НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК КОРОНАВИРУСОВ ВИДОВ 229Е, NL63, ОС43, HKU1 МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ОБРАТНО-ТРАНСКРИПТАЗНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 C12N15/50 A61K39/215 

Изобретение относится к наборам для выявления генетического материала (РНК) коронавирусов в клинических образцах и секционных пробах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавирусов, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.

При помощи разработанных диагностических праймеров возможно выявление генетического материала (РНК) коронавирусов видов 229Е, NL63, OC43, HKU1.

Согласно последней классификации Международного Таксономического Комитета коронавирусы видов 229Е, NL63, OC43, HKU1 относятся к порядку Nidovirales, семейству Coronaviridae. Вирусы 229Е и NL63 относятся к роду Alphacoronavirus, вирусы OC43 и HKU1 принадлежат к роду Betacoronavirus [http://www.ictvonline.org/ virusTaxonomy.asp; Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses (2009) Carstens E.B., Arch Virol. 2010; 155(1):133].

Коронавирусы видов 229Е, NL63, OC43 и HKU1 вызывают острые респираторные инфекции. В связи с тем, что на территории России до сих пор уделяется недостаточное внимание аспектам дифференциальной диагностики респираторных патогенов, остается неясным вклад указанных вирусов в общую заболеваемость. Остаются невыясненными особенности их эпидемиологии, патогенеза. Это в свою очередь не позволяет создавать эффективные средства специфической терапии и профилактики коронавирусных инфекций, вызванных вирусами видов 229Е, NL63, OC43, HKU1. Все это делает задачу по разработке набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для идентификации РНК коронавирусов 229Е, NL63, OC43, HKU1 в клинических образцах актуальной.

Известен ряд запатентованных разработок, касающихся наборов праймеров для ПЦР-анализа, позволяющих детектировать РНК коронавирусов (заявка Республики Корея №20060017212, МПК C12Q 1/68, опубл. 23.02.2006; патент США №7718354, МПК C12Q 1/68, опубл. 18.05.2010).

Однако указанные наборы позволяют выявлять РНК коронавирусов, не дифференцируя вирусы по виду.

Известен набор праймеров для идентификации ряда семейств и видов как бактерий, так и вирусов, в том числе семейство Coronaviridae и виды коронавирусов 229E и OC43 (заявка США №20080050718, МПК C12Q 1/68, опубл. 28.02.2008).

Однако использование праймеров и зонда, лежащих в области высококонсервативного гена полимеразы коронавируса человека 229Е и ОС43 не позволяет провести глубокий эпидемиологический анализ выявленных в пробе коронавирусов 229E и OC43.

Известен коммерческий набор реагентов «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» компании «ИнтерЛабСервис» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва) [http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/index.php?sid=677] для выявления коронавирусов, вызывающих респираторные заболевания людей, на территории Российской Федерации.

Однако тест-система «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» не позволяет определить вид коронавируса, вызвавшего респираторное заболевание.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченный зонд для детекции РНК коронавируса человека HKU1 (Заявка Республики Корея №20100129888, МПК C12Q 1/68, опубл. 10.12.2010). Праймеры и зонд лежат внутри высококонсервативного гена полимеразы коронавируса человека HKU1.

Однако использование праймеров и зонда, лежащих в области высококонсервативного гена полимеразы коронавируса человека HKU1 не позволяет провести глубокий эпидемиологический анализ выявленного в пробе коронавируса. Кроме того, указанный набор праймеров и зонда обеспечивает выявление в пробе только одного коронавируса человека HKU1.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов, позволяющего за одну реакцию амплификации идентифицировать коронавирусы человека 229Е, NL63, OC43, HKU1, а также получать амплифицированный фрагмент менее консервативного S-гена коронавирусов, что дает возможность провести более глубокий эпидемиологический анализ выявленных в пробе коронавирусов.

