® измеряют для вычисления выхода стадии, и пул анализируют на уровни агрегатов/мономера с использованием SEC, и НСР и уровни белка А анализируют с использованием осуществляемых лабораторными средствами анализов ELISA.

Таблица 15 приводит характеристики очистки для этой стадии доочистки. Получают выход стадии равный почти 100%, и все уровни примесей находятся в пределах спецификаций продукта. Поскольку нагрузка для этого опыта не проходит через POD с XOHC и через стадию доочистки на мембране Q, ожидается, что качество продукта дополнительно улучшится, когда будут включены эти стадии.

Таблица 15 Характеристики доочистки на катиоонобменной колонке Poros XS для элюата после белка А с MAb B Мономер (%) HCP (нг/мг) Белок A (нг/мг) Исходные материалы 95 514 8,6 Элюат 99,5 4 0,4

Пример 7

В этом примере осуществляют другой способ очистки белка для очистки MAb C в лабораторном масштабе. После дезактивирования вирусов при низких значениях pH, после фильтрования на фильтре глубинного типа POD от Millipore, материал, как описано в примере 1, доводят до pH 5 посредством добавления 2M уксусной кислоты к раствору, и электропроводность доводят до 5 мС/см посредством разбавления водой с последующим фильтрованием на 0,22-мкм мембране. В кондиционированный материал вводят порциями дополнительные количества белка А и белков клеток-хозяев для исследования способности этой хроматографической смолы к удалению этих технологических примесей. Материал с введенными порциями примесей вводят в 4,9-мл катионообменную колонку Poros XS® (Life Technologies) при скорости потока, соответствующей времени пребывания 2,9 мин. Перед нагрузкой, колонку очищают с помощью 0,1M NaOH, уравновешивают с помощью буфера со 100 мМ ацетата натрия, pH 5. После введения нагрузки 68 мг/мл MAb C, колонку промывают уравновешивающим буфером, а затем элюируют с помощью 380 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5. Элюат собирают на основе данных UV280 от 200 миллиед. оптической плотности до 400 миллиед. оптической плотности. Эксперимент осуществляют при комнатной температуре. Концентрацию и объем пула продукта от Poros XS® измеряют для вычисления выхода стадии, и пул анализируют на уровни агрегатов/мономера с использованием SEC, и НСР и уровни белка А анализируют с использованием осуществляемых лабораторными средствами анализов ELISA.

Таблица 16 приводит характеристики очистки. Получают выход стадии 93%, и все уровни примесей находятся в пределах спецификаций продукта.

Таблица 16 Характеристики доочистки с помощью катиоонобменной колонки Poros XS для элюата MAb C белком A Агрегаты
(%) Мономер
(%) HCP (нг/мг) Белок A
(нг/мг) Нагрузка 1,1 98,9 62,3 38,7 Элюат 0,4 99,5 0,8 3,5

Все ссылки, цитируемые в настоящем описании, включая, без ограничения, все статьи, публикации, патенты, заявки на патенты, презентации, тексты, отчеты, рукописи, брошюры, книги, Интернет- сообщения, журнальные статьи и/или периодические издания, тем самым включаются в качестве ссылок в настоящее описание во всей своей полноте. Обсуждение ссылок в настоящем документе предназначается только для приведения предположений, сделанных их авторами, и не делается предположений, что любая ссылка представляет предыдущий уровень техники. Заявители оставляют за собой право подвергать сомнению точность и релевантность цитируемых ссылок.

Эти и другие модификации и варианты настоящего изобретения могут осуществляться специалистами в данной области без отклонения от духа и рамок настоящего изобретения, которые более конкретно описываются в прилагаемой формуле изобретения. В дополнение к этому, необходимо понять, что аспекты различных вариантов осуществления могут заменять друг друга частично или полностью. Кроме того, специалисты в данной области заметят, что приведенное выше описание приводится только в качестве примера, и не предназначено для ограничения изобретения, как оно описано далее в прилагаемой формуле изобретения. Следовательно, дух и рамки прилагаемой формулы изобретения не должны ограничиваться описанием версий, содержащихся в нем.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы очистки моноклонального антитела. Способы включают обработку образца с помощью поглощающей смолы для аффинной хроматографии, дезактивирование вирусов в полученном элюате путем понижения рН до 3-4, обработку полученного элюата с помощью фильтра глубинного типа с последующей обработкой с помощью ионообменной мембраны и дополнительную стадию хроматографии полученного элюата с получением моноклонального антитела. Также заявленный способ может включать стадию осветления образца перед обработкой на поглощающей смоле для аффинной хроматографии и стадии нанофильтрования, ультрафильтрования и диафильтрования на заключительном этапе очистки моноклонального антитела. Предложенный способ очистки обеспечивает высокую степень чистоты моноклональных антител без ущерба для выхода продукта и может быть использован для получения моноклональных антител высокой чистоты. 2 н. и 29 з.п. ф-лы, 8 ил., 16 табл., 7 пр.

1. Способ очистки моноклонального антитела, включающий:

a. получение образца, содержащего моноклональное антитело;

b. обработку образца с помощью поглощающей смолы для аффинной хроматографии с получением первого элюата, содержащего моноклональное антитело;

c. дезактивирование вирусов в первом элюате, где дезактивирование вирусов включает понижение рН первого элюата до рН от примерно 3 до примерно 4, с получением дезактивированного элюата, содержащего моноклональное антитело;

d. обработку дезактивированного элюата с помощью, по меньшей мере, одного фильтра глубинного типа с получением фильтрованного элюата, содержащего моноклональное антитело;

e. обработку фильтрованного элюата с помощью, по меньшей мере, одной ионообменной мембраны с получением второго элюата, содержащего моноклональное антитело; и

f. подвержение второго элюата воздействию дополнительной стадии хроматографии.

