ПЕПТИДЫ MPHOSPH1 И ВАКЦИНЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ИХ Российский патент 2017 года по МПК C07K7/06 C07K14/705 C07K16/30 C12N15/12 C12N5/783 C12N5/784 C12N15/63 A61K39/00 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биологических наук, более конкретно к области терапии злокачественной опухоли. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются эффективными в качестве вакцин против злокачественной опухоли, а также к лекарственным средствам для любого или обоих из лечения и профилактики опухолей.

Приоритет

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 61/522991, поданной 12 августа 2011 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Уровень техники

Было показано, что цитотоксические T-лимфоциты (CTL) распознают эпитопные пептиды, происходящие из ассоциированных с опухолью антигенов (TAA), находящихся на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем уничтожают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) с помощью иммунологических подходов было открыто множество других TAA (NPL 1, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время находятся в клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Для пролиферации и выживания злокачественных клеток необходимы способствующие TAA. Использование таких TAA в качестве мишеней для иммунотерапии может минимизировать хорошо описанный риск ускользания от иммунного ответа злокачественных клеток, присущего делеции, мутации или подавлению регуляции TAA, вследствие терапевтически обусловленной иммунной селекции. Таким образом, идентификация новых TAA, способных индуцировать мощные и специфичные противоопухолевые иммунные ответы, оправдывает дальнейшую разработку, и, таким образом, в настоящее время клинически применяются стратегии вакцинации пептидами от различных типов злокачественных опухолей (NPL 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). На настоящий момент описано несколько клинических испытаний с использованием этих пептидов, происходящих из опухолевых антигенов. К сожалению, многие из текущих испытаний вакцин против злокачественной опухоли продемонстрировали только низкий уровень объективных ответов (NPL 11, Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). Таким образом, в данной области остается потребность в новых TAA в качестве иммунотерапевтических мишеней.

MPHOSPH1 (фосфопротеин 1 M-фазы; номер доступа GenBank № NM_016195 и NP_057279, SEQ ID NO: 125 и 126), был идентифицирован в качестве одного из белков, специфически фосфорилируемых при переходе G2/M, и его характеризуют как белок, родственный направленному на плюс-конец кинезину (NPL 14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.). Более конкретно, было описано, что MPHOSPH1 является направленным на плюс-конец молекулярным мотором, который играет ключевую роль в цитокинезе и накапливается в средней зоне веретена в клетках HeLa в процессе от анафазы до телофазы (NPL 14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; NPL 15, Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8). В ходе анализов профиля экспрессии генов с использованием полногеномных кДНК-микрочипов, содержащих 23040 генов, MPHOSPH1 был идентифицирован в качестве новой молекулы, активируемой при раке мочевого пузыря (NPL 16, Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1;67(7):3276-85.; PTL 1, WO2006/085684). Более того, с помощью нозерн-блот анализа было выявлено, что экспрессия продуктов гена MPHOSPH1 ограничена семенником и отсутствует в нормальных жизненно-важных органах.

Ранее были идентифицированы некоторые пептидные фрагменты, происходящие из MPHOSPH1, имеющие способность индуцировать цитотоксические T-лимфоциты (CTL) (PTL 2, WO2008/047473). Эти пептидные фрагменты продемонстрировали способность индуцировать CTL против клеток, стимулированных распознаваемыми ими пептидными фрагментами. Однако в предшествующих исследованиях не было подтверждено, обладают ли пептидные фрагменты способностью индуцировать CTL, нацеленные на опухолевые клетки, экспрессирующие ген MPHOSPH1 и антиген HLA-A2.

Список ссылок

[Патентная литература]

[PTL 1] WO2006/085684

[PTL 2] WO2008/047473

[Непатентная литература] [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.

[NPL 15] Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8

[NPL 16] Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1; 67(7):3276-85.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии новых пептидов, которые могут служить в качестве подходящих мишеней для иммунотерапии. Поскольку TAA, главным образом, воспринимаются иммунной системой как "свое" и, таким образом, часто не обладают иммуногенностью, открытие подходящих мишеней является крайне важным. Как указано выше, MPHOSPH1 (например, SEQ ID NO: 126, кодируемый геном с номером доступа в GenBank № NM_016195 (SEQ ID NO: 125)) был идентифицирован в качестве активированного в злокачественных опухолях, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и рак мягких тканей. Таким образом, настоящее изобретение сфокусировано на MPHOSPH1 в качестве мишени-кандидата для иммунотерапии злокачественной опухоли/опухоли, более конкретно на новых эпитопных пептидах MPHOSPH1, которые могут служить в качестве подходящих иммунотерапевтических мишеней.

В связи с этим, настоящее изобретение относится, по меньшей мере частично, к идентификации определенных эпитопных пептидов, которые обладают способностью индуцировать CTL, специфичные к MPHOSPH1, среди пептидов, происходящих из MPHOSPH1. Как более подробно рассмотрено ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали с использованием пептидов-кандидатов, связывающих HLA-A*0201, происходящих из MPHOSPH1. Затем получали клеточные линии CTL со специфической активностью против положительных по HLA-A2 клеток-мишеней, обрабатываемых каждым из пептидов-кандидатов. Результаты, представленные в настоящем описании, демонстрируют, что эти пептиды представляют собой ограниченные по HLA-A2 эпитопные пептиды, которые могут индуцировать мощные и специфические иммунные ответы против клеток, экспрессирующих MPHOSPH1. Кроме того, эти результаты указывают на то, что MPHOSPH1 является высоко иммуногенными и его эпитопы являются эффективными мишенями для иммунотерапии злокачественной опухоли/опухоли.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление выделенных пептидов, которые связывают антиген HLA и индуцируют CTL, где пептиды включают иммунологически активный фрагмент MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126). Такие пептиды можно использовать для индукции CTL in vitro или ex vivo, или для введения прямо индивидууму, так чтобы индуцировать in vivo иммунные ответы против злокачественных опухолей, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Пептиды по настоящему изобретению обычно имеют длину менее 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот. Предпочтительными пептидами по настоящему изобретению являются нонапептиды или декапептиды. Особенно предпочтительные пептиды имеют аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, поскольку показано, что эти пептиды связываются с антигеном HLA-A2 и индуцируют CTL.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению представляют собой пептиды длиной менее 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120. В типичных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению представляют собой нонапептиды или декапептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120. Более того, как продемонстрировано в настоящем описании, было подтверждено, что пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, индуцирует CTL, нацеленные на опухолевые клетки, экспрессирующие MPHOSPH1 и антиген HLA-A2. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению представляют собой пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.

При контактировании с антигенпредставляющими клетками (APC) in vitro, ex vivo или in vivo, пептиды по настоящему изобретению связываются с антигенами HLA-A2 на APC и представляются на APC в качестве комплексов с антигенами HLA-A2. Альтернативно пептиды по настоящему изобретению могут захватываться в APC, процессироваться до фрагментов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120 в APC, и представляться на APC в качестве комплексов с антигенами HLA-A2. Следовательно, индуцируются CTL, специфичные к таким пептидам, и такие CTL считаются элементами настоящего изобретения.

Также настоящее изобретение относится к модифицированным пептидам, имеющим аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, при условии, что модифицированные пептиды сохраняют способность индуцировать CTL, эквивалентную способности индуцировать CTL исходного немодифицированного пептида. В связи с этим, настоящее изобретение относится к выделенному пептиду длиной менее 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот, который обладает способностью индуцировать CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) аминокислотной последовательности, где 1, 2 или несколько аминокислота(аминокислот) заменены в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14 и 64, и

(ii) аминокислотной последовательности согласно (i), где аминокислотная последовательность имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) C-концевая аминокислота указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из валина и лейцина.

Более того, настоящее изобретение также относится к выделенному пептиду длиной менее 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот, который обладает способностью индуцировать CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i') аминокислотной последовательности, где 1, 2 или несколько аминокислота(аминокислот) заменены в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73, 77, 79, 97, 103 и 120, и

(ii) аминокислотной последовательности согласно (i), где аминокислотная последовательность имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) C-концевая аминокислота указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из валина и лейцина.

Как продемонстрировано в настоящем описании, такие пептиды могут связываться с антигенами HLA-A2 на APC и могут быть представлены на APC в качестве комплексов с антигенами HLA-A2. Альтернативно такие пептиды могут захватываться в APC, процессироваться до фрагментов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из (i), (ii), (i') и (ii') в APC, и представляться на APC в качестве комплексов с антигенами HLA-A2, когда эти пептиды контактируют с APC. Следовательно, индуцируются CTL, специфичные к таким пептидам, и такие CTL считаются элементами настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает выделенные полинуклеотиды, которые кодируют любые из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды можно использовать для индукции или получения APC, имеющих способность индуцировать CTL. Подобно описанным выше пептидам по настоящему изобретению, такие APC можно вводить индивидууму для индукции иммунных ответов против злокачественных опухолей.

При введении индивидууму пептиды по настоящему изобретению представляются на поверхности APC, чтобы индуцировать нацеливание CTL на соответствующие пептиды. Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является предоставление средств или композиций, которые включают один или несколько пептид(ов) или полинуклеотид(ов), предусмотренный согласно настоящему изобретению, для индукции любой или обеих из APC или CTL. Такие средства или композиции также можно использовать для одной или более цели(ей), выбранной из лечения злокачественной опухоли, профилактики злокачественной опухоли или предупреждения послеоперационного рецидива злокачественной опухоли. Примеры злокачественных опухолей-мишеней включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей. Таким образом, другой задачей настоящего изобретения предоставление фармацевтических средств или композиций для любого или обоих из лечения злокачественной опухоли и профилактики злокачественной опухоли, причем такие фармацевтические средства или композиции составлены так, чтобы они включали один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Вместо или в дополнение к пептидам или полинуклеотидам по настоящему изобретению, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать в качестве активных ингредиентов APC или экзосомы, которые представляют любой из пептидов по настоящему изобретению.

Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индукции APC, которые представляют на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, например, при контактировании APC с пептидом по настоящему изобретению или введении полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC. Такие APC способны индуцировать CTL, которые специфично распознают клетки, которые представляют пептиды-мишени на их поверхности и применимы в иммунотерапии злокачественной опухоли. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способы индукции APC, имеющих способность индуцировать CTL, а также APC, полученных такими способами. Кроме того, настоящее изобретение также охватывает средства или композиции для применения в индукции APC, причем такие средства или композиции включают любые пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению.

Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление способа индукции CTL, причем такой способ включает стадию совместного культивирования CD8-положительных T-клеток с APC или экзосомами, представляющими пептид по настоящему изобретению на их поверхности, или стадию введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR может связываться с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, представленного на клеточной поверхности. CTL, полученные такими способами, могут быть применимы в любом или обоих из лечения злокачественной опухоли и профилактики злокачественной опухоли. Примеры злокачественных опухолей включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление выделенных APC, которые представляют на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые нацелены на пептиды по настоящему изобретению. Эти APC и CTL применимы в контексте иммунотерапии злокачественной опухоли.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способов индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем такие способы включают стадию введения средства или композиции, которые включают по меньшей мере один компонент, выбранный из пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотидов, кодирующих такие пептиды, экзосом или APC, представляющих такие пептиды и CTL, которые распознают клетки, представляющие такие пептиды на их поверхности.

Применимость настоящего изобретения распространяется на любое из ряда заболеваний, связанных с сверхэкспрессией MPHOSPH1 или обусловленных ей, таких как злокачественная опухоль, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Более конкретно, настоящее изобретение относится следующим: [1] Выделенный пептид согласно следующим ниже (a) или (b):

(a) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120;

(b) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, где 1, 2 или несколько аминокислота(аминокислот) заменена, удалена, вставлена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, и где пептид обладает способностью индуцировать цитотоксические T-лимфоциты (CTL),

[2] Выделенный пептид согласно [1], где пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, выбрана из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, выбрана из группы, состоящей из валина и лейцина,

[3] Выделенный пептид согласно [1] или [2], где пептид представляет собой нонапептид или декапептид,

[4] Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид согласно любому из [1]-[3],

[5] Композиция для индукции CTL, где композиция содержит один или несколько пептид(ов) согласно любому из [1]-[3], или один или несколько полинуклеотид(ов) согласно [4],

[6] Композиция для индукции APC, имеющих способность индуцировать CTL, где композиция содержит один или несколько пептид(ов) согласно любому из [1]-[3], или один или несколько полинуклеотид(ов) согласно [4],

[7] Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) одного или более пептидов согласно любому из [1]-[3];

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих пептид согласно любому из [1]-[3];

(c) одной или более APC или экзосом, которые представляют комплекс пептида согласно любому из [1]-[3] и антигена HLA на их поверхности; и

(d) одна или несколько CTL, которые распознают клетку, представляющую комплекс пептида согласно любому из [1]-[3] и антигена HLA на ее поверхности,

[8] Фармацевтическая композиция согласно [7] для применения в любом или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли, или для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума,

[9] Фармацевтическая композиция согласно [7] или [8], где фармацевтическая композиция составлена для введения индивидууму, антигеном HLA которого является HLA-A2,

[10] Способ индукции антигенпредставляющей клетки (APC), обладающей способностью индуцировать CTL, причем указанный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) контактирования APC с пептидом согласно любому из [1]-[3] in vitro, ex vivo или in vivo, и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид согласно любому из [1]-[3], в APC,

[11] Способ индукции CTL, причем указанный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с APC, которая представляет на ее поверхности комплекс антигена HLA и пептида согласно любому из [1]-[3];

(b) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая представляет на ее поверхности комплекс антигена HLA и пептида по любому из [1]-[3]; и

(c) введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, в CD8-положительную T-клетку, где TCR может связываться с комплексом антигена HLA и пептида согласно любому из [1]-[3], представленным на клеточной поверхности,

[12] Выделенная APC, которая представляет на ее поверхности комплекс антигена HLA и пептида согласно любому из [1]-[3],

[13] APC согласно [12], которая индуцируется способом согласно [10],

[14] Выделенная CTL, которая распознает клетку, представляющую на ее поверхности комплекс антигена HLA и пептида согласно любому из [1]-[3],

[15] CTL согласно [14], где указанная CTL индуцируется способом согласно [11],

[16] Способ любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли у индивидуума, где способ включает стадию введения индивидууму (a) фармацевтически эффективного количества(количеств):

(a) одного или более пептидов согласно любому из [1]-[3];

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих пептид согласно любому из [1]-[3];

(c) одной или более APC или экзосом, которые представляют комплекс пептида согласно любому из [1]-[3] и антигена HLA на их поверхности; или

(d) одной или более CTL, которые распознают клетку, представляющую комплекс пептида согласно любому из [1]-[3] и антигена HLA на ее поверхности,

[17] Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает стадию введения индивидууму композиции, содержащей пептид согласно любому из [1]-[3] или полинуклеотид, кодирующий пептид,

[18] Антитело или его иммунологически активный фрагмент против пептида согласно любому из [1]-[3],

[19] Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид согласно любому из [1]-[3],

[20] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором согласно [19], и

[21] Диагностический набор, содержащий пептид согласно любому из [1]-[3], полинуклеотид согласно [4] или антитело согласно [18].

Задачи и признаки изобретения станут более понятными при прочтении следующего описания вместе с прилагаемыми фигурами и примерами. Следует понимать, что как в вышеуказанном описании сущности настоящего изобретения, так и в нижеследующем подробном описании проиллюстрированы варианты осуществления, и они не ограничивают настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя изобретение описано в настоящем описании применительно к ряду конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что описание иллюстрирует изобретение и его не следует истолковывать, как ограничивающее изобретение. Специалисты в данной области способны осуществить различные модификации и применения без отклонения от сущности и объема изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения. Аналогично, другие задачи, признаки, польза и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из этого описания сущности изобретения и определенных вариантов осуществления, описанных ниже, и будут хорошо понятны специалистам в данной области. Такие задачи, признаки, польза и преимущества будут понятны из представленного выше описания совместно с прилагаемыми примерами, данными, фигурами и всеми обоснованными выводами, сделанными на их основе, отдельно или с учетом ссылок, включенных в настоящее описание.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применения настоящего изобретения станут очевидными квалифицированному специалисту с учетом краткого описания чертежей и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют.

[Фиг.1]

На фиг.1 представлена серия фотографий (a)-(j), на которых представлены результаты анализа с помощью ELISPOT IFN-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, происходящими из MPHOSPH1. CTL в лунке номер #7, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), в лунке #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), в лунке #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), в лунке #2, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), в лунке #1, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), в лунке #1, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f), в лунке #4, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), в лунке #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) и в лунке #8, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i) показали высокую продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях указывает на то, что клетки из соответствующей лунки увеличивали в количестве для получения линий CTL. Напротив, как типично для отрицательных данных, специфическое продуцирование IFN-гамма из CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-575 (SEQ ID NO: 1) (j), не показано. На фигурах "+" указывает на продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, обработанных соответствующим пептидом, и "-" указывает на продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных никакими пептидами.

[Фиг.2a-f]

Фигура 2a-f состоит из серии линейных графиков, (a)-(f), на которых представлены результаты анализа ELISA IFN-гамма, демонстрирующего продукцию IFN-гамма в линиях CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), и MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f). Количество IFN-гамма, который продуцировали линии CTL, измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, полученные путем стимуляции каждым пептидом, демонстрируют мощную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает на продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, обработанных соответствующим пептидом, и "-" указывает на продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных никакими пептидами. Соотношение R/S указывает на соотношение количества отвечающих клеток (линия CTL) и стимулирующих клеток.

[Фиг.2g-i]

Фигура 2g-i состоит из серии графиков, (g)-(i), на которых представлены результаты анализа ELISA IFN-гамма, демонстрирующего продукцию IFN-гамма в линиях CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i). Количество IFN-гамма, который продуцировали линии CTL, измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, полученные путем стимуляции каждым пептидом, демонстрируют мощную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает на продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, обработанных соответствующим пептидом, и "-" указывает на продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных никакими пептидами. Соотношение R/S указывает на соотношение количества отвечающих клеток (линия CTL) и стимулирующих клеток.

[Фиг.3]

Фигура 3 состоит из серии линейных графиков, (a)-(e), на которых представлена продукция IFN-гамма клонами CTL, полученными путем ограниченных разведений из линий CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (b), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (c), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (d) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (e). Результаты демонстрируют, что клоны CTL, полученные стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют высокую продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре "+" указывает на продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, обработанных соответствующим пептидом, и "-" указывает на продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных никакими пептидами. Соотношение R/S указывает на соотношение количества отвечающих клеток (линия CTL) и стимулирующих клеток.

