Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной ПЦР Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Изобретение относится к наборам олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации генетического материала энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и может быть использовано в вирусологии и эпидемиологии для обеспечения эпидемической безопасности населения при различных видах водопользования.

Известно, что для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем, в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Проблема лабораторной диагностики острых кишечных инфекций неустановленной этиологии у детей / Т.В. Амвросьева, Н.В. Поклонская, Е.П. Кишкурно, Н.Л. Клюйко, О.Н. Казинец, А.А. Безручко, О.И. Камяк // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: материалы междунар. науч.-практ. конф. / ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора. – Новосибирск, 2009. – С. 52-55). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции, представляющего собой полимеразную цепную реакцию с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 3-6 часов обнаружить в исследуемом материале вирусную РНК.

Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В основе метода лежат две реакции – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. В реакции обратной транскрипции на матрице вирусной РНК строится комплиментарная ДНК (кДНК). В следующей за реакцией обратной транскрипции ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка кДНК (амплификация). Амплифицируемый участок кДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров) без которых не возможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуорисцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту, либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.

В настоящее время на территории Российской Федерации существует единственный коммерческий набор для детекции кДНК ротовируса человека методом ПЦР "АмплиСенс®ОРВИ-скрин-FL" (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва) - набор реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (РНК респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, ротовирусов, ДНК аденовирусов групп B, C и E и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией).

Для ПЦР диагностики энтеровирусов используются ПЦР-тест-системы с детекцией методом электрофореза таких компаний, как ЗАО «БиоХимМак» (http://www.biochemmack.ru/product/moleculardiagnostics/infectious/), ЗАО «Литех» и наборы реагентов для ПЦР производства "ИзоГен" (http://www.lytech.ru/ catalog_69.htm). Набор с гибридизационно-флуоресцентной детекцией производит компания «ИнтерЛабСервис» (http://www.interlabservice.ru/catalog/ reagents/index.php?sid=678).

Для диагностики вирусов гепатита А методом ПЦР используется набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита A (HAV) в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HAV-FL.

Для диагностики вируса гепатита Е методом ПЦР используется набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита E (HEV) в клиническом материале ООО «Лаборатория ИзоГен».

Наборы для диагностики аденовирусов, астро- и норовирусов методом ПЦР выпускаются компанией «ИнтерЛабСервис».

Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (патент РФ №2542968, МПК С12Q1/68, опубл. 27.02.2015 г.).

Однако и такой набор для мультиплексной ПЦР не обеспечивает идентификацию проб из водной среды с целью диагностики энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.

Таким образом, из уровня техники не известны мультиплексные ПЦР тест-системы для идентификации проб из водной среды с целью диагностики энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.

Техническим результатом является создание набора для мультиплексной ПЦР, обеспечивающего исследование проб водной среды с целью одновременного выявления в них энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.

Указанный технический результат достигается созданием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, энтеровирусов, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, имеющих следующую структуру:

для выявления РНК ротовирусов:

- прямой (F1) и обратный (R1) праймеры:

F1: 5`- GATATTGGACCNTCTGATTCTGC -3`

R1: 5`- ATTGCTGTNGATGAATCCATAGACAC -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):

Z1: ROX-TTAGATCGAATGCAGTTAAGACAAACGC-BHQ2

для выявления РНК вируса гепатита А:

- прямой (F2) и обратный (R2) праймеры:

F2: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3`

R2: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTGT -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z2):

Z2: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGT-BHQ2

для выявления РНК вируса гепатита Е:

- прямой (F3) и обратный (R3) праймеры:

F3: 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGT -3’

R3: 5`- GGTTGGTTGGATGAATATAGGG -3’

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z3):

Z3: Cy5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC-BHQ2

для выявления РНК энтеровирусов:

- прямой (F4) и обратный (R4) праймеры:

F4: 5`- AGTCTATTGAGCTARTTGGT -3’

R4: 5`- ACACGGACACCCAAAGTAGT -3’

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z4):

Z4: FAM-CCTGAATGCGGCTAATCC-BHQ1

для выявления РНК аденовирусов:

- прямой (F5) и обратный (R5) праймеры:

