СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИХ КАРБОКСИЭТИЛЬНЫЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬ В α- ИЛИ γ-ПОЛОЖЕНИИ БОКОВОЙ ЦЕПИ Российский патент 2016 года по МПК C07K1/04 C07K14/00 C07K19/00 

Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH₂)₂N(COCH₂B)-CH[(CH₂)₂COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH₂)₂COOH]-CH₂-N(COCH₂B)-CH₂-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, по известному протоколу с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, отличающийся тем, что для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºС, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота / трифторметансульфокислота / триизопропилсилан 8:1:1.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области биоорганической химии, фармакологии, молекулярной биологии и может быть использовано для получения терапевтически значимых миметиков олигонуклеотидов, перспективных лекарств направленного действия, обладающих повышенной стабильностью в биологических средах. Предлагаемый способ отщепления не только повышает выход целевых олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК), несущих отрицательно заряженные карбоксиэтильные группы (α- и γ-кэ-ПНК, или α- и γ-ce-PNA в английской транскрипции), но и значительно снижает протекание побочных процессов. Использование настоящего способа отщепления α- и γ-кэ-олигомеров ПНК будет способствовать созданию новых исследовательских инструментов молекулярной биологии и медицины, разработке стабильных чувствительных элементов биосенсоров.

Уровень технического состояния

В настоящее время большой интерес исследователей привлекает относительно новый класс веществ - так называемые пептидно-нуклеиновые кислоты. Они способны специфично связываться с комплементарными последовательностями ДНК и РНК с образованием более прочных комплексов по сравнению с природными аналогами. Наиболее известные аминоэтилглициновые ПНК (АЭГ-ПНК, aeg-PNA) [1] имеют ахиральный незаряженный остов (Фиг. 1) и, как следствие, ряд недостатков: низкая растворимость в воде, склонность к самоагрегации, низкая проникающая способность через клеточные мембраны, способность к образованию как параллельных, так и антипараллельных дуплексов с нуклеиновыми кислотами.

В последние десять лет был предложен целый ряд модификаций ПНК [2]. Один из основных подходов для получения ПНК с новыми свойствами состоит во введении заместителей в различные положения остова олигомера, среди которых наиболее перспективными для терапевтического и/или диагностического применения является модификация с введением отрицательного заряда в боковую цепь остова.

Наличие отрицательного заряда дает возможность управлять процессом гибридизации за счет изменения ионной силы раствора [3], значительно улучшает растворимость олигомеров в воде и упрощает работу с ними в биологических средах.

К сегодняшнему дню описаны различные модификации аминоэтилглициновой структуры ПНК с введением в остов отрицательного заряда:

1) тиминовый мономер γ-ПНК на основе L-Asp (введение радикала -CH₂COOH в γ-положение остова) [4, 5] и олигомеры АЭГ ПНК с включением 1 или 3 модифицированных мономеров [3, 5];

2) олигоаспарагинаты (AspПНК, AspPNA) [6];

3) N^γ-карбоксиалкил-замещенные тиминовые мономеры и олигомеры (N^γ-CH₂COOH и N^γ-(CH₂)₅COOH) [7] и др.

Синтез новых модифицированных пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи (α-кэ и γ-кэ) (Фиг. 1) ранее был описан в наших работах [8-10], являющихся прототипом настоящего изобретения. Данные подходы, однако, позволили выделить только короткие последовательности (тетра- и гексамеры) [8, 10]. Декамеры ПНК получали либо с очень низким выходом (см. ниже гомотиминовые декамеры), либо они полностью разрушались при отщеплении с носителя [9].

В стандартном Boc-протоколе твердофазного синтеза в основном в качестве твердой подложки используют полистирол с (4-метилбензгидрил)аминогруппами, сшитый 1-2 % дивинилбензола, так называемая MBHA смола (далее - носитель) [1].