2. Способ по п. 1, в котором стадия фильтрования с помощью фильтра глубинного типа и стадия с ионообменной мембраной предлагаются в виде последовательности фильтров.

3. Способ по п. 1, в котором поглощающую смолу для аффинной хроматографии выбирают из группы, состоящей из смолы с белком А, смолы с белком G, смолы с белком A/G и смолы с белком L.

4. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой культуру клеток.

5. Способ по п. 1, в котором образец осветляют перед обработкой с помощью поглощающей хроматографической смолы.

6. Способ по п. 5, в котором образец осветляют с помощью способа осветления, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования, микрофильтрования, ультрафильтрования, фильтрования с помощью фильтра глубинного типа, стерильного фильтрования и обработки детергентом.

7. Способ по п. 1, в котором первый элюат инкубируют в течение примерно 30 - примерно 90 минут во время дезактивирования вирусов.

8. Способ по п. 1, в котором дезактивированный элюат доводят до рН 5-10 перед стадией фильтрования с помощью фильтра глубинного типа.

9. Способ по п. 1, в котором стадия фильтрования с помощью фильтра глубинного типа включает фильтрование, по меньшей мере, через один фильтр глубинного типа.

10. Способ по п. 1, в котором стадия фильтрования с помощью фильтра глубинного типа включает фильтрование, по меньшей мере, через два фильтра глубинного типа, расположенных последовательно или параллельно.

11. Способ по п. 1, в котором после стадии фильтрования с помощью фильтра глубинного типа следует стадия фильтрования на капсульном стерильном фильтре.

12. Способ по п. 1, в котором ионообменная мембрана содержит Q мембрану.

13. Способ по п. 12, в котором стадию с использованием Q мембраны осуществляют в проточном режиме.

14. Способ по п. 1, в котором после стадии с использованием ионообменной мембраны следует стадия фильтрования с помощью стерильного капсульного фильтра.

15. Способ по п. 1, в котором дезактивированный элюат обрабатывают с помощью одного фильтра глубинного типа и отфильтрованный элюат обрабатывают с помощью ионообменной мембраны, расположенной последовательно с ним.

16. Способ по п. 1, в котором дополнительную стадию хроматографии выбирают из группы, состоящей из хроматографии гидрофобных взаимодействий, хроматографии, работающей в смешанном режиме, и катиоонобменной хроматографии.

17. Способ по п. 1, в котором второй элюат дополнительно подвергают воздействию стадии нанофильтрования.

18. Способ по п. 1, в котором второй элюат дополнительно подвергают воздействию стадии ультрафильтрования и диафильтрования.

19. Способ очистки моноклонального антитела, включающий:

a. получение образца, содержащего моноклональное антитело;

b. осветление образца с получением осветленного образца;

c. обработку осветленного образца с помощью поглощающей смолы для аффинной хроматографии с получением первого элюата, содержащего моноклональное антитело;

d. дезактивирование вирусов в первом элюате, где дезактивирование вирусов включает понижение рН первого элюата до рН от примерно 3 до примерно 4, с получением дезактивированного элюата, содержащего моноклональное антитело;

e. обработку дезактивированного элюата с помощью, по меньшей мере, одного фильтра глубинного типа с получением отфильтрованного элюата, содержащего моноклональное антитело;

f. обработку отфильтрованного элюата с помощью, по меньшей мере, одной ионообменной мембраны с получением второго элюата, содержащего моноклональное антитело;

g. обработку второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы с получением третьего элюата, содержащего моноклональное антитело;

h. воздействие на третий элюат нанофильтрования с получением элюата после нанофильтрования, содержащего белок; и

i. воздействие на элюат после нананофильтрования, ультрафильтрования и диафильтрования.

20. Способ по п. 19, в котором дополнительная хроматографическая смола включает хроматографическую смолу для работы в смешанном режиме.

21. Способ по п. 20, в котором обработка второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы, работающей в смешанном режиме, включает одну или несколько хроматографических методик, выбранных из группы, состоящей из анионного обмена, катионного обмена, гидрофобных взаимодействий, гидрофильного взаимодействия, водородной связи, связи пи-пи орбиталей и сродства к металлам.

22. Способ по п. 21, в котором обработка второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы, работающей в смешанном режиме, включает сочетание механизмов хроматографии анионного обмена и гидрофобных взаимодействий.

23. Способ по п. 21, в котором хроматографическая колонка для работы в смешанном режиме может работать в проточном режиме или в режиме связывания-элюирования.

24. Способ по п. 19, в котором дополнительная хроматографческая смола включает катионообменную смолу.

25. Способ по п. 24, в котором обработка второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы для работы в смешанном режиме включает одну или несколько хроматографических методик, выбранных из группы, состоящей из анионного обмена, катионного обмена, гидрофобных взаимодействий, гидрофильных взаимодействий, водородной связи, связи пи-пи орбиталей и сродства к металлам.

26. Способ по п. 25, в котором обработка второго элюата с помощью дополнительной хроматографической смолы для работы в смешанном режиме включает сочетание хроматографических механизмов анионного обмена и гидрофобных взаимодействий.

27. Способ по п. 24, в котором колонка для хроматографии катионного обмена работает в режиме связывания-элюирования.

28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором дезактивирование вирусов включает понижение рН первого элюата до рН от примерно 3,4 до примерно 4.

29. Способ по п. 28, в котором поглощающей смолой для аффинной хроматографии является смола с белком А.

30. Способ по любому из пп. 1-27, в котором дезактивирование вирусов включает понижение рН первого элюата до рН от примерно 3,4 до примерно 3,6.

31. Способ по п. 30, в котором поглощающей смолой для аффинной хроматографии является смола с белком А.