[Фиг. 4]

На фиг.4 представлен линейный график, на котором представлена специфическая активность CTL против опухолевых клеточных линий. Клетки J82, которые экспрессируют как MPHOSPH1, так и HLA-A*0201, клетки HT1376, которые экспрессируют MPHOSPH1, но не HLA-A*0201, и клетки T2, которые экспрессируют HLA-A*0201, но не MPHOSPH1, использовали в качестве стимулирующих клеток. Клон CTL, полученный с помощью MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), продемонстрировал специфическую активность CTL против клеток J82. С другой стороны не было выявлено специфической активности CTL против клеток HT1376 и T2. Соотношение R/S указывает на соотношение количества отвечающих клеток (линия CTL) и стимулирующих клеток.

[Фиг.5]

На фиг.5 представлен линейный график, на котором изображена цитотоксическая активность CTL против опухолевых клеточных линий. Клетки UMUC-3, которые экспрессируют как MPHOSPH1, так и HLA-A*0201, клетки MKN4, которые экспрессируют MPHOSPH1, но не HLA-A*0201, и T2, которые экспрессируют HLA-A*0201, но не MPHOSPH1, использовали в качестве клеток-мишеней. Клон CTL, полученный с помощью MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), продемонстрировал мощную цитотоксическую активность против клеток UMUC-3. С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности CTL против клеток MKN45 и T2. Соотношение E/T указывает на соотношение количества эффекторных клеток (клон CTL) и клеток-мишеней.

[Фиг.6]

На фиг.6 представлен линейный график, на котором изображена цитотоксическая активность CTL против клеток-мишеней, которые экспрессируют MPHOSPH1 и HLA-A*0206. В качестве контроля получали клетки COS7, трансфицированные HLA-A*0206 или полноразмерным геном MPHOSPH1. Линия CTL, полученная с MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), показала специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфицированных как MPHOSPH1, так и HLA-A*0206 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих либо HLA-A*0206 (треугольник), либо MPHOSPH1 (круг).

Описание вариантов осуществления

Хотя для осуществления на практике или испытания вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, предпочтительные способы, устройства и материалы описаны в настоящем описании. Однако до описания материалов и способов по настоящему изобретению, следует понимать, что эти описания являются только иллюстративными и не предполагается, что они являются ограничивающими. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретным и размерами, формами, форматами, материалами, методологиями, протоколами и т.д., описанными в настоящем описании, поскольку они могут варьировать в соответствии с общепринятым экспериментированием и/или оптимизацией. Более того, терминология, используемая в описании, предназначена только для описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

Описание каждой публикации, патента и патентной заявки, упомянутых в этом описании, конкретно включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Однако ничто в настоящем документе не следует истолковывать как допущение того, что настоящее изобретение дает право на противопоставление факта создания изобретения с более ранним приоритетом.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречий, настоящее описание, включая определения, будет решающим.

Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

I. Определения

Форма единственного числа, как используют в рамках изобретения, означает "по меньшей мере один", если конкретно не указано иное.

Термины "выделенный" и "очищенный", используемые применительно к веществу (например, пептиду, антителу, полинуклеотиду и т.д.), указывают на то, что вещество по существу свободно по меньшей мере от одного вещества, которое также может быть включено в природный источник. Таким образом, выделенный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу свободен от клеточного материала, такого как углевод, липид или другие загрязняющие белки из клеточного или тканевого источника, из которого происходит пептид, или по существу свободен от химических предшественников или других химических веществ, когда он химически синтезирован. Термин "по существу свободен от клеточного материала" включает препараты пептида, в которых пептид отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или рекомбинантно продуцирован. Таким образом, пептид, который по существу свободен от клеточного материала, включает препараты полипептида, имеющие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по массе сухого вещества) гетерологичного белка (также называемого в настоящем описании "загрязняющим белком"). Когда пептид продуцирован рекомбинантными способами, он также предпочтительно по существу свободен от культуральной среды, которая включает препараты пептида с культуральной средой, составляющей менее чем приблизительно 20%, 10% или 5% от объема пептидного препарата. Когда пептид продуцируют химическим синтезом, он предпочтительно по существу свободен от химических предшественников или других химических веществ, которые включают препараты пептида, причем химические предшественники или другие химические вещества, вовлеченные в синтез пептида, составляют менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (по массе сухого вещества) от объема пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат содержит выделенный или очищенный пептид, может быть показано, например, по появлению единичной полосы после полиакриламидного гель-электрофореза с додецилсульфатом натрия (SDS) белкового препарата и по окрашиванию геля кумасси бриллиантовым синим или сходными с ним. В предпочтительном варианте осуществления пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению являются выделенными или очищенными.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотный остаток(ов) может представлять собой модифицированный остаток(и) или не встречающийся в природе остаток(и), такой как искусственный химический миметик(и) соответствующей встречающейся в природе аминокислоты(аминокислот), а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот.

Термин "олигопептид" иногда используют в настоящем описании для обозначения пептидов по настоящему изобретению, которые имеют длину 20 остатков или менее, как правило, 15 остатков или менее и, как правило, состоят из от приблизительно 8 до приблизительно 11 остатков, часто 9 или 10 остатков. Последние называют в настоящем описании "нонапептидами" и "декапептидами", соответственно.

Термин "аминокислота", как используют в рамках изобретения, относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют сходным образом со встречающимися в природе аминокислотами. Аминокислота может представлять собой либо L-аминокислоту, либо D-аминокислоту. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Выражение "аналог аминокислоты" относится к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппа, аминогруппа и R-группа), как и встречающаяся в природе аминокислота, однако имеют одну или несколько модифицированную R-группу(групп) или модифицированную основную цепь (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин метилсульфоний). Выражение "миметик аминокислоты" относится к химическим соединениям, которые имеют отличающиеся структуры, но сходные функции с основными аминокислотами.

Аминокислоты могут обозначаться в настоящем описании с помощью их широко известного трехбуквенного обозначения или однобуквенного обозначения, рекомендованного IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

Термины "ген", "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используют в настоящем описании взаимозаменяемо и, если конкретно не указано иное, аналогично аминокислотам, обозначаемым их общепринятым однобуквенным кодом.

Термины "средство" и "композиция" используют в рамках изобретения взаимозаменяемо для обозначения продукта, который включает указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который является результатом, прямо или непрямо, комбинирования указанных ингредиентов в указанных количествах. Такие термины, когда их используют применительно к определению "фармацевтический" (как в "фармацевтическом средстве" и "фармацевтической композиции") охватывают продукт, который включает активный ингредиент(ы), и любой инертный ингредиент(ы), который составляет носитель, а также любой продукт, который является результатом, прямо или непрямо, комбинации, образования комплекса или агрегации любых двух или более ингредиентов, или диссоциации одного или более из ингредиентов, или других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термины "фармацевтическое средство" и "фармацевтическая композиция" относятся к любому продукту, полученному смешением молекулы или соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.

Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель", как используют в рамках изобретения, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включающие, но не ограничивающиеся ими, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению особенно применимы в качестве вакцин. В контексте настоящего изобретения выражение "вакцина" (также называемая "иммуногенной композицией") относится к средству или композиции, которые обладают функцией индукции противоопухолевого иммунитета при инокуляции животным.

Термин "активный ингредиент" в рамках настоящего изобретения относится к веществу в средстве или композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в контексте фармацевтического средства или композиции термин "активный ингредиент" относится к веществу, которое демонстрирует объективный фармакологический эффект. Например, в случае фармацевтических средств или композиций для применения в лечении или профилактике злокачественной опухоли, активные ингредиенты в средствах или композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на злокачественные клетки и/или ткани, прямо или непрямо. Предпочтительно, такое действие может включать снижение или ингибирование роста клеток, повреждение или уничтожение злокачественных клеток и/или тканей и т.д. Как правило, непрямым эффектом активных ингредиентов является индукция CTL, распознающих или уничтожающих злокачественные клетки. Перед включением в состав "активный ингредиент" также может обозначаться как "активное вещество", "лекарственное вещество" или "технический продукт".

Если не определено иначе, термин "злокачественная опухоль" относится к злокачественным опухолям, которые сверхэкспрессируют ген MPHOSPH1, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Если не определено иначе, термины "цитотоксический T-лимфоцит", "цитотоксическая T-клетка" и "CTL" используют в настоящем описании взаимозаменяемо и, если конкретно не указано иное, они относятся к подгруппе T-лимфоцитов, которые способны распознавать не являющиеся собственными клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

Если не определено иначе, термин "HLA-A2", как используют в рамках изобретения, как правило, относится к подтипам, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 и HLA-A*0250.

Если не определено иначе, термин "набор", как используют в рамках изобретения, используют в отношении комбинации реагентов и других материалов. В рамках настоящего изобретения предусматривается, что набор может включать микроматрицу, чип, маркер и т.д. Не предполагают, что термин "набор" ограничивается конкретной комбинацией реагентов и/или материалов.

Как используют в рамках изобретения, в контексте индивидуума или пациента, выражение "антиген HLA индивидуума или пациента представляет собой HLA-A2", относится к тому, что индивидуум или пациент гомозиготно или гетерозиготно обладает геном антигена HLA-A2 в качестве молекулы MHC (главный комплекс гистосовместимости) класса I, и в клетках индивидуума или пациента экспрессируется антиген HLA-A2 в качестве антигена HLA.

В той степени, в которой способы и композиции по настоящему изобретению применимы в контексте "лечения" злокачественной опухоли, лечение считается "эффективным", если оно приводит к клинической пользе, такой как снижение размера, распространения или потенциала к метастазированию злокачественной опухоли у индивидуума, замедление прогрессирования злокачественной опухоли, смягчение клинического симптома злокачественной опухоли, продление выживаемости, подавление послеоперационного рецидива и т.д. Когда лечение применяют профилактически, "эффективный" означает, что оно замедляет или предотвращает образование злокачественной опухоли или предотвращает или смягчает клинический симптом злокачественной опухоли. Эффективность определяют в соответствии с любым известным способом диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

В той степени, в которой способы и композиции по настоящему изобретению применимы в контексте "предупреждения" и "профилактики" злокачественной опухоли, такие термины используют в рамках настоящего изобретения взаимозаменяемо для обозначения любой активности, которая снижает уровень смертности от заболевания или заболеваемости им. Предупреждение и профилактика могут происходить "на первичном, вторичном и третичном уровнях предупреждения". В то время как при первичном предупреждении и профилактике развитие заболевания не происходит, вторичный и третичный уровни предупреждения и профилактики охватывают активность, нацеленную на предупреждение и профилактику прогрессирования заболевания и возникновение симптомов, а также на снижение отрицательного воздействия уже возникшего заболевания путем восстановления функции и уменьшения обусловленных заболеванием осложнений. Альтернативно предупреждение и профилактика могут включать широкий диапазон профилактических способов терапии, нацеленных на смягчение тяжести конкретного нарушения, например, снижение пролиферации и метастазирования опухолей.

В контексте настоящего изобретения лечение и/или профилактика злокачественной опухоли и/или предупреждение ее послеоперационного рецидива включают любой из видов активности, которые приводят, например, к следующим событиям, таким как ингибирование роста злокачественных клеток, обратное развитие или регрессия опухоли, индукция ремиссии и подавление возникновения злокачественной опухоли, регрессия опухоли и снижение или ингибирование метастазирования, подавление послеоперационного рецидива злокачественной опухоли и продление выживаемости. Эффективное лечение и/или профилактика злокачественной опухоли снижает смертность и улучшает прогноз у индивидуумов, имеющих злокачественную опухоль, снижает уровни опухолевых маркеров в крови и смягчает выявляемые симптомы, сопровождающие злокачественную опухоль. Например, снижение или улучшение симптомов, эффективно обеспечивающих лечение и/или профилактику, включает снижение на 10%, 20%, 30% или более, или стабильное заболевание.

В контексте настоящего изобретения термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые специфически реагируют с намеченным белком или его пептидом. Антитело может включать антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Более того, антитело в рамках настоящего изобретения используют в наиболее широком значении и конкретно оно охватывает целые моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух целых антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. "Антитело" указывает на все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

II. Пептиды

Пептиды по настоящему изобретению, подробно описанные ниже, могут быть обозначены как "пептид(ы) MPHOSPH1" или "полипептид(ы) MPHOSPH1".

Чтобы продемонстрировать, что пептиды, происходящие из MPHOSPH1, функционируют в качестве антигена, распознаваемого CTL, пептиды, происходящие из MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126), анализировали для определения того, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными по HLA-A2, которые представляют собой часто встречающиеся аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994).

Кандидаты для связывающих HLA-A2 пептидов, происходящих из MPHOSPH1, идентифицировали на основе их аффинности связывания с HLA-A2.

Более того, после стимуляции in vitro T-клеток дендритными клетками (DC), обработанными (нагруженными) этими пептидами, успешно получали CTL путем стимуляции DC каждым из следующих пептидов:

MPHOSPH1-A2-9-850 (SEQ ID NO: 5),

MPHOSPH1-A2-9-129 (SEQ ID NO: 14),

MPHOSPH1-A2-9-846 (SEQ ID NO: 64),

MPHOSPH1-A2-10-460 (SEQ ID NO: 73),

MPHOSPH1-A2-10- 770 (SEQ ID NO: 77),

MPHOSPH1-A2-10- 407 (SEQ ID NO: 79),

MPHOSPH1-A2-10- 923 (SEQ ID NO: 97),

MPHOSPH1-A2-10-1484 (SEQ ID NO: 103) и

MPHOSPH1-A2-10-282 (SEQ ID NO: 120).

Эти полученные CTL показали мощную специфическую активность CTL против клеток-мишеней, обработанных соответствующими пептидами. Эти результаты демонстрируют, что MPHOSPH1 является антигеном, распознаваемым CTL, и что исследованные пептиды являются эпитопными пептидами MPHOSPH1, ограниченными по HLA-A2; и, таким образом, эти пептиды могут быть эффективными в качестве антигенов-мишеней для цитотоксичности CTL. Более того, MPHOSPH1-A2-10-282 (SEQ ID NO: 120) индуцировал CTL, имеющие мощную цитотоксическую активность против злокачественных клеток, экспрессирующих как MPHOSPH1, так и антиген HLA-A2, в качестве молекулы MHC класса I. Этот результат указывает на то, что пептид MPHOSPH1-A2-10-282, встречающийся в природе in vivo, представляется на злокачественных клетках, экспрессирующих MPHOSPH1, антигеном HLA-A2 (например, HLA-A*0201 или HLA-A*0206). Согласно этим данным, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, или его производные, мутанты, варианты или модифицированные пептиды пригодны в контексте иммунологической терапии для лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует MPHOSPH1 и антиген HLA-A2. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в настоящем описании, можно использовать для иммунологической терапии злокачественной опухоли. Примеры злокачественных опухолей, подлежащих лечению, включают, например, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей. Однако пептиды по настоящему изобретению можно использовать при любых злокачественных опухолях, при условии, что они экспрессируют MPHOSPH1 и антиген HLA-A2.

Поскольку ген MPHOSPH1 сверхэкспрессируется в злокачественных клетках, таких как клетки рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, рака почек и опухоли мягких тканей, но не экспрессируется в большинстве нормальных органов, он является хорошей мишенью для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков) распознаваемым CTL эпитопов из MPHOSPH1. Альтернативно настоящее изобретение относится к выделенным пептидам, которые связываются с антигенами HLA и индуцируют цитотоксические T-лимфоциты (CTL), где пептид состоит из иммунологически активного фрагмента MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126). Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению представляют собой пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.

Главным образом, в настоящее время доступно программное обеспечение, например, через Интернет, такое как программное обеспечение, описанное в Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75 и Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, которое можно использовать для вычисления аффинности связывания между различными пептидами и антигенами HLA in silico. Аффинность связывания с антигенами HLA можно измерять как описано, например, в Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, и Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796, которые обобщенно представлены, например, в Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Способы определения аффинности связывания описаны, например, в Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) и Protein Science (2000, 9: 1838-1846). Таким образом, можно использовать такое программное обеспечение для выбора этих фрагментов, происходящих из MPHOSPH1, которые обладают высокой аффинностью связывания с антигенами HLA. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды, состоящие из любых фрагментов, происходящих из MPHOSPH1, для которых такие известные программы определят, что они связываются с антигенами HLA. Более того, такие пептиды могут включать пептид, состоящий из полноразмерной последовательности MPHOSPH1.

Пептиды по настоящему изобретению, в частности, полипептиды и декапептиды по настоящему изобретению, могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками, при условии, что пептиды сохраняют их способность индуцировать CTL. Конкретные дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из любого типа аминокислот, при условии, что они не ухудшают способность исходного пептида индуцировать CTL. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды, обладающие способностью индуцировать CTL, где пептиды включают аминокислотную последовательность, происходящую из MPHOSPH1. Такие пептиды составляют, например, менее чем приблизительно 40 аминокислот, часто менее чем приблизительно 20 аминокислот, обычно менее чем приблизительно 15 аминокислот.

Главным образом, известно, что модификации одной, двух, нескольких или более аминокислот в пептиде не влияют на функцию пептида, или в некоторых случаях даже усиливают желаемую функцию исходного пептида. В действительности, известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, модифицированной путем замены, вставки, делеции и/или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков в исходную эталонную последовательность) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид, обладающий способностью индуцировать CTL, по настоящему изобретению может состоять из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, в которых одна, две или несколько аминокислот добавлены, удалены, встроены и/или замещены.

В другом варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут представлять собой пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислота(аминокислот) заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, при условии что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать CTL. В предпочтительных вариантах осуществления пептид по настоящему изобретению может представлять собой пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислота(аминокислот) заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, при условии что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать CTL.

Специалистам в данной области понятно, что отдельные модификации (т.е. добавления, вставки, делеции или замены) аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент общей аминокислотной последовательности, имеют тенденцию к обеспечению сохранения свойств исходной боковой цепи аминокислоты; таким образом, их называют "консервативной заменой" или "консервативной модификацией", где изменение белка приводит к белку со сходными функциями. Таблицы консервативных замен, в которых представлены функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Примерами свойств боковых цепей аминокислот являются гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, имеющие следующие общие функциональные группы или характеристики: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); содержащая гидроксильную группу боковая цепь (S, T, Y); содержащая атом серы боковая цепь (C, M); содержащая карбоновую кислоту и амид боковая цепь (D, N, E, Q); содержащая основание боковая цепь (R, K, H); и содержащая ароматическую группу боковая цепь (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга:

1) Аланин (A), глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), глутамин (Q);

4) Аргинин (R), лизин (K);

5) Изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);

6) Фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);

7) Серин (S), треонин (T); и

8) Цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также считаются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептид по настоящему изобретению не ограничивается ими и может включать неконсервативные модификации, при условии, что полученный модифицированный пептид сохраняет способность исходного немодифицированного пептида индуцировать CTL. Более того, модифицированные пептиды не должны исключать индуцирующие CTL пептиды, происходящие из полиморфных вариантов, внутривидовых гомологов или аллелей MPHOSPH1.