Обычно для расщепления связи олигомер-носитель используют стандартную для АЭГ ПНК методику «low-high TFMSA», заключающуюся в последовательной обработке носителя растворами с низкой и высокой концентрацией трифторметансульфокислоты в течение 1 ч при 0ºС (раствор «low TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/диметилсульфид/трифторметансульфокислота (11:2:6:1, по объему); раствор «high TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/трифторметансульфокислота (8:1:1, по объему)) [1]. Однако его основной недостаток состоит в низких выходах кэ-замещенных олигомеров.

Использование данного способа для отщепления декамеров H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ и H₂N-(T₁₀)^γ-кэ-CONH₂ (Фиг. 2) приводило практически к полному расщеплению целевых последовательностей. Выделить удалось только γ-декамер (выход 0,7 %) (Таблица 1).

Снижение времени обработки носителя раствором «low TFMSA» до 15 мин и раствором «high TFMSA» до 20 мин позволило получить α-олигомер, однако также с чрезвычайно низким выходом (0,2 %) (Фиг. 3А) (Таблица 1).

Декамер H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ (Фиг. 2, 4А) в этих условиях также подвергался практически полному разрушению. Из-за преобладания побочных продуктов целевой олигомер выделить не удалось [9], а короткоцепочечные олигомеры АЭГ ПНК с включением γ-кэ-замещенных тиминовых мономеров H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂ и H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂ (Фиг. 2) были получены с выходами 4,2 и 3,1 % соответственно (Таблица 1).

Другой метод расщепления синтезированного олигомера ПНК и носителя заключается в использовании смеси трифторуксусная кислота/трифторметансульфокислота/триизопропилсилан в объемном соотношении 3:1:0,1. Впервые она была применена в отношении незаряженных АЭГ ПНК при субмономерной стратегии синтеза гомопиримидиновых олигомеров. При этом температурные и временные режимы не были описаны [11]. Ранее на примере тетрамера H₂N-G^α-кэCAT-CONH₂ (Фиг. 2) мы показали возможность применения данной смеси для получения карбоксиэтил-замещенных ПНК. Преимущество данной методики стало очевидным только в случае сильного предварительного охлаждения носителя до -30°С. Тетрамер H₂N-G^α-кэCAT-CONH₂ был выделен с выходом 35 % [8]. Результат был также подтвержден на короткоцепочечных γ-олигомерах - для тетрамера H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂ выход синтеза увеличился с 4,2 до 31 %, а для гексамера H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂ - с 3,1 до 27 % [10], и на α-декамерах - олигомер H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ не удалось отделить от укороченной на одно мономерное звено последовательности с массой 3017 Да (Фиг. 4Б, 5А), а выход H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ увеличился с 0,2 до 2,3 % (Фиг. 3Б, таблица 1). Время обработки для тетра- и гексамеров составило 45 мин, для декамеров - 1,5 ч.

Заявляемый способ разрыва ковалентной связи олигомера ПНК с носителем включает обработку последнего раствором трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан в объемном соотношении 8:1:1 с сильным предварительным охлаждением носителя до -45÷-50°С. Время обработки 10- и 12-меров составило 2 ч. Уменьшение концентрации трифторметансульфокислоты, увеличение концентрации триизопропилсилана (скавенджер, «ловушка радикалов») и сильное охлаждение носителя приводит к подавлению побочных реакций, упрощению выделения кэ-олигомеров ПНК и соответственно увеличению общего выхода синтеза.

Преимущество заявляемого способа подтвердили на примере гомопиримидиновых декамеров H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ (Фиг. 3В)_, H₂N-(T₁₀)^γ-кэ-CONH₂ и H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ (Фиг. 4В, 5Б) и коротких последовательностей H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂ и H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂ (Таблица 1).

