Способ пробоподготовки биоорганических образцов Российский патент 2017 года по МПК G01N1/28 B01D59/44 H01J49/00 

Изобретение относится к методам пробоподготовки биоорганических, в том числе медицинских образцов для определения в них изотопного соотношения ¹⁴С/¹²С и ¹⁴С/¹³С с помощью ускорительного масс-спектрометра (УМС).

Известно, что метод УМС позволяет проводить измерение изотопного соотношения (отношение концентрации редкого изотопа к полной концентрации элемента) от 10^-9 до 10^-15 в образце массой от микрограмма до нанограмма (US 5209919, А61K 51/04, G01N 33/60, 11.05.1993). Благодаря высокой чувствительности, метод УМС нашел применение в различных областях исследований, таких как радиоуглеродная датировка и науки о Земле.

Одним из применений этого метода является исследование продуктов метаболизма лекарственных и биологически активных веществ, меченных радиоактивным изотопом. Применение малых доз вещества позволит снизить не только радиационный уровень, но и понизить негативное влияние самого лекарственного или биологически активного препарата. Более того, возможность анализа малых проб позволит свести к минимуму биопсию жира, мышц и костной ткани. Возможность безопасных испытаний новых биоорганических веществ на человеке позволит сократить время и расходы, избегая испытания на животных и исключая непригодные препараты на ранних этапах его тестирования (Hellborg R (2003) Accelerator mass spectrometry - an overview. Vacuum, 70, 365-372).

Для анализа на УМС биоорганический образец проходит несколько стадий пробоподготовки, в результате получают углекислый газ, который может идти непосредственно на изотопный анализ, или, что происходит в большинстве случаев, из него получают углеродную таблетку.

Наиболее эффективным подходом получения углекислого газа из концентрированных образцов является сжигание малого количества образца (US 8642953, H01J 49/34, 04.02.2014). Однако данный метод неприменим при малых концентрациях анализируемых веществ.

Если концентрация углерода в образце, представляющем собой водный раствор органического вещества, мала, то необходима стадия сушки или упаривания образца. Высушенный образец вакуумируется и запаивается в стеклянную трубку, содержащую обожженную проволоку оксида меди. Окисление проходит в течение ночи при 900°C. (ЕР 1257845, А2, B01D 59/44 G01N 1/28, 20.11.2002). К недостаткам этого метода подготовки проб можно отнести возможность потери летучих соединений на стадии сушки, а также на следующем этапе возможность неполного окисления соединений серы и азота и необходимость дополнительной очистки получаемого газа от окислов серы и азота.

Таким образом, в литературе не известны способы проведения жидкофазного окисления проб, при котором можно переводить углерод из жидкого биоорганического образца любой концентрации непосредственно в углекислый газ, который затем поступает на анализ УМС.

Описываемое изобретение представляет собой аналог процедуры традиционной пробоподготовки (US 8642953, H01J 49/34, 04.02.2014) с целью расширить возможности анализа жидких образцов. Предлагается заменить первые две стадии пробоподготовки, а именно сушки образца и его сжигания, на процедуру жидкофазного окисления. В качестве окислителя планируется использовать пероксид водорода. Процесс окисления будет катализироваться любым соединением, обладающим каталитической активностью в реакции разложения пероксида водорода, в частности, переходными металлами, например платиной и ее соединениями, железом и его соединениями, медью и ее соединениями (Cu(NO₃)₃, CuSO₄ и др.) или любой их комбинацией, в виде растворов или нанесенных на твердую матрицу, в частности, на цеолит, например Cu-ZSM-5.

Изобретение решает задачу расширения спектра анализируемых веществ на изотопный состав углерода с применением ускорительной масс-спектрометрии.

Технический результат - получение газообразного образца для анализа на ускорительном масс-спектрометре или дальнейшего превращения его в углеродную таблетку, более подробно - превращение углерода из водного раствора биоорганического образца любой концентрации непосредственно в углекислый газ, минуя стадии сушки и сжигания, при этом летучие соединения также превращаются в CO₂, при этом сера и азот переводятся из состава органических веществ в нелетучие неорганические соединения, преимущественно в сульфаты и нитраты, растворенные в воде.