Для достижения более высокой аффинности связывания аминокислотные остатки можно встраивать, заменять, удалять или добавлять к пептидам по настоящему изобретению или, альтернативно, аминокислотные остатки можно удалять из них для достижения более высокой аффинности связывания. Для сохранения требуемой способности индуцировать CTL, предпочтительно модифицируют (т.е. встраивают, удаляют, добавляют и/или замещают) только небольшое количество (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. В рамках настоящего изобретения термин "несколько" означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3, или менее. Процент аминокислот, подлежащих модификации, может составлять, например, 20% или менее, предпочтительно 15% или менее, более предпочтительно 10% или менее, еще более предпочтительно от 1 до 5%.

При использовании в контексте иммунотерапии злокачественной опухоли пептиды по настоящему изобретению могут представляться на поверхности клетки или экзосомы в качестве комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, но также обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA. В связи с этим, пептиды можно модифицировать путем замены, вставки, делеции и/или добавления аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида, обладающего улучшенной аффинностью связывания. В дополнение к пептидам, которые естественным образом экспонируются, поскольку закономерности последовательностей пептидов, экспонируемых путем связывания с антигенами HLA, уже известны (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), в иммуногенные пептиды по настоящему изобретению можно вносить модификации на основе такой закономерности.

Например, пептиды, проявляющие высокую аффинность связывания HLA-A2, имеют тенденцию к тому, чтобы в них вторая с N-конца аминокислота была заменена на лейцин или метионин. Аналогично, также можно удобным образом использовать пептиды, в которых C-концевая аминокислота заменена на валин или лейцин. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает пептиды, обладающие аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, в которых вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменена лейцином или метионином, и/или где C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен валином или лейцином. В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в которой вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, заменена лейцином или метионином, и/или C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен валином или лейцином. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению могут содержать аминокислотную последовательность, в которой вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120 заменена лейцином или метионином, и/или C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен валином или лейцином.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пептидам, обладающим способностью индуцировать CTL, где пептиды имеют общую формулу, выбранную из группы, состоящей из (1)-(9) как указано ниже:

(1) - соответствует MPHOSPH1-A2-9-850 (SEQ ID NO: 5)-

F [X1] L T I E N E [X2],

(2) -соответствует MPHOSPH1-A2-9-129 (SEQ ID NO: 14)-

F [X1] G C I M Q P [X2],

(3) - соответствует MPHOSPH1-A2-9-846 (SEQ ID NO: 64)-

G [X1] R A F L L T [X2],

(4) -соответствует MPHOSPH1- A2-10-460 (SEQ ID NO: 73)-

Y [X1] A Y D E T L N [X2],

(5) -соответствует MPHOSPH1-A2-10-770 (SEQ ID NO: 77)-

K [X1] I C N E T V E [X2]

(6) -соответствует MPHOSPH1-A2-10-407 (SEQ ID NO: 79)-

L [X1] T L G K C I N [X2]

(7) -соответствует MPHOSPH1-A2-10- 923 (SEQ ID NO: 97)-

K [X1] S N E I E T A [X2]

(8) -соответствует MPHOSPH1-A2-10-1484 (SEQ ID NO: 103)-

Q [X1] V A A L E I Q [X2], и

(9) -соответствует MPHOSPH1- A2-10-282 (SEQ ID NO: 120)-

Y [X1] Y D L F V P V [X2].

В общих формулах (1)-(9), [X1] представляет собой лейцин или метионин, и [X2] представляет собой валин или лейцин. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения общая формула может представлять собой (9), которая соответствует SEQ ID NO: 120. Настоящее изобретение, кроме того, относится к выделенному пептиду, соответствующему общим формулам (1)-(9), определенным выше, к которому одна, две или несколько аминокислот добавлены на любом или обоих из его N-конца и C-конца. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным пептидам, соответствующим общим формулам (1)-(9), из которых один, два или несколько аминокислотных остатков удалены на любом или обоих из его N-конца и C-конца. Настоящее изобретение также относится к выделенному пептиду, соответствующему общим формулам (1)-(9), в котором одна, две или несколько аминокислот встроены или удалены в каком либо участке последовательности.

Замены можно вносить не только в концевые аминокислоты, но также в положения потенциальных участков распознавания пептидов T-клеточным рецептором (TCR). В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что пептид с аминокислотными заменами может иметь равную или лучшую функцию, чем исходный пептид, например, CAP1, p53 _(264-272), Her-2/neu _(369-377) или gp100 _(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 и S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

Настоящее изобретение также предусматривает добавление одной, двух или нескольких аминокислот к любому или обоим из N- и C-конца пептидов по настоящему изобретению. Таким модифицированные пептиды, сохраняющие способность индуцировать CTL, также включены в настоящее изобретение.

Однако, когда пептидная последовательность идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличающуюся функцию, могут индуцироваться отрицательные побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы против определенных веществ. Таким образом, может быть желательным проведение поиска гомологии с использованием доступных баз данных для избежания ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда при поиске гомологии становится понятно, что в природе не существует пептида, идентичного или имеющего отличие на 1 или 2 аминокислоты относительно заданного пептида, заданный пептид можно модифицировать для увеличения его аффинности связывания с антигенами HLA, и/или для увеличения его способности индуцировать CTL без какого-либо риска таких побочных эффектов.

Хотя ожидается, что пептиды, обладающие аффинностью связывания с антигенами HLA, как описано выше, являются высоко эффективными, пептиды-кандидаты, которые отбирают в соответствии с наличием высокой аффинности связывания в качестве индикатора, далее исследуют в отношении наличия способности индуцировать CTL. В рамках настоящего изобретения выражение "способность индуцировать CTL" указывает на способность пептида индуцировать CTL, когда он представлен на антигенпредставляющей клетке (APC). Кроме того, "способность индуцировать CTL" включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис клеток-мишеней посредством CTL и увеличивать продуцирование IFN-гамма посредством CTL.

Способность индуцировать CTL подтверждают путем индукции APC, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки (DC)), или более конкретно DC, происходящих из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции APC исследуемым пептидом, смешения APC с CD8-положительными клетками для индукции CTL, а затем измерения IFN-гамма против клеток-мишеней, продуцированного и высвобожденного CTL. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, созданных, чтобы они экспрессировали антиген HLA человека (например, животные, описанные в BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA-A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response). Альтернативно, клетки-мишени можно метить радиоактивной меткой ⁵¹Cr и т.п., и цитотоксическую активность CTL можно вычислять из радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. Альтернативно ее можно исследовать путем измерения IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного CTL в присутствии клеток, которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализации зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против IFN-гамма.

В результате исследования способности CTL индуцировать пептиды, как описано выше, было открыто, что нонапептиды и декапептиды, выбранные из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность указанную в SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, показали способность индуцировать CTL, а также высокую аффинность связывания с антигеном HLA. Таким образом, эти пептиды проиллюстрированы в качестве предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Более того, результаты анализа гомологии продемонстрировал, что такие пептиды не обладают значительной гомологией с пептидами, происходящими из любых других известных продуктов генов человека. Это снижает вероятность неизвестных или нежелательных иммунных ответов при использовании иммунотерапии. Таким образом, также в этом аспекте эти пептиды пригодны для индукции иммунитета против MPHOSPH1 у пациентов со злокачественной опухолью. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120.

В дополнение к модификации, как описано выше, пептиды по настоящему изобретению могут быть связаны с другими пептидами, при условии, что полученный связанный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать CTL. Примеры подходящих "других" пептидов включают: пептиды по настоящему изобретению или индуцирующие CTL пептиды, происходящие из других TAA. Пептид по настоящему изобретению может быть связан с "другим" пептидом прямо или непрямо через линкер. Линкеры между пептидами хорошо известны в данной области, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).

Например, пептиды, происходящие из ассоциированных с опухолью антигенов не из MPHOSPH1, также можно использовать для увеличения иммунного ответа через HLA класса I и/или класса II. В данной области хорошо известно, что злокачественные клетки экспрессируют более одного ассоциированного с опухолью гена. Были выделены некоторые индуцирующие CTL пептиды, происходящие из таких TAA (например, WO2008/047473, WO2010/047062, WO2008/102557, WO2009/025116). Таким образом, примеры "других" пептидов, которые связаны с пептидом по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, индуцирующие CTL пептиды, происходящие из TAA, отличных от MHPOSPH1. В рамках настоящего изобретения "другие" пептиды могут быть не только ограниченными по MHC класса I пептидами, но также ограниченными по MHC класса II пептидами. Специалист в данной области может получить полипептиды, включающие один или несколько пептидов MPHOSPH1, и один или несколько пептидов не из MPHOSPH1, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, с использованием общепринятых методик молекулярной биологии.

Описанные выше связанные пептиды называют в настоящем описании "политопами", т.е. группами из двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунный ответ пептидов, которые могут быть связаны друг с другом с различным расположением (например, соединенные, перекрывающиеся). Политоп (или нуклеиновую кислоту, кодирующую политоп) можно вводить в соответствии со стандартными протоколами иммунизации, например, животным, для исследования эффективности политопа в отношении стимуляции, усиления и/или провоцирования иммунного ответа.

Пептиды можно связывать вместе прямо или через использование фланкирующих последовательностей с образованием политопов, и использование политопов в качестве вакцин хорошо известно в данной области (см., например, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171(l):299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и комбинации эпитопов, можно получать и исследовать на распознавание посредством CTL и на эффективность в отношении повышения иммунного ответа.

Пептиды по настоящему изобретению, кроме того, можно связывать с другими веществами, при условии, что они сохраняют способность индуцировать CTL. Иллюстративные примеры таких "других" веществ включают, но не ограничиваются ими, пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование; при условии, что модификации не нарушают биологическую активность пептидов, как описано в настоящем описании. Эти типы модификаций можно проводить для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Например, для повышения стабильности полипептида in vivo в данной области известно введение D-аминокислот, миметиков аминокислот или неприродных аминокислот; эта идея также может быть принята для полипептидов по настоящему изобретению. Стабильность полипептида можно анализировать рядом способов. Например, для исследования стабильности можно использовать пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Когда пептиды по настоящему изобретению включают остаток цистеина, пептиды имеют тенденцию к образованию димеров через дисульфидную связь между SH-группами остатков цистеина. Таким образом, также пептиды по настоящему изобретению включают димеры пептидов по настоящему изобретению.

Более того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, в которых замещены, удалены, вставлены и/или добавлены один, два или несколько аминокислотных остатков, можно проводить скрининг и отбирать пептиды, имеющие такую же или более высокую активность по сравнению с исходными пептидами. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к способу скрининга или отбора модифицированных пептидов, имеющих такую же или более высокую активность по сравнению с оригинальными пептидами. Например, способ может включать стадии:

a: модификация (замена, делеция, вставка или добавление по меньшей мере одного аминокислотного остатка пептида по настоящему изобретению,

b: определение активности указанного пептида, модифицированного на стадии (a), и

c: выбор пептида, имеющего такую же или более высокую активность по сравнению с исходным пептидом.

В рамках настоящего изобретения активность может включать активность связывания MHC и способность индуцировать APC или CTL. Предпочтительно, активность пептида представляет собой способность индуцировать CTL.

III. Получение пептидов MPHOSPH1

Пептиды по настоящему изобретению можно получать с использованием хорошо известных способов. Например, пептиды по настоящему изобретению можно получать синтетически, с помощью технологии рекомбинантных ДНК или химическим синтезом. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать индивидуально или в качестве более длинных полипептидов, включающих два или более пептидов. Пептиды можно выделять, т.е. очищать или выделять, по существу свободными от встречающихся в природе белков клетки-хозяина и их фрагментов, или любых других химических веществ.

Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей или фосфорилирование, при условии, что такие модификации не нарушают биологической активности исходных пептидов. Другие иллюстративные модификации включают встраивание D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения времени полужизни полипептидов в сыворотке.

Пептид по настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза на основе выбранной аминокислотной последовательности. Например, общепринятые способы пептидного синтеза, которые могут быть выбраны для синтеза, включают:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно пептиды по настоящему изобретению можно получать, используя любые известные способы генетической инженерии для продуцирования пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, во-первых, сначала получают подходящий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий заданный пептид в экспрессируемой форме (например, ниже регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности) и трансформируют в подходящую клетку-хозяина. Такие векторы и клетки-хозяева также предусматриваются настоящим изобретением. Затем клетку-хозяина культивируют для продуцирования представляющего интерес пептида. Пептид также можно продуцировать in vitro, используя систему для трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые кодируют любой из вышеупомянутых пептидов по настоящему изобретению. Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут включать полинуклеотиды, происходящие из встречающегося в природе гена MPHOSPH1 (например, номер доступа GenBank № NM_001031702 (SEQ ID NO: 125)) или полинуклеотиды, имеющие их консервативно модифицированные нуклеотидные последовательности. В рамках изобретения выражение "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Вследствие вырожденности генетического кода любой данный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все из кодонов GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодоном определяется аланин, кодон может быть заменен на любой из соответствующих кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновых кислот, называемые в данной области "молчащими вариантами", представляют собой один из типов консервативно модифицированного варианта. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты, описанная в настоящем описании как кодирующая пептид, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет хорошо понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая описанная кодирующая пептид нуклеотидная последовательность отражает подразумеваемое описание молчащих вариантов, ассоциированных с ней.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно в данной области, молекула ДНК соответственно состоит из оснований, таких как встречающиеся в природе основания A, T, C, и G, и в РНК T заменен на U. Специалисту в данной области понятно, что не встречающиеся в природе основания также могут быть включены в полинуклеотиды.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множество пептидов по настоящему изобретению с встроенными между ними аминокислотными последовательностями или без них. Например, встроенная аминокислотная последовательность может обеспечить участок расщепления (например, распознаваемая ферментом последовательность) полинуклеотида или транслируемых пептидов. Более того, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать любые дополнительные последовательности для кодирующей последовательности, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который включает регуляторные последовательности, требуемые для экспрессии пептида, или он может представлять собой экспрессирующий вектор (плазмиду) с маркерными генами и т.п. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды можно получать путем манипулирования с полинуклеотидами общепринятыми рекомбинантными способами с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.

Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать как рекомбинантный, так и химический синтез. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно получать путем встраивания полинуклеотида, имеющего кодирующую последовательность пептида по настоящему изобретению, в соответствующий вектор, который может экспрессироваться при трансфекции в компетентную клетку. Альтернативно полинуклеотид по настоящему изобретению можно амплифицировать с использованием способов ПЦР или реплицировать в подходящем хозяине (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием твердофазных способов, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

V. Экзосомы

Кроме того, настоящее изобретение относится к внутриклеточным везикулам, называемым экзосомами, которые представляют комплексы, образованные между пептидами по настоящему изобретению и антигенами HLA, на их поверхности. Экзосомы можно получать, например, с использованием способов, подробно описанных в публикациях заявок на патент Японии Kohyo № Hei 11-510507 и WO99/03499, и их можно получать с использованием APC, полученных от пациентов, которых подвергают лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инокулировать в качестве вакцин, аналогично пептидам по настоящему изобретению.

Тип антигенов HLA, включенных в комплексы, должен соответствовать типу антигенов HLA у индивидуумов, для которых требуется лечение и/или профилактика. Например, для японцев HLA-A2, в частности HLA-A*0201 и HLA-A*0206, часто являются пригодными. Использование типа HLA-A2, который в высокой степени экспрессируется среди японцев и европиоидов, является благоприятным для получения эффективных результатов, и применимы подтипы, такие как HLA-A*0201 и HLA-A*0206. Как правило, в клинике тип антигена HLA у пациента, для которого требуется лечение, исследуется заранее, что обеспечивает надлежащий отбор пептидов, имеющих высокие уровни аффинности связывания с этим антигеном, или имеющих способность индуцировать CTL путем представления антигенов. Более того, для получения пептидов, демонстрирующих высокую аффинность связывания и способность индуцировать CTL, можно осуществлять замену, делецию или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот на основе аминокислотной последовательности встречающегося в природе неполного пептида MPHOSPH1.

При использовании антигена HLA типа HLA-A2 для экзосом по настоящему изобретению пептиды, имеющие аминокислотную последовательность любого из 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, обладают особой применимостью. В некоторых вариантах осуществления экзосомы по настоящему изобретению представляют собой экзосомы, которые представляют комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA-A2 на их поверхности. Типичные примеры антигена HLA-A2, содержащегося в таких комплексах, включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201 и HLA-A*0206.

VI. Антигенпредставляющие клетки (APC)

Настоящее изобретение также относится к выделенным APC, которые представляют комплексы, образованные между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению, на их поверхности. APC могут происходить из пациентов, которых подвергают лечению и/или профилактике, и их можно вводить в качестве вакцин сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению.

APC не ограничиваются конкретным типом клеток и включают дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, представляют белковые антигены на их поверхности, так чтобы они распознавались лимфоцитами. Поскольку DC являются типичными APC, имеющими наиболее мощную активность индукции CTL среди APC, DC пригодны в качестве APC по настоящему изобретению.

Например, APC по настоящему изобретению можно получать путем индукции DC из моноцитов периферической крови, а затем контактирования (стимуляции) их с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, в организме индивидуума индуцируются APC, которые представляют пептиды по настоящему изобретению. Таким образом, APC по настоящему изобретению можно получать путем взятия APC от индивидуума после введения индивидууму пептидов по настоящему изобретению. Альтернативно APC по настоящему изобретению можно получать путем контактирования APC, взятых от индивидуума, с пептидом по настоящему изобретению.

APC по настоящему изобретению можно вводить индивидууму для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума самостоятельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать стадии:

a: взятия APC от первого индивидуума,

b: контактирования APC стадии a с пептидом по настоящему изобретению, и

c: введения APC стадии b второму индивидууму.