Используя заявляемый способ, также были синтезированы 12-меры ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами ПНК: Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2) с выходами 7,3 и 7,1 % соответственно. Изучали способность этих олигомеров к комплементарному связыванию с олигонуклеотидом d(GGAGGGAGGTGA) (ДНК 2). По данным УФ-плавления и КД-спектроскопии (Фиг. 6) олигомеры ПНК 1 и ПНК 2 образуют устойчивые антипараллельные дуплексы с комплементарной цепью ДНК 2. Причем температуры плавления этих дуплексов существенно выше, чем температура плавления антипараллельного дуплекса олигонуклеотидов ДНК 1/ДНК 2 ((d(TCACCTCCCTCC)/ d(GGAGGGAGGTGA))). Т_пл (ПНК 1/ДНК 2) = 66,0°С, Т_пл (ПНК 2/ДНК 2) = 82,9°С, Т_пл (ДНК 1/ДНК 2) = 56,4°С.

Результаты данного исследования показывают перспективность синтеза и дальнейшего изучения свойств карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК как in vitro, так и in vivo (за счет повышенной растворимости).

Раскрытие изобретения и технический результат

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа отщепления α- и γ-карбоксиэтил-содержащих олигомеров ПНК с полистирольного носителя, предусматривающее практически полное устранение образования побочных продуктов, связанных с N-концевыми перегруппировками остова. Это существенно облегчает дальнейшую очистку олигомеров ПНК с помощью ВЭЖХ.

Технический результат достигается тем, что для постсинтетической обработки олигомеров использовали триизопропилсилан вместо м-крезола, вводимого в смесь трифторуксусная кислота/трифторметансульфокислота. Кроме того, мы определили соотношение реагентов и температурный режим реакции, при котором выходы олигомеров значительно увеличиваются.

Описание чертежей

На Фиг. 1 представлена общая структура олигомеров ПНК.

На Фиг. 2 представлены структуры синтезированных карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК: H₂N-G^α-кэCAT-CONH₂, H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH_2, H₂N-(T₁₀)^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂, Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2).

На Фиг 3. представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч) (Б), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 4 представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 5 представлены ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ по известной методикой TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 6 представлен результат исследования гибридизационных характеристик для 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2), а именно кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов ПНК/ДНК и ДНК/ДНК.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

В примере 1 описан синтез ПНК олигомеров.

В примере 2 приведен анализ влияния условий постсинтетической обработки полистирольного носителя с иммобилизованным олигомером ПНК на состав реакционных смесей методами MALDI-TOF-масс-спектрометрии и ОФ ВЭЖХ.

В примере 3 описаны гибридизационные характеристики 12-меров ПНК.

Примеры реализации

Пример 1. Синтез олигомеров ПНК

Мономеры АЭГ, α- и γ-карбоксиэтил-замещенных ПНК получали в препаративных количествах по известным методикам [10, 12-15].

Олигомеры ПНК получали по стандартному Boc-протоколу твердофазного синтеза от C к N-концу цепи на приборе для пептидного синтеза [1, 8-10, 16].

Синтезированы 5 олигомеров ПНК (Фиг. 2, Таблица 1), постсинтетическая обработка которых проводилась по известным методикам «low-high TFMSA» (раствор «low TFMSA» - трифторуксусная кислота/ м-крезол/ диметилсульфид/ трифторметансульфокислота (11:2:6:1, по объему), 0ºС; раствор «high TFMSA» - трифторуксусная кислота/м-крезол/трифторметансульфокислота (8:1:1, по объему), 0ºС) [1] и смесью трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан (3:1:0,1 по объему) с предварительным охлаждением носителя до -30°С (45 мин для тетра- и гексамеров и 1,5 ч для декамеров) и заявляемым способом (трифторуксусная кислота/ трифторметансульфокислота/ триизопропилсилан в объемном соотношении 8:1:1 с предварительным охлаждением носителя до -45÷-50°C). Время обработки полистирольного носителя составляло 2 ч в случае отщепления 10- и 12-меров и 45 мин при отщеплении коротких последовательностей (≤ 6 нуклеотидов). Выходы синтеза оценивали исходя из количества носителя, удельной нагрузки стартового мономера и количества чистого целевого олигомера.