F5: 5`- CCACGGTGGGGTTTCTAAACTT -3`

R5: 5`- CCCAGTGGTCTTACATGCACATC -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):

Z5: ROX-TGCACCAGACCCGGGCTCAG-BHQ2

для выявления РНК норовирусов:

- прямой (F6) и обратный (R6) праймеры:

F6: 5`- CAAGARACNATGTTCAGRTGGATGA -3`

R6: 5`- TCGACGCCATCTTCATTCACA -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z6):

Z6: R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ2

для выявления РНК астровирусов:

- прямой (F7) и обратный (R7) праймеры:

F7: 5`- AGTTGCTTGCTGCGTTCA -3’

R7: 5`- TTGCTAGCCATCACACTTCT -3’

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z7):

Z7: Cy5-ACAGAAGAGCAACTCCATCGC-BHQ2,

где: присутствие в нуклеотидной последовательности пуринового основания R=A или G;

присутствие в нуклеотидной последовательности пиримидинового основания Y=T или C;

следующий альтернативный порядок следования нуклеотидов: N=A или C или G или T.

Олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации ротовирусов, вирусов гепатита А и Е и энтеровирусов приготовлены в виде смеси в одной пробирке, а олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации аденовирусов, норовирусов и астровирусов приготовлены в виде смеси в другой пробирке.

Перечень графических материалов. Фиг. 1. Результаты анализа энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал FAM). Фиг. 2. Результаты анализа вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5). Фиг. 3. Результаты анализа вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G). Фиг. 4. Результаты анализа ротовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX). Фиг. 5. Результаты анализа аденовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX). Фиг. 6. Результаты анализа астровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5). Фиг. 7. Результаты анализа норовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).

Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием лабораторной коллекции энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Выбранные праймеры и ДНК-зонды обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации вирусной кДНК была подтверждена секвенированием.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК ротовирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры фланкируют участок гена, кодирующего вирусный гликопротеин 1 (VP1-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 28117 по 28630 нуклеотид (513 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК энтеровирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры комплементарны не кодирующей части геномной РНК (5”-UTR). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 72 по 521 нуклеотид (449 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита А. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 311 по 421 нуклеотид (110 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита Е. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 5298 по 5370 нуклеотид (72 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК норовирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 4986 по 5084 нуклеотид (98 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК астровирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 4168 по 4349 нуклеотид (181 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК аденовирусов человека. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома (hexon protein gene) с 21 по 152 нуклеотид (132 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

В результате научных исследований достигнут следующий технический результат, а именно: разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих надежную детекцию энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакцией (см. таблицу 1).

Таблица 1

Высокоспецифичные праймеры и зонды для детекции энтеровирусов человека, ротавирусов, вируса гепатита А, вируса гепатита Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека с помощью метода ПЦР в реальном времени.

Ротовирусы

Праймеры и зонд Последовательность (5` → 3`) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F1 GATATTGGACCNTCTGATTCTGC 55 117 R1 ATTGCTGTNGATGAATCCATAGACAC 55 Z1 ROX-TTAGATCGAATGCAGTTAAGACAAACGC-BHQ2 61

Вирус гепатита А

Праймеры и зонд
Последовательность (5’ → 3’) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F2 GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT 54 162 R2 CGGCGTTGAATGGTTTTTGT 54 Z2 R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGT-BHQ2 63

Вирус гепатита Е

Праймеры и зонд
Последовательность (5’ → 3’) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F3 CGGCRGTGGTTTCTGGGGT 57 200 R3 GGTTGGTTGGATGAATATAGGG 54 Z3 Cy5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC-BHQ2 66

Энтеровирусы

Праймеры и зонд
Последовательность (5’ → 3’) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F4 AGTCTATTGAGCTARTTGGT 55 449 R4 ACACGGACACCCAAAGTAGT 55 Z4 FAM-CCTGAATGCGGCTAATCC-BHQ1 65

Аденовирусы

Праймеры и зонд Последовательность (5` → 3`) Тм,
(°С) Размер ампликона, п.н. F1 CCACGGTGGGGTTTCTAAACTT 55 117 R1 CCCAGTGGTCTTACATGCACATC 55 Z1 ROX-TGCACCAGACCCGGGCTCAG-BHQ2 61