Первый индивидуум и второй индивидуум могут быть одним и тем же индивидуумом или они могут быть различными индивидуумами. APC, полученные на стадии b, можно вводить в качестве вакцины для лечения или профилактики злокачественной опухоли, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Настоящее изобретение также относится к способу или процессу изготовления фармацевтической композиции для индукции APC, где способ включает стадию смешения или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения APC по настоящему изобретению имеют способность индуцировать CTL. В контексте APC выражение "наличие способности индуцировать CTL" относится к демонстрации более высокой способности индуцировать CTL по сравнению с APC, не контактировавшими с пептидами. Такие APC, имеющие способность индуцировать CTL, можно получать способом, который включает стадию переноса полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC in vitro, а также способ, упомянутый выше. Введенные гены могут быть в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения включают, но не ограничиваются ими, различные способы, общепринятые в данной области, такие как липофекция, электропорация или способ с фосфатом кальция. Более конкретно, его можно проводить, как описано в Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; опубликованном японском переводе международной публикации № 2000-509281. Путем переноса ген в APC, ген претерпевает транскрипцию, трансляцию и т.п. в клетке, а затем полученный белок процессируется MHC класса I или класса II, и проходит через каскад представления неполных пептидов.

В некоторых вариантах осуществления APC по настоящему изобретению представляют собой APC, которые представляют комплексы антигена HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению на их поверхности. Типичные примеры антигена HLA-A2, содержащегося в таких комплексах, включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201 и HLA-A*0206.

VII. Цитотоксические T-лимфоциты (CTL)

CTL, индуцированные против любого из пептидов по настоящему изобретению, усиливают иммунный ответ, нацеленный на злокачественные клетки in vivo и, таким образом, непосредственно их можно использовать в качестве вакцин, аналогично пептидам. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые специфически индуцируются или активируются любым из пептидов по настоящему изобретению.

Такие CTL можно получать путем (1) введения пептида(ов) по настоящему изобретению индивидууму, (2) контактирования (стимуляции) полученных от индивидуума APC, и CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с пептидом(ами) по настоящему изобретению, (3) контактирования CD8-положительных T-клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с APC или экзосомами, представляющими комплекс антигена HLA и пептида на их поверхности, или (4) введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR может связываться с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA-A2 на клеточной поверхности. Такие APC или экзосомы, предназначенные для получения CTL, можно получать способами, описанными выше. Подробное описание способа (4) представлено ниже в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".

CTL по настоящему изобретению могут быть получены от пациентов, которых подвергают лечению и/или профилактике, и их можно вводить сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими пептиды, APC или экзосомы по настоящему изобретению, для регуляции эффектов. Полученные CTL специфично действуют против клеток-мишеней, представляющих пептиды по настоящему изобретению, например, те же пептиды, которые использовались для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экспрессируют MPHOSPH1, такие как злокачественные клетки или клетки, трансфицированные геном MPHOSPH1; и клетки, которые представляют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности вследствие стимуляции пептидом, также могут служить в качестве мишеней для атаки активированных CTL.

В некоторых вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению распознают клетки, представляющие комплексы антигена HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению. В контексте CTL выражение "распознают клетку" относится к связыванию комплекса антигена HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности через ее TCR и проявлению специфической цитотоксической активности против клетки. В рамках изобретения "специфическая цитотоксическая активность" относится к проявлению цитотоксической активности против клетки, представляющей комплекс антигена HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению, но не против других клеток. Типичные примеры антигена HLA-A2, содержащегося в таком комплексе, включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201 и HLA-A*0206.

VIII. T-клеточный рецептор (TCR)

Настоящее изобретение также относится к композициям, которые включают полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы TCR, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц TCR, где TCR может связываться с комплексом антигена HLA-A2 и пептидом по настоящему изобретению на клеточной поверхности, и к способам их применения. Такие субъединицы TCR обладают способностью образовывать TCR, которые придают специфичность T-клеткам против опухолевых клеток, экспрессирующих MPHOSPH1. С использованием известных в данной области способов можно идентифицировать полинуклеотиды, кодирующие каждую из альфа- и бета-цепей TCR CTL, индуцированных пептидом по настоящему изобретению (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, можно предпочтительно использовать способ ПЦР. ПЦР-праймеры для анализа могут представлять собой, например, 5'-R праймер (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') (SEQ ID NO: 127) в качестве праймера с 5'-стороны и 3-TRa-C праймер (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') (SEQ ID NO: 128), специфичный к C-области альфа-цепи TCR, праймер 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') (SEQ ID NO: 129), специфичный к C1-области бета-цепи TCR, или праймер 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') (SEQ ID NO: 130), специфичный к C2-области бета-цепи TCR в качестве праймеров с 3'-стороны, но не ограничиваясь ими. Производные TCR могут связывать клетки-мишени, представляющие пептид по настоящему изобретению, с высокой авидностью, и необязательно опосредовать эффективное уничтожение клеток-мишеней, представляющих пептид по настоящему изобретению, in vivo и in vitro.

Полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы TCR, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц TCR, могут быть включены в подходящие векторы, например, ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны в данной области. Полинуклеотиды или векторы, включающие его, могут быть эффективно перенесены в T-клетку (например, CD8-положительную T-клетку), например, T-клетку от пациента. Преимущественно, настоящее изобретение относится к готовой к продаже композиции, позволяющей быструю модификацию собственных T-клеток пациента (или другого млекопитающего) для быстрого и легкого образования модифицированных T-клеток, имеющих превосходные свойства уничтожения злокачественных клеток.

Специфические TCR против пептидов по настоящему изобретению должны быть способны специфично распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, обеспечивая специфическую активность T-клеток против клетки-мишени, представляющей комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, когда TCR представляется на поверхности T-клетки. Требуемую активность можно подтвердить любыми известными способами посредством того, что CTL, полученные путем введения полипептида(ов), кодирующего такие субъединицы TCR, могут специфично распознавать такие клетки-мишени. Предпочтительные примеры таких способов включают, например, анализ окрашивания мультимеров HLA с использованием молекул HLA и пептидов по настоящему изобретению, и анализ ELISPOT. Путем проведения анализа ELISPOT может быть подтверждено, что CTL, полученные описанными выше способами, могут специфично распознавать клетки-мишени, и что сигналы, полученные при таком распознавании, могут передаваться внутриклеточно. Более того, также может быть подтверждено известными способами, что CTL, полученные описанными выше способами, могут иметь специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней. Примеры таких способов включают, например, анализ высвобождения Cr с использованием клеток, экспрессирующих как антиген HLA-A2, так и MPHOSPH1.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к CTL, которые получают путем трансдукции полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, где TCR может связываться с комплексом пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, и антигена HLA-A2 на клеточной поверхности.

Трансдуцированные CTL способны нацеливаться на злокачественные клетки in vivo, и их можно увеличивать в количестве хорошо известными способами культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL по настоящему изобретению можно использовать для получения иммуногенной композиции, пригодной в лечении или в профилактике, или и в лечении и в профилактике, злокачественной опухоли у пациента, нуждающегося в терапии или защите (WO2006/031221).

IX. Фармацевтические композиции:

Поскольку экспрессия MPHOSPH1 специфически повышена при злокачественной опухоли, примеры которой включают, но необязательно ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей, по сравнению с нормальными тканями, пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству или композиции, изготовленным для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли, причем такое средство или композиция включают один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов. Альтернативно в качестве активных ингредиентов для фармацевтических средств или композиций можно использовать любые из описанных выше экзосом или APC, которые представляют комплекс пептида по настоящему изобретению и антиген HLA. Кроме того, упомянутые выше CTL, которые могут распознавать клетку, представляющую комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, также можно использовать в качестве активных ингредиентов для фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение относится к средствам или композициям, которые включают по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из:

(a) одного или более пептидов по настоящему изобретению;

(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(c) одной или более APC или экзосом по настоящему изобретению; и

(d) одной или более CTL по настоящему изобретению.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению также применимы в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения, выражение "вакцина" (также называемая "иммуногенной композицией") относится к композиции, которая обладает функцией повышения, усиления и/или индукции противоопухолевого иммунитета при инокуляции животным. Иными словами, настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам или композициям по настоящему изобретению для индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно использовать для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли у индивидуума. Примеры таких индивидуумов, у которых можно применять такие фармацевтические средства или композиции, включают людей, а также других млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, обезьяну, бабуина и шимпанзе, в частности, коммерчески важное животное или домашнее животное. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно составлять для введения индивидууму, антиген HLA которого представляет собой HLA-A2.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента для изготовления фармацевтического средства или композиции, изготовленных для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли или опухоли, включая ее послеоперационный рецидив, причем такой активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению на их поверхности; и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.

Альтернативно настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту для применения в любом или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли или опухоли, причем указанный активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению на их поверхности; и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.

Альтернативно настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу изготовления фармацевтической композиции или средства для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли или опухоли, где способ или процесс включает стадию составления фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосомы по настоящему изобретению; и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение также относится к способу или процессу изготовления фармацевтической композиции или средства для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественного новообразования или опухоли, где способ или процесс включает стадии смешения активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосомы по настоящему изобретению; и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу для любого или обоих из лечения и профилактики злокачественной опухоли или опухли, где способ включает стадию введения индивидууму по меньшей мере одного активного ингредиента, выбранного из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотида, кодирующегго такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосомы по настоящему изобретению; и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением было выявлено, что пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120 являются пептидами с ограниченным по HLA-A2 эпитопом и, таким образом, они служат в качестве кандидатов, которые могут индуцировать специфический иммунный ответ против злокачественной опухоли, экспрессирующей HLA-A2 и MPHOSPH1 у индивидуума. Таким образом, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению, которые включают любой из этих пептидов с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 или 120, особенно пригодны для введения индивидуумам, антиген HLA которых представляет собой HLA-A2. Особенно предпочтительным примером этих пептидов является пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, для которого было подтверждено, что он обладает способностью индуцировать CTL, нацеленные на злокачественные клетки, экспрессирующие антиген HLA-A2 и MPHOSPH1. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению включают пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, или его модифицированную версию, или включают полинуклеотид, кодирующий такой пептид. То же применимо к фармацевтическим средствам или композициям, которые включают полинуклеотиды, кодирующие любые из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению).

Злокачественные опухоли, подлежащие лечению фармацевтическими средствами или композициями по настоящему изобретению, включают любую злокачественную опухоль, в которой экспрессируется MPHOSPH1 (например, сверхэкспрессируется), примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут содержать, в дополнение к вышеупомянутым активным ингредиентам, другие пептиды, которые способны индуцировать CTL против злокачественных клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые представляют другие пептиды, или сходные с ними. Примеры таких "других" пептидов, способных индуцировать CTL против злокачественных клеток, включают, но не ограничиваются ими, специфические антигены злокачественной опухоли (например, идентифицированные TAA).

Если необходимо, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению необязательно могут включать другие терапевтические вещества в качестве дополнительного активного ингредиента, при условии, что вещество не ингибирует противоопухолевый эффект активного ингредиента по настоящему изобретению (т.е. пептида, полинуклеотида, экзосомы, APL, CTL по настоящему изобретению). Например, составы могут включать противовоспалительные вещества или композиции, обезболивающие средства, химиотерапевтические средства, и т.п. В дополнение к включению других терапевтических веществ в само лекарственное средство, лекарственные средства по настоящему изобретению также можно вводить последовательно или одновременно с одной или несколькими другими фармакологическими средствами или композициями. Количество лекарственного средства и фармакологического средства или композиции зависит, например, от того, какой тип фармакологического средства(средств) или композиции(ий) используют, от подвергаемого лечению заболевания и режима и пути введения.

Специалистам в данной области понятно, что, в дополнение к ингредиентам, конкретно упомянутым в настоящем описании, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать другие вещества, общепринятые в данной области, исходя из типа рассматриваемого состава (например, наполнители, связующие вещества, разбавители, эксципиенты и т.д.).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть упакованы в изделия, например, в качестве наборов, содержащих материалы, пригодные для лечения патологических состояний заболевания, подлежащего лечению, например, злокачественной опухоли. Изделие может включать контейнер с любым из фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению с ярлыком. Пригодные контейнеры включают бутыли, флаконы и тест-пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. На ярлыке на контейнере должно быть указано, что средство или композицию используют для лечения или предупреждения одного или более состояний заболевания. На ярлыке также могут быть указаны инструкции по введению и т.д.

В дополнение к контейнеру, описанному выше, набор, включающий фармацевтическое средство или композицию по настоящему изобретению, необязательно может дополнительно включать второй контейнер, в котором содержится фармацевтически приемлемый разбавитель. Кроме того, он может включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению, если желательно, могут быть упакованы в упаковку или распределяющее устройство, которые могут содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Например, упаковка может включать металлическую или пластмассовую фольгу, как например, блистерная упаковка. К упаковке или распределяющему устройству могут прилагаться инструкции по введению.

(1) Фармацевтические композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента

Пептиды по настоящему изобретению можно вводить прямо в качестве фармацевтического средства или композиции, или, если необходимо, они могут быть составлены общепринятыми способами составления. В последнем случае, в дополнение к пептидам по настоящему изобретению, могут быть включены носители, эксципиенты и т.п., которые обычно используют для лекарственных средств, в соответствующих случаях без конкретных ограничений. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются ими, стерилизованную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и т.п. Более того, фармацевтические вещества, средства или композиции при необходимости могут содержать стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно использовать для целей борьбы со злокачественной опухолью.

Пептиды по настоящему изобретению можно получать в комбинации, которая включает два или более пептидов по настоящему изобретению, для индукции CTL in vivo. Пептиды могут быть в смеси или они могут быть конъюгированы друг с другом с использованием стандартных способов. Например, пептиды можно химически связывать или экспрессировать в качестве единой слитой полипептидной последовательности, которая может иметь одну или несколько аминокислоту(аминокислот) в качестве линкера (например, лизиновый линкер: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или отличающимися. При введении пептидов по настоящему изобретению пептиды представляются с высокой плотностью антигенами HLA на APC, а затем происходит индукция CTL, которые специфично реагируют с комплексом, образованным между экспонированным пептидом и антигеном HLA. Альтернативно APC (например, DC) можно извлекать из индивидуума, а затем стимулировать пептидами по настоящему изобретению с получением APC, которые представляют любые из пептидов по настоящему изобретению на их клеточной поверхности. Эти APC можно повторно вводить индивидууму для индукции CTL у индивидуумов, и в результате агрессивность в отношении ассоциированного с опухолью эпителия может быть увеличена.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению, которые включают любой из пептидов по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, также могут включать адъювант, так чтобы клеточный иммунитет эффективно устанавливался. Альтернативно, фармацевтическое средство или композицию по настоящему изобретению можно вводить с другими активными ингредиентами, или можно вводить путем составления в виде гранул. Адъювант относится к любому соединению, веществу ли композиции, которые усиливают иммунный ответ против белка при введении вместе (или последовательно) с белком, имеющим иммунологическую активность. Адъювант, который можно использовать, включает адъюванты, описанные в литературе (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Иллюстративные адъюванты включают фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, токсин Salmonella, неполный адъювант Фрейнда (IFA), полный адъювант Фрейнда (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, эмульсию типа O/W и т.д., но не ограничиваясь ими.

Более того, удобно использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых пептид связан с гранулами диаметром несколько микрометров, и составы, в которых липид связан с пептидом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, пептиды по настоящему изобретению также можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительные примеры солей включают соли со щелочным металлом, соли с металлом, соли с органическим основанием, соли с амином, соли с органической кислотой (уксусная кислота, муравьиная кислота, пропионовая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, виннокаменная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, щавелевая кислота, бензойная кислота, метансульфоновая кислота и т.д.) и соли с неорганической кислотой (хлористоводородная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота и т.д.). Как используют в рамках изобретения, выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединения и которые получают путем реакции с неорганическими или органическими кислотами или основаниями.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать компонент, который стимулирует CTL. В качестве веществ, способных стимулировать CTL in vivo против вирусных антигенов, идентифицированы липиды. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно присоединять к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина, а затем связывать с пептидом по настоящему изобретению. Затем липидированный пептид можно вводить либо прямо, либо в мицелле или частице, включенной в липосому или эмульгированной в адъюванте. В качестве другого примера стимуляции CTL-ответов липидами, для стимуляции CTL можно использовать липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинил-серил-серин (P3CSS), когда они ковалентно связаны с соответствующим пептидом (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Примеры подходящих способов введения включают, но не обязательно ограничиваются ими, пероральное введение, внутрикожную, подкожную, внутримышечную, внутрикостную, внутрибрюшинную и внутривенную инъекцию, или сходные с ними, и системное введение или местное введение вблизи заданных областей (т.е. прямая инъекция). Введение можно проводить путем однократного введения или усиливать путем многократных введений. Дозы пептидов по настоящему изобретению можно корректировать соответствующим образом в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, возраста пациента, массы тела, способа введения и т.п., и обычно они составляют от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг, и их можно вводить от одного раза в несколько суток до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области без труда определит подходящие и оптимальные дозировки.

(2) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению также могут включать полинуклеотиды, кодирующие пептид(ы), описанные в настоящем описании, в экспрессирующейся форме. В рамках настоящего изобретения выражение "в экспрессирующейся форме" означает, что полинуклеотид, когда его вводят в клетку, будет экспрессироваться in vivo в качестве полипептида, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В иллюстративном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляющего интерес полинуклеотида включает регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) может быть организован так, чтобы происходило его стабильное встраивание в геном клетки-мишени (см., например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для описания кассетных векторов для гомологичной рекомбинации). Также см., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США № 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и WO 98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают "обнаженную ДНК", облегченную (опосредуемая бупивакаином, полимерами, пептидами) доставку, комплексы катионных липидов и опосредуемую частицами ("генная пушка") или опосредуемую давлением доставку (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению также могут быть экспрессированы с помощью вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессирующих векторов включают ослабленные вирусные хозяева, такие как вирус осповакцины или вирус оспы кур. Этот подход вовлекает использование, например, вируса осповакцины в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид. При введении в хозяина рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, и, тем самым, индуцирует иммунный ответ. Векторы осповакцины и способы, пригодные в протоколах иммунизации описаны, например, в патенте США № 4722848. Другим вектором является BCG (бацилла Кальмета-Герена). Векторы BCG описаны в Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Широкое множество других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, например, аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы Salmonella typhi, детоксифицированные векторы токсина вируса сибирской язвы и т.п., будут очевидными. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка олинуклеотида пациенту может быть либо прямой, в случае которой на пациента прямо воздействуют вектором, несущим полинуклеотид, либо непрямой, в случае которой клетки сначала трансформируют представляющим интерес полинуклеотидом in vitro, а затем клетки трансплантируют пациенту. Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия in vivo и ex vivo.