Результаты, приведенные в Таблице 1, доказывают преимущество заявляемого способа постсинтетической обработки по сравнению с известным протоколом.

Пример 2. Анализ влияния условий постсинтетической обработки полистирольного носителя с иммобилизованным олигомером ПНК на состав реакционных смесей

Пример 2.1. Метод MALDI-TOF-масс-спектрометрии

MALDI-TOF-масс-спектры регистрировали на приборе Bruker MicroFlex (Германия), оснащенном азотным УФ-лазером с длиной волны 337 нм и стандартной мишенью - MSP target polished steel (Bruker, Германия). В качестве матрицы использовали насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Fluka, США) в смеси ацетонитрил:вода 1:1.

Из Фиг. 3 и 4 очевидно, что только использование заявляемого способа обеспечивает заметное превалирование пика целевого вещества в масс-спектрах реакционных смесей.

Пример 2.2. ВЭЖХ-анализ профилей реакционных смесей, полученных различными методиками.

ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent Chemstation 1100 Series на колонке Macherey-Nagel Nucleosil C18 (3,2×250 мм; 5 мкм) в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония при 40ºС со скоростью потока 0,8 мл/мин с УФ-детектированием при 260 нм. Из Фиг. 5 видно, что применение заявляемого способа обеспечивает получение реакционной смеси с низким содержанием примесей, что значительно облегчает ВЭЖХ-очистку олигомеров и повышает общий выход синтеза.

Пример 3. Исследование гибридизационных характеристик ДНК-ПНК комплексов методами КД и УФ-плавления.

Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (d(TCACCTCCCTCC), ДНК 1 и d(GGAGGGAGGTGA), ДНК 2) и олигомеры ПНК (Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC, ПНК 1 и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC, ПНК 2) смешивали в эквимолярном соотношении в буфере 10мM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, 140 мM KCl, 5 мM MgCl₂, рН 7,4, с суммарной концентрацией 5 мкМ, нагревали до 90°С и медленно охлаждали до 5°С.

Кривые УФ-плавления и КД-спектры полученных образцов регистрировали на спектрофотометре Chirascan™ Applied Photophysics (Великобритания). Поглощение определяли при постоянной длине волны 260 нм, температурный интервал составлял 5-90°С c шагом 2°С (допускаемая погрешность 0,1°С). Из Фиг. 6 видно, что олигомеры ПНК 1 и ПНК 2 образуют устойчивые антипараллельные дуплексы с комплементарной цепью ДНК 2, температура плавления которых выше, чем у природного аналога ДНК 1/ДНК 2.

Литература

1. L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1995. V. 3. P. 175-183.

2. R. Corradini, S. Sforza, T. Tedeschi, F. Totsingan, A. Manicardi, R. Marchelli. Peptide Nucleic Acids with a Structurally Biased Backbone. Updated Review and Emerging Challenges. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2011. V.11. №12. P. 1535-1554.

3. N.T.S. De Costa, J.M. Heemstra. Differential DNA and RNA sequence discrimination by PNA having charged side chains. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014. V. 24. P. 2360-2363.

4. G. Haaima, A, Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen. Peptide nucleic acids (PNAs) containing thymine monomers derived from chiral amino acids: hybridization and solubility properties of D-Lysine PNA. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. №17. P. 1939-1942.

5. N.T.S. De Costa, J.M. Heemstra. Evaluating the effect of ionic strength on duplex stability for PNA having negatively or positively charged side chains. Plos One. 2013. V. 8. №3. P. 1-8.

6. Y.M. Bae, M.H. Kim, G.S. Yu, B.H. Um, H.K. Park, H. Lee, K.T. Lee, Y.D. Suh, J.S. Choi. Enhanced splicing correction effect by an oligo-aspartic acid-PNA conjugate and cationic carrier complexes. Journal of controlled release. 2014. V. 175. P. 54-62.