Задача решается способом пробоподготовки биоорганических, в том числе биологически активных и медицинских, образцов для анализа на ускорительном масс-спектрометре УМС, который включает окисление содержащегося в биоорганическом образце углерода до диоксида углерода в жидкой фазе, в качестве окислителя используют пероксид водорода, а в качестве катализатора используют соединение, обладающее каталитической активностью в реакции разложения пероксида водорода, такие как: переходные металлы, например, платиной и ее соединениями, железо и его соединениями, медью и ее соединениями (Cu(NO₃)₃, CUSO₄ и др.) или любой их комбинацией, в виде растворов или нанесенных на твердую матрицу, в частности на цеолит, например, Cu-ZSM-5, Pt-ZSM-5, выделяющийся в результате окисления диоксид углерода направляют на анализ на ускорительном масс-спектрометре (УМС) либо на стадию графитизации CO₂ для получения углеродной таблетки и последующего анализа на УМС.

Выделяющийся в результате окисления диоксид углерода в случае необходимости подвергают дополнительной процедуре очистки и осушки путем последовательных операций: адсорбции CO₂ на сорбенте, десорбции CO₂ с сорбента при нагревании, замораживанием диоксида углерода и вакуумированием с последующим размораживанием CO₂ и направлением очищенного газа на анализ на ускорительном масс-спектрометре или на графитизацию с последующим анализом на УМС.

Предлагается заменить упаривание, сушку и сжигание, на процедуру жидкофазного окисления. В качестве окислителя планируется использовать пероксид водорода. Процесс окисления будет катализироваться любым соединением, обладающим каталитической активностью в реакции разложения пероксида водорода, например медьсодержащим цеолитом Cu-ZSM-5.

Преимущества предлагаемого метода окисления заключаются в возможности подготовки жидкого биоорганического образца любой концентрации и отсутствии стадии упаривания и сушки и, как следствие, исключении возможности потери летучих соединений, а также в полном окислении соединений серы до растворимых и нелетучих сульфатов, азота до растворимых и нелетучих нитратов.

Известно, что переходные металлы, в частности соединения меди, платины, являются катализаторами разложения пероксида водорода. При определенных значениях рН могут реализовываться различные механизмы разложения. При достаточно низких значениях рН (<10) реакция протекает через образование гидроксильных радикалов. Эти радикалы сами по себе являются сильными окислителями и могут провести окисление органических молекул, но большая их часть, как правило, расходуется с образованием молекул кислорода. При использовании гетерогенного катализатора наблюдается увеличение вклада реакции окисления по сравнению с гомогенными системами. Это объясняется адсорбцией органических веществ на поверхности катализатора, на которой происходит образование гидроксильных радикалов. Органические молекулы оказываются вблизи источника образования гидроксильных радикалов, тем самым увеличивая вероятность их взаимодействия. Адсорбционные центры освобождаются по мере окисления адсорбата (Sashkina K А (2013) Hierarchical zeolite FeZSM-5 as a heterogeneous Fenton-type catalyst. Journal of Catalysis, 299, 44-52).