Норовирусы

Праймеры и зонд
Последовательность (5’ → 3’) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F2 CAAGARACNATGTTCAGRTGGATGA 54 162 R2 TCGACGCCATCTTCATTCACA 54 Z2 R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ2 66

Астровирусы

Праймеры и зонд
Последовательность (5’ → 3’) Тm
(°С) Размер ампликона, п.н. F3 AGTTGCTTGCTGCGTTCA 55 200 R3 TTGCTAGCCATCACACTTCT 55 Z3 Cy5-ACAGAAGAGCAACTCCATCGC-BHQ2 66

Примечание. Где:

присутствие в нуклеотидной последовательности пуринового основания R=A или G;

присутствие в нуклеотидной последовательности пиримидинового основания Y=T или C;

следующий альтернативный порядок следования нуклеотидов: N=A или C или G или T.

Конструирование внутреннего контрольного образца. В качестве внутреннего контрольного образца была использована защищенная двухцепочечная РНК фага MS-2. Псевдофаг получали клонированием под T5 фаговый промотер фрагмента 370 п.н. кДНК фага MS-2 в вектор pQE31. Синтез матричной РНК индуцировали IPTG. Фаговые частицы очищали центрифугированием.

Внутренний контрольный образец (ВКО), позволяет компенсировать ингибирование и контролировать процессы пробоподготовки и амплификации, что обеспечивает более точное определение РНК в каждом анализируемом образце. ВКО представляет собой неинфекционную защищенную РНК бактериофага MS2 (концентрация 10⁵ копий РНК MS2/мл).

Выделение вируссодержащего материала из образцов воды.

Пробу воды готовили 1000-кратным разведением клинического образца, содержащего вирус, в дистилированной и автоклавированнной воде. Пробы подвергались фильтрации через подобранную оптимальную фильтрационную систему. Используемые в работе системы для фильтрации воды с целью дальнейшего исследования на наличие вирусного генетического материала:

1. Мембранный фильтрующий модуль МФМ-0142.

2. Фильтрационная система Midisart 2000 (Sartorius, Германия).

3. Система вакуумной фильтрации (Sartorius, Германия).

4. Система вакуумной фильтрации с приставкой предварительной фильтрации (Sartorius, Германия).

Для концентрирования вирусов с фильтрационными системами использовали мембраны марки ММПА+-020-142 (ООО НПП «Технофильтр», Россия). В качестве системы сравнения использовали адсорбирующее картриджи из набора для отбора проб и индикации вирусов в питьевой воде ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» (Республика Беларусь).

Фильтрацию воды проводили после предварительного добавления в нее 10-кратных разведений вируссодержащих образцов с известной концентрацией вируса, после чего проводили элюцию концентрированного вируссодержащего материала из мембраны и затем проводили выделение вирусной РНК (ДНК). Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции (Евроген, Россия), после чего в реакции обратной транскрипции (наборы для обратной транскрипции, Изоген, Россия) получали кДНК и проводили ПЦР в режиме реального времени, используя мультиплексный вариант тест-системы. Оптимальными считались те способы фильтрации воды и выделения вирусной РНК, при которых достигалась наибольшая чувствительность.

Пробу воды готовили 1000-кратным разведением клинического образца, содержащего ротавирус в дистилированной и автоклавированнной воде. Пробы подвергались фильтрации через подобранную оптимальную фильтрационную систему. После чего производилась элюция с мембраны, выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени с использованием мультиплексного варианта тест-систем. Наиболее удобной в работе оказалась система вакуумной фильтрации с приставкой предварительной фильтрации (Sartorius, Германия), поскольку одновременно позволяла проводить отсечку бактериального компонента из образцов воды (на первый 0.22 мкм фильтр) и сорбцию вирусного материала на мембрану марки ММПА+-020-142 (ООО НПП «Технофильтр», Россия). Мембраны обладают повышенной сорбционной способностью по отношению к вирусам, колифагам и пирогенам. Мембраны микропористые полиамидные с положительным дзета-потенциалом изготовленные на основе полиамида (Nylon-6 и Nylon-66). Мембраны ММПА+ имеют крупноячеистое строение с тонкими микропористыми перегородками, что предопределяет непрерывность структуры мембран и обеспечивает прочность и эластичность в сухом и смоченном виде. Благодаря высокой пористости и контролируемому размеру пор мембраны обладают высокой эффективностью удержания микрочастиц при большой скорости фильтрации.