Для общего обзора способов генной терапии, см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Способы, широко известные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые применимы для настоящего изобретения, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger in, Gene Transfer и Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Подобно введению пептидов, введение полинуклеотидов можно проводить путем пероральной, внутрикожной, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрикостной и/или внутрибрюшинной инъекции или сходных с ними, например, является применимым системное введение или местное введение вблизи заданных областей. Введение можно проводить путем однократного введения или усиливать путем многократных введений. Дозу полинуклеотида в подходящем носителе или клеток, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по настоящему изобретению, можно корректировать соответствующим образом, в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, возраста пациента, массы тела, способа введения и т.д. и обычно она составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг, и ее можно вводить от одного раза в несколько суток до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области может надлежащим образом выбрать подходящую дозу.

X. Способы, в которых используются пептиды, экзосомы, APC и CTL

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для получения и индукции APC и CTL. Экзосомы и APC по настоящему изобретению также можно использовать для индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC можно использовать в комбинации с любыми другими соединениями, при условии, что дополнительные соединения не ингибируют способность индуцировать CTL. Таким образом, для индукции CTL можно использовать любые из упомянутых выше фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению. В дополнение к этому, также для индукции APC можно использовать фармацевтические средства и композиции, включающие пептиды и полинуклеотиды, как объяснено ниже.

(1) Способы индукции антигенпредставляющих клеток (APC)

Настоящее изобретение относится к способам индукции APC, обладающих способностью индуцировать CTL, с использованием пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают стадию контактирования APC с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ, включающий стадию контактирования APC с пептидами по настоящему изобретению ex vivo, может включать стадии:

a: взятия APC от индивидуума, и

b: контактирования APC стадии a с пептидом по настоящему изобретению.

APC не ограничиваются конкретными типами клеток, и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, представляют белковые антигены на их клеточной поверхности, чтобы они распознавались лимфоцитами. Предпочтительно, DC можно использовать, поскольку они обладают наиболее сильной способностью индуцировать CTL среди APC. Любой из пептидов по настоящему изобретению можно использовать самостоятельно или в комбинации с другими пептидами по настоящему изобретению или индуцирующими CTL пептидами, происходящими из TAA, отличных от MPHOSPH1.

С другой стороны, когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, APC контактируют с пептидами in vivo, и следовательно, в организме индивидуума индуцируются APC, обладающие способностью индуцировать CTL. Таким образом, способ по настоящему изобретению включает введение индивидууму пептидов по настоящему изобретению для индукции APC со способностью индуцировать CTL в организме индивидуума. Аналогично, когда полинуклеотиды по настоящему изобретению вводят индивидууму в экспрессирующейся форме, пептиды по настоящему изобретению изобретение экспрессируются и контактируют с APC in vivo, и, следовательно, в организме индивидуума индуцируются APC, обладающие способностью индуцировать CTL. Таким образом, способ по настоящему изобретению также может включать введение индивидууму полинуклеотидов по настоящему изобретению для индукции APC со способностью индуцировать CTL в организме индивидуума. Выражение "экспрессирующаяся форма" описана выше в разделе "IX. Фармацевтические композиции, (2) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента".

Более того, способ по настоящему изобретению может включать введение полинуклеотида по настоящему изобретению в APC для индукции APC со способностью индуцировать CTL. Например, способ может включать стадии:

a: взятия APC от индивидуума, и

b: введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.

Стадию b можно проводить, как описано выше в разделе "VI. Антигенпредставляющие клетки".

Альтернативно настоящее изобретение относится к способу получения антигенпредставляющей клетки (APC), которая специфично индуцирует активность CTL против MPHOSPH1, где способ включает одну из следующих стадий:

(a) контактирование APC с пептидом по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.

Альтернативно настоящее изобретение относится к способам индукции APC, обладающих способностью индуцировать CTL, где способы включают стадию, выбранную из:

(a) контактирования APC с пептидом по настоящему изобретению;

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.

Способы по настоящему изобретению можно осуществлять in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно, способы по настоящему изобретению можно осуществлять in vitro или ex vivo. APC, используемые для индукции APC, имеющих способность индуцировать CTL, предпочтительно могут представлять собой APC, экспрессирующие антиген HLA-A2. Такие APC можно получать способами, хорошо известными в данной области, из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), полученных от индивидуума, антиген HLA которого представляет собой HLA-A2. APC, индуцированные способом по настоящему изобретению, могут представлять собой APC, которые представляют комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA (антигена HLA-A2) на их поверхности. Когда APC, индуцированные способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунных ответов против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно является тем же индивидуумом, от которого получены APC. Однако индивидуум может отличаться от донора APC, при условии, что индивидуум имеет тот же тип HLA, что и донор APC.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средствам или композициям для применения в индукции APC, имеющих способность индуцировать CTL, и такие средства или композиции включают один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, для изготовления композиции или средства, составленных для индукции APC. Альтернативно настоящее изобретение дополнительно относится к пептиду по настоящему изобретению или полипептиду, кодирующему пептид, для применения в индукции APC, обладающих способностью индуцировать CTL.

(2) Способы индукции CTL

Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием пептидов, полинуклеотидов, экзосом или APC по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующего каждую из субъединиц TCR, где TCR может распознавать (связываться с) комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, представленного на клеточной поверхности. Предпочтительно, способы индукции CTL могут включать по меньшей мере одну стадию, выбранную из:

a) контактирования CD8-положительной T-клетки с антигенпредставляющей клеткой и/или экзосомой, которая представляет на ее поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению; и

b) введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, в CD8-положительную T-клетку, где TCR может распознавать (связываться с) комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, представленным на клеточной поверхности.

Когда пептиды, полинуклеотиды, APC или экзосомы по настоящему изобретению вводят индивидууму, в организме индивидуума индуцируются CTL и усиливается иммунный ответ, нацеленный на злокачественные клетки, экспрессирующие MPHOSPH1. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения индивидууму пептидов, полинуклеотидов, APC или экзосом по настоящему изобретению.

Альтернативно CTL также можно индуцировать, используя их ex vivo или in vitro, и после индукции CTL, активированные CTL можно возвращать индивидууму. Например, способ может включать стадии:

a: взятия APC от индивидуума,

b: контактирования APC стадии a с пептидом, и

c: совместного культивирования APC стадии b с CD8-положительными T-клетками.

APC, подлежащие совместного культивирования с CD8-положительными T-клетками в указанной выше стадии c, также можно получать путем переноса полинуклеотида по настоящему изобретению в APC, как описано выше в разделе "VI. Антигенпредставляющие клетки", хотя настоящее изобретение не ограничивается ими и, таким образом, охватывает любые APC, которые эффективно представляют находящийся на их поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению.

Необязательно можно использовать экзосомы, которые представляют на их поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению вместо вышеупомянутых APC. Иными словами, настоящее изобретение может включать стадию совместного культивирования экзосом, представляющих на их поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Такие экзосомы можно получать способами, описанными выше в разделе "V. Экзосомы".

APC или экзосомы, используемые для индукции CTL, предпочтительно могут представлять собой APC или экзосомы, которые представляют на их поверхности комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA-A2.

Более того, CTL можно индуцировать путем введения полинуклеотида, кодирующего обе субъединицы TCR, или полинуклеотидов, кодирующих каждую из субъединиц TCR, в CD8-положительную T-клетку, где TCR может связываться с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, представленным на клеточной поверхности. Такую трансдукцию можно проводить, как описано выше в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".

Способы по настоящему изобретению можно осуществлять in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно, способы по настоящему изобретению можно осуществлять in vitro или ex vivo. CD8-положительные T-клетки, используемые для индукции CTL, можно получать хорошо известными в данной области способами из PBMC, полученных от индивидуума. В предпочтительных вариантах осуществления, донором для CD8-положительных T-клеток может быть индивидуум, у которого антигеном HLA является HLA-A2. CTL, индуцируемые способами по настоящему изобретению, могут представлять собой CTL, которые могут распознавать клетки, представляющие комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA на их поверхности. Когда CTL, индуцируемые способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунных ответов против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно является тем же индивидуумом, из которого происходят CD8-положительные T-клетки. Однако индивидуум может быть отличным от донора CD8-положительных T-клеток, при условии, что индивидуум имеет тот же тип HLA, что и донор CD8-положительных T-клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу изготовления фармацевтического средства или композиции для индукции CTL, где способ или процесс включает стадию смешения или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средству или композиции для индукции CTL, где средство или композиция содержит один или несколько пептид(ов), один или несколько полинуклеотид(ов), или одну или несколько APC или экзосом по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится применению пептида, полинуклеотида, или APC или экзосомы по настоящему изобретению для изготовления средства или композиции, составленных для индукции CTL.

Альтернативно настоящее изобретение, кроме того, относится к пептиду, полинуклеотиду или APC или экзосоме по настоящему изобретению для применения в индукции CTL.

(3) Способы индукции иммунного ответа

Более того, настоящее изобретение относится к способам индукции иммунного ответа против заболеваний, обусловленных с MPHOSPH1. Предусматриваемые заболевания включают злокачественную опухоль, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Способы по настоящему изобретению включают стадию введения индивидууму средства(средств) или композиции(ий), содержащих любой из пептидов по настоящему изобретению или кодирующих их полинуклеотидов. Способ по настоящему изобретению предусматривает введение экзосом или APC, представляющих любой из пептидов по настоящему изобретению. Для подробного описания см. раздел "IX. Фармацевтические композиции", в частности часть, описывающую применение фармацевтических средств и композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и APC, которые можно использовать для способов индукции иммунного ответа по настоящему изобретению, подробно описаны в разделах "V. Экзосомы", "VI. Антигенпредставляющие клетки (APC)", и (1) и (2) из "X. Способы, в которых используются пептиды, экзосомы, APC и CTL", выше.

В предпочтительных вариантах осуществления индивидуумы, которых лечат способом по настоящему изобретению, могут представлять собой индивидуумов, антиген HLA которых представляет собой HLA-A2.

Настоящее изобретение также относится к способу или процессу изготовления фармацевтического средства или композиции, индуцирующих иммунный ответ, где способ может включать стадию смешения или составления полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

Альтернативно способ по настоящему изобретению может включать стадию введения вакцинной или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, которая содержит:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую такой пептид, как описано в настоящем описании, в экспрессирующейся форме;

(c) APC или экзосому, представляющую пептид по настоящему изобретению на ее поверхности; или

(d) CTL по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения злокачественную опухоль, экспрессирующую MPHOSPH1, можно лечить с помощью этих активных ингредиентов. Примеры такой злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей. Таким образом, перед введением вакцинных или фармацевтических композиций, включающих активные ингредиенты, предпочтительно подтвердить, что уровень экспрессии MPHOSPH1 в клетках или тканях, подлежащих лечению, повышен по сравнению с нормальными клетками того же органа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли экспрессирующей MPHOSPH1, причем этот способ может включать стадии:

i) определения уровня экспрессии MPHOSPH1 в клетках или ткани(ях), полученных от индивидуума со злокачественной опухолью, подлежащей лечению;

ii) сравнения уровня экспрессии MPHOSPH1 с нормальным контролем; и

iii) введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из стадий (a)-(d), описанных выше, индивидууму со злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей MPHOSPH1, по сравнению с нормальным контролем.

Альтернативно настоящее изобретение также относится к вакцинной или фармацевтической композиции, которая включает по меньшей мере один компонент, выбранный из (a)-(d), описанных выше, для применения для введения индивидууму, имеющему злокачественную опухоль, сверхэкспрессирующую MPHOSPH1. Иными словами, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации индивидуума, подлежащего лечению полипептидом MPHOSPH1 по настоящему изобретению, причем такой способ включает стадию определения уровня экспрессии MPHOSPH1 в полученных от индивидуума клетках или ткани(ях), где увеличение уровня по сравнению с нормальным контрольным уровнем экспрессии гена указывает на то, что индивидуум может иметь злокачественную опухоль, которую можно лечить с помощью полипептида MPHOSPH1 по настоящему изобретению. Способ идентификации индивидуума, подлежащего лечению от злокачественной опухоли по настоящему изобретению, более подробно описан ниже.

Для определения уровня экспрессии MPHOSPH1 можно использовать любую полученную от индивидуума клетку или ткань, при условии, что она включает реальный продукт транскрипции или трансляции MPHOSPH1. Примеры подходящих образцов включают, но не ограничиваются ими, ткани и жидкости организма, такие как кровь, мокрота и моча. Предпочтительно, полученный от индивидуума образец клеток или ткани содержит популяцию клеток, включающую эпителиальную клетку, более предпочтительно, злокачественную эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, полученную из ткани, предположительно являющейся злокачественной. Кроме того, если необходимо, клетку можно очищать из полученных тканей и жидкостей организма, а затем использовать в качестве полученного от индивидуума образца.

Индивидуумом, подлежащим лечению способом по настоящему изобретению, предпочтительно является млекопитающее. Иллюстративные млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, например, человека, не являющегося человеком примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь и корову.

В соответствии с настоящим изобретением можно определять уровень экспрессии MPHOSPH1 в клетках или тканях, полученных от индивидуума. Уровень экспрессии можно определять на уровне продукта транскрипции (нуклеиновая кислота) с использованием способов, известных в данной области. Например, мРНК MPHOSPH1 можно количественно определять с использованием зондов способами гибридизации (например, нозерн-гибридизация). Выявление можно проводить на чипе, матрице и т.п. Для выявления уровня экспрессии MPHOSPH1 может быть предпочтительным использование матрицы. Специалисты в данной области могут изготовить такие зонды с использованием информации о последовательности MPHOSPH1. Например, в качестве зондов можно использовать кДНК MPHOSPH1. Если необходимо, зонды можно метить подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изотопы, и выявление уровня экспрессии гена можно проводить в качестве интенсивности гибридизованных меток.

Более того, продукт транскрипции MPHOSPH1 (например, SEQ ID NO: 125) можно количественно определять с использованием праймеров с помощью способов выявления на основе амплификации (например, RT-ПЦР). Такие праймеры можно получать на основе доступной информации о последовательности гена.

В частности, зонд или праймер, используемый для способа по настоящему изобретению, гибридизуется в жестких условиях, условиях умеренной жесткости или условиях низкой жесткости с мРНК MPHOSPH1. Как используют в рамках изобретения, выражение "жесткие условия (гибридизации)" относится к условиям, в которых зонд или праймер будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и отличаются в различных обстоятельствах. Специфическую гибридизацию более длинных последовательностей наблюдают при более высоких температурах, чем для более коротких последовательностей. Как правило, температуру жестких условий выбирают так, чтобы она была на 5 градусов С ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных их последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии. Поскольку последовательности-мишени, как правило, присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов являются оккупированными в равновесном состоянии. Как правило, жесткие условия, в которых концентрация соли является меньшей, чем приблизительно 1,0 M ионы натрия, как правило, приблизительно от 0,01 до 1,0 M ионов натрия (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3 и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30 градусов С для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 градусов С для более длинных зондов или праймеров. Жестких условий также можно достигать добавлением дестабилизирующих веществ, таких как формамид.

Зонд или праймер по настоящему изобретению, как правило, представляет собой по существу очищенный олигонуклеотид. Олигонуклеотид, как правило, включает область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях меньшей мере приблизительно с 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 последовательно расположенными нуклеотидами последовательности смысловой цепи нуклеиновой кислоты, включающей последовательность MPHOSPH1, или нуклеотидами последовательности антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, включающей последовательность MPHOSPH1, или встречающегося в природе мутанта этих последовательностей. В частности, например, в предпочтительном варианте осуществления в качестве праймера для амплификации генов, подлежащих выявлению, можно использовать олигонуклеотид, имеющий длину 5-50 нуклеотидов. Более предпочтительно, можно проводить выявление мРНК или кДНК гена MPHOSPH1 с олигонуклеотидным зондом или праймером конкретного размера, как правило, длиной 15-30 оснований. Размер может составлять по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 12 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, и зонды и праймеры могут иметь размер в диапазоне 5-10 нуклеотидов, 10-15 нуклеотидов, 15-20 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов и 25-30 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления длину олигонуклеотидного зона или праймера можно выбирать из диапазона 15-25. Методики анализа, устройства или реагенты для выявления гена с использованием такого олигонуклеотидного зонда или праймера хорошо известны (например, олигонуклеотидный микрочип или ПЦР). В этих анализах зонды или праймеры также могут включать последовательности метки или линкера. Кроме того, зонды или праймеры могут быть модифицированы поддающейся выявлению меткой или аффинным лигандом, подлежащим улавливанию. Альтернативно в методиках выявлению на основе гибридизации, также в качестве зонда можно использовать полинуклеотид, имеющий от нескольких сотен (например, приблизительно 100-200) оснований до нескольких тысяч (например, приблизительно 1000-2000) оснований в длину (например, анализ с использованием нозерн-блоттинга или анализ на кДНК-микрочипах).

Альтернативно для диагностики по настоящему изобретению можно проводить выявление продукта трансляции. Например, можно определять количество белка MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 35) или его иммунологического фрагмента. Способы определения количества белка в качестве продукта трансляции включают способы иммуноанализа, в которых используется антитело, специфично распознающее белок. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Более того, для выявления можно использовать любой фрагмент или модификацию (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv и т.д.) антитела, при условии, что фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком MPHOSPH1. Такие антитела против пептидов по настоящему изобретению и их фрагмента также предусматриваются настоящим изобретением. Способы получения этих типов антител для выявления белков хорошо известны в данной области, и для получения таких антител и их эквивалентов в рамках настоящего изобретения можно использовать любой способ.

В качестве другого способа выявления уровня экспрессии гена MPHOSPH1 на основе его продукта трансляции можно измерять интенсивность окрашивания с помощью иммуногистохимического анализа с использованием антитела против белка MPHOSPH1. Иными словами, при таком измерении сильное окрашивание указывает на увеличенное присутствие/уровень белка и, в то же время, высокий уровень экспрессии гена MPHOSPH1.

Уровень экспрессии гена-мишени, например, гена MPHOSPH1, в злокачественных клетках может быть определен как повышенный, если уровень увеличен относительно контрольного уровня (например, уровня в нормальных клетках) гена-мишени, например, на 10%, 25% или 50%; или увеличен более чем в 1,1 раза, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз или более.