Использование катализаторов на основе цеолитов эффективно при окислении малых молекул, таких как фенол, этанол, мочевина, благодаря развитой системе микропор. Однако окисление крупных молекул проходит только за счет внешней поверхности катализатора по причине стерических затруднений, что объясняет низкую степень минерализации молекул типа лигнина, размер которого составляет примерно 20 нм. Возникает необходимость увеличения внешней поверхности катализатора. Для этого существует два подхода: уменьшение размера частиц катализатора и использование некоторого темплата при синтезе цеолита для создания дополнительной системы крупных пор. В первом случае частицы катализатора будут коагулировать с образованием более крупных частиц. Таким образом, в обоих случаях будет происходить формирование частиц катализатора с иерархической системой пор. Применение таких катализаторов в реакциях окисления крупных молекул позволяет достигнуть значительно большей степени минерализации.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л мочевины, 20 г/л медьсодержащего цеолита Cu-ZSM-5, полученного гидротермальным способом по известной методике (Sashkina K А (2013) Hierarchical zeolite FeZSM-5 as a heterogeneous Fenton-type catalyst. Journal of Catalysis, 299, 44-52) с последующим нанесением активного компонента методом ионного обмена по известной процедуре (Yashnik S.A. (2005) Catalytic properties and electronic structure of copper ions in Cu-ZSM-5, Catalysis Today, 110, 3-4, 310-325), и 2 M пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее накопившуюся смесь газов пропускают через кварцевый капилляр, в котором находится 1 г сорбента - оксида кальция, при температуре 450°C. После пропускания систему закрывают и откачивают с помощью мембранного насоса, затем сорбент разогревают до температуры 900°C и перемещают выделяемый им CO₂ в пробирку графитизации с катализатором - порошком железа в количестве 6-8 мг, при помощи вымораживания жидким азотом. Капилляры соединяют между собой с помощью быстроразъемных соединений SMC и кранов луер-лок.

На чертеже представлен стенд для сушки, очистки и концентрирования углекислого газа с дальнейшей графитизацией СО₂. 1 - осушитель, 2 - датчик давления, 3 - Fe катализатор, 4 - поступление водорода, 5 - вакуум, 6 - сорбент, 7 - осушитель, 8 - поступление газообразных продуктов окисления (СО₂, Н₂О, NO₂ и т.д.).

После напуска углекислый газ размораживают, определяют его давление, вновь вымораживают на дне кварцевой пробирки и напускают водород до отношения Н₂:CO₂=2.5-3. Количество напущенного водорода контролируют по показаниям датчика давления. Затем кварцевую пробирку размораживают и замеряют полное давление в системе, после чего донную часть пробирки помещают в печь. Удаление образующейся в ходе графитизации воды осуществляют перхлоратом магния. За кинетикой графитизации следят по изменению давления с помощью датчиков Honeywell или МРХ 4250. После окончания графитизации кварцевую кювету с железом извлекают и взвешивают катализатор после графитизации. Порошок зауглероженного железа прессуют в алюминиевые пистоны для УМС-анализа.

Пример 2.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л глюкозы, 5⋅10^-3 М CuSO₄, и 2 М пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч. Выделяемый углекислый газ направляют непосредственно на анализ на УМС.

Пример 3.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л кларитромицина, 20 г/л цеолита, содержащего биметаллический активный компонент, Fe-Cu-ZSM-5, причем FeZSM-5 получен гидротермальным способом по известной методике (Sashkina K А (2013) Hierarchical zeolite FeZSM-5 as a heterogeneous Fenton-type catalyst. Journal of Catalysis, 299, 44-52), а медь наносится методом ионного обмена по известной процедуре (Yashnik S.A. (2005) Catalytic properties and electronic structure of copper ions in Cu-ZSM-5, Catalysis Today, 110, 3-4, 310-325), и 2 M пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее накопившуюся смесь газов направляют на процедуру очистки и осушки следующим образом. Смесь газов пропускают через кварцевый капилляр, в котором находится 1 г сорбента - оксида кальция или оксид магния, при температуре 450°C (в случае оксида магния - при температуре 200°C). После пропускания систему закрывают и откачивают с помощью мембранного насоса, затем сорбент разогревают до температуры 900°C, выделяющийся диоксид углерода замораживают и вакуумируют с последующим размораживанием СО₂ и направляют сухой и чистый CO₂ на анализ на УМС.

Пример 4.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л сахарозы, 20 г/л силикагеля с платиной, нанесенной методом пропитки с последующим восстановлением водородом, Pt-SiO₂ и 2 М пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее выделяемый углекислый газ направляют непосредственно на анализ на УМС или действуют по методике, описанной в примере 1.