Экстракция вирусной РНК

Предварительную инактивацию образцов и выделение вирусной РНК проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Вирусную РНК выделяли из 100 мкл вируссодержащей жидкости фенол-хлороформным реагентом, с использованием набора «Евроген» (г. Москва) согласно инструкции производителя.

Реакция обратной транскрипции

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «ИзоГен» (г. Москва) согласно инструкции производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, а также, по температуре отжига праймеров.

Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таб. 1), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl₂, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров и 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.

Таблица 2

ПЦР-смесь А (из расчета на одну пробирку)

Компонент Объем, мкл ПЦР-буфер×10 3 дНТФ (5 мМ) 1 MgCl₂ (50 мМ) 1.5 Hot Start Taq ДНК-полимераза 0.3 Смесь прямых праймеров – F1 (по 10 нМ) 2 Смесь обратных праймеров – R1 (по 10 нМ) 2 Смесь ДНК-зондов – Z1 (по 15 нМ) 0.5 Образец (кДНК) 3 diH₂O 16.7

ПЦР-смесь В (из расчета на одну пробирку)

Компонент Объем, мкл ПЦР-буфер×10 3 дНТФ (5 мМ) 1 MgCl₂ (50 мМ) 1.5 Hot Start Taq ДНК-полимераза 0.3 Смесь прямых праймеров – F2 (по 10 нМ) 2 Смесь обратных праймеров – R3 (по 10 нМ) 2 Смесь ДНК-зондов – Z2 (по 15 нМ) 0.5 Образец (кДНК) 3 diH₂O 16.7

ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации Таблицы 3. Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналам – Green (FAM, 470 nm /510 nm), Yellow (R6G, 530 нм / 560 нм), Red (Cy5, 625 нм / 660 нм) и Orange (ROX, 585 нм / 605 нм), в двух пробирках:

Пробирка А: смесь олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих детекцию энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е.

Пробирка В: смесь олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих детекцию норовирусов, астровирусов, аденовирусов и ВКО (внутренний контольный образец).

Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг. 1-7).

Таблица 3

Программа амплификации

№ Операция T, °C T, мин:с 1 Hold/Активация HotStart-Taq-ДНК-полимеразы 95 05:00 2 Cycling 1/Циклирование 1 (10 циклов), без детекции флюоресценции. 95 00:10 55 00:30 72 00:20 3 Cycling 2/Циклирование 2 (40 циклов), с детекцией флюоресценции по каналам FAM, ROX, Cy5 и R6G. 95 00:10 55 00:30 детекция 72 00:20

На фиг. 1-7 представлены результаты анализа образцов методом ПЦР в реальном времени. В эксперименте методом ПЦР в реальном времени были проанализированы последовательные десятикратные разведения кДНК энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.

На фиг. 1 приведены результаты анализа энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал FAM).

Примечание:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК энтеровирусов);

2 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:100);

3 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:1000);

4 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

На фиг. 2 приведены результаты анализа вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5).

Примечание:

1. положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК гепатита Е);

2. кДНК гепатита Е, (разведение 1:100);

3. кДНК гепатита Е, (разведение 1:1000);

4. кДНК гепатита Е, (разведение 1:10000);

5. отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер)

На фиг. 3 представлены езультаты анализа вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).

Примечание:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК вируса гепатита А);

2 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:100);

3 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:1000);

4 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

На фиг. 4 приведены результаты анализа ротовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX).

Примечание:

1. положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК ротовируса);

2. кДНК ротовируса, (разведение 1:100);

3. кДНК ротовируса, (разведение 1:1000);

4. кДНК ротовируса, (разведение 1:10000);

5. отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

На фиг. 5 представлены результаты анализа аденовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX).