Указанный технический результат достигается тем, что набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для детекции РНК коронавирусов человека видов 229Е, NL63, OC43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции включает для идентификации каждого вида коронавируса пару олигодезокси-рибонуклеотидов, обладающих специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно-меченный зонд, имеющие следующую структуру:

Разработанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов позволяет, как выявить наличие в образце РНК коронавирусов 229Е, NL63, OC43, HKU1, так и получать в зависимости от вида вируса фрагменты длиной 260-569 пар оснований (п.о.), что позволяет провести секвенирование полученного ампликона и провести более глубокое исследование выявленного материала. Кроме этого, с помощью предложенных праймеров можно провести ПЦР в два раунда, которая является более чувствительным методом. К тому же в разработанном наборе могут быть использованы контрольные образцы с известной концентрацией для выявления вирусной нагрузки в исследуемой пробе.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг.1 (А, Б, В и Г) приведен результат ПЦР-анализа в режиме реального времени, полученный с использованием рекомбинантных плазмид (pHCoV-229E, pHCoV-HKU1, pHCoV-NL63, pHCoV-OC43), несущих вирусспецифическую вставку S гена коронавируса человека видов 229Е (фиг.1,А), HKU1 (фиг.1, Б), NL63 (фиг.1, В) и OC43 (фиг.1, Г) по каналам FAM (470/510 нм), ROX(585/610 нм), R6G (530/555 нм) и Cy5 (625/660 нм). На фиг.2 приведен результат ПЦР-анализа после разделения продуктов амплификации, полученных с использованием рекомбинантных плазмид (pHCoV), несущих вирусспецифическую вставку S гена коронавирусов человека видов 229Е, NL63, OC43, HKU, в 2% агарозном геле

Описание методики конструирования набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов на консервативную область S гена (spike protein) генома коронавирусов 229Е, NL63, OC43, HKU1. Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. Важно отметить, что все этапы оптимизации проведения ОТ-ПЦР были осуществлены с использованием коммерческих ферментов и приборов для амплификации, являясь коммерчески доступными, они предназначены для массового применения в диагностических лабораториях России. Это позволяет широко применять данное изобретение в лабораторной практике.

Используемые в работе последовательности геномов вирусов были получены из международной базы данных GenBank. Для построения элайнментов, анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0.0 (Informax, США) и онлайн интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI).

Ниже в таблице 1 и в приложении к заявке приведен заявляемый набор праймеров и зондов для детекции коронавирусов.

Референс-последовательности базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI): 1 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_002645.1 (NC_002645.1), 2 - Human □oronavirus HKU1, complete genome (NC_006577.2), 3 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_005831.2 (NC_005831.2), 4 - Human coronavirus OC43, complete genome (AY391777.1).

В ходе работы было проанализировано 38 имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей S гена коронавируса 229Е, 59 нуклеотидных последовательностей S гена коронавируса ОС43, 60 нуклеотидных последовательностей S гена коронавируса NL63, 56 нуклеотидных последовательностей S гена коронавируса HKU1.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования. После чего компетентные клетки E. Coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученными плазмидами pCR2.1 (Invitrogen, США), несущими вирусспецифическую вставку синтезированных фрагментов ДНК. В ходе проделанной работы было сконструировано 4 рекомбинантные плазмиды: pHCoV-229E, pHCoV-OC43, pHCoV-NL63, pHCoV-HKU1. Наличие специфической к вирусному геному ДНК-вставки подтверждали секвенированием.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ОТ-ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды pHCoV, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Реакцию амплификации проводили в 30 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl₂, 0.17 мМ каждого из нуклеозид-трифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), в смесь также добавляли 0.3 мкМ прямого и обратного праймеров и 0.1 мкМ флуоресцентного ДНК-зонда.

30 мкл ПЦР-смеси имеет следующий состав (из расчета на одну пробирку):

Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналам - Green 470/510 нм (краситель FAM), Yellow 530/555 нм (краситель R6G), Orange 585/610 нм (краситель ROX), Red 625/660 нм (краситель Cy5). Измерение флюоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг.1 (А. Б, В и Г)).