7. C. De Cola, A. Manicardi, R. Corradini, I. Izzo, F. De Riccardis. Carboxyalkyl peptoid PNAs: synthesis and hybridization properties. Tetrahedron. 2012. V. 68. P. 499-506.

8. М.В. Ширяева, Ю.Г. Кириллова, Е.Д. Никольская, Д.И. Прохоров, И.П. Смирнов, Г.Е. Позмогова. Оптимизация твердофазного синтеза полиамидных миметиков нуклеиновых кислот с применением MALDI-TOF-масс спектрометрии. Вестник МИТХТ. 2013. Т.8. №1. С. 87-95.

9. Ю.Г. Кириллова, М.В. Танкевич, Д.И. Прохоров, В.И. Швец. Особенности твердофазного синтеза отрицательно заряженных хиральных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. ЖОрХ. 2013. Т.49. №12. С. 1787-1795.

10. A.V. Dezhenkov, M.V. Tankevich, E.D. Nikolskaya, I.P. Smirnov, G.E. Pozmogova, V.I. Shvets, Yu. G. Kirillova. Synthesis of anionic peptide nucleic acid oligomers including γ-carboxyethyl thymine monomers. Mendeleev Commun. 2015. V. 25. P. 47-48.

11. G. Upert, M. Mehiri, M.-L. Goddard, A. Di Giorgio, R. Benhida, R. Condom, N. Patino. The “fully protected backbone” approach as a versatile tool for a new solid-phase PNA synthesis strategy. Tetrahedron Lett. 2005. V.46. P. 4081-4085.

12. K.L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H.F Hansen, T. Vulpius, K.H. Petersen, R.F. Berg, P.E. Nielsen, O. Buchardt. Synthesis of peptide nucleic acid monomers containing the four natural nucleobases: thymine, cytosine, adenine, and guanine and their oligomerization. J. Org. Chem. 1994. V. 59. № 19. P. 5767-5773.

13. Баранов, Н.С. Цвид, В.И. Лукьянченко, Д.И. Прохоров, Ю.Г. Кириллова, В.И. Швец. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2007. Т. 2. № 5. С. 28.

14. N.P. Boyarskaya, Yu.G. Kirillova, E.A. Stotland, D.I. Prokhorov, E.N. Zvonkova, V.I. Shvets. Doklady Chemistry. 2006. Т. 408. № 1. С. 57-60.

15. А.В. Деженков, М.А. Льянов, Д.И. Прохоров, Н.Е. Лысенко, О.В. Есипова, Ю.Г. Кириллова. Синтез мономеров γ-замещенных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №6. С. 72-76.

16. М.В. Ширяева, Ю.Г. Кириллова, О.В. Есипова, С.В. Еремин, Т.А. Лукьянова, В.И. Швец. Твердофазный синтез отрицательно заряженных олигомеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №2. С. 81-85.

Подписи к чертежам

Фиг. 1. Общая структура олигомеров ПНК.

Фиг. 2. Структуры олигомеров H₂N-G^α-кэCAT-CONH₂, H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH_2, H₂N-(T₁₀)^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂, Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2).

Фиг. 3. Сравнительный анализ MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ методикой «low-high TFMSA» (0°С, 15 и 20 мин, соответственно) (А), смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (Б) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (В).

Фиг. 4. Сравнительный анализ MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ методикой «low-high TFMSA» (0°С, 15 и 20 мин, соответственно) (А), смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (Б) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (В).

Фиг. 5. ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении декамера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ известной смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 3:1:0,1 (-30°С, 1,5 ч) (А) и заявляемым способом - смесью TFA-TFMSA-TIS в объемном соотношении 8:1:1 (-45÷-50°С, 2 ч) (Б).

Фиг. 6. Кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1/ДНК 2) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2/ДНК 2) с комплементарной последовательностью олигонуклеотида и антипараллельного дуплекса ДНК 1/ДНК 2 (5′-d(TCACCTCCCTCC)-3′/5′-d(GGAGGGAGGTGA)-3′).