Примечание:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК аденовирусов);

2 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10²);

3 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10³);

4 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10⁴);

5 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10⁵);

6 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10⁶);

7 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10⁷);

8 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:10⁸);

9 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

На фиг. 6 представлены результаты анализа астровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5).

Примечание:

1 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10¹);

2 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10²);

3 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10³);

4 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10⁴);

5 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10⁶);

6 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10⁷);

7 - кДНК астровирусов, (разведение 1:10⁸);

8 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

На фиг. 7 приведены результаты анализа норовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).

Примечание:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК норовирусов);

2 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10²);

3 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10³);

4 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10⁴);

5 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10⁵);

6 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10⁶);

7 - кДНК норовирусов, (разведение 1:10⁷);

8 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).

Заявленная чувствительность известных наборов (аналогов и прототипа) не более 10³ геномных эквивалентов (ГЭ) в образце. Разработанный авторами заявляемый набор реагентов для одновременного выявления энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов методом ПЦР в реальном времени также имеет чувствительность – не более 10³ геномных эквивалентов (ГЭ) в образце, но при этом позволяет реализовать большую мультиплексность – 7 инфекционных агентов (передающихся через воду) в одном образце, что подтверждает получение заявленного технического результата.

Изобретение относится к наборам олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации генетического материала методом мультиплексной ПЦР. Представленный набор содержит олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации таких РНК вирусов, как энтеровирусы, ротовирусы, вирусы гепатита А и Е, аденовирусы, норовирусы и астровирусы. Изобретение может быть использовано в исследовании проб водной среды с целью выявления в них энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 ил.

1. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, энтеровирусов, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакциии, имеющих следующую структуру:

для выявления ротовирусов:

- прямой (F1) и обратный (R1) праймеры:

F1: 5`- GATATTGGACCNTCTGATTCTGC -3`

R1: 5`- ATTGCTGTNGATGAATCCATAGACAC -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):

Z1: ROX-TTAGATCGAATGCAGTTAAGACAAACGC-BHQ2

для выявления вируса гепатита А:

- прямой (F2) и обратный (R2) праймеры:

F2: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3`

R2: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTGT -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z2):

Z2: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGT-BHQ2

для выявления вируса гепатита Е:

- прямой (F3) и обратный (R3) праймеры:

F3: 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGT -3`

R3: 5`- GGTTGGTTGGATGAATATAGGG -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z3):

Z3: Cy5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC-BHQ2

для выявления энтеровирусов:

- прямой (F4) и обратный (R4) праймеры:

F4: 5`- AGTCTATTGAGCTARTTGGT -3`

R4: 5`- ACACGGACACCCAAAGTAGT -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z4):

Z4: FAM-CCTGAATGCGGCTAATCC-BHQ1

для выявления аденовирусов:

- прямой (F5) и обратный (R5) праймеры:

F5: 5`- CCACGGTGGGGTTTCTAAACTT -3`

R5: 5`- CCCAGTGGTCTTACATGCACATC -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):

Z5: ROX-TGCACCAGACCCGGGCTCAG-BHQ2

для выявления норовирусов:

- прямой (F6) и обратный (R6) праймеры:

F6: 5`- CAAGARACNATGTTCAGRTGGATGA -3`

R6: 5`- TCGACGCCATCTTCATTCACA -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z6):

Z6: R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ2

для выявления астровирусов:

- прямой (F7) и обратный (R7) праймеры:

F7: 5`- AGTTGCTTGCTGCGTTCA -3`

R7: 5`- TTGCTAGCCATCACACTTCT -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z7):

Z7: Cy5-ACAGAAGAGCAACTCCATCGC-BHQ2,

где: присутствие в нуклеотидной последовательности пуринового основания R=A или G;

присутствие в нуклеотидной последовательности пиримидинового основания Y=T или C;

следующий альтернативный порядок следования нуклеотидов: N=A или C или G или T.

2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации ротовирусов, вирусов гепатита А и Е и энтеровирусов приготовлены в виде смеси реагентов в одной пробирке.

3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации аденовирусов, норовирусов и астровирусов приготовлены в виде смеси реагентов в одной пробирке.