Дополнительно проводили электрофорез продуктов ПЦР в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (Ethidium bromide). Результаты оценивали по наличию флуоресцирующих полос, соответствующих фрагментам ДНК в 720 п.о. (фиг.2). Полосы флуоресценции в геле соответствовали полученным в реакции амплификации участкам плазмидной ДНК - pHCoV.

Для определения аналитической чувствительности метода, были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК (pHCoV). Концентрацию плазмидной ДНК определяли при помощи коммерческого набора реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США). Аналитическая чувствительность разработанного метода с использованием внутренних праймеров для всех четырех инфекционных агентов составила 10³ геномных эквивалентов в мл (ГЭ/мл). При постановке ПЦР в два раунда аналитическая чувствительность составила 10² ГЭ/мл.

В результате проделанной работы был получен следующий технический результат: разработан набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации РНК коронавирусов человека видов 229Е, NL63, OC43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с детекцией в режиме реального времени в клинических образцах.

Разработанный набор позволяет выявить до 1000 копий молекулы кДНК при постановке ПЦР в один раунд и до 100 копий молекулы кДНК при постановке ПЦР в два раунда.

Таким образом, заявляемый набор праймеры и зонды позволяют получать амплифицированный фрагмент менее консервативного S-гена коронавирусов, что дает возможность провести более глубокий эпидемиологический анализ выявленного в пробе коронавируса. К тому же выбранные нами дезоксирибонуклеотидные праймеры и зонды позволяют за одну реакцию амплификации, идентифицировать одновременно 4 вида коронавирусов человека. Кроме этого реакцию амплификации с выбранными нами праймерами можно провести в 2 раунда, что позволяет выявлять единичные копии генетического материала коронавирусов 4 видов: 229Е, NL63, OC43, HKU1.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов для идентификации РНК коронавирусов видов 229Е, NL63, ОС43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии. 2 ил., 1 табл.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для детекции РНК коронавирусов человека видов 229Е, NL63, ОС43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции, включающий для идентификации каждого вида коронавируса пару олигодезокси-рибонуклеотидов, обладающих специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно меченый зонд, имеющие следующую структуру:
- последовательности видоспецифические к коронавирусу человека 229Е: внешний 5r→3r
5r-GCAACGGCYGTGTTGG-3r
внутренние 5r→3r
5r-ТATTGCTTYGTAAATACTACTATTGGC-3r
5r-TRACGGCTTCTACATTACCTAAAG-3r
зонд 5r→3r
FAM-TGCACTACCTAAGACAGTTCGTGAGTTT-BHQ1;
- последовательности видоспецифические к коронавирусу человека HKU1:
внешний 5r→3r
5r-TTRTGAGGTTGAACAACAATAGTATAAGA-3r
внутренние 5r→3r
5r-GCCTACAACAYTAGCTGTTATAGGTG-3r
5r-GCACCAGATTTAGGRAAATAACC-3r
зонд 5r→3r
ROX-CCTCGCATAAGTGAGTATGTTGTGGAT-BHQ2
ROX-CCGCGTATAAGCGAGGATGTTGTTGAT-BHQ2;
- последовательности видоспецифические к коронавирусу человека NL63: внешние 5r→3r
5r-TTTGATAACCAGTCGAAGTCACC-3r
5r-CTGATTAGGAATCAAYTCAGCAAG-3r
внутренние 5r→3r
5r-GTTGGAAGCGTGTTCCTACC-3r
5r-ATCAACACCATTCTGAACAAGATC-3r
зонд 5r→3r
R6G-TGTTATTCAGTGCTTTGGTCCTCGT-BHQ2
- последовательности видоспецифические к коронавирусу человека ОС43: внешние 5r→3r
5r-TTTATATGATTCTAAYGGTAATCTCTAYG-3r
5r-CCACTACCTACTGTGAGATCACATG-3r
внутренние 5r→3r
5r-GTCGTGTTTCWGCGGCC-3r
5r-GCATTGACAACACAACCAAGAT-3r
зонд 5r→3r
Cy5-CGAACCAGCATTGCTATYTCGG-BHQ2