Пример 5.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л интерферона, 20 г/л платина-содержащего цеолита Pt-ZSM-5, приготовленного методом ионного обмена по известной методике (Ismagilov Z.R. (2009) Deep desulphurization of diesel fuels on bifunctional monolithic nanostructured Pt-zeolite catalysts, Catalysis Today, 144, 3-4, 235-250), обладающего иерархической системой пор, полученной по известной методике (Sashkina К А (2013) Hierarchical zeolite FeZSM-5 as a heterogeneous Fenton-type catalyst. Journal of Catalysis, 299, 44-52), и 2 M пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее действуют по методике, описанной в примере 1.

Пример 6.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 1 г/л глюкозы, 20 г/л платина-содержащего бета-цеолита Pt-BEA, приготовленного методом ионного обмена по известной методике (Ismagilov Z.R. (2009) Deep desulphurization of diesel fuels on bifunctional monolithic nanostructured Pt-zeolite catalysts, Catalysis Today, 144, 3-4, 235-250), и 2 M пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее действуют по методике, описанной в примере 1.

Пример 7.

В стеклянном реакторе готовят 10 мл раствора, содержащего 5 г/л сахарозы, 20 г/л диоксида титана с нанесенной методом пропитки медью Cu-TiO₂ и 2 М пероксида водорода. Из реактора откачивают воздух. Реакция проходит при перемешивании в течение 4 ч.

Далее выделяемый углекислый газ направляют непосредственно на анализ на УМС или действуют по методике, описанной в примере 1.

Изобретение относится к методам пробоподготовки биоорганических, в том числе медицинских образцов для определения в них изотопного соотношения ¹⁴С/¹²С и ¹⁴С/¹³С с помощью ускорительного масс-спектрометра (УМС). Процесс проводят с использованием системы жидкофазного окисления, содержащей в качестве окислителя пероксид водорода и катализатор разложения пероксида водорода. Выделяющийся в результате окисления диоксид углерода в случае необходимости подвергают дополнительной процедуре очистки и осушки путем последовательных операций: адсорбции СО₂ на сорбенте, десорбции СО₂ с сорбента при нагревании, замораживанием диоксида углерода и вакуумированием с последующим размораживанием СО₂ и направлением очищенного газа на анализ на ускорительном масс-спектрометре. В случае необходимости очищенный углекислый газ подвергают каталитической графитизации с последующим прессованием и получением углеродной таблетки. Обеспечивается получение газообразного или твердого образца для анализа на ускорительном масс-спектрометре. 3 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 ил.

1. Способ пробоподготовки биоорганических, в том числе медицинских, образцов для анализа на ускорительном масс-спектрометре УМС, включающий окисление содержащегося в биоорганическом образце углерода до диоксида углерода, отличающийся тем, что биоорганический образец окисляют в жидкой фазе, в качестве окислителя используют пероксид водорода, а в качестве катализатора используют соединение, обладающее каталитической активностью в разложении пероксида водорода, выделяющийся в результате окисления диоксид углерода направляют на анализ на ускорительном масс-спектрометре УМС либо на стадию графитизации СО₂ для получения углеродной таблетки и последующего анализа на УМС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве соединений, обладающих каталитической активностью в разложении пероксида водорода, используют переходные металлы, например платину и ее соединения, медь и ее соединения или любые их комбинации, в виде растворов или нанесенные на твердую матрицу.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделяющийся в результате окисления диоксид углерода в случае необходимости подвергают дополнительной процедуре очистки и осушки путем последовательных операций: адсорбции СО₂ на сорбенте, десорбции СО₂ с сорбента при нагревании, замораживанием диоксида углерода и вакуумированием с последующим размораживанием СО₂ и направлением очищенного газа на анализ на ускорительном масс-спектрометре.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что графитизацию выделенного в результате окисления углекислого газа проводят путем последовательных операций: адсорбции СО₂ на сорбенте при низкой температуре, десорбции СО₂ с сорбента при высокой температуре, замораживанием углекислого газа в зоне каталитической графитизации, каталитическая графитизация СО₂ и прессование.