Контрольный уровень можно определять в то же время, что и в злокачественных клетках с использованием образца(ов), ранее взятого или сохраненного от индивидуум(ов), для которых известен их статус(ы) заболевания (злокачественное или незлокачественное). Кроме того, в качестве нормального контроля можно использовать нормальные клетки, полученные из незлокачественных областей органа, который подлежит лечению. Альтернативно контрольный уровень можно определять статистическим способом на основе результатов, полученных путем анализа ранее определенного уровня(ей) экспрессии гена MPHOSPH1 от индивидуумов, для которых известны их статусы заболевания. Более того, контрольный уровень может быть получен из базы данных профилей экспрессии в ранее протестированных клетках. Более того, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения уровень экспрессии гена MPHOSPH1 в биологическом образце можно сравнивать с множеством контрольных уровней, определенных во множестве эталонных образцов. Предпочтительно использовать контрольный уровень, определенный в эталонном образце, полученном из типа ткани, сходного с типом ткани биологического образца, полученного от индивидуума. Более того, предпочтительно использовать стандартную величину уровней экспрессии гена MPHOSPH1 в популяции с известным статусом заболевания. Стандартную величину можно получать любым способом, известным в данной области. Например, в качестве стандартной величины можно использовать диапазон среднего значения +/-2 S.D. или среднего значения +/-3 S.D.

В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный в биологическом образце, о котором известно, что он является незлокачественным, называют "нормальным контрольным уровнем". С другой стороны, если контрольный уровень определен из злокачественного биологического образца, его называют "контрольным уровнем злокачественной опухоли". Разность между уровнем экспрессии в образце и контрольным уровнем можно нормализовать к уровню экспрессии контрольных нуклеиновых кислот, например, генов домашнего хозяйства, о которых известно, что их уровни экспрессии не зависят от злокачественного или незлокачественного состояния клетки. Иллюстративные контрольные гены включают, но не ограничиваются ими, ген бета-актина, ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ген рибосомального белка P1.

Когда уровень экспрессии гена MPHOSPH1 увеличен по сравнению с нормальным контрольным уровнем или сходен/эквивалентен контрольному уровню злокачественной опухоли, у индивидуума может быть диагностирована злокачественная опухоль, подлежащая лечению.

Также настоящее изобретение относится к способу (i) диагностики того, имеет ли индивидуум предположительно злокачественную опухоль, подлежащую лечению, и/или (ii) выбора индивидуума для лечения злокачественной опухоли, причем способ может включать стадии:

a) определения уровня экспрессии MPHOSPH1 в клетках или ткани(ях), полученных от индивидуума, который предположительно имеет злокачественную опухоль, подлежащую лечению;

b) сравнения уровня экспрессии MPHOSPH1 с нормальным контрольным уровнем;

c) диагностики индивидуума как имеющего злокачественную опухоль, подлежащую лечению, если уровень экспрессии MPHOSPH1 увеличен по сравнению с нормальным контрольным уровнем; и

d) выбора индивидуума для лечения злокачественной опухоли, если у индивидуума диагностировано наличие злокачественной опухоли, подлежащей лечению, на стадии c).

Альтернативно такой способ может включать стадии:

a) определения уровня экспрессии MPHOSPH1 в клетках или ткани(ях), полученных от индивидуума, который предположительно имеет злокачественную опухоль, подлежащую лечению;

b) сравнения уровня экспрессии MPHOSPH1 с контрольным уровнем злокачественной опухоли;

c) диагностики индивидуума как имеющего злокачественную опухоль, подлежащую лечению, если уровень экспрессии MPHOSPH1 сходен или эквивалентен с контрольным уровнем злокачественной опухоли; и

d) выбора индивидуума для лечения злокачественной опухоли, если у индивидуума диагностирована злокачественная опухоль, подлежащая лечению, на стадии c).

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для диагностики или определения индивидуума, который страдает от или имеет риск развития злокачественной опухоли или предположительно страдает от или имеет риск развития злокачественной опухоли, которую можно лечить с помощью полипептида MPHOSPH1 по настоящему изобретению, который также может быть пригоден для оценки и/или мониторинга эффективности или применимости иммунотерапии злокачественной опухоли. Предпочтительно, злокачественная опухоль включает, но не ограничивается ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей. Более конкретно, набор предпочтительно может включать по меньшей мере один реагент для выявления экспрессии гена MPHOSPH1 в происходящей от индивидуума клетке, который может быть выбран из группы:

(a) реагент для выявления мРНК гена MPHOSPH1;

(b) реагент для выявления белка MPHOSPH1 или его иммунологического фрагмента; и

(c) реагент для выявления биологической активности белка MPHOSPH1.

Примеры реагентов, подходящих для выявления мРНК гена MPHOSPH1, могут включать нуклеиновые кислоты, которые специфично связывают или идентифицируют мРНК MPHOSPH1, такие как олигонуклеотиды, которые имеют последовательность, комплементарную части мРНК MPHOSPH1. Эти типы олигонуклеотидов иллюстрируются праймерами и зондами, которые являются специфичными для мРНК MPHOSPH1. Эти типы олигонуклеотидов можно получать на основе способов, хорошо известных в данной области. Если необходимо, реагент для выявления мРНК MPHOSPH1 может быть иммобилизован на твердой матрице. Более того, в набор может быть включено более одного реагента для выявления мРНК MPHOSPH1.

С другой стороны, примеры реагентов, пригодных для выявления белка MPHOSPH1 или его иммунологического фрагмента, могут включать антитела к белку MPHOSPH1 или его иммунологическому фрагменту. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Более того, в качестве реагента можно использовать любой фрагмент или модификацию (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv и т.д.) антитела, при условии что фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком MPHOSPH1 или его иммунологическим фрагментом. Способы получения этих типов антител для выявления белков хорошо известны в данной области, и в рамках настоящего изобретения для получения таких антител и их эквивалентов можно использовать любой способ. Более того, антитело можно метить генерирующими сигнал молекулами путем прямого присоединения или с помощью технологии непрямого мечения. Метки и способы мечения антител и выявления связывания антител с их мишенями хорошо известны в данной области, и в рамках настоящего изобретения можно использовать любые метки и способы. Более того, в набор может быть включено более одного реагента для выявления белка MPHOSPH1.

Набор может содержать более одного из упомянутых выше реагентов. Кроме того, набор может включать твердую матрицу и реагент для связывания зонда для гена MPHOSPH1 или антитела против пептида MPHOSPH1, среду и контейнер для культивирования клеток, реагенты положительного и отрицательного контроля и вторичное антитело для выявления антитела против пептида MPHOSPH1. Например, в качестве подходящих контрольных реагентов могут служить образцы тканей, полученные от индивидуумов без злокачественной опухоли или страдающих злокачественной опухолью. Набор по настоящему изобретению, кроме того, может включать другие материалы, желаемые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку (например, письменные, напечатанные, в форме CD-ROM, и т.д.) с инструкциями по применению. Эти реагенты и т.п. могут находиться в контейнере с ярлыком. Подходящие контейнеры включают бутыли, флаконы и тест-пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластмасса.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения когда реагент представляет собой зонд против мРНК MPHOSPH1, реагент может быть иммобилизован на твердой матрице, такой как пористая полоска, формирующая по меньшей мере один участок выявления. Область измерения или выявления на пористой полоске может включать множество участков, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту (зонд). Тест-полоска также может содержать участки для отрицательного и/или положительного контроля. Альтернативно, контрольные участки могут быть расположены на полоске, отдельной от тест-полоски. Необязательно, различные участки выявления могут содержать различные количества иммобилизованных нуклеиновых кислот, т.е. более высокое количество в первом участке выявления и меньшие количества в последующих участках. При добавлении исследуемого образца количество участков, отражающих поддающийся выявления сигнал, обеспечивает количественный показатель количества мРНК MPHOSPH1, присутствующей в образце. Участки выявления могут быть сформированы в любой подходящей для выявления форме и, как правило, в форме прямоугольника или точки, охватывающей ширину тест-полоски.

Кроме того, набор по настоящему изобретению может включать образец положительного контроля или стандартный образец MPHOSPH1. Образец положительного контроля по настоящему изобретению можно получать путем взятия положительных по MPHOSPH1 образцов, а затем анализа их уровней MPHOSPH1. Альтернативно очищенный белок или полинуклеотид MPHOSPH1 можно добавлять к клеткам, которые не экспрессируют MPHOSPH1, с получением положительного образца или стандартного образца MPHOSPH1. В контексте настоящего изобретения очищенный MPHOSPH1 может представлять собой рекомбинантный белок. Уровень MPHOSPH1 в образце положительного контроля, например, превышает пороговую величину.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение, кроме того, относится к диагностическому набору, включающему белок или его часть, специфично распознаваемые антителом по настоящему изобретению или его фрагментом.

Примеры неполных пептидов по настоящему изобретению включают полипептиды, состоящие из по меньшей мере 8, предпочтительно 15, и более предпочтительно 20 последовательно расположенных аминокислот в аминокислотной последовательности белка по настоящему изобретению. Злокачественную опухоль можно диагностировать путем выявления антитела в образце (например, крови, ткани) с использованием белка или пептида (полипептида) по настоящему изобретению. Способы получения белка по настоящему изобретению и пептидов являются такими, как описано выше.

Способы диагностики злокачественной опухоли по настоящему изобретению можно осуществлять путем определения разности между количеством антитела против MPHOSPH1 и его количеством в соответствующем контрольном образце, как описано выше. У индивидуума предполагают наличие злокачественной опухоли, если клетки или ткани индивидуума содержат антитела против продуктов экспрессии (MPHOSPH1) гена и определяют, что количество антитела против MPHOSPH1 превышает уровень пороговой величины по сравнению с нормальным контролем.

В другом варианте осуществления диагностический набор по настоящему изобретению может включать пептид по настоящему изобретению и молекулу HLA, связывающуюся с ним. Способ выявления антигенспецифических CTL с использованием антигенных пептидов и молекул HLA уже разработан (например, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6). Таким образом, комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулы HLA можно использовать в способе выявления в целях выявления специфичных к опухолевому антигену CTL, тем самым обеспечивая более раннее выявление опухоли, рецидива опухоли и/или метастаза опухоли. Кроме того, его можно использовать для выбора индивидуумов, для которых являются применимыми фармацевтические препараты, включающие пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, или для оценки эффекта лечения фармацевтических препаратов.

В частности, в соответствии с известным способом (см., например, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6), можно получать олигомерный комплекс, такой как тетрамер радиоактивно меченной молекулы HLA и пептида по настоящему изобретению. С использованием комплекса диагностику можно проводить, например, путем определения специфичных к антигенному пептиду CTL в лимфоцитах периферической крови человека, полученных от индивидуума, предположительно страдающих злокачественной опухолью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам или диагностическим средствам для оценки иммунологического ответа у индивидуума с использованием пептидных эпитопов, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления изобретения в качестве реагентов для оценки или прогнозирования иммунного ответа у индивидуума можно использовать ограниченные по HLA-A2 пептиды, как описано в настоящем описании. Иммунный ответ, подлежащий оценке, можно индуцировать контактированием иммуногена с иммунокомпетентными клетками in vitro или in vivo. В определенных вариантах осуществления в качестве реагента можно использовать любые вещества или композиции, которые могут приводить к образованию антигенспецифических CTL, которые распознают и связываются с пептидным эпитопом(ами). Может быть необязательным использование пептидных реагентов в качестве иммуногена. Системы анализа, которые используют для такого анализа, включают относительно недавние технические разработки, такие как тетрамеры, окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы высвобождения интерферона или анализы ELISPOT. В предпочтительных вариантах осуществления иммунокомпетентные клетки для оценки иммунологического ответа можно выбирать из периферической крови, лимфоцитов периферической крови (PBL) и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Способы взятия или выделения таких иммунокомпетентных клеток хорошо известны в данной области. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления иммунокомпетентные клетки, подлежащие контактированию с пептидным реагентом, включают антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки.

Например, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в анализах окрашивания с помощью тетрамеров для оценки мононуклеарных клеток периферической крови на присутствие антигенспецифических CTL после воздействия антигена опухолевых клеток или иммуногена. Тетрамерный комплекс HLA можно использовать, чтобы прямо визуализировать специфичные к антигену CTL (см., например, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; и Altman et al, Science 174: 94-96, 1996) и определить долю популяции антигенспецифических CTL в образце мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реагент с использованием пептида по изобретению можно получать, как описано ниже.

Пептид, который связывается с молекулой HLA, подвергают рефолдингу в присутствии соответствующей тяжелой цепи HLA и бета-2-микроглобулина с получением тримолекулярного комплекса. В комплексе С-конец тяжелой цепи биотинилируют в участке, который был ранее встроен способами инженерии в белок. Затем к комплексу добавляют стрептавидин для образования тетрамера, состоящего из тримолекулярного комплекса и стрептавидина. С помощью флуоресцентно меченого стрептавидина тетрамер можно использовать для окрашивания антигенспецифических клеток. Затем клетки можно идентифицировать, например, проточной цитометрией. Такой анализ можно использовать для диагностических или прогностических целей. Клетки, идентифицированные с помощью такой методики, также можно использовать для терапевтических целей.

Настоящее изобретение также относится к реагентам для оценки иммунных ответов на повторную дозу (см., например, Bertoni et aL, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 и Penna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991), включающим пептиды по настоящему изобретению. Например, образцы PBMC пациента, полученные от индивидуумов со злокачественной опухолью, подлежащих лечению, можно анализировать на присутствие антигенспецифических CTL с использованием специфических пептидов. Образец крови, содержащий мононуклеарные клетки, можно оценивать путем культивирования PBMC и стимуляции клеток пептидом по изобретению. После соответствующего периода культивирования увеличенную в количестве популяцию клеток можно анализировать, например, на активность CTL.

Пептиды также можно использовать в качестве реагентов для оценки эффективности вакцины. PBMC, полученные от пациента, вакцинированного иммуногеном, можно анализировать с использованием, например, любого из описанных выше способов. Типируют HLA пациента и выбирают реагенты пептидных эпитопов, которые распознают аллелеспецифические молекулы, присутствующие у пациента, для анализа. На иммуногенность вакцин может указывать присутствие специфичных к эпитопу CTL в образце PBMC.

Пептиды по изобретению также можно использовать для получения антител с использованием способов, хорошо известных в данной области (см., например, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; и Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), которые могут быть пригодны для диагностики, выявления или мониторинга злокачественных опухолей. Такие антитела могут включать антитела, которые распознают пептид в контексте молекулы HLA, т.е. антитела, которые связываются с комплексом пептид-MHC.

Пептиды и композиции по настоящему изобретению имеют ряд дополнительных применений, некоторые из которых описаны в настоящем описании. Например, настоящее изобретение относится к способу диагностики или выявления нарушения, характеризующегося количеством иммуногенного полипептида MPHOSPH1. Эти способы вовлекают определение количества связывающего HLA пептида MPHOSPH1, или комплекса пептида MPHOSPH1 и молекулы HLA класса I в биологическом образце. Экспрессию пептида или комплекса пептида и молекулы HLA класса I можно определять или выявлять путем анализа со связывающим партнером для пептида или комплекса. В предпочтительном варианте осуществления связывающий партнер для пептида или комплекса может представлять собой антитело, которое распознает и специфически связывается с пептидом. Экспрессию MPHOSPH1 в биологическом образце, таком как биоптат опухоли, также можно исследовать с помощью стандартных протоколов ПЦР-амплификации с использованием праймеров MPHOSPH1. Пример опухолевой экспрессии представлен в настоящем описании и дальнейшее описание иллюстративных условий и праймеров для амплификации MPHOSPH1 может быть найдено в WO2003/27322, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпочтительно, диагностические способы вовлекают контактирование выделенного биологического образца от индивидуума со средством, специфичным к пептиду MPHOSPH1, для выявления присутствия пептида MPHOSPH1 в биологическом образце. Как используют в рамках изобретения, "контактирование" означает помещение биологического образца достаточно близко к средству и в соответствующих условиях, например, концентрации, температуры, времени, ионной силы, для обеспечения специфического взаимодействия между средством и пептидом MPHOSPH1, которые присутствуют в биологическом образце. Как правило, условия для контактирования средства с биологическим образцом представляют собой условия, известные специалистам в данной области тем, что они облегчают специфическое взаимодействие между молекулой и распознаваемой ей структурой (например, белком и распознаваемым им рецептором, антителом и распознаваемым им белковым антигеном, нуклеиновой кислотой и распознаваемой ей комплементарной последовательностью) в биологическом образце. Оптимальные условия для облегчения специфического взаимодействия между молекулой и распознаваемой ей структурой описаны в патенте США № 5108921, выданном Low et al, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Диагностический способ по настоящему изобретению можно проводить либо in vivo или in vitro, либо как в in vivo, так и in vitro. Таким образом, в рамках настоящего изобретения биологический образец может находиться in vivo или in vitro. Например, биологический образец может представлять собой ткань in vivo, и средство, специфичное к иммуногенному полипептиду MPHOSPH1, можно использовать для выявления присутствия таких молекул в ткани. Альтернативно биологический образец можно получать и выделять in vitro (например, образец крови, биоптат опухоли, экстракт ткани). В особенно предпочтительном варианте осуществления биологический образец может представлять собой содержащий клетки образец, более предпочтительно, образец, содержащей опухолевые клетки, взятые от индивидуума, подлежащего диагностике или лечению.

Альтернативно диагностику можно проводить способом, который позволяет прямое количественное определение антигенспецифических T-клеток путем окрашивания меченными флуоресцеином мультимерными комплексами HLA (например, Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330). Также предусмотрено окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы высвобождения интерферона-гамма или анализы ELISPOT. Все из окрашивания мультимерами, внутриклеточного окрашивания лимфокинов и анализов ELISPOT являются по меньшей мере в 10 раз более чувствительными, чем более традиционные анализы (Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413;). Также можно использовать пентамеры (например, US 2004-209295A), декстрамеры (например, WO 02/072631) и стрептамеры (например, Nature medicine 6. 631-637 (2002)).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики или оценки иммунологического ответа у индивидуума, которому вводили по меньшей мере один из пептидов MPHOSPH1 по настоящему изобретению, причем способ включает стадии:

(a) контактирования иммуногена с иммунокомпетентными клетками в условиях, подходящих для индукции CTL, специфичных к иммуногену;

(b) выявления или определения уровня индукции CTL, индуцированных на стадии (a); и

(c) коррелирования иммунологического ответа индивидуума с уровнем индукции CTL.

В контексте настоящего изобретения иммуноген предпочтительно включает по меньшей мере один из (a) пептида MPHOSPH1, выбранного из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, и (b) пептидов, имеющих такие аминокислотные последовательности, в которых такие аминокислотные последовательности модифицированы с помощью 1, 2 или более аминокислотной замены(замен). В то же время, условия, подходящие для индукции специфичных к иммуногену CTL, хорошо известны в данной области. Например, иммунокомпетентные клетки можно культивировать in vitro в присутствии иммуногена(ов) для индукции специфичных к иммуногену CTL. Для индукции специфичных к иммуногену CTL, к клеточной культуре можно добавлять любые стимулирующие факторы. Например, IL-2 является предпочтительным стимулирующим фактором для индукции CTL. В некоторых вариантах осуществления стадию мониторинга или оценки иммунологического ответа у индивидуума, подлежащего лечению от злокачественной опухоли пептидом, можно проводить до, в процессе и/или после лечения. Как правило, в ходе протокола терапии злокачественной опухоли иммуногенные пептиды неоднократно вводят индивидууму, подлежащему лечению. Например, иммуногенные пептиды можно вводить каждую неделю в течение 3-10 недель. Таким образом, иммунологический ответ индивидуума можно оценивать или подвергать мониторингу в ходе протокола лечения злокачественной опухоли. Альтернативно стадия оценки или мониторинга иммунологического ответа на терапию злокачественной опухоли может проводиться после завершения протокола лечения.

В соответствии с настоящим изобретением усиленная индукция специфичных к иммуногену CTL по сравнению с контролем указывает на то, что индивидуум, подлежащий оценке или диагностированию, иммунологически ответил на иммуноген(ы), который был/были введены. Подходящие контроли для оценки иммунологического ответа могут включать, например, уровень индукции CTL, когда иммунокомпетентные клетки не контактируют с пептидом, или контактируют с контрольным пептидом(ами), имеющим аминокислотную последовательность, отличную от любого из пептидов MPHOSPH1 (например, случайная аминокислотная последовательность). В предпочтительном варианте осуществления иммунологический ответ у индивидуума оценивают специфическим для последовательности образом, путем сравнения с иммунологическим ответом на каждый иммуноген, вводимый индивидууму. В частности, даже когда смесь некоторых типов пептидов MPHOSPH1 вводят индивидууму, иммунологический ответ может варьировать, в зависимости от пептидов. В этом случае, путем сравнения иммунологического ответа между каждым пептидом можно идентифицировать пептиды, на которые индивидуум имеет более высокий ответ.

XI. Антитела

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с пептидами по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфично связываются с пептидом по настоящему изобретению и не связываются (или связываются слабо) с другим пептидом. Альтернативно антитела могут связывать пептиды по изобретению, а также их гомологи.

Антитела против пептидов по изобретению могут найти применение в диагностических и прогностических анализах злокачественной опухоли, а также в методологиях визуализации. Аналогично, такие антитела могут найти применение в лечении, диагностике и/или прогнозировании других злокачественных опухолей, в тех случаях, когда MPHOSPH1 также экспрессируется или сверхэкспрессируется у пациента со злокачественной опухолью. Более того, экспрессирующиеся внутриклеточно антитела (например, одноцепочечные антитела) могут быть терапевтически пригодными для лечения злокачественных опухолей, в которые вовлечена экспрессия MPHOSPH1, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для выявления и/или количественного определения белка MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126) или его фрагмента, включая полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120. Такие анализы могут включать одно или несколько антител против MPHOSPH1, способных распознавать и связывать белок MPHOSPH1 или его фрагменты, соответствующим образом. В контексте настоящего изобретения, антитела против MPHOSPH1, связывающиеся с полипептидом MPHOSPH1, предпочтительно распознают полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, для исключения других пептидов. Специфичность связывания антитела можно подтверждать с помощью теста ингибирования. Иными словами, когда связывание между антителом, подлежащим анализу, и полноразмерным полипептидом MPHOSPH1 ингибируется в присутствии каких-либо полипептидных фрагментов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120, антитело считают специфично связывающимся с фрагментом. В контексте настоящего изобретения, такие иммунологические анализы проводят в различных форматах иммунологических анализов, хорошо известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, различные типы радиоиммунных анализов, иммунохроматографический способ, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), флуоресцентные иммуноферментные анализы (ELIFA), и т.п.

Сходные иммунологические, но не антительные, анализы по изобретению также могут включать анализы T-клеточной иммуногенности (ингибиторные или стимулирующие), а также анализы связывания MHC. Кроме того, также изобретение предусматривает иммунологические способы визуализации, способные выявлять клетки, экспрессирующие MPHOSPH1, включая, но не ограничиваясь ими, радиосцинтиграфические способы визуализации с использованием меченых антител по настоящему изобретению. Такие анализы могут быть клинически пригодными для выявления, мониторинга и прогнозирования злокачественных опухолей, экспрессирующих MPHOSPH1, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почек и опухоль мягких тканей.

Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с пептидом по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению можно использовать в любой форме, такой как моноклональные или поликлональные антитела, и включает антисыворотку, полученную иммунизацией животного, такого как кролик, пептидом по изобретению, все классы поликлональных и моноклональных антител, антитела человека и гуманизированные антитела, полученные генетической рекомбинацией.

Пептид по настоящему изобретению, используемый в качестве антигена для получения антитела, может происходить из животных любого вида, однако предпочтительно, он происходит из млекопитающего, такого как человек, мышь или кролик, более предпочтительно, из человека. Происходящий из человека пептид можно получать из нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем описании.

В соответствии с настоящим изобретением полные и неполные пептиды белка могут служить в качестве антигена для иммунизации. Примеры подходящих неполных пептидов включают, например, амино(N)-концевой или карбокси(C)-концевой фрагмент пептида по настоящему изобретению.

В рамках настоящего описания антитело определяют как белок, который реагирует либо с полноразмерным пептидом MPHOSPH1, либо с его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению распознает фрагменты пептида MPHOSPH1, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 и 120. Способы синтеза олигопептидов хорошо известны в данной области. После синтеза пептиды необязательно можно очищать перед использованием в качестве иммуногена. В настоящем изобретении олигопептид (например, 9- или 10-мер) можно конъюгировать или связывать с носителями для усиления иммуногенности. В качестве носителя хорошо известен гемоцианин лимфы улитки (KLH). Способы конъюгации KLH и пептида также хорошо известны в данной области.

Альтернативно ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению или его фрагмент, можно встраивать в известный экспрессирующий вектор, который затем используют для трансформации клетки-хозяина, как описано в настоящем описании. Желаемый пептид или его фрагмент можно выделять из внешней среды клеток-хозяев или из клеток-хозяев любым стандартным способом, а затем можно использовать в качестве антигена. Альтернативно в качестве антигена можно использовать цельные клетки, экспрессирующие пептид, или их лизаты, или химически синтезированный пептид.

Любое млекопитающее можно иммунизировать антигеном, хотя предпочтительно учитывают совместимость с родительскими клетками для слияния клеток. Как правило, можно использовать животных семейства Rodentia, Lagomorpha или Primates. Животные семейства Rodentia включают, например, мышей, крыс и хомячков. Животные семейства Lagomorpha включают, например, кролика. Животные семейства Primate включают, например, обезьяны Catarrhini (низшие узконосые обезьяны), такие как Macaca fascicularis, макак-резус, плащеносный павиан и шимпанзе.

Способы иммунизации животных антигенами известны в данной области. Внутрибрюшинная инъекция или подкожная инъекция антигенов является стандартным способом иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антигены можно разбавлять и суспендировать в соответствующем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического раствора и т.д. Если желательно, суспензию антигена можно смешивать с соответствующим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, преобразовывать в эмульсию, а затем вводить млекопитающим. Предпочтительно, после этого следует несколько введений антигена, смешанного с соответствующим количеством неполного адъюванта Фрейнда, раз в от 4 до 21 суток. Для иммунизации также можно использовать соответствующий носитель. После иммунизации, как описано выше, сыворотку можно исследовать стандартным способом на увеличение количества желаемых антител.

Поликлональные антитела против пептидов по настоящему изобретению можно получать путем взятия крови от иммунизированного млекопитающего, исследованного на увеличение желаемых антител в сыворотке, и выделения сыворотки из крови любым общепринятым способом. Поликлональные антитела включают сыворотку, содержащую поликлональные антитела, а также из сыворотки можно выделять фракцию, содержащую поликлональные антитела. Из фракции можно получать иммуноглобулины G или M, которые распознают только пептид по настоящему изобретению, используя, например, аффинную колонку, с которой связан пептид по настоящему изобретению, и далее очищая эту фракцию с использованием колонки с белком A или белком G.

Для получения моноклональных антител для применения в контексте настоящего изобретения иммунные клетки отбирают у млекопитающего, иммунизированного антигеном, и проверяют на увеличение уровня желаемых антител в сыворотке, как описано выше, и подвергают клеточному слиянию. Иммунные клетки, используемые для слияния, предпочтительно можно получать из селезенки. Другие предпочтительные родительские клетки, подлежащие слиянию с описанным выше иммуноцитом, включают, например, клетки миеломы млекопитающих и, более предпочтительно, клетки миеломы, имеющие приобретенное свойство для селекции слитых клеток с помощью лекарственных средств.

Описанные выше иммуноциты и клетки миеломы можно подвергать слиянию в соответствии с известными способами, например, способом Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Гибридомы, полученные в результате слияния клеток, можно отбирать, культивируя их в стандартной селективной среде, такой как среда HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование клеток, как правило, продолжают в среде HAT в течение от нескольких суток до нескольких недель - времени, достаточного для обеспечения гибели всех других клеток (неслитых клеток), за исключением желаемой гибридомы. Затем можно проводить стандартное лимитирующее разведение для скрининга и клонирования гибридомной клетки, продуцирующей желаемое антитело.

В дополнение к описанному выше способу, где не являющегося человеком животного иммунизируют антигеном для получения гибридомы, лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом EB, можно иммунизировать пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами in vitro. Затем иммунизированные лимфоциты можно подвергать слиянию с происходящими из человека клетками миеломы, которые способны к неограниченному делению, такими как U266, с получением гибридомы, продуцирующей желаемое антитело человека, которое способно связываться с пептидом (нерассмотренная опубликованная патентная заявка Японии № (JP-A) Sho 63-17688).

Затем полученные гибридомы можно трансплантировать в брюшную полость мыши и выделять асцитную жидкость. Полученные моноклональные антитела можно очищать, например, преципитацией с сульфатом аммония, хроматографией на колонке с белком A или белком G, ионообменной хроматографией с DEAE или хроматографией на аффинной колонке, с которой связан пептид по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению можно использовать не только для очистки и выявления пептида по настоящему изобретению, но также в качестве кандидата на роль агонистов и антагонистов пептида по настоящему изобретению.

Альтернативно иммунную клетку, такую как иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитела, можно иммортализовывать с помощью онкогена и использовать для получения моноклональных антител.

Полученные таким образом моноклональные антитела также можно получать рекомбинантными способами с использованием технологий генетической инженерии (см., например, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованную в Великобритании MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, ДНК, кодирующую антитело, можно клонировать из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитело, встраивать в соответствующий вектор и вводить в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, полученным, как описано выше.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент антитела или модифицированное антитело, при условии, что оно связывается с одним или несколькими пептидами по изобретению. Например, фрагмент антитела может представлять собой Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором Fv-фрагменты из H- и L-цепей лигированы соответствующим линкером (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагмент антитела можно получать путем обработки антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно можно конструировать ген, кодирующий фрагмент антитела, встраивать его в экспрессирующий вектор и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине (см., например, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun и Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Антитело можно модифицировать путем конъюгации с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированное антитело можно получать путем химической модификации антитела. Эти способы модификации являются общепринятыми в данной области.

Альтернативно антитело по настоящему изобретению можно получать в качестве химерного антитела с вариабельной областью, происходящей из не являющегося человеческим антитела, и константной областью, происходящей из антитела человека, или в качестве гуманизированного антитела, включающего определяющую комплементарность область (CDR), происходящую из не являющегося человеческим антитела, каркасную область (FR) и константную область, происходящую из антитела человека. Такие антитела можно получать в соответствии с известной технологией. Гуманизацию можно проводить путем замены последовательностями CDR или последовательностью CDR грызунов соответствующих последовательностей антитела человека (см. например, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, где по существу менее чем целый вариабельный домен человека замещен соответствующей последовательностью из не являющегося человеком вида.

Также можно использовать полностью человеческие антитела, включающие вариабельные области человека в дополнение к каркасным и константным областям человека. Такие антитела можно получать с использованием различных способов, известных в данной области. Например, способы in vitro вовлекают использование рекомбинантных библиотек фрагментов антител человека, экспонированных на бактериофаге (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991), Аналогично, антитела человека можно получать путем введения локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например, мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан, например, в патентах США № 6150584, 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016.

Антитела, полученные, как описано выше, можно очищать до гомогенности. Например, выделение и очистку антител можно проводить в соответствии со способами разделения и очистки, используемыми для белков в целом. Например, антитело можно отделять и выделять путем соответствующим образом выбранного и комбинированного применения колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, SDS полиакриламидного гель-электрофореза и изоэлектрического фокусирования (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но они не ограничиваются ими. В качестве аффинной колонки можно использовать колонку с белком A и колонку с белком G. Иллюстративные колонки с белком A для применения включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

Примеры подходящих способов хроматографии, кроме аффинной хроматографии, включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, обращено-фазовую хроматографию, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографические способы можно осуществлять путем жидкофазной хроматографии, такой как ВЭЖХ и FPLC.

Например, для измерения антигенсвязывающей активности антитела по изобретению можно использовать измерение поглощения, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментный иммуноанализ (EIA), радиоиммунный анализ (RIA) и/или иммунофлуоресцентный анализ. В ELISA антитело по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете, на планшет наносят пептид по изобретению, а затем наносят образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант антителопродуцирующих клеток или очищенных антител. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и мечено ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшет инкубируют. Далее после промывания в планшет добавляют субстрат фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и измеряют поглощение для оценки антигенсвязывающей активности образца. Для оценки связывающей активности антитела в качестве антигена можно использовать фрагмент пептида, такой как C-концевой или N-концевой фрагмент. Для оценки активности антитела в соответствии с настоящим изобретением можно использовать BIAcore (Pharmacia).

Описанные выше способы позволяют выявление или количественное определение пептида по изобретению путем воздействия антитела по изобретению на образец, предположительно содержащий пептид по изобретению, и выявления или количественного определения иммунного комплекса, образовавшегося между антителом и пептидом.

Поскольку способ выявления или количественного измерения пептида по изобретению может специфически выявлять или количественно определять пептид, способ может быть пригоден в различных экспериментах, в которых используют пептид.

XII. Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к векторам, кодирующим пептид по настоящему изобретению, и клеткам-хозяевам, в которые введен полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению. Вектор по настоящему изобретению пригоден в качестве носителя для полинуклеотида, особенно ДНК, по настоящему изобретению в клетке-хозяине, для экспрессии пептида по настоящему изобретению, или для введения полинуклеотида по настоящему изобретению для генной терапии.

Когда в качестве клетки-хозяина выбирают E. coli и вектор амплифицируется и продуцируется в большом количестве в E. coli (например, JM109, DH5 alpha, HB101 или XL1Blue), вектор должен иметь "ori", подходящий для амплификации в E. coli, и маркерный ген, подходящий для выбранных трансформированных E. coli (например, ген устойчивости к лекарственному средству для селекции с помощью лекарственного средства, такого как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол или сходные с ними). Например, можно использовать векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, PCR-Script, и т.д. Кроме того, также для субклонирования и экстракции кДНК можно использовать pGEM-T, pDIRECT и pT7, а также векторы, описанные выше. Когда для получения белка по настоящему изобретению используют вектор, может быть пригодным экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующий вектор, подлежащий экспрессии в E. coli, должен иметь описанные выше характеристики для амплификации в E. coli. Когда в качестве клетки-хозяина используют E. coli, такие как JM109, DH5 alpha, HB101 или XL1 Blue, вектор должен иметь промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), промотор araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или сходные с ними, который может эффективно экспрессировать желаемый ген в E. coli. В этом отношении, вместо описанных выше векторов можно использовать, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае, хозяином предпочтительно являются BL21, которые экспрессируют РНК-полимеразу T7). Кроме того, вектор также может содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Иллюстративная сигнальная последовательность, которая направляет пептид на секрецию в периплазму E. coli, представляет собой сигнальную последовательность pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Способы введения векторов в клетки-хозяева включают, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.

В дополнение к E. coli для получения полипептида по настоящему изобретению можно использовать, например, экспрессирующие векторы, происходящие из млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, происходящие из клеток насекомых (например, "бакуловирусная экспрессирующая система Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), экспрессирующие векторы, происходящие из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, происходящие из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, происходящие из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующие векторы, происходящие из дрожжей (например, "набор для экспрессии в Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) и экспрессирующие векторы, происходящие из Bacillus subtilis (например, pPL608, pKTH50).

Для экспрессии вектора в клетках животных, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, вектор должен иметь промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EF1-альфа (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для селекции трансформантов (например, ген устойчивости к лекарственному средству для селекции с помощью лекарственного средства (например, неомицин, G418)). Примеры известных векторов с этими характеристиками включают, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Далее настоящее изобретение более подробно описано с помощью примеров. Однако, хотя следующие материалы, способы и примеры могут служить для того, чтобы помочь специалисту в данной области получать и применять определенные варианты осуществления настоящего изобретения, они предназначены только для иллюстрации аспектов настоящего изобретения, и, таким образом, никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Как будет хорошо понятно специалисту в данной области, для применения на практике и исследования настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, сходные или эквивалентные способом и материалам, описанным в настоящем описании.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Клеточные линии

T2, HLA-A*0201-положительную B-лимфобластоидную клеточную линию, HLA-A*0206-положительную B-лимфобластоидную клеточную линию, HT1376, J82, COS7 и UM-UC3 приобретали от ATCC. MKN-45 приобретали от JCRB.

Выбор пептидов-кандидатов, происходящих из MPHOSPH1

9-мерные и 10-мерные пептиды, происходящие из MPHOSPH1, которые связываются с молекулой HLA-A*0201, предсказывали с использованием программного обеспечения для предсказания связывания "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75; Kuzushima et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81). Эти пептиды синтезировали в Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным твердофазным способом синтеза и очищали обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде в концентрации 20 мг/мл и хранили при -80 градусах C.

Индукция CTL in vitro

Происходящие из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпредставляющих клеток для индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), которые отвечают против пептидов, представленных на лейкоцитарном антигене человека (HLA). DC получали in vitro, как описано в литературе (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). В частности, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные от здорового добровольца (положительного по HLA-A*0201) с помощью раствора Ficoll-Paque plus (Pharmacia) разделяли по прикреплению на пластмассовую чашку для культивирования тканей (Becton Dickinson), чтобы обогатить их фракцией моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали присутствии 1000 Е/мл гранулолцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 Е/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержавшей 2% инктивированную нагреванием аутологичную сыворотку (AS). После культивирования в течение 7 суток индуцированные цитокинами DC обрабатывали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 ч при 37 градусах C в среде AIM-V. Оказалось, что полученные клетки экспрессировали ассоциированные с DC молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II, на их клеточной поверхности (данные не представлены). Затем эти обработанные пептидом DC инактивировали облучением рентгеновским излучением (20 Гр) и смешивали в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными путем положительной селекции с помощью набора CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуры помещали в 48-луночные планшеты (Corning); каждая лунка содержала 1,5 Х 10⁴ обработанных пептидом DC, 3 Х 10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Через трое суток эти культуры дополняли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. На 7 и 14 сутки T-клетки дополнительно стимулировали обработанными пептидом DC. DC каждый раз получали так, как описано выше. CTL тестировали против обработанных пептидом клеток T2 после 3-го раунда стимуляции пептидом на 21 сутки (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Методика увеличения в количестве CTL

CTL увеличивали в количестве в культуре с использованием способа, сходного со способом, описанным Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Всего 5 Х 10⁴ CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS с 2 типами B-лимфобластоидных клеточных линий человека, инактивированных митомицином C, в присутствии 40 нг/мл моноклонального антитела против CD3 (Pharmingen). Через одни сутки после инициации культур к культурам добавляли 120 МЕ/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей средой AIM-V/5% AS, содержавшей 30 МЕ/мл IL-2 на 5, 8 и 11 сутки (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Установление клонов CTL

Проводили разведения для получения 0,3, 1 и 3 CTL/лунка в 96-луночном круглодонном микропланшете для титрования (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 1 Х 10⁴ клеток/лунка 2 типов B-лимфобластоидных клеточных линий человека, 30 нг/мл антитела против CD3, и 125 Е/мл IL-2 всего в 150 микролитров/лунка среды AIM-V, содержавшей 5%AS. Через 10 суток к среде добавляли 50 микролитров/лунка IL-2, чтобы достигнуть конечной концентрации 125 Е/мл IL-2. Активность CTL исследовали на 14 сутки, и клоны CTL увеличивали в количестве с использованием того же способа, как описано выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Специфическая активность CTL

Для исследования специфической активности CTL проводили ферментный спот-иммуноанализ (ELISPOT) интерферона (IFN)-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) IFN-гамма. В качестве стимулирующих клеток получали обработанные пептидом T2 (1×10⁴/лунка). Культивированные клетки в 48-луночном планшете линии CTL и клоны CTL использовали в качестве отвечающих клеток. Анализ ELISPOT IFN-гамма и анализ ELISA IFN-гамма проводили согласно методике изготовителя.

Способность CTL распознавать линию клеток-мишеней, которая экзогенно экспрессировала MPHOSPH1 и HLA-A*0201

Клон CTL исследовали в отношении его способности распознавать клетку-мишень, которая эндогенно экспрессировала MPHOSPH1 и HLA-A*0201. Установленный клон CTL культивировали с линиями клеток-мишеней (5 Х 10⁴/лунка) в течение двух ночей. После инкубации проводили измерение IFN-гамма в культуральной среде с помощью ELISA. ELISA IFN-гамма проводили согласно методики изготовителя.

Цитотоксическая активность

Клоны CTL исследовали в отношении их способности уничтожать опухолевые клетки, эндогенно экспрессирующие MPHOSPH1 и HLA-A*0201. Клетки-мишени (опухолевые клеточные линии) метили 100 микроКи Na₂⁵¹CrO₄ (Perkin Elmer) в течение 1 ч в инкубаторе с CO₂. Обработанные пептидом клетки-мишени получали путем инкубации клеток с 20 микрограмм/мл пептида в течение 16 ч перед мечением. Клетки-мишени, меченные ⁵¹Cr, промывали и смешивали с клонами CTL в конечном объеме 200 микролитров в 96-луночных круглодонных микропланшетах для титрования. Планшеты центрифугировали (4 минуты при 800 об./мин.) для увеличения контакта клетка-клетка и помещали в инкубатор с CO₂. После инкубации в течение 4 ч из каждой лунки собирали 50 микролитров супернатанта и радиоактивность определяли с помощью гамма-счетчика (PerkinElmer). Процент специфической цитотоксичности определяли путем вычисления процента специфического высвобождения ⁵¹Cr по следующей формуле: {(cpm для высвобождения исследуемого образца - cpm для самопроизвольного высвобождения)/(cpm для максимального высвобождения - cpm для самопроизвольного высвобождения)}×100. Самопроизвольное высвобождение определяли путем инкубации клеток-мишеней отдельно в отсутствие эффекторных клеток. Максимальное высвобождение получали путем инкубации мишеней с 1 Н HCl. Все измерения проводили в двух экземплярах.

Установление клеток, вынужденно экспрессирующих любой или оба из гена-мишени и HLA-A0206

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания генов-мишеней или HLA-A*0206 амплифицировали способом ПЦР. Амплфицированный способом ПЦР продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Плазмиды трансфицировали в COS7, которая представляет собой нулевую клеточную линию по гену-мишени и HLA-A*0206, с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с методикой изготовителя. Через 2 суток после трансфекции трансфицированные клетки собирали с помощью версена (Invitrogen) и использовали в качестве стимулирующих клеток (5 Х 10⁴ клеток/лунка) для анализа активности CTL.

Способность CTL распознавать линию клеток-мишеней, которые эндогенно экспрессируют MPHOSPH1 и HLA-A*0206

Клон CTL исследовали в отношении его способности распознавать клетку-мишень, которая эндогенно экспрессировала MPHOSPH1 и HLA-A*0206. Установленную линию и клон CTL культивировали с линиями клеток-мишеней (5 Х 10⁴/лунка) в течение двух ночей. После инкубации IFN-гамма в культуральной среде измеряли с помощью ELISA. ELISA IFN-гамма проводили в соответствии с методикой изготовителя.

Результаты

Усиленная экспрессия MPHOSPH1 в злокачественных опухолях

Данные о полном профиле экспрессии генов, полученные для различных злокачественных опухолей с использованием кДНК-микрочипа, показали, что экспрессия MPHOSPH1 (номер доступа GenBank № NM_016195; SEQ ID NO: 125) была специфично повышена в злокачественных тканях по сравнению с соответствующей нормальной тканью. Экспрессия MPHOSPH1 была достоверно увеличена в 30 из 31 случаев рака мочевого пузыря, 8 из 36 случаев рака молочной железы, 18 из 18 случаев рака шейки матки, 5 из 17 случаев холангиоцеллюлярной карциномы, 25 из 31 случаев CML, 6 из 11 случаев рака ободочной и прямой кишки, 6 из 14 случаев рака желудка, 5 из 5 случаев NSCLC, 7 из 7 случаев лимфомы, 6 из 10 случаев остеосаркомы, 7 из 22 случаев рака предстательной железы, 10 из 18 случаев рака почки и 15 из 21 случаев опухоли мягких тканей (таблица 1).

Таблица 1
Соотношение случаев активации MPHOSPH1 в злокачественной ткани по сравнению с нормальной соответствующей тканью Злокачественная опухоль/опухоль Соотношение Рак мочевого пузыря 30/31 Рак молочной железы 8/36 Рак шейки матки 18/18 Холангиоцеллюлярная карцинома 5/17 CML 25/31 Рак толстой и прямой кишки 6/11 Рак желудка 6/14 NSCLC 5/5 Лимфома 7/7 Остеосаркома 6/10 Рак предстательной железы 7/22 Рак почки 10/18 Опухоль мягких тканей 15/21

Предсказание связывающих HLA-A02 пептидов, происходящих из MPHOSPH1

В таблицах 2a и 2b показано связывание с HLA-A02 9-мерных и 10-мерных пептидов MPHOSPH1 в порядке высокой аффинности связывания. Всего 47 пептидов, имеющих потенциальную способность связывания HLA-A02, выбирали и исследовали для определения эпитопных пептидов.

Индукция CTL с помощью предсказанных пептидов из MPHOSPH1, ограниченных по HLA-A*0201

CTL для этих пептидов, происходящих из MPHOSPH1, получали в соответствии с протоколами, как описано в разделе "Материалы и способы". Специфическую активность CTL в отношении пептида выявляли с помощью анализа ELISPOT IFN-гамма (фиг.1). Лунка номер #7, стимулированная MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), #5, стимулированная MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), #5, стимулированная MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), #2, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), #1, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), #1, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f), #4, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), #5, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) и #8, стимулированная MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i) продемонстрировали мощную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. С другой стороны, не было выявлено специфической активности CTL путем стимуляции другими пептидами, представленными в таблице 2 a и b, несмотря на то, что эти пептиды имели возможную активность связывания с HLA-A*0201. В качестве типичного случая отрицательных данных не наблюдали специфической продукции IFN-гамма из CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-575 (SEQ ID NO: 1) (j). Взятые вместе, эти данные указывают на то, что 10 выбранных пептидов, происходящих из MPHOSPH1, могли индуцировать эффективные CTL.

Установление линии и клона CTL против происходящего из MPHOSPH1 пептида

Клетки в лунке номер #7, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), #2, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), #1, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), #1, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f), #4, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), #5, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) и #8, стимулированные MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i), которые показали специфическую активность CTL в отношении пептида в анализе ELISPOT IFN-гамма увеличивали в количестве и устанавливали линии CTL (фиг.2). Активность CTL этих линий CTL измеряли с помощью ELISA IFN-гамма. Линии CTL продемонстрировали мощную продукцию IFN-гамма против клеток T2, обработанных соответствующим пептидом по сравнению с клетками T2 без обработки пептидом. Более того, клоны CTL устанавливали путем лимитирующего разведения из линий CTL, как описано в разделе "Материалы и способы", и продукцию IFN-гамма из клонов CTL против клеток T2, обработанных соответствующим пептидом, измеряли с помощью ELISA IFN-гамма. Мощную продукцию IFN-гамма наблюдали из клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (b), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (c), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (d) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (e) (Фиг.3).

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих MPHOSPH1 и HLA-A*0201

Установленный клон CTL исследовали в отношении способности распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют молекулу MPHOSPH1 и HLA-A*0201. Клон CTL, стимулированный MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), показал мощную активность CTL против клеток J82, которые экспрессируют как MPHOSPH1, так и HLA-A*0201. С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности CTL против клеток HT1376, которые экспрессируют MPHOSPH1, но не HLA-A*0201, и клеток T2, которые экспрессируют HLA-A*0201, но не MPHOSPH1 (фиг.4). Таким образом, эти данные отчетливо демонстрируют, что пептид MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) эндогенно процессировался и экспрессировался на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*0201 и распознавался CTL.

Цитотоксическая активность против опухолевой клеточной линии, экспрессирующей MPHOSPH1 и HLA-A*0201

Установленные клоны CTL исследовали в отношении их способности распознавать и уничтожать опухолевые клеточные линии, которые экспрессируют MPHOSPH1 и HLA-A*0201. Клон CTL, стимулированный MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), показал мощную цитотоксическую активность против клеток UMUC-3, которые экспрессируют как MPHOSPH1, так и HLA-A*0201. С другой стороны, не было выявлено значительной цитотоксической активности в случае обоих клонов CTL против клеток MKN45, которые экспрессируют MPHOSPH1, но не HLA-A*0201, и клеток T2, которые экспрессируют HLA-A*0201, но не MPHOSPH1 (фиг.5). Эти результаты указывают на то, что пептид MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), происходящий из MPHOSPH1, может быть доступен для использования в вакцинах против злокачественной опухоли для пациентов с опухолями, экспрессирующими MPHOSPH1.

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих MPHOSPH1 и HLA-A*0206

Установленную линию CTL, индуцированную против пептида MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), исследовали в отношении способности распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют молекулу MPHOSPH1 и HLA-A*0206. Клетки COS7, трансфицированные полноразмерными генами как MPHOSPH1, так и HLA-A*0206 (конкретная модель клеток-мишеней, которые экспрессируют ген MPHOSPH1 и HLA-A*0206) получали в качестве стимулирующих клеток, и клетки COS7, трансфицированные либо полноразмерным MPHOSPH1, либо HLA-A*0206, использовали в качестве контролей. На фиг.6 клон CTL, стимулированный MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), продемонстрировал мощную активность CTL против клеток COS7, экспрессирующих как MPHOSPH1, так и HLA-A*0206. С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности CTL против контролей. Таким образом, эти данные отчетливо демонстрируют, что пептид MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) эндогенно процессируется и экспрессируется на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*0206 и он распознается CTL.

Анализ гомологии антигенных пептидов

CTL, стимулированные MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) продемонстрировали значительную и специфическую активность CTL. Этот результат может быть следствием того факта, что последовательность MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120), гомологична пептиду, происходящему из других молекул, которые известны тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для исключения этой возможности, проводили анализ гомологии для этих пептидных последовательностей с использованием для запроса алгоритм BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательности со значительной гомологией. Результаты анализов гомологии показали, что последовательности MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) и MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) уникальны и, таким образом, насколько авторам настоящего изобретения известно, вероятность является малой, что эти молекулы могут индуцировать непредусмотренный иммунологический ответ на некоторую неродственную молекулу.

В заключение, новые эпитопные пептиды HLA-A*0201, происходящие из MPHOSPH1, идентифицированного в настоящем описании, могут быть пригодны в области иммунотерапии злокачественной опухоли.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение относится к новым TAA, в частности, TAA, происходящим из MPHOSPH1, которые могут индуцировать мощные и специфические противоопухолевые иммунные ответы и, таким образом, применимы для широкого множества типов злокачественных опухолей. Такие TAA могут быть пригодны в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с MPHOSPH1, например, злокачественной опухоли, более конкретно, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, рака почек и опухоли мягких тканей.

Хотя настоящее изобретение описано в настоящем описании подробно и применительно к его конкретным вариантам осуществления, следует понимать, что представленное выше описание является иллюстративным и пояснительным по своей сути и предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. С помощью общепринятого экспериментирования специалисту в данной области будет хорошо понятно, что различные изменения и модификации можно вносить в них без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, границы и пределы которого определяются прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к противоопухолевым вакцинам на основе эпитопных пептидов MPHOSPH1, и может быть использовано в медицине. Получают пептид состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120. Пептид может содержать замены С- и/или N-концевой аминокислоты указанной последовательности на лейцин или метионин. Полученный эпитопный пептид обладает способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в присутствии антигенпредставляющей клетки (АРС), несущей HLA-A*0201 или HLA-А*0206. Изобретение позволяет индуцировать иммунный ответ против злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1 у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206. 14 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 1 пр.

1. Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в присутствии антигенпредставляющей клетки (АРС), несущей HLA-A*0201 или HLA-А*0206, где указанный пептид представляет собой (а) или (b):

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120, где пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(i) вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120 заменена лейцином или метионином; и

(ii) С-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 120 заменена валином или лейцином.

2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по п. 1.

3. Композиция для индукции CTL в присутствии АРС, несущей HLA-A*0201 или HLA-A*0206, где композиция содержит от 0,001 мг до 1000 мг одного или более пептидов по п. 1.

4. Композиция для индукции АРС, несущей HLA-A*0201 или HLA-А*0206, имеющей способность индуцировать CTL, где указанная композиция содержит от 0,001 мг до 1000 мг одного или более пептидов по п. 1.

5. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1, или индукции иммунного ответа против нее у индивидуума, содержащая от 0,001 мг до 1000 мг одного или более пептидов по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция составлена для введения индивидууму, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206.

6. Способ индукции антигенпредставляющей клетки (АРС), несущей HLA-A*0201 или HLA-A*0206 и обладающей способностью индуцировать CTL, причем указанный способ включает стадию приведения АРС, несущей HLA-A*0201 или HLA-A*0206, в контакт с пептидом по п. 1 in vitro.

7. Способ индукции CTL, причем указанный способ включает стадию приведения АРС, несущей HLA-A*0201 или HLA-A*0206 в комплексе с пептидом по п. 1, в контакт с CD8-положительной Т-клеткой в условиях in vitro.

8. Выделенная АРС, способная индуцировать CTL, специфичные в отношении клеток-мишеней, которая представляет на ее поверхности комплекс, образованный HLA-A*0201 или HLA-A*0206 и пептидом по п. 1, где указанная АРС индуцирована способом по п. 6.

9. Выделенный CTL, нацеленный против раковых клеток, экспрессирующих MPHOSPH1, у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206, где указанный CTL индуцирован способом по п. 7.

10. Способ лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1, у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206, где способ включает стадию введения индивидууму (а) фармацевтически эффективного количества (количеств):

(a) одного или более пептидов по п. 1;

(b) одной или более АРС, которые представляют на своей поверхности пептид по п. 1 в комплексе с HLA-A*0201 или HLA-А*0206, где вводимые АРС являются аутологичными;

(с) одного или более CTL, которые нацелены на опухолевые клетки-мишени, экспрессирующие MPHOSPH1, и распознают АРС, представляющую пептид по п. 1 в комплексе с HLA-A*0201 или HLA-А*0206, где вводимые CTL являются аутологичными.

11. Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1, у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206, причем указанный способ включает стадию введения индивидууму композиции, содержащей пептид по п. 1.

12. Способ индукции иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1, у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206, причем указанный способ включает стадии:

(a) сбор АРС у индивидуума;

(b) приведение АРС стадии (а) в контакт с пептидом по п. 1; и

(c) введение АРС стадии (b) индивидууму; или

(d) сбор АРС и CD8-положительной Т-клетки у индивидуума;

(e) приведение АРС стадии (d) в контакт с пептидом по п. 1;

(f) смешивание АРС стадии (е) с CD8-положительной Т-клеткой стадии (d) и совместное культивирование для индукции CTL; и

(h) введение CTL, индуцированного на стадии (f), индивидууму.

13. Вектор для экспрессирования пептида по п. 1, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по п. 1.

14. Применение одного или более активных ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из (а)-(с) ниже, в получении фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей MPHOSPH1, у индивидуума, HLA антиген которого представляет собой HLA-A*0201 или HLA-A*0206:

(a) одного или более пептидов по п. 1;

(b) одной или более АРС, несущих HLA-A*0201 или HLA-A*0206 и представляющих пептид по п. 1, которые приготовлены посредством следующих стадий:

(1) сбор АРС у индивидуума;

(2) приведение АРС стадии (1) в контакт с пептидом по п. 1;

и

(c) одного или более CTL, которые приготовлены посредством следующих стадий:

(1) сбор АРС и CD8-положительной Т-клетки у индивидуума;

(2) приведение АРС стадии (1) в контакт с пептидом по п. 1; и

(3) смешивание АРС стадии (b) с CD8-положительной Т-клеткой стадии (1) и совместное культивирование для индукции CTL.