Список сокращений

Boc - трет-бутилоксикарбонил-

B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание

ПНК (PNA) - пептидно-нуклеиновая кислота

кэ (ce) - карбоксиэтил-

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

АЭГ ПНК (aeg PNA) - аминоэтилглициновые ПНК

Asp - аспарагиновая кислота

TFMSA - трифторметансульфокислота

УФ - ультрафиолет

КД-спектроскопия - спектроскопия кругового дихроизма

MALDI-TOF-масс-спектрометрия - матричная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Описание чертежей

На Фиг. 1 представлена общая структура олигомеров ПНК.

На Фиг. 2 представлены структуры синтезированных карбоксиэтил-замещенных олигомеров ПНК: H₂N-G^α-кэCAT-CONH₂, H₂N-ACAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-CAT^γ-кэCAT^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH_2, H₂N-(T₁₀)^γ-кэ-CONH₂, H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂, Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2).

На Фиг 3. представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(T₁₀)^α-кэ-CONH₂ по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч) (Б), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 4 представлено сравнение MALDI-TOF-масс-спектров реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ по известным методикам «low-high TFMSA» (15 и 20 мин) (А) и TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 5 представлены ВЭЖХ-профили реакционных смесей, полученных при отщеплении олигомера H₂N-(C₄T₆)^α-кэ-CONH₂ по известной методикой TFA/TFMSA/TIS (3:1:0,1 по объему, 1,5 ч), а также предлагаемым способом (2 ч) (В).

На Фиг. 6 представлен результат исследования гибридизационных характеристик для 12-меров ПНК с чередующимися АЭГ и γ-карбоксиэтил-замещенными мономерами Gly-T^γ-кэCAC^γ-кэCTC^γ-кэCCT^γ-кэCC (ПНК 1) и Gly-T^γ-кэCA^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэCC^γ-кэTC^γ-кэC (ПНК 2), а именно кривые УФ-плавления и КД-спектры антипараллельных комплексов ПНК/ДНК и ДНК/ДНК.

Изобретение относится к области биоорганической химии, фармакологии, молекулярной биологии и может быть использовано для получения терапевтически значимых полиамидных миметиков олигонуклеотидов (ПНК), перспективных лекарств направленного действия, обладающих повышенной стабильностью в биологических средах. Предложен способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH₂)₂N(COCH₂B)-CH[(CH₂)₂COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH₂)₂COOH]-CH₂-N(COCH₂B)-CH₂-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, в котором для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºС, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота:трифторметансульфокислота:триизопропилсилан 8:1:1. Способ позволяет практически полностью устранить образование побочных продуктов, связанных с N-концевыми перегруппировками полиамидного остова. Таким образом, состав конечной реакционной смеси существенно обогащается целевым олигомером ПНК, что облегчает его дальнейшую очистку с помощью ВЭЖХ. 6 ил., 3 пр.

Способ получения олигомеров пептидно-нуклеиновых кислот, содержащих карбоксиэтильный заместитель в α- или γ-положении боковой цепи, заключающийся в наращивании на полистирольном носителе полиамидной последовательности, содержащей α-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-(CH₂)₂N(COCH₂B)-CH[(CH₂)₂COOH]-CO- или γ-карбоксиэтил-замещенные звенья общей формулы -NH-CH[(CH₂)₂COOH]-CH₂-N(COCH₂B)-CH₂-CO-, где B - пуриновое или пиримидиновое нуклеиновое основание, с последующей обработкой носителя смесью на основе трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты, отличающийся тем, что для увеличения выхода и упрощения очистки целевых олигомеров, а именно уменьшения количества побочных продуктов, носитель предварительно охлаждают до -45÷-50ºC, а вместо м-крезола к смеси кислот добавляют триизопропилсилан при объемном соотношении реагентов трифторуксусная кислота:трифторметансульфокислота:триизопропилсилан 8